CN109996883A - 酶组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种酶组合物、一种用于制备该酶组合物的方法，以及该酶组合物在酶促水解中的用途。

Description

酶组合物
技术领域
本公开涉及一种酶组合物、一种用于制备该酶组合物的方法，以及该酶组合物在酶促水解中的用途。
背景技术
木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，并且为产生化石燃料的替代能源提供了有吸引力的平台。该材料是可大量获得的并且可以被转化成有价值的产品，例如糖或生物燃料(诸如生物乙醇)。
由木质纤维素材料生产发酵产物是本领域中已知的，并且通常包括预处理、水解、发酵和任选地回收发酵产物的步骤。在可包括液化、预糖化和/或糖化的步骤的水解过程中，存在于木质纤维素材料中的纤维素部分地(通常为30％至95％，可取决于酶活性和水解条件)由纤维素分解酶转化为还原糖。水解通常在45℃至50℃的高温和非无菌条件下持续6至168小时的过程期间进行。
通常，由如酵母等微生物将糖转化为有价值的发酵产物，例如乙醇。发酵以单独的、优选厌氧的处理步骤，在相同或不同的容器中进行。将发酵期间的温度调节至30℃至33℃，以适应微生物(通常为酵母)的生长和乙醇生产。在发酵过程期间，剩余的纤维素材料由已经存在于水解步骤中的酶转化为还原糖，同时产生微生物生物质和乙醇。一旦纤维素材料转化为可发酵糖并且所有可发酵糖转化为乙醇、二氧化碳和微生物生物质，就完成了发酵。这可能要花长达6天的时间。通常，水解和发酵的总处理时间可总计长达13天。
酶生产的成本是从木质纤维素材料发酵产物的整个生产过程中的主要成本因素。因此，已经采取了几种方法来降低酶和酶组合物的成本，例如增加由生产微生物产生的酶的量、通过诱变技术调节和构建新的和改进的酶，以及探索遗传多样性。
所有这些方法都没有将酶活性充分提高到克服在从木质纤维素材料发酵产物的整个生产过程中酶生产的高成本。这些方法的一个缺陷是一次关注单一酶，忽略了与其他纤维素分解酶的可能协同效应。
已经进行了若干尝试来开发酶组合物以使木质纤维素材料的酶促水解最大化。例如，WO 2011/000949描述了产生可用于木质纤维素材料的酶促水解的特定酶组合物的Talaromyces突变菌株。
然而，这些尝试没有成功开发出具有足够改善的木质纤维素生物质水解性能的酶组合物。
因此，尽管进行了大量研究工作，但是仍然需要改进的酶组合物，所述改进的酶组合物降低涉及木质纤维素材料的水解和发酵的方法中总体生产成本。
发明概述
本公开的目的是提供一种改进的酶组合物、用于制备该酶组合物的方法，以及该酶组合物在从木质纤维素材料制备糖产物和/或发酵产物的方法中的用途。
发明详述
在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包括”和“包含”以及诸如“含有”的变型应被包含性地解释。也就是说，这些词语旨在传达在上下文允许的情况下可能包括未具体叙述的其他要素或整数。本文中不使用数量词修饰是指一个或多于一个(即，一个或至少一个)。例如，“要素”可以指一个要素或多于一个要素。
在本公开的上下文中，“改善的”和/或“增加的”用于表示与包含乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的酶组合物，其中乙酰木聚糖酯酶以如由RAXE定义的相对于乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的分数存在，并且其中裂解多糖单加氧酶以如由RLPMO定义的相对于裂解多糖单加氧酶和乙酰木聚糖酯酶的分数存在，其中RAXE低于0.04或高于0.29并且RLPMO低于0.71或高于0.96相比，在相同的处理或相同的处理条件下，包含乙酰木聚糖酯酶(AXE)和裂解多糖单加氧酶(LPMO)的酶组合物，其中乙酰木聚糖酯酶以如由RAXE定义的相对于乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的分数存在，并且其中裂解多糖单加氧酶以如由RLPMO定义的相对于裂解多糖单加氧酶和乙酰木聚糖酯酶的分数存在，其中RAXE为0.04至0.29并且RLPMO为0.71至0.96显示出更高的葡聚糖和木聚糖转化率。
本公开涉及一种包含乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的酶组合物，其中乙酰木聚糖酯酶以如由RAXE定义的相对于乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的分数存在，并且其中裂解多糖单加氧酶以如由RLPMO定义的相对于裂解多糖单加氧酶和乙酰木聚糖酯酶的分数存在，其中RAXE为0.04至0.29并且RLPMO为0.71至0.96。优选地，RAXE为0.05至0.25，并且RLPMO为0.75至0.95。更优选地，RAXE为0.05至0.18，并且RLPMO为0.82至0.95。
乙酰木聚糖酯酶的比率(RAXE)，被定义为酶组合物中乙酰木聚糖酯酶的总重量除以酶组合物中乙酰木聚糖酯酶的总重量和裂解多糖单加氧酶的总重量，可用下式计算：RAXE＝总AXE/(总AXE+总LPMO)。裂解多糖单加氧酶的比率(RLPMO)，被定义为酶组合物中的裂解多糖单加氧酶的总重量除以酶组合物中裂解多糖单加氧酶的总重量和乙酰木聚糖酯酶的总重量，可用下式计算：RLPMO＝总LPMO/(总AXE+总LPMO)。
如本文所述，本公开的酶组合物包含乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶。应理解“乙酰木聚糖酯酶”是指“至少一种乙酰木聚糖酯酶”，并且“裂解多糖单加氧酶”是指“至少一种裂解多糖单加氧酶”。因此，本公开的酶组合物可包含多于一种乙酰木聚糖酯酶和/或多于一种裂解多糖单加氧酶。在存在几种乙酰木聚糖酯酶和/或几种裂解多糖单加氧酶的情况下，RAXE涉及酶组合物中所有乙酰木聚糖酯酶的重量除以酶组合物中乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的总重量，并且RLPMO涉及酶组合物中所有裂解多糖单加氧酶的重量除以酶组合物中乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的总重量。
如本文所用，裂解多糖单加氧酶是最近由CAZy归类于家族AA9(辅助活性家族9)或家族AA10(辅助活性家族10)中的酶。因此，存在AA9裂解多糖单加氧酶和AA10裂解多糖单加氧酶。裂解多糖单加氧酶能够打开结晶葡聚糖结构并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。裂解多糖单加氧酶也可能影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等人，Journal of Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)，名为GH61的蛋白质(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)是裂解多糖单加氧酶。GH61最初基于在一个家族成员中测量到非常弱的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性而被归类为内切葡聚糖酶，但最近由CAZy重新归类于家族AA9中。CBM33(碳水化合物结合模块家族33)也是裂解多糖单加氧酶(参见Isaksen等人，Journal of Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)。CAZy最近将CBM33重新归类于AA10家族中。
在一个实施方式中，裂解多糖单加氧酶包括AA9裂解多糖单加氧酶。这意味着酶组合物中的至少一种裂解多糖单加氧酶是AA9裂解多糖单加氧酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有裂解多糖单加氧酶都是AA9裂解多糖单加氧酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自Thermoascus，诸如来自Thermoascusaurantiacus的裂解多糖单加氧酶，所述裂解多糖单加氧酶为诸如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2并且在WO2014/130812和WO 2010/065830中描述为SEQ ID NO:1的裂解多糖单加氧酶；或者来自Thielavia，诸如来自Thielavia terrestris的裂解多糖单加氧酶，所述裂解多糖单加氧酶为诸如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或在WO2014/130812和WO 2008/148131以及WO 2011/035027中描述为SEQ ID NO:4的裂解多糖单加氧酶；或者来自Aspergillus，诸如来自Aspergillus fumigatus的裂解多糖单加氧酶，所述裂解多糖单加氧酶为诸如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的裂解多糖单加氧酶；或者来自Penicillium，诸如来自Penicilliumemersonii的裂解多糖单加氧酶，所述裂解多糖单加氧酶为诸如在WO 2011/041397中公开为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中公开为SEQ ID NO:2的裂解多糖单加氧酶。其他合适的裂解多糖单加氧酶包括但不限于Trichoderma reesei(参见WO 2007/089290)、Myceliophthora thermophila(参见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、Penicillium pinophilum(参见WO 2011/005867)、Thermoascus sp.(参见WO 2011/039319)和Thermoascus crustaceous(参见WO 2011/041504)。可以包含在酶组合物中的其他纤维素分解酶描述于仅举几个示例而言WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593中。在一个优选实施方式中，裂解多糖单加氧酶来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii(参见WO 2012/000892)。
在一个实施方式中，酶组合物包含的裂解多糖单加氧酶的量为酶组合物中蛋白质总量的10％至30％(w/w)。
如本文所用，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖的脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可催化来自聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖，α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但通常不催化来自三乙酰基甘油的乙酰基水解。这种多肽通常不作用于乙酰化甘露聚糖或果胶。
在一个实施方式中，乙酰木聚糖酯酶包括CE1乙酰木聚糖酯酶(碳水化合物酯酶1)。这意味着酶组合物中至少一种乙酰木聚糖酯酶是CE1乙酰木聚糖酯酶。在酶组合物中存在更多乙酰木聚糖酯酶的情况下，这些乙酰木聚糖酯酶可以是CE1乙酰木聚糖酯酶。
在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自Aspergillus aculeatus(参见WO2010/108918)、Chaetomium globosum、Chaetomium gracile、Humicola insolens DSM1800(参见WO 2009/073709)、Hypocrea jecorina(参见WO 2005/001036)、Myceliophterathermophila(参见WO 2010/014880)、Neurospora crassa、Phaeosphaeria nodorum或Thielavia terrestris NRRL8126(参见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在一个优选实施方式中，乙酰木聚糖酯酶来自Rasamsonia，诸如菌株Rasamsonia emersonii(参见WO2012/000888)。
在一个实施方式中，酶组合物包含的乙酰木聚糖酯酶的量为酶组合物中蛋白质总量的1.0％至2.5％(w/w)。在一个优选实施方式中，酶组合物包含的乙酰木聚糖酯酶的量为酶组合物中蛋白质总量的1.1％至2.4％(w/w)。在一个更优选的实施方式中，酶组合物包含的乙酰木聚糖酯酶的量为酶组合物中蛋白质总量的1.5％至2.4％(w/w)。在最优选的实施方式中，酶组合物包含的乙酰木聚糖酯酶的量为酶组合物中蛋白质总量的1.7％至2.4％(w/w)。
在一个实施方式中，本公开的酶组合物还包含半纤维素酶。在一个实施方式中，酶组合物还包含半纤维素酶，其中半纤维素酶以由RHC定义的相对于半纤维素酶和裂解多糖单加氧酶的分数存在，其中RHC为0.15至0.65。优选地，RHC为0.20至0.60。更优选地，RHC为0.22至0.55。
如本文所述，本公开的酶组合物包含半纤维素酶。应当理解，“半纤维素酶”意指“至少一种半纤维素酶”。因此，本公开的酶组合物可包含多于一种半纤维素酶。
在一个实施方式中，半纤维素酶包括β-木糖苷酶和/或木聚糖内切酶。
半纤维素酶的比率(RHC)，被定义为酶组合物中β-木糖苷酶和木聚糖内切酶的总重量除以酶组合物中β-木糖苷酶、木聚糖内切酶和裂解多糖单加氧酶的总重量，可用下式计算：RHC＝(总BX+总EX)/(总BX+总EX+总LPMO)。
在存在几种β-木糖苷酶和/或几种木聚糖内切酶的情况下，RHC涉及酶组合物中的所有β-木糖苷酶和所有木聚糖内切酶的重量除以酶组合物中的所有β-木糖苷酶、所有木聚糖内切酶和所有裂解多糖单加氧酶的总重量。
如本文所用，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖水解以从非还原末端去除连续D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶还可以水解木二糖。β-木糖苷酶也可称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶(xylobiase)。
在一个实施方式中，β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。这意味着酶组合物中的至少一种β-木糖苷酶是GH3β-木糖苷酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有β-木糖苷酶都是GH3β-木糖苷酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自Neurospora crassa、Aspergillusfumigatus或Trichoderma reesei的β-木糖苷酶。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，诸如来自Rasamsonia emersonii(参见WO 2014/118360)的β-木糖苷酶。
如本文所用，木聚糖内切酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可被称为内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。替代物为EC 3.2.1.136，其为一种葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖(glucuronoarabinoxylan)木聚糖内切酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖中的1,4-木糖苷键的酶。
在一个实施方式中，木聚糖内切酶包括GH10木聚糖内切酶。这意味着酶组合物中的至少一种木聚糖内切酶是GH10木聚糖内切酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有木聚糖内切酶都是GH10木聚糖内切酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自Aspergillus aculeatus(参见WO 94/21785)、Aspergillus fumigatus(参见WO 2006/078256)、Penicillium pinophilum(参见WO 2011/041405)、Penicillium sp.(参见WO 2010/126772)、Thielavia terrestris NRRL8126(参见WO 2009/079210)、Talaromyces leycettanus、Thermobifida fusca或Trichophaea saccata GH10(参见WO 2011/057083)的木聚糖内切酶。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，诸如来自Rasamsonia emersonii(参见WO 02/24926)的木聚糖内切酶。
在一个实施方式中，酶组合物还包含β-葡糖苷酶(BG)、纤维二糖水解酶I(CBHI)、纤维二糖水解酶II(CBHII)和内切葡聚糖酶(EG)。
如本文所用，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端非还原β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这种多肽可对β-D-葡糖苷具有广泛的特异性，并且还可水解以下项中的一者或多者：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。该酶也可称为苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶，纤维二糖酶或龙胆二糖酶(gentobiase)。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自Aspergillus的β-葡糖苷酶，诸如来自Aspergillus oryzae的β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶为诸如在WO 02/095014中公开的β-葡糖苷酶或者在WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白；或者来自Aspergillus fumigatus的β-葡糖苷酶，诸如在WO 2005/047499中公开为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中公开为SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶；或者Aspergillus fumigatusβ-葡糖苷酶变体，诸如在WO 2012/044915中公开的β-葡糖苷酶变体，诸如具有以下取代的β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5进行位置编号)；或者来自Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger或Aspergillus kawachi的β-葡糖苷酶。在另一实施方式中，β-葡糖苷酶来源于Penicillium，诸如来源于Penicilliumbrasilianum，该β-葡糖苷酶在WO 2007/019442中公开为SEQ ID NO:2；或者来源于Trichoderma，诸如来源于Trichoderma reesei，该β-葡糖苷酶为诸如在US 6,022,725、US6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US 2006/0258554US 2004/0102619中所述的β-葡糖苷酶。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于Thielavia terrestris(WO 2011/035029)或Trichophaea saccata(WO2007/019442)。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，诸如来自Rasamsonia emersonii(参见WO 2012/000886)的β-葡糖苷酶。
如本文所用，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1,4-β-D-糖苷键水解，从而从链末端释放纤维二糖的任何多肽。该酶也可称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖酶、1,4-β-纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、外切-1,4-β-D-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自Aspergillus，诸如来自Aspergillusfumigatus的纤维二糖水解酶I，该纤维二糖水解酶I为诸如在WO 2011/057140中公开为SEQID NO:6或者在WO 2014/130812中公开为SEQ ID NO:6的Cel7A CBH I；来自Trichoderma，诸如来自Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶I；来自Chaetomium，诸如来自Chaetomiumthermophilum的纤维二糖水解酶I；来自Talaromyces，诸如来自Talaromyces leycettanus的纤维二糖水解酶I；或者来自Penicillium，诸如来自Penicillium emersonii的纤维二糖水解酶I。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，诸如来自Rasamsoniaemersonii(参见WO 2010/122141)的纤维二糖水解酶I。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自Aspergillus，诸如来自Aspergillusfumigatus的纤维二糖水解酶II，该纤维二糖水解酶II为诸如在WO 2014/130812中公开为SEQ ID NO:7的纤维二糖水解酶II；或者来自Trichoderma，诸如来自Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶II；或者来自Talaromyces，诸如来自Talaromyces leycettanus的纤维二糖水解酶II；或者来自Thielavia，诸如来自Thielavia terrestris的纤维二糖水解酶II，该纤维二糖水解酶II为诸如来自Thielavia terrestris的纤维二糖水解酶II CEL6A。在一个优选实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，诸如来自Rasamsonia emersonii(参见WO 2011/098580)的纤维二糖水解酶II。
如本文所用，内切葡聚糖酶是能够催化纤维素、地衣多糖或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-糖苷键的内切水解的酶。它们属于EC 3.2.1.4，并且还能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。内切葡聚糖酶也可称为纤维素酶、结晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维素糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。这意味着酶组合物中至少一种内切葡聚糖酶是GH5内切葡聚糖酶或GH7内切葡聚糖酶。在酶组合物中存在更多内切葡聚糖酶的情况下，这些内切葡聚糖酶可以是GH5内切葡聚糖酶、GH7内切葡聚糖酶，或GH5内切葡聚糖酶和GH7内切葡聚糖酶的组合。在一个优选实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自Trichoderma，诸如来自Trichodermareesei的内切葡聚糖酶；来自Humicola，诸如来自菌株Humicola insolens的内切葡聚糖酶；来自Aspergillus，诸如来自Aspergillus aculeatus或Aspergillus kawachii的内切葡聚糖酶；来自Erwinia，诸如来自Erwinia carotovara的内切葡聚糖酶；来自Fusarium，诸如来自Fusarium oxysporum的内切葡聚糖酶；来自Thielavia，诸如来自Thielaviaterrestris的内切葡聚糖酶；来自Humicola，诸如来自Humicola grisea var.thermoidea或Humicola insolens的内切葡聚糖酶；来自Melanocarpus，诸如来自Melanocarpusalbomyces的内切葡聚糖酶；来自Neurospora，诸如来自Neurospora crassa的内切葡聚糖酶；来自Myceliophthora，诸如来自Myceliophthora thermophila的内切葡聚糖酶；来自Cladorrhinum，诸如来自Cladorrhinum foecundissimum的内切葡聚糖酶；和/或来自Chrysosporium，诸如来自菌株Chrysosporium lucknowense的内切葡聚糖酶。在一个优选实施方式中，内切葡聚糖酶来自Rasamsonia，诸如来自菌株Rasamsonia emersonii(参见WO01/70998)。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶，该细菌内切葡聚糖酶包括但不限于Acidothermus cellulolyticus内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655、WO 00/70031、WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；以及Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。
酶组合物优选包含至少两种活性，但通常组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。酶组合物可以包含每活性类别多于一种的酶活性。例如，酶组合物可包含两种内切葡聚糖酶活性，例如内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。酶组合物可包含一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在一个实施方式中，酶组合物包含至少两种纤维素酶。如本文所用，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。该至少两种纤维素酶可含有相同或不同的活性。在一个实施方式中，酶组合物包含除纤维素酶之外的至少一种酶，例如半纤维素酶或果胶酶。如本文所用，半纤维素酶是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。如本文所用，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。该至少一种其他酶可具有辅助酶活性，即直接或间接地导致木质纤维素降解的附加活性。在此提到了这种辅助活性的示例。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含一种、两种、三种、四种或更多种类别的纤维素酶，例如一种、两种、三种或四种或所有的裂解多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、一种或两种纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含裂解多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶和乙酰木聚糖酯酶。
在一个实施方式中，酶组合物还包含下述酶中的一种或多种酶。
如本文所用，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-键和1,4-键的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键水解的任何多肽。这种多肽可以作用于地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖，而不作用于仅含有1,3-键或1,4-键的β-D-葡聚糖。该酶也可被称为地衣多糖酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶或混合键的β-葡聚糖酶。这种类型的酶的替代物是EC 3.2.1.6，其被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶。在还原基团参与待水解的键的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，这种类型的酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶、昆布多糖酶、1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。该酶也可被称为α-N-阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯呋喃糖酶或阿拉伯糖苷酶。可包含在酶组合物中的阿拉伯呋喃糖酶的示例包括但不限于来自Aspergillusniger、Humicola insolens DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和M.giganteus(参见WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖酶。
如本文所用，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸糖苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸。该酶也可被称为α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶。这些酶也可以水解4-O-甲基化葡糖醛酸，4-O-甲基化葡糖醛酸也可以作为取代基存在于木聚糖中。替代物是EC 3.2.1.131:木聚糖α-1,2-葡糖醛酸苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基链的水解。可在酶组合物中包含的α-葡糖醛酸糖苷酶的示例包括但不限于来自Aspergillus clavatus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aspergillus terreus、Humicola insolens(参见WO 2010/014706)、Penicilliumaurantiogriseum(参见WO 2009/068565)和Trichoderma reesei的α-葡糖醛酸糖苷酶。
如本文所用，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏酸酰基-糖+H2O＝阿魏酸+糖。该糖类可以是例如寡糖或多糖。它通常可以催化酯化糖中的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团的水解，该酯化糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲酯通常是较差的底物。该酶也可称为肉桂酰酯水解酶、阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰酯酶。它也可以被称为半纤维素酶辅助酶，因为它可以帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁的半纤维素和果胶。可包含在酶组合物中的阿魏酸酯酶的示例包括但不限于来自Humicola insolens DSM 1800(参见WO 2009/076122)、Neosartorya fischeri、Neurospora crassa、Penicillium aurantiogriseum(参见WO2009/127729)和Thielavia terrestris(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酸酯酶。
如本文所用，香豆酰酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸+糖。该糖类可以是例如寡糖或多糖。该酶也可被称为反式-4-香豆酰酯酶、反式-对香豆酰酯酶、对香豆酰酯酶或对香豆酸酯酶。该酶也落入EC 3.1.1.73内，因此也可被称为阿魏酸酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。该酶也可称为蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可以被称为外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端、非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称为甘露聚糖酶或甘露糖酶。
如本文所用，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他聚半乳糖醛酸中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称为聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶、果胶酶(pectinase)、内切聚半乳糖醛酸酶、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶、果胶聚半乳糖醛酸酶、聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶、内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
如本文所用，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化以下反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸(pectate)。该酶也被称为果胶酯酶(pectinesterase)、果胶脱甲氧基酶、果胶甲氧基酶、果胶甲基酯酶、果胶酶、果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果胶酰水解酶(pectin pectylhydrolase)。
如本文所用，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。该酶也被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶、内切-1,4-β-半乳聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
如本文所用，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，该酶具有催化果胶的GalUA残基的羟基处的乙酰基脱乙酰的乙酰基酯酶活性。
如本文所用，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化对(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸甲酯的消除性切割以得到在非还原性末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也可被称为果胶裂解酶、果胶反式消除酶(trans-eliminase)；内切果胶裂解酶、聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、果胶溶解酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-聚半乳糖醛酸裂解酶。
如本文所用，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化对(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸的消除性切割以得到在非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也可被称为聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸反式消除酶、聚半乳糖醛酸酯裂解酶、内切果胶甲基反式消除酶、果胶酸反式消除酶、内切半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶、PGA裂解酶、PP酶-N、内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式消除酶、聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸裂解酶。
如本文所用，α鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李糖聚半乳糖醛酸(rhamnogalacturonan)中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。该酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸，从而释放二半乳糖醛酸(digalacturonate)的任何多肽。该酶也可被称为外切-聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下反应的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。该酶也可被称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan1,4-α-galacturonidase)、外切聚半乳糖醛酸酶、聚(半乳糖醛酸)水解酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-聚半乳糖醛酸酶、外切聚-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。该酶也可被称为果胶酸二糖裂解酶、果胶酸外切裂解酶、外切果胶酸反式消除酶、外切果胶酸裂解酶、外切聚半乳糖醛酸-反式-消除酶、PATE、外切-PATE、外切-PGL或(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸还原末端二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李糖聚半乳糖醛酸水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李糖聚半乳糖醛酸结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键的任何多肽。
如本文所用，鼠李糖聚半乳糖醛酸裂解酶是能够以内切方式在鼠李糖聚半乳糖醛酸中通过β-消除来切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
如本文所用，鼠李糖聚半乳糖醛酸乙酰基酯酶是能够催化鼠李糖聚半乳糖醛酸中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。
如本文所用，鼠李糖聚半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式从严格交替的鼠李糖聚半乳糖醛酸结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木糖聚半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木糖聚半乳糖醛酸的任何多肽。该酶也可被称为木糖聚半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。该酶也可被称为α-N-阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯呋喃糖酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。该酶也可被称为内切阿拉伯糖酶、阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽与其他部分(诸如糖)之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶表征为属于EC 3.4，并且适用于在如本文所述的方法中使用。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和软木脂。
“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，以及在本领域中描述的已知解聚或以其他方式分解木质素聚合物的其他酶。还包括能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)与木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下酶组成的组：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以使用的己糖基转移酶的示例是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解以得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已经表征并可为适用的，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31)、透明质酸-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.36)、葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)、甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质膨胀素(swollenin)含有N末端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C末端扩展蛋白样结构域。如本文所述，扩展蛋白样蛋白质或膨胀素样蛋白质可包含此类结构域中的一种或两种结构域和/或可破坏细胞壁的结构(诸如破坏纤维素结构)，而任选地不产生可检测量的还原糖。
纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(参见Foreman等人，J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)；纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物；或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合体。这通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesion domain)与每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物附接的纤维素结合模块(CBM)。支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一种或两种结构域。
过氧化氢酶；术语“过氧化氢酶”是指过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC1.11.1.6或EC 1.11.1.21)，其催化两种过氧化氢转化为氧和两种水。可以基于以下反应，通过监测过氧化氢在240nm的降解来确定过氧化氢酶活性：2H2O2→2H2O+O2。在50mM磷酸盐pH 7.0中在25℃下用10.3mM底物(H202)和约100单位酶/ml来进行该反应。在16-24秒内通过分光光度法来监测吸光度，该吸光度应当对应于从0.45到0.4的吸光度降低。一个过氧化氢酶活性单位可表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解一微摩尔的H202。
如本文所用的术语“淀粉酶”是指水解淀粉中(直链淀粉和支链淀粉两者中)的α-1,4-糖苷键的酶，诸如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98)、葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)；以及水解支链淀粉中的分支点α-1,6-糖苷键的酶，诸如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和限制葡聚糖酶(EC 3.2.1.142)。
酶组合物可以由上述种类的酶中的各种种类酶的成员、一种酶种类的几个成员，或这些酶种类的任何组合组成。如本文所述的酶组合物中的不同酶可以从不同来源获得。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时提供(即，作为单一组合物本身)，或单独或顺序地提供。
在一个实施方式中，酶组合物中的酶来源于真菌，优选丝状真菌，或所述酶包含真菌酶，优选丝状真菌酶。在一个优选实施方式中，真菌是Rasamsonia，其中Rasamsoniaemersonii是最优选的。在一个实施方式中，核心组的(木质)纤维素降解酶(即纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)可以来源于Rasamsonia emersonii。如果需要的话，则该组酶可以补充有来自其他来源的额外酶活性。此类额外的活性可以来源于经典来源和/或由经遗传修饰的生物产生。因此，酶组合物可包含来自除Rasamsonia以外的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。在一个实施方式中，它们可以与一种或多种Rasamsonia酶一起使用，或者它们可以在不存在额外Rasamsonia酶的情况下使用。
“丝状真菌”包括亚门Eumycota和Oomycota(如由Hawksworth等人在Ainsworthand Bisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995,CAB International,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义的)的所有丝状形式。丝状真菌通过由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁来表征。营养生长是通过菌丝延伸进行的，并且碳分解代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于菌株Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Beauvaria、Cephalosporium、Ceriporiopsis、Chaetomium paecilomyces、Chrysosporium、Claviceps、Cochiobolus、Coprinus、Cryptococcus、Cyathus、Emericella、Endothia、Endothia mucor、Filibasidium、Fusarium、Geosmithia、Gilocladium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Myrothecium、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Podospora、Pyricularia、Rasamsonia、Rhizomucor、Rhizopus、Scylatidium、Schizophyllum、Stagonospora、Talaromyces、Thermoascus、Thermomyces、Thielavia、Tolypocladium、Trametes、Trichoderma和Trichophyton。
几种丝状真菌菌株对于公众来说是在许多培养物保藏中心中可轻易获得的，所述培养物保藏中心为诸如美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelculture,CBS)和农业研究机构保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)北方区域研究中心(Northern Regional Research Center,NRRL)。此类菌株的示例包括Aspergillus niger CBS 513.88、Aspergillus oryzae ATCC20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、Penicillium chrysogenum CBS 455.95、Penicillium citrinum ATCC 38065、Penicillium chrysogenum P2、Talaromyces emersonii CBS393.64、Acremoniumchrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Chrysosporium lucknowense C1、Garg27K、VKM F-3500-D、ATCC44006，以及它们的衍生株。
酶(例如为完整发酵液的形式)可通过用合适的微生物(例如丝状真菌)发酵合适的底物来制备，其中所述酶是由微生物产生的。可以改变微生物以改善或制造酶。例如，微生物可以通过经典的菌株改良程序或通过重组DNA技术进行突变。因此，本文提到的微生物可原样使用以产生酶，或者可以进行改变以增加生产或产生改变的酶，所述改变的酶可包括异源酶，例如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶，因此酶不是由微生物初始产生的酶。优选地，使用真菌，更优选丝状真菌,来产生酶。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，使用诱导产生酶的微生物进行酶表达的底物。
在一个实施方式中，酶组合物包含“热稳定”酶。如本文所使用的“热稳定的”酶是指所述酶的最适温度为50℃或更高、60℃或更高、70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高，85℃或更高。它们可以例如从嗜热微生物中分离，或者可以由技术人员设计并人工合成。在一个实施方式中，多核苷酸可以从嗜热或耐热丝状真菌中分离或获得，或从非嗜热或非耐热真菌中分离，但被发现是热稳定的。
“嗜热真菌”是指在50℃或更高的温度下生长的真菌。“耐热”真菌是指在45℃或更高，最大值接近50℃的温度下生长的真菌。
合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是Humicola、Rhizomucor、Myceliophthora、Rasamsonia、Talaromyces、Thermomyces、Thermoascus或Thielavia细胞，优选为Rasamsonia细胞。优选的嗜热或耐热真菌是Humicola grisea var.thermoidea、Humicolalanuginosa、Myceliophthora thermophila、Papulaspora thermophilia、Rasamsoniabyssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Rasamsonia argillacea、Rasamsoniaeburnean、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsonia cylindrospora、Rhizomucorpusillus、Rhizomucor miehei、Talaromyces bacillisporus、Talaromyces leycettanus、Talaromyces thermophilus、Thermomyces lenuginosus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus和Thielavia terrestris。
嗜热真菌不限于特定的分类学目，并且存在于整个真菌生命树上。示例为Mucorales中的Rhizomucor，Sordariales中的Myceliophthora，以及Eurotiales中的Talaromyces、Thermomyces和Thermoascus(参见Mouchacca，1997)。大多数Talaromyces菌种是嗜常温菌，但是例外是Emersonii和Thermophila组内的菌种。组Emersonii包括Talaromyces emersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces bacillisporus和Talaromyces leycettanus，它们都在40℃生长良好。Talaromyces bacillisporus是耐热的，Talaromyces leycettanus是耐热至嗜热的，并且Talaromyces emersonii和Talaromyces byssochlamydoides是真实嗜热的(参见Stolk和Samson，1972)。Talaromyces的组Thermophila的唯一成员Talaromyces thermophilus在50℃快速生长(参见Stolk和Samson，1972)。这些嗜热Talaromyces菌种的当前分类主要基于表型和生理特征，诸如它们在40℃以上生长的能力，子囊孢子颜色、子囊果覆盖物(ascornatal covering)的结构和某种类型的无性型的形成。Stolk和Samson(1972)指出，组Emersonii的成员具有Paecilomyces(Talaromyces byssochlamydoides和Talaromyces leycettanus)或Penicillium cylindrosporum系(Talaromyces emersonii和Talaromycesbacillisporus)的无性型。后来，Pitt(1979)基于各种特征，如从端孔而非在颈(collula/neck)上形成分生孢子(Penicillium和Paecilomyces的特征)，而将属于Penicilliumcylindrosporum系的菌种转移到Geosmithia属。在Geosmithia属内，仅Geosmithiaargillacea是耐热的，并且Stolk等人(1969)和Evans(1971)提出了与Talaromyces的组Emersonii的成员的关联。Talaromyces内的嗜热Talaromyces菌种与Trichocomaceae的系统发生关系是未知的(参见J.Houbraken,Antonie van Leeuwenhoek 2012年2月；101(2):403-21)。
Rasamsonia是包括耐热的和嗜热的Talaromyces和Geosmithia菌种的新属(J.Houbraken等人，出处同上)。基于表型、生理和分子数据，Houbraken等人提出将菌种Talaromyces emersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces eburneus、Geosmithia argillacea和Geosmithia cylindrospora转移至新属Rasamsonia。
优选的嗜热真菌是Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Thermomyces lenuginosus、Talaromyces thermophilus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus和Thermoascus aurantiacus，其中Rasamsonia emersonii为最优先的。Talaromyces emersonii、Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsoniaemersonii在本文中可互换使用。
在一个实施方式中，酶组合物是完整发酵液。在一个实施方式中，酶组合物是真菌的完整发酵液，优选地是丝状真菌的完整发酵液，优选地是Rasamsonia属的完整发酵液。完整发酵液可以通过非重组和/或重组丝状真菌的发酵来制备。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含一种或多种可与丝状真菌同源或异源的基因。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含一种或多种可与丝状真菌同源或异源的基因，其中该一种或多种基因编码能够降解纤维素底物的酶。完整发酵液可包含本文所述的任何多肽或它们的任何组合。
优选地，酶组合物是完整发酵液，其中的细胞被杀死，即失活。在一个实施方式中，完整发酵液包含多肽、有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片，以及培养基。
通常，在适于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养丝状真菌。使用本领域已知的方法，在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基、温度范围和其他适于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶产生的条件是本领域已知的。可以通过将丝状真菌培养至稳定期并将丝状真菌保持在限制性碳条件下达足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的一段时间来制备完整发酵液。一旦酶(诸如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)由丝状真菌分泌到发酵培养基中，就可以使用完整发酵液。完整发酵液可包含丝状真菌。在一个实施方式中，完整发酵液包含在发酵结束时产生的发酵物质的未分馏内容物。通常，完整发酵液包含在丝状真菌生长至饱和、在碳限制性条件下孵育以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)后存在的用过的培养基和细胞碎片。在一些实施方式中，完整发酵液包含用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。存在于完整发酵液中的丝状真菌细胞可以使用本领域已知的方法杀死以产生细胞被杀死的完整发酵液。例如，添加有机酸会导致杀死细胞。如果需要的话，也可以对细胞进行裂解和/或渗透化。在一个实施方式中，完整发酵液是细胞被杀死的完整发酵液，其中完整发酵液含有被杀死的丝状真菌细胞。换句话说，完整发酵液包含比活细胞更多的失活细胞，优选仅失活细胞。在一些实施方式中，通过用化学和/或pH处理使丝状真菌裂解来杀死细胞，以产生丝状真菌细胞被杀死的完整发酵液。在一些实施方式中，通过以下方式来杀死细胞：用化学和/或pH处理使丝状真菌裂解，以及将细胞被杀死的发酵混合物的pH调节至合适的pH。在一个实施方式中，将完整发酵液与有机酸混合。
如本文所用的术语“完整发酵液(whole fermentation broth)”是指通过细胞发酵产生的制备物，该制备物不经历或经历最少的回收和/或纯化。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制性条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶表达)并分泌到细胞培养基中时，产生了完整发酵液。通常，完整发酵液是未分馏的，并且包含用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物，优选为失活的细胞。
在一个实施方式中，可以将完整发酵液进行分馏，并且可以使用分馏出的内容物中的一种或多种内容物。例如，可以从完整发酵液中去除杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的酶组合物。
完整发酵液还可包含防腐剂和/或抗微生物剂。此类防腐剂和/或试剂是本领域中已知的。在一个实施方式中，用于杀死细胞的有机酸还可以具有防腐剂和/或抗微生物剂的功能。
如本文所述的完整发酵液通常是液体，但可含有不溶性组分，诸如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可以去除不溶性组分以提供澄清的完整发酵液。
在一个实施方式中，完整发酵液可以补充有一种或多种酶活性物质，所述酶活性物质不是内源表达的，或者由丝状真菌以相对低的水平表达，以改善纤维素底物降解成例如可发酵的糖，诸如葡萄糖或木糖。可以将补充酶作为补充物添加到完整发酵液中，即将它们掺入完整发酵液中。额外的酶可以以完整发酵液的形式补充，或者可以补充为纯化的或经最少回收和/或纯化的酶。
在一个实施方式中，完整发酵液可以补充有至少另一种完整发酵液。其他完整发酵液可以来源于相同类型的真菌或来源于另一类型的真菌，例如第一完整发酵液可以来源于Rasamsonia，而第二完整发酵液可以来源于Rasamsonia或Aspergillus。
在一个实施方式中，完整发酵液是发酵过表达一种或多种酶的重组丝状真菌以改善纤维素底物的降解的完整发酵液。或者，完整发酵液是发酵非重组丝状真菌的完整发酵液和过表达一种或多种酶的重组丝状真菌以改善纤维素底物的降解的完整发酵液的混合物。在一个实施方式中，完整发酵液是发酵过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌的完整发酵液。或者，完整发酵液是发酵非重组丝状真菌的完整发酵液和发酵过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌的完整发酵液的混合物。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物的pH为2.0至5.5。优选地，酶组合物的pH为2.5至5.0。更优选地，酶组合物的pH为3.0至4.5。因此，酶组合物中的酶能够在低pH下起作用。
在一个实施方式中，在如本文所述的用于制备酶组合物的方法中使用的容器的体积为至少1m3。优选地，该容器的体积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3。通常，该容器将小于300m3。
在如本文所描述用于制备酶组合物的方法中，将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)的群体在对适当的生长条件下在液体或固体培养基中培养。在一个实施方式中，以补料分批培养、分批培养、连续培养或它们的任何组合来培养微生物细胞。优选地，以补料分批培养来培养丝状真菌。本领域的技术人员充分了解各种培养模式及其条件。在一个实施方式中，在好氧条件下进行培养。本领域的技术人员充分了解用于好氧培养的发酵罐设计，诸如关于搅拌槽和泡罩塔的设计。
本公开涉及一种用于从木质纤维素材料制备糖的方法，该方法包括以下步骤：(a)用本文所述的酶组合物水解木质纤维素材料以获得糖，以及(b)任选地回收糖。
本公开还涉及一种用于从木质纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)用本文所述的酶组合物水解木质纤维素材料以获得糖，(b)通过使获得的糖与发酵微生物接触来发酵该获得的糖，以产生发酵产物，以及(c)任选地回收发酵产物。
在酶促水解后，可以对水解的木质纤维素材料进行至少一次固/液分离。固/液分离的方法和条件将取决于所用木质纤维素材料的类型，并且完全在本领域技术人员的范围内。示例包括但不限于离心、旋风分离、过滤、倾析、筛分和沉降。在一个优选实施方式中，通过离心或沉降来进行固/液分离。在固/液分离期间，可以使用用于改善分离的装置和/或助剂。
在一个实施方式中，在酶促水解之前使木质纤维素材料经历预处理步骤。在一个实施方式中，在酶促水解之前使木质纤维素材料经历洗涤步骤。在一个实施方式中，在酶促水解之前使木质纤维素材料经历至少一次固/液分离。因此，在对木质纤维素材料进行酶促水解之前，可以使木质纤维素材料经历至少一次固/液分离。固/液分离可在预处理步骤之前和/或之后进行。上面已经描述了用于固/液分离的合适方法和条件。
在一个实施方式中，使经酶促水解的木质纤维素材料经历固/液分离步骤，之后是解毒步骤和/或浓缩步骤。
在如本文所述的方法中，可将木质纤维素材料加入到一个或多个容器中。在一个实施方式中，在加入木质纤维素材料之前，酶组合物已经存在于该一个或多个容器中。在另一个实施方式中，可以将酶组合物加入一个或多个容器中。在一个实施方式中，在添加酶组合物之前，木质纤维素材料已经存在于该一个或多个容器中。在一个实施方式中，将木质纤维素材料和酶组合物两者同时加入一个或多个容器中。存在于一个或多个容器中的酶组合物可以是含水组合物。
在一个实施方式中，酶促水解包括至少液化步骤，其中在至少第一容器中水解木质纤维素材料；以及糖化步骤，其中在该至少第一容器中和/或在至少第二容器中水解经液化的木质纤维素材料。糖化可以在与液化相同的容器(即至少第一容器)中进行，也可以在单独的容器(即至少第二容器)中进行。因此，在酶促水解中可以组合液化和糖化。或者，液化和糖化可以是单独的步骤。液化和糖化可以在不同温度下执行，但也可以在单一温度下执行。在一个实施方式中，液化温度高于糖化温度。液化优选在60-85℃的温度下进行，并且糖化优选在50-65℃的温度下进行。
酶促水解可以在一个或多个容器中执行，但也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中执行。这也适用于酶促水解包括液化步骤和糖化步骤时。液化步骤可以在一个或多个容器中执行，但也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中执行，和/或糖化步骤可以在一个或多个容器中执行，但也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中执行。要使用的容器的示例包括但不限于补料分批搅拌容器、分批搅拌容器、使用超滤的连续流动搅拌容器，以及连续活塞流柱式反应器。可以用一个或多个叶轮、泵和/或静态搅拌器来进行搅动。
酶促水解中使用的酶可以在酶促水解之前和/或期间加入。如上所述，当在酶促水解之前对木质纤维素材料进行固/液分离时，可以在固/液分离之前加入酶促水解中使用的酶。或者，它们也可以在固/液分离后或在固/液分离之前和之后加入。也可以在酶水解期间加入酶。在酶促水解包括液化步骤和糖化步骤的情况下，可以在液化步骤期间和/或之后加入另外的酶。可以在糖化步骤之前和/或期间加入另外的酶。也可以在糖化步骤后加入另外的酶。
在一个实施方式中，总酶促水解时间为10小时或更长时间、12小时或更长时间、14小时或更长时间、16小时或更长时间、18小时或更长时间、20小时或更长时间、30小时或更长时间、40小时或更长时间、50小时或更长时间、60小时或更长时间、70小时或更长时间、80小时或更长时间、90小时或更长时间、100小时或更长时间、110小时或更长时间、120小时或更长时间、130小时或更长时间、140小时或更长时间、150小时或更长时间、160小时或更长时间、170小时或更长时间、180小时或更长时间、190小时或更长时间、200小时或更长时间。
在一个实施方式中，总酶促水解时间为10至300小时、16至275小时，优选20至250小时，更优选30至200小时，最优选40至150小时。
将在用于酶促水解的一个或多个容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10至4000cP之间，在10至2000cP之间，优选在10至1000cP之间。
在该方法包含包括液化步骤和糖化步骤的酶促水解的情况下，将液化步骤中木质纤维素材料的粘度保持在10至4000cP之间，在10至2000cP之间，优选在10至1000cP之间，和/或将糖化步骤中木质纤维素材料的粘度保持在10至1000cP之间，在10至900cP之间，优选在10至800cP之间。
可以用Brookfield DV III流变仪在用于水解的温度下测定粘度。
在一个实施方式中，在酶促水解过程中加入氧气。在一个实施方式中，在酶促水解的至少一部分期间加入氧气。在酶促水解期间可以连续或不连续地加入氧气。在一个实施方式中，在酶促水解期间一次或多次地加入氧气。在一个实施方式中，可以在酶促水解之前，在将木质纤维素材料加入到用于酶促水解的容器中期间，在将酶加入到用于酶水解的容器中期间，在酶促水解的一部分期间，在整个酶促水解期间，或它们的任意组合期间加入氧。将氧加入酶促水解中使用的一个或多个容器中。
可以以几种形式加入氧。例如，氧可以作为氧气、富氧气体(诸如富氧空气)或空气加入。也可借助于原位氧生成来加入氧。例如，可以通过电解产生氧；可以酶促地产生氧，例如通过加入过氧化物；或者可以化学地产生氧，例如通过氧生成系统，诸如KHSO5。例如，通过过氧化氢酶从过氧化物产生氧。过氧化物可以以溶解的过氧化物的形式加入，或通过酶促或化学反应产生。在将过氧化氢酶用作产生氧的酶的情况下，可以使用存在于酶组合物中的过氧化氢酶进行水解，或者可以为此目的而加入过氧化氢酶。
如何加入氧的示例包括但不限于借助于喷射加入氧、电解、氧的化学加入，从顶部填充在酶促水解中使用的一个或多个容器(将水解产物投入槽中，以及因此将氧引入水解产物中)，以及向所述一个或多个容器的顶部空间加入氧。当将氧加入容器的顶部空间时，可以供应水解反应所需的足够氧气。通常，可以控制和/或改变加入到容器中的氧的量。通过在水解时间的部分期间仅将氧加入所述容器中，可以限制供应的氧。另一种选项是以低浓度加入氧，例如通过使用空气和再循环空气(离开容器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气。增大所加入的氧的量可以通过在较长的水解时间期间加入氧，通过加入较高浓度的氧或通过加入更多空气来实现。另一种控制氧浓度的方式是加入氧消耗器和/或氧发生器。可以将氧引入(例如吹入)到木质纤维素材料的液体水解容器内容物中。也可以将氧吹入到容器的顶部空间中。
在一个实施方式中，在将木质纤维素材料加入到用于酶促水解的一个或多个容器之前和/或期间和/或之后，将氧加入到所述一个或多个容器中。可以将氧与进入水解容器的木质纤维素材料一起引入。可以将氧引入到将进入容器的材料流中，或者与容器内容物中经过容器的外部环路的部分一起引入。
在一个实施方式中，在酶促水解和/或发酵中所用的容器的体积为至少1m3。优选地，容器的体积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3。通常，容器将小于3000m3或5000m3。在酶促水解中使用几个容器的情况下，所述几个容器可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。在酶促水解包括单独的液化步骤和糖化步骤的情况下，用于液化步骤的容器和用于糖化步骤的容器可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。
酶水解优选在40℃或更高，优选45℃或更高的温度下进行。在一个实施方式中，酶促水解在40-90℃，优选45-90℃的温度下进行。在该步骤中，热稳定的纤维素分解酶为优选的。
在用于将木质纤维素材料转化为发酵产物的常规方法中，优选在腐败条件下进行处理步骤以降低操作成本。因此，污染性微生物的污染和生长可能发生并导致不希望的副作用，诸如乳酸、甲酸和乙酸的产生，底物上的发酵产物的产量损失，毒素和细胞外多糖的产生。这些效应可能会显著影响生产成本。高处理温度和/或短处理时间限制了水解和发酵期间的污染风险。热稳定酶，如Rasamsonia的热稳定酶，能够在高于60℃的温度下水解木质纤维素材料。在这些温度下，污染性微生物将导致不希望的副作用的风险几乎为零。
在发酵步骤(其中例如产生乙醇)期间，温度通常在30℃至38℃之间，并且优选由于生产损耗而不升高。通过应用短发酵过程时间，尽可能减少了污染物进行污染和/或生长的风险和影响。在使用稳定的酶，如Rasamsonia的稳定的酶时，可以施加短的发酵时间，由此尽可能减少污染物进行污染和/或生长的风险。通过以这种方式施加Rasamsonia的热稳定纤维素分解酶实现的成本降低导致了由于污染而导致处理失败的风险较低。
热预处理后的第一步骤是将经预处理的材料冷却至酶具有最佳活性的温度。在大规模上，这通常通过加入(冷却)水来完成，加入(冷却)水除了降低温度之外，还降低了干物质含量。通过使用热稳定酶，如Rasamsonia的热稳定酶，可以实现成本降低，这是因为(i)由于在水解期间允许更高的温度，因此需要更少的对经预处理的材料的冷却，并且(ii)加入更少的水，这增大了水解和发酵期间的干物质含量，从而提高了乙醇设备的乙醇生产能力(每体积每时间单位产生的量)。通过使用热稳定的酶，如Rasamsonia的热稳定的酶，也可通过使用冷却水来实现成本降低，该冷却水的温度高于使用非热稳定酶的过程中使用的水。
在水解结束时，酶活性看起来很低，这是因为一旦几乎所有的纤维素被转化后就几乎不释放还原糖。然而，存在的酶活性物质的量仅略微降低，假设主要是由于酶被吸附到底物上。通过在水解后施加固液分离，诸如离心、过滤、倾析、沉降，可以回收溶液中60％或更多(例如70％)的酶活性物质，并在下一次水解期间重新用于水解新的经预处理的木质纤维素材料。
此外，在固/液分离后，溶液中的酶可以从含有来自酶促作用的还原糖和其他水解产物的溶液中分离。这种分离可以在有或没有酶首先吸附到任何类型的载体上的情况下，通过包括但不限于超滤和微滤、离心、倾析、沉降的技术来完成。例如，在用0.175ml/g材料干物质酶负载水解经预处理的材料20h后，释放了50％理论最大量的还原糖，并且在进行相同水解72h后，释放了90％理论最大量的还原糖。通过离心和超滤，在渗余物中回收了60-70％的酶活性物质，而滤液含有超过80％的释放还原糖。通过重复使用渗余物，无论是原样使用还是在进一步纯化和/或浓缩之后使用，可以使下一水解步骤期间的酶剂量减少60％至70％。以这种方式通过使用稳定的纤维素分解酶(如Rasamsonia的稳定的纤维素分解酶)实现的成本降低是较低酶剂量的结果。
如上所述的包括水解后的酶再循环的过程可以与发酵后产生发酵产物的微生物的再循环进行组合，以及与在产生发酵产物的微生物和产生水解酶的微生物的繁殖和培养中使用含有还原糖的滤液作为底物(经纯化和/或经浓缩或经稀释的)进行组合。含有还原糖的滤液还可以在由产生发酵产物的微生物产生发酵产物和由产生酶的微生物产生水解酶的过程中用作底物(经纯化和/或经浓缩或经稀释的)。
酶(如来自Rasamsonia的酶)的热稳定性导致在进行水解、发酵和稀釜馏物真空蒸馏后保持纤维素分解活性。在三个连续的处理步骤期间酶的总活性降低。因此，在真空蒸馏后获得的稀釜馏物可以重新用作用于将经预处理的材料转化为例如乙醇的新开始的水解-发酵-蒸馏处理循环的酶的来源。稀釜馏物可以浓缩或(未)稀释形式使用，和/或经纯化并且具有或没有额外的酶补充。
在一种最佳方法中，在新的处理循环中重新使用稀釜馏物之前，将一定量的酶补充到该稀釜馏物中，该补充的酶的量等于在先前处理循环的三个连续处理步骤期间损失的活性物质量。以这种方式，避免了酶的过剂量，并且因此获得了酶的最有效使用。此外，通过在第一处理循环中提供高的酶剂量，以及补充等于在以下处理循环中的三个连续处理步骤期间损失的活性物质的量的酶，可以在每个处理循环中获得最高可能的水解速率，从而导致少于48小时的短水解时间与最有效的酶使用的组合。
通过在水解期间施加混合，增大了有效酶-底物结合成功的机会，这导致了催化活性的更有效使用。除非混合对酶具有负面影响，否则这将导致较低的酶剂量并因此导致降低的成本。稳定的酶(如来自Rasamsonia的热稳定的酶)是稳健的并且能够抵抗(局部地)高剪切和温度的环境，所述环境是在剧烈混合浆料期间的情况。因此，在混合系统中使用它们是有益的，并且将导致剂量减少以及因此成本降低。
优选地，酶促水解中使用的酶组合物是稳定的。如本文所用的与水解方法有关的“稳定的酶组合物”是指该酶组合物在30小时的水解反应时间后保持活性，优选在30小时的水解反应时间后为其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，酶组合物在40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、150小时、200小时、250小时、300小时、350小时、400小时、450小时、500小时的水解反应时间后保持活性。
酶存在于酶促水解的液化步骤和糖化步骤中。这些酶可以相同或不同。此外，如上所述，可以在液化步骤和糖化步骤期间加入额外的酶。所加入的酶可以是已经存在于液化步骤和糖化步骤中的酶。或者，它们可以是不同的酶。此外，在液化步骤期间加入的额外酶可以与在糖化步骤期间加入的额外酶不同或可以与在糖化步骤期间加入的额外酶相同。
如本文所用的木质纤维素材料包括任何木质纤维素和/或半纤维素材料。适用于如本文所述的方法的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质和/或非原始生物质，诸如农业生物质、商业有机物、建筑和拆除碎片、城市固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见形式的生物质包括树木，灌木和草，小麦，麦秆，糖蔗，糖蔗茎秆，糖蔗渣，柳枝稷，芒草，能源甘蔗，玉米，玉米秸秆，玉米皮，玉米穗轴，油菜茎，大豆茎，甜高粱，玉米干酒糟，包含来自籽粒的纤维的玉米粒，来自对诸如玉米、小麦和大麦等谷粒进行研磨(包括湿磨和干磨)的产品和副产品(通常被称为“麸皮或纤维”)，以及市政固体废弃物、废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废弃物、废纸，以及纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝、矮树丛、藤茎、玉米和玉米皮、能源作物、森林、水果、花卉、谷物、草、草本作物、叶子、树皮、针叶、原木、根、树苗、短期轮作的木本作物、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、葡萄藤、甜菜粕、小麦麦麸(wheat midlings)，燕麦壳，以及硬木和软木(不包括具有有害材料的木材)。此外，农业生物质包括从农业过程(包括农业和林业活动)产生的有机废弃物，特别地包括林业木材废料。农业生物质可以是上述单独物质，或它们的任何组合或混合物中的任一者。
在一个实施方式中，在酶促水解之前和/或期间对木质纤维素材料进行预处理。预处理方法是本领域中已知的，并且包括但不限于热、机械、化学改性、生物改性，以及它们的任何组合。通常执行预处理是为了增强木质纤维素材料的酶促水解可及性，和/或水解半纤维素，和/或溶解木质纤维素材料中的半纤维素和/或纤维素和/或木质素。在一个实施方式中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或使用稀酸或稀碱的处理来处理木质纤维素材料。预处理方法的示例包括但不限于蒸汽处理(例如在100-260℃、7-45巴的压力、中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如在蒸汽存在或不存在下，在120-200℃、2-15巴的压力、酸性pH下用0.1–5％H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2-30分钟)、有机溶剂处理(例如在有机溶剂和蒸汽存在下在160-200℃、7-30巴的压力、酸性pH下用1-1.5％H2SO4处理30-60分钟)、石灰处理(例如在水/蒸汽存在下在60-160℃、1-10巴的压力、碱性pH下用0.1-2％NaOH/Ca(OH)2处理60-4800分钟)、ARP处理(例如在150-180℃，在9-17巴的压力存在下，在碱性pH下用5-15％NH3处理10-90分钟)、AFEX处理(例如在60-140℃、8-20巴的压力、碱性pH下用>15％NH3处理5-30分钟)。
可以洗涤木质纤维素材料。在一个实施方式中，可以在预处理后洗涤木质纤维素材料。洗涤步骤可用于去除可用作发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。洗涤步骤可以以技术人员已知的方式进行。在洗涤之后，确实存在其他解毒方法。木质纤维素材料也可以通过这些方法中的任何方法(或任何方法组合)进行解毒，所述方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、萃取、吸附、中和、超施石灰、加入还原剂、加入解毒酶(诸如漆酶或过氧化物酶)、加入能够对水解产物进行解毒的微生物。
在一个实施方式中，对经酶促水解的木质纤维素材料进行洗涤和/或解毒。在一个实施方式中，对在经酶促水解的木质纤维素材料进行固/液分离后获得的固体级分和/或液体级分进行洗涤和/或解毒。在一个实施方式中，使在经酶促水解的木质纤维素材料进行固/液分离后获得的液体级分经历解毒步骤和/或浓缩步骤。解毒步骤可以通过如上所述方法中的任何方法来完成。浓缩步骤可以通过本领域的技术人员熟知的方法来完成，所述方法包括但不限于离心。
酶组合物可以非常有效地水解木质纤维素材料，例如玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗茎秆和/或糖蔗渣，所述木质纤维素材料然后可以进一步转化为产品，诸如乙醇、沼气、丁醇、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化工原料。另外，来自水解后的过程的中间产物，例如作为沼气产生中间体的乳酸，可用作其他材料的构建块。
在一个实施方式中，水解中加入的酶组合物的量(在本文中也称为酶剂量或酶负载)较低。在一个实施方式中，酶组合物的量为10mg蛋白质/g干物质重量或更低、9mg蛋白质/g干物质重量或更低、8mg蛋白质/g干物质重量或更低、7mg蛋白质/g干物质重量或更低、6mg蛋白质/g干物质重量或更低、5mg蛋白质/g干物质或更低、4mg蛋白质/g干物质或更低、3mg蛋白质/g干物质或更低、2mg蛋白质/g干物质或更低，或1mg蛋白质/g干物质或更低(表示为以mg蛋白质/g干物质计的蛋白质)。在一个实施方式中，酶组合物的量为5mg酶/g干物质重量或更低、4mg酶/g干物质重量或更低、3mg酶/g干物质重量或更低、2mg酶/g干物质重量或更低、1mg酶/g干物质重量或更低、0.5mg酶/g干物质重量或更低、0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低、0.3mg酶/g干物质重量或更低、0.25mg酶/g干物质重量或更低、0.20mg酶/g干物质重量或更低、0.18mg酶/g干物质重量或更低、0.15mg酶/g干物质重量或更低，或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为以mg酶/g干物质计的纤维素酶总量)。
在一个实施方式中，在酶促水解中使用的酶组合物的量为4.5mg至15mg蛋白质/克木质纤维素材料中的葡聚糖干物质重量。在一个实施方式中，在酶促水解中使用的酶组合物的量为5mg至12mg蛋白质/克木质纤维素材料中的葡聚糖干物质重量。在一个实施方式中，在酶促水解中使用的酶组合物的量为6mg至10mg蛋白质/克木质纤维素材料中的葡聚糖干物质重量。
酶促水解期间的pH可由技术人员进行选择。在一个实施方式中，水解期间的pH可以为3.0至6.5。所使用的酶可具有至多2个pH单位、至多3个pH单位、至多5个pH单位的宽pH范围。最佳pH可以在2.0至8.0、2.5至7.5、3.0至7.0、3.5至6.5、4.0至5.0、4.0至4.5的pH极限内，或为约4.2。在酶促水解的液化步骤和酶促水解的糖化步骤中使用的pH可以不同或可以相同。在液化步骤和糖化步骤期间使用不同的酶的情况下，所述酶的最佳pH可以不同或可以相同。
在一个实施方式中，进行水解步骤直至木质纤维素材料中70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多的可用糖被释放。
重要的是，可以在水解反应中使用高水平的(木质纤维素材料的)干物质来进行如本文所述的水解方法。在一个实施方式中，酶促水解结束时的干物质含量为5重量％或更高、6重量％或更高、7重量％或更高、8重量％或更高、9重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、16重量％或更高、17重量％或更高、18重量％或更高、19重量％或更高、20重量％或更高、21重量％或更高、22重量％或更高、23重量％或更高、24重量％或更高、25重量％或更高、26重量％或更高、27重量％或更高、28重量％或更高、29重量％或更高、30重量％或更高、31重量％或更高、32重量％或更高、33重量％或更高、34重量％或更高、35重量％或更高、36重量％或更高、37重量％或更高、38重量％或更高，或39重量％或更高。在一个实施方式中，酶促水解结束时的干物质含量为在5重量％-40重量％之间、在6重量％-40重量％之间、在7重量％-40重量％之间、在8重量％-40重量％之间、在9重量％-40重量％之间、在10重量％-40重量％之间、在11重量％-40重量％之间、在12重量％-40重量％之间、在13重量％-40重量％之间、在14重量％-40重量％之间、在15重量％-40重量％之间、在16重量％-40重量％之间、在17重量％-40重量％之间、在18重量％-40重量％之间、在19重量％-40重量％之间、在20重量％-40重量％之间、在21重量％-40重量％之间、在22重量％-40重量％之间、在23重量％-40重量％之间、在24重量％-40重量％之间、在25重量％-40重量％之间、在26重量％-40重量％之间、在27重量％-40重量％之间、在28重量％-40重量％之间、在29重量％-40重量％之间、在30重量％-40重量％之间、在31重量％-40重量％之间、在32重量％-40重量％之间、在33重量％-40重量％之间、在34重量％-40重量％之间、在35重量％-40重量％之间、在36重量％-40重量％之间、在37重量％-40重量％之间、在38重量％-40重量％之间、在39重量％-40重量％之间。
在一个实施方式中，酶促水解的液化步骤结束时的干物质含量为5重量％或更高、6重量％或更高、7重量％或更高、8重量％或更高、9重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、16重量％或更高、17重量％或更高、18重量％或更高、19重量％或更高、20重量％或更高、21重量％或更高、22重量％或更高、23重量％或更高、24重量％或更高、25重量％或更高、26重量％或更高、27重量％或更高、28重量％或更高、29重量％或更高、30重量％或更高、31重量％或更高、32重量％或更高、33重量％或更高、34重量％或更高、35重量％或更高、36重量％或更高、37重量％或更高、38重量％或更高，或39重量％或更高。在一个实施方式中，酶促水解的液化步骤结束时的干物质含量为在5重量％-40重量％之间、6重量％-40重量％之间、在7重量％-40重量％之间、在8重量％-40重量％之间、在9重量％-40重量％之间、在10重量％-40重量％之间、在11重量％-40重量％之间、在12重量％-40重量％之间、在13重量％-40重量％之间、在14重量％-40重量％之间、在15重量％-40重量％之间、在16重量％-40重量％之间、在17重量％-40重量％之间、在18重量％-40重量％之间、在19重量％-40重量％之间、在20重量％-40重量％之间、在21重量％-40重量％之间、在22重量％-40重量％之间、在23重量％-40重量％之间、在24重量％-40重量％之间、在25重量％-40重量％之间、在26重量％-40重量％之间、在27重量％-40重量％之间、在28重量％-40重量％之间、在29重量％-40重量％之间、在30重量％-40重量％之间、在31重量％-40重量％之间、在32重量％-40重量％之间、在33重量％-40重量％之间、在34重量％-40重量％之间、在35重量％-40重量％之间、在36重量％-40重量％之间、在37重量％-40重量％之间、在38重量％-40重量％之间、在39重量％-40重量％之间。
在一个实施方式中，酶促水解的糖化步骤结束时的干物质含量为5重量％或更高、6重量％或更高、7重量％或更高、8重量％或更高、9重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、16重量％或更高、17重量％或更高、18重量％或更高、19重量％或更高、20重量％或更高、21重量％或更高、22重量％或更高、23重量％或更高、24重量％或更高、25重量％或更高、26重量％或更高、27重量％或更高、28重量％或更高、29重量％或更高、30重量％或更高、31重量％或更高、32重量％或更高、33重量％或更高、34重量％或更高、35重量％或更高、36重量％或更高、37重量％或更高、38重量％或更高，或39重量％或更高。在一个实施方式中，酶促水解的糖化步骤结束时的干物质含量为在5重量％-40重量％之间、6重量％-40重量％之间、在7重量％-40重量％之间、在8重量％-40重量％之间、在9重量％-40重量％之间、在10重量％-40重量％之间、在11重量％-40重量％之间、在12重量％-40重量％之间、在13重量％-40重量％之间、在14重量％-40重量％之间、在15重量％-40重量％之间、在16重量％-40重量％之间、在17重量％-40重量％之间、在18重量％-40重量％之间、在19重量％-40重量％之间、在20重量％-40重量％之间、在21重量％-40重量％之间、在22重量％-40重量％之间、在23重量％-40重量％之间、在24重量％-40重量％之间、在25重量％-40重量％之间、在26重量％-40重量％之间、在27重量％-40重量％之间、在28重量％-40重量％之间、在29重量％-40重量％之间、在30重量％-40重量％之间、在31重量％-40重量％之间、在32重量％-40重量％之间、在33重量％-40重量％之间、在34重量％-40重量％之间、在35重量％-40重量％之间、在36重量％-40重量％之间、在37重量％-40重量％之间、在38重量％-40重量％之间、在39重量％-40重量％之间。
如上所述，本公开还涉及一种用于从木质纤维素材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)用本文所述的酶组合物水解木质纤维素材料以获得糖，(b)通过使获得的糖与发酵微生物接触来发酵该获得的糖，以产生发酵产物，以及(c)任选地回收发酵产物。
在一个实施方式中，在一个或多个容器中执行发酵(即步骤b)。在一个实施方式中，通过产生醇的微生物进行发酵以产生醇。在一个实施方式中，通过产生有机酸的微生物进行发酵以产生有机酸。通过产生醇的微生物进行发酵以产生醇可以在执行酶水解的相同容器中进行。或者，通过产生醇的微生物进行发酵以产生醇和通过产生有机酸的微生物进行发酵以产生有机酸可以在一个或多个单独的容器中执行，但也可以在一个或多个相同的容器中进行。
在一个实施方式中，通过酵母进行发酵。在一个实施方式中，产生醇的微生物和/或产生有机酸的微生物是酵母。在一个实施方式中，产生醇的微生物能够发酵至少C5糖和至少C6糖。在一个实施方式中，产生有机酸的微生物能够发酵至少C6糖。在一个实施方式中，产生醇的微生物和产生有机酸的微生物是不同的微生物。在另一个实施方式中，产生醇的微生物和产生有机酸的微生物是相同的微生物，即产生醇的微生物还能够产生有机酸，诸如琥珀酸。
在另一方面，本公开因此包括使用微生物来对包括糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源进行发酵的发酵过程。碳源可以包括任何碳水化合物寡聚物或聚合物，包括L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单位，诸如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。为了从此类碳水化合物中释放木糖或葡萄糖单位，可以将适当的糖酶(诸如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等)加入到发酵培养基中，或者可以由经修饰的宿主细胞来产生适当的糖酶。在后一种情况下，经修饰的宿主细胞可经基因工程化以产生和分泌此类糖酶。使用葡萄糖的寡聚源或聚合源的另一优点是，其使得能够例如通过使用限速量的糖酶来在发酵期间维持游离葡萄糖的低(较低)浓度。这继而将抑制非葡萄糖的糖(诸如木糖)的代谢和运输所需的系统。在一种优选的方法中，经修饰的宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选为木糖)和葡萄糖两者，优选同时发酵两者，在这种情况下优选使用对葡萄糖抑制不敏感的经修饰的宿主细胞以防止二次生长。除了使用L-阿拉伯糖源(任选为木糖)(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基还将包含经修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物(诸如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成是本领域中熟知的。
发酵时间可以比相同条件下的常规发酵中更短，在常规发酵中部分酶促水解仍然必须参与发酵过程中。在一个实施方式中，对于50g/l葡萄糖和来自木质纤维素材料的相应其他糖(例如50g/l木糖、35g/l L-阿拉伯糖和10g/l半乳糖)的糖组合物，发酵时间为100小时或更短、90小时或更短、80小时或更短、70小时或更短，或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，发酵时间可相应地缩短。在一个实施方式中，对于由C6糖制备乙醇，乙醇生产步骤的发酵时间在10小时与50小时之间，并且对于由C5糖制备乙醇，乙醇生产步骤的发酵时间在20小时与100小时之间。在一个实施方式中，琥珀酸生产步骤的发酵时间为20至70小时。
发酵过程可以是好氧或厌氧发酵过程。厌氧发酵过程在本文中定义为在没有氧的情况下运行的发酵过程，或基本上不消耗氧，优选消耗少于5mmol/L/h、2.5mmol/L/h或1mmol/L/h，更优选消耗0mmol/L/h的氧的发酵过程(即氧消耗是不可检测的)，并且其中有机分子用作电子供体和电子受体两者。在没有氧的情况下，无法通过氧化磷酸化来对在糖酵解和生物质形成中产生的NADH进行氧化。为了解决该问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物中的一种衍生物作为电子和氢受体，从而再生NAD+。因此，在一个优选的厌氧发酵过程中，丙酮酸用作电子(和氢受体)并被还原成发酵产物，诸如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选实施方式中，发酵过程是厌氧的。厌氧过程是有利的，因为它比好氧过程更便宜：需要更少的特殊设备。此外，预计厌氧过程比好氧过程产生更高的产物产量。通常好氧条件下的生物质产量高于厌氧条件下。因此，通常在好氧条件下，预期的产物产率低于厌氧条件下。
在另一实施方式中，在氧限制条件下进行发酵过程。更优选地，发酵过程是好氧的并且在氧限制条件下进行。氧限制发酵过程是氧气消耗受到氧从气体到液体的变换的限制的过程。氧限制程度由进入气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/质量传递性质确定。优选地，在氧限制条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h，更优选至少6mmol/L/h，并且甚至更优选至少7mmol/L/h。
在一个实施方式中，醇发酵过程是厌氧的，而有机酸发酵过程是好氧的，但在氧限制条件下进行。
发酵过程优选在对所用微生物最佳的温度下进行。因此，对于大多数酵母或真菌细胞，在低于42℃，优选38℃或更低的温度下执行发酵过程。对于酵母或丝状真菌宿主细胞，优选在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度和高于20℃、22℃或25℃的温度下执行发酵过程。在一个实施方式中，在25℃与35℃之间执行醇发酵步骤和有机酸发酵步骤。
在一个实施方式中，用发酵微生物来进行发酵。在一个实施方式中，用C5发酵微生物来进行C5糖的醇(例如乙醇)发酵。在一个实施方式中，用C5发酵微生物或商用C6发酵微生物来进行C6糖的醇(例如乙醇)发酵。适用于乙醇生产的市售酵母包括但不限于BIOFERMTMAFT和XR(NABC—North American Bioproducts Corporation,GA,USA)、ETHANOLREDTM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann's Yeast,USA)、FERMIOLTM(DSMFood Specialties)、GERT STRANDTM(Gert Strand AB,Sweden)，以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一个实施方式中，在一个或多个繁殖容器中进行产生醇的微生物和/或产生有机酸的微生物的繁殖。在繁殖后，可以将产生醇的微生物和/或产生有机酸的微生物加入到一个或多个发酵容器中。或者，将产生醇的微生物和/或产生有机酸的微生物的繁殖与产生醇的微生物和/或产生有机酸的微生物的发酵相结合，以分别产生醇和/或有机酸。
在一个实施方式中，产生醇的微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，它还能够发酵至少一种C6糖。在一个实施方式中，本公开还描述了一种用于从木质纤维素材料制备乙醇的方法，该方法包括以下步骤：(a)执行如本文所述的从木质纤维素材料制备糖产物的方法，(b)对经酶促水解的木质纤维素材料进行发酵以产生乙醇；以及(c)任选地回收乙醇。可以用能够发酵至少一种C5糖的微生物来进行发酵。
在一个实施方式中，产生有机酸的微生物是能够发酵至少一种C6糖的微生物。在一个实施方式中，本公开描述了一种用于从木质纤维素材料制备琥珀酸的方法，该方法包括以下步骤：(a)执行如本文所述的从木质纤维素材料制备糖产物的方法，(b)对经酶促水解的木质纤维素材料进行发酵以产生琥珀酸；以及(c)任选地回收琥珀酸。可以用能够发酵至少一种C6糖的微生物来进行发酵。
产醇微生物可以是原核生物或真核生物。在该过程中使用的微生物可以是经基因工程化的微生物。合适的产生醇的生物的示例是酵母，例如Saccharomyces，例如Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pastorianus或Saccharomyces uvarum；Hansenula；Issatchenkia，例如Issatchenkia orientalis；Pichia，例如Pichia stipites或Pichia pastoris；Kluyveromyces，例如Kluyveromyces fagilis；Candida，例如Candidapseudotropicalis或Candida acidothermophilum；Pachysolen，例如Pachysolentannophilus；或细菌，例如Lactobacillus，例如Lactobacillus lactis；Geobacillus；Zymomonas，例如Zymomonas mobilis；Clostridium，例如Clostridium phytofermentans；Escherichia，例如E.coli；Klebsiella，例如Klebsiella oxytoca。在一个实施方式中，能够发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选属于Saccharomyces cerevisiae菌种。在如本文所述的方法中使用的酵母，例如Saccharomyces cerevisiae，能够转化己糖(C6)糖和戊糖(C5)糖。在如本文所述的方法中使用的酵母，例如Saccharomyces cerevisiae，能够厌氧地发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除厌氧时使用葡萄糖外，酵母还能够使用L-阿拉伯糖和木糖。在一个实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸，和/或转化为期望的发酵产物，例如转化为乙醇。能够从L-阿拉伯糖产生乙醇的生物，例如Saccharomycescerevisiae菌株，可以通过以下方式来产生：引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮乙醛酸)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因以修饰宿主酵母。可以将此类基因引入宿主细胞中以使宿主细胞能够使用阿拉伯糖。在WO2003/095627中描述了这种方法。来自Lactobacillus plantarum的araA、araB和araD基因可以被使用并且公开于WO2008/041840中。来自Bacillus subtilis的araA基因和来自Escherichia coli的araB和araD基因可以被使用并且公开于EP1499708中。在另一个实施方式中，araA、araB和araD基因可来源于属Clavibacter、Arthrobacter和/或Gramella中的至少一者，特别是Clavibacter michiganensis、Arthrobacter aurescens和/或Gramella forsetii中的一者，如在WO 2009011591中所公开的。在一个实施方式中，酵母还可以包括木糖异构酶基因的一个或多个拷贝和/或木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶的一个或多个拷贝。
酵母可包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的示例是引入一个或多个xylA基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1基因；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许增加通过细胞中戊糖磷酸途径的流量。遗传工程化酵母的示例描述于EP1468093和/或WO2006/009434中。
合适的商用酵母的示例是RN1016，其为购自DSM,the Netherlands的木糖和葡萄糖发酵Saccharomyces cerevisiae菌株。
在一个实施方式中，用于产生乙醇的发酵方法是厌氧的。本文先前已经定义了厌氧。在另一个优选的实施方式中，用于产生乙醇的发酵方法是好氧的。在另一个优选的实施方式中，用于产生乙醇的发酵方法处于氧限制条件下，更优选为好氧的且在氧限制条件下。本文先前已经定义了氧限制条件。
作为上述发酵方法的替代，可以使用至少两种不同的细胞，这意味着该方法是共发酵方法。如上所述的发酵方法的所有优选实施方式也是该共发酵方法的优选实施方式：发酵产物的种类、L-阿拉伯糖来源和木糖来源的种类，发酵条件(好氧或厌氧条件、氧限制条件、进行该过程的温度、乙醇的产率、乙醇的产量)。
产生有机酸的微生物可以是原核生物或真核生物。在该过程中使用的微生物可以是经基因工程化的微生物。合适的产生有机酸的生物体的示例是酵母，例如Saccharomyces，例如Saccharomyces cerevisiae；真菌，例如Aspergillus菌株，诸如Aspergillus niger和Aspergillus fumigatus、Byssochlamys nivea、Lentinus degener、Paecilomyces varioti和Penicillium viniferum；以及细菌，例如Anaerobiospirillumsucciniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannhei succiniciproducersMBEL 55E、Escherichia coli、Propionibacterium菌种、Pectinatussp.、Bacteroides sp.(诸如Bacteroides amylophilus)、Ruminococcus flavefaciens、Prevotellaruminicola、Succcinimonas amylolytica、Succinivibrio dextrinisolvens、Wolinellasuccinogenes，以及Cytophaga succinicans。在一个实施方式中，能够发酵至少一种C6糖的产生有机酸的微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选属于Saccharomyces cerevisiae菌种。如本文所述用于有机酸产生方法中的酵母，例如Saccharomyces cerevisiae，能够转化己糖(C6)糖。在如本文所述的方法中使用的酵母，例如Saccharomyces cerevisiae，能够厌氧地发酵至少一种C6糖。
可以缩短总反应时间(或水解步骤和发酵步骤一起的反应时间)。在一个实施方式中，在90％葡萄糖产量下，总反应时间为300小时或更短、200小时或更短、150小时或更短、140小时或更短、130小时或更短、120小时或更短、110小时或更短、100小时或更短、90小时或更短，80小时或更短，75小时或更短，或约72小时。相应地，可以在较低的葡萄糖产量下达到较低的总反应时间。
可通过如本文所述方法产生的发酵产物可以是来源于发酵的任何物质。它们包括但不限于醇(诸如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(诸如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(诸如丙酮)；氨基酸(诸如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃(诸如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃(诸如环戊烷、环己烷、环庚烷，以及环辛烷)、烯烃(诸如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；以及气体(诸如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(C02)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特殊化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶(诸如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶)。在一个优选实施方式中，在如本文所述的发酵方法中制备有机酸和/或醇。在一个优选实施方式中，在如本文所述的发酵方法中制备琥珀酸和/或乙醇。
对于几种木质纤维素材料发现了本文所述的有益效应，因此认为本文所述的有益效应存在于所有种类的木质纤维素材料的水解中。发现了几种酶的有益效应，因此认为这几种酶存在于所有种类的水解酶组合物中。
实施例
实施例1
具有不同RAXE和RLPMO的酶共混物的制备
根据WO 2014/202622中所述的方法，使用A.niger作为表达宿主来产生单一的乙酰木聚糖酯酶(AXE)(参见WO 2012/000888)和单一的裂解多糖单加氧酶(LPMO)(参见WO2012/000892)。另外，根据WO 2011/000949的实施例3中所述的方法来产生纤维素酶组合物。
使用以下TCA-丙酮沉淀-缩二脲测定来测定乙酰木聚糖酯酶、裂解多糖单加氧酶和纤维素酶组合物的蛋白质浓度。将蛋白质样品用水稀释至浓度在2mg/ml与8mg/ml之间。制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、8mg/ml和10mg/ml)，并将所述稀释液包括作为样品以产生校准曲线。对于每个稀释的蛋白质样品，将270μl转移到含有830μl 12％(w/v)三氯乙酸的丙酮溶液的10ml试管中并充分混合。随后，将试管在冰水上孵育一小时，并在4℃和4000xg下离心30分钟。弃去上清液，并通过将试管倒置在薄纸上并使其在室温下静置30分钟来干燥沉淀。接下来，将3ml BioQuant Biuret试剂混合物加入到试管中的沉淀中，并在混合后加入1ml水后将沉淀溶解。将试管充分混合并在室温下孵育30分钟。在546nm处测量混合物的吸光度，其中使用水样品作为空白测量，并且通过BSA校准线计算蛋白质浓度。
接下来，制备不同的酶共混物。制备的酶共混物及其组成列于表1中。百分比表示在水解测定中投配的总蛋白质的每种组分(纤维素酶组合物、乙酰木聚糖酯酶和/或裂解多糖单加氧酶)的相对量(参见实施例2)。例如，在水解测定中总酶剂量为2.5mg蛋白质/克干物质的情况下，对于共混物0，纤维素酶组合物以100％投配，并且因此为2.5mg/g干物质。在共混物1中，将总蛋白的90％作为纤维素酶组合物投配(即2.25mg/g干物质)，并将总蛋白的10％作为乙酰木聚糖酯酶投配(即0.25mg/g干物质)等等。
在表2中，给出了最终共混物中乙酰木聚糖酯酶、裂解多糖单加氧酶、β-木糖苷酶和木聚糖内切酶的总量。该总量是使用单一乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶(在A.niger中产生)和纤维素组合物中的乙酰木聚糖酯酶、裂解多糖单加氧酶、β-木糖苷酶和木聚糖内切酶内容物的蛋白质浓度计算的值，所述蛋白质浓度是如在WO 2011/000949的实施例14中所述使用蛋白质组学测定的。
实施例2
具有不同REG和RLPMO的酶共混物的水解性能
在水解测定中测定酶共混物的水解活性。将每次水解实验中投配的蛋白质总量保持恒定于2.5mg/g干物质。
为了制备低酸预处理的玉米秸秆，使用中试规模的预处理反应器，在稳态条件下以186℃、6.7分钟的停留时间进行操作。在热处理之前，将玉米秸秆用H2SO4浸渍10分钟，以将pH设定于2.5(在预处理后于室温下测定的)。
在水解测定中，将共混物加入低酸预处理的玉米秸秆中，在pH 4.5、62℃的温度下孵育72小时，并通过共混物从玉米秸秆原料中释放葡萄糖和木糖的能力来比较共混物的水解活性。在该测定中，将木质纤维素材料的浓度设定为15％(w/w)干物质，并且总纤维素酶浓度为2.5mg蛋白质/克干物质。通过用水稀释更浓缩的悬浮液并随后用4M NaOH溶液将所得浆液的pH调节至pH 4.5，来制备15％干物质的悬浮液。在40ml离心瓶(NalgeneOakridge)中以20g的总体积执行水解反应。在62℃的烘箱培养箱(Techne HB-1D杂交烘箱)中进行孵育，同时在设定点3处旋转。在pH 4.5和62℃的温度下孵育72小时后，将水解产物样品离心，并使用配备有反射指数检测器(Agilent 1260Infinity)的高效液相色谱系统(Agilent 1100)分析上清液的葡萄糖和木糖含量。通过使用300×7.8mm Aminex HPX-87P(Bio rad产品目录号125-0098)柱；前置柱：Micro guard Carbo-P(Bio Rad产品目录号125-0119)；流动相为HPLC级水；流速为0.6ml/min并且柱温为85℃来进行进行糖分离。注射体积为10μl。将样品用HPLC级水稀释至最大2.5g/l葡萄糖，并使用0.2μm过滤器(AfridiscLC25mm注射器过滤器PVDF膜)进行过滤。根据保留时间鉴定和定量葡萄糖和木糖，将所述保留时间与范围为0.2g/l；0.4g/l；1.0g/l；2.0g/l的外部葡萄糖标准品(D-(+)-葡萄糖，Sigma产品目录号：G7528)和范围为0.2g/l；0.4g/l；1.0g/l；2.0g/l的木糖标准品(木糖，Sigma))进行比较
随后，使用由不同酶共混物从木质纤维素材料释放的葡萄糖和木糖的浓度来比较共混物的水解性能。将由纤维素酶组合物释放的葡萄糖和木糖用作参考，并使用下式来相对于纤维素酶组合物计算所有其他共混物的性能：
共混物性能＝(由共混物释放的总葡萄糖(g/l)+木糖(g/l))/(由纤维素酶组合物释放的总葡萄糖(g/l)+木糖(g/l))*100％
对于纤维素酶组合物(共混物0)以及具有单一乙酰木聚糖酯酶加入和/或单一裂解多糖单加氧酶加入的酶共混物，计算三种比率。
乙酰木聚糖酯酶的比率(RAXE)，被定义为混合物中乙酰木聚糖酯酶的总重量除以混合物中乙酰木聚糖酯酶的总重量和裂解多糖单加氧酶的总重量，可用下式计算：RAXE＝总AXE/(总AXE+总LPMO)。
裂解多糖单加氧酶的比率(RLPMO)，被定义为混合物中的裂解多糖单加氧酶的总重量除以混合物中裂解多糖单加氧酶的总重量和乙酰木聚糖酯酶的总重量，可用下式计算：RLPMO＝总LPMO/(总AXE+总LPMO)。
半纤维素酶的比率(RHC)，被定义为酶组合物中β-木糖苷酶和木聚糖内切酶的总重量除以酶组合物中β-木糖苷酶、木聚糖内切酶和裂解多糖单加氧酶的总重量，可用下式计算：RHC＝(总BX+总EX)/(总BX+总EX+总LPMO)。
各种酶共混物的水解性能示于表3中。数据清楚地显示，具有与WO 2011/000949所述的酶共混物(WO 2011/000949中的共混物的RAXE为0.47-0.74并且RLPMO为0.26-0.53)类似的RAXE和RLPMO的共混物具有比本公开的酶共混物更低的水解性能，本公开的酶共混物的RAXE为0.04-0.29并且RLPMO为0.71-0.96。
所具有的RAXE在0.04-0.29的范围之外、RLPMO在0.71-0.96的范围之外并且RHC在0.15-0.65的范围之外的测试酶共混物，即酶共混物0、1和6，具有的水解性能为100％或更低，而具有的RAXE为0.04-0.29、RLPMO为0.71-0.96并且RHC为0.15-0.65的酶共混物，即酶共混物2、3、4和5具有的水解性能高于100％。因此，此类共混物具有改进的性能。
表1：纤维素酶共混物.
*所示百分比是纤维素酶组合物、AXE和/或LPMO相对于最终共混物中总蛋白质的重量百分比。
表2：纤维素酶共混物.
表3.酶共混物的水解性能，以及REG、RLPMO和RHC的值。
共混物 R<sub>AXE</sub> R<sub>LPMO</sub> R<sub>HC</sub> 水解性能
1 0.7 0.3 0.7 96.5％
0 0.3 0.7 0.7 100％
2 0.18 0.82 0.55 101.6％
3 0.13 0.87 0.45 102.2％
4 0.07 0.93 0.31 105.6％
5 0.05 0.95 0.22 103.2％
6 0.02 0.98 0.08 97.1％

Claims (15)

1.一种酶组合物，其包含乙酰木聚糖酯酶、裂解多糖单加氧酶、半纤维素酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II和内切葡聚糖酶，其中所述乙酰木聚糖酯酶以由RAXE定义的相对于乙酰木聚糖酯酶和裂解多糖单加氧酶的分数存在，其中所述裂解多糖单加氧酶以由RLPMO定义的相对于裂解多糖单加氧酶和乙酰木聚糖酯酶的分数存在，并且其中所述半纤维素酶以由RHC定义的相对于半纤维素酶和裂解多糖单加氧酶的分数存在，其中RAXE为0.04至0.29，RLPMO为0.71至0.96并且RHC为0.15至0.65。
2.根据权利要求1所述的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶包括CE1乙酰木聚糖酯酶。
3.根据权利要求1或2所述的酶组合物，其中所述裂解多糖单加氧酶包括AA9裂解多糖单加氧酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的酶组合物，其中所述半纤维素酶包括β-木糖苷酶和/或木聚糖内切酶。
5.根据权利要求4所述的酶组合物，其中所述β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。
6.根据权利要求4或5所述的酶组合物，其中所述木聚糖内切酶包括GH10木聚糖内切酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的酶组合物，其中所述酶组合物包含的乙酰木聚糖酯酶的量为所述酶组合物中的蛋白质总量的1.0％至2.5％(w/w)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的酶组合物，其中所述酶组合物包含的裂解多糖单加氧酶的量为所述酶组合物中的蛋白质总量的10％至30％(w/w)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的酶组合物，所述酶组合物为完整发酵液。
10.一种用于从木质纤维素材料制备糖的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用根据权利要求1至9中任一项所述的酶组合物来水解所述木质纤维素材料以获得所述糖，以及
b)任选地回收所述糖。
11.一种用于从木质纤维素材料产生发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)用根据权利要求1至9中任一项所述的酶组合物来水解所述木质纤维素材料以获得糖，
b)通过以下方式来发酵获得的所述糖：使获得的所述糖与发酵微生物接触以产生所述发酵产物，以及
c)任选地回收所述发酵产物。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述酶组合物的用量为4.5mg至15mg蛋白质/克所述木质纤维素材料中的葡聚糖干物质重量。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中在酶促水解之前使所述木质纤维素材料经历预处理步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述预处理为蒸汽处理、稀酸处理、有机溶剂处理、石灰处理、ARP处理或AFEX处理。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇并且所述发酵微生物是能够发酵至少一种C5糖的产醇微生物。
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