CN104039958A - 纤维素分解酶组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)的酶组合物，和所述纤维素分解酶组合物用于水解乙酰化纤维素材料的用途。最终，本发明亦涉及使用本发明的纤维素分解酶组合物从乙酰化纤维素材料产生发酵产物的工艺。
Description
对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
该发明是在由能源部授予的批准号(Grant No):DE-EE0002870下以政府支持完成的。政府在该发明中具有一定权利。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及纤维素分解酶组合物；使用此种纤维素分解组合物水解乙酰化纤维素材料的方法；和使用本发明的纤维素分解酶组合物产生发酵产物的工艺。
将含纤维素原料(cellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料是理想的，以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。
纤维素材料的酶促水解的速率和程度取决于多种结构特征如木质素含量，乙酰含量，和结晶度。在天然植物中，半纤维素材料如木糖具有部分的天然乙酰化程度，而纤维素材料(纤维素)则不具备。然而，当对纤维素材料进行用例如酸如乙酸的原材料，则发生乙酰化。此种纤维素材料的乙酰化影响酶促可消化性。
WO2005/047499公开了烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶及其基因。
WO2006/078256公开了烟曲霉GH10木聚糖酶。
WO2008/151079公开了用于降解纤维素材料的组合物。
WO2009/042846公开了来源于土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
WO2011/041397公开了具有纤维素分解增强活性的青霉属菌种(Penicillium sp.)GH61多肽。
WO2011/057140公开了烟曲霉纤维二糖水解酶I；烟曲霉纤维二糖水解酶II；和烟曲霉β-木糖苷酶。
存在对于可更有效地水解乙酰化纤维素材料的纤维素分解酶组合物的需求。
发明内容
本发明涉及包含纤维素分解活性的酶组合物；其用于水解乙酰化纤维素材料的用途；和使用本发明的纤维素分解酶组合物产生发酵产物的工艺。
在第一个方面，本发明涉及包含纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)的酶组合物。
在第二个方面，本发明涉及水解乙酰化纤维素材料的方法，其包括对所述乙酰化纤维素材料施以本发明的酶组合物，所述酶组合物包含纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
在一个实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶来源于梭孢壳属(Thielavia)，如土生梭孢霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
在第三个方面，本发明涉及从乙酰化纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括：
(a)通过对所述乙酰化纤维素材料施以本发明的酶组合物或根据本发明的水解方法水解所述材料；
(b)使用发酵生物进行发酵；和
(c)任选地回收所述发酵产物。
附图说明
图1显示在11日水解之后的葡萄糖产量(yield)(％)。
图2显示在11日水解之后的木糖产量(％)。
图3显示来自经预处理的乙酰化玉米秸秆浆(corn stover pulp)(5％固形物，pH5.2，50℃，6mg蛋白/g纤维素)的结果。
定义
乙酰化纤维素材料：术语“乙酰化纤维素材料“指与天然纤维素材料相比具有更高程度的乙酰化的纤维素材料。在一个实施方案中，靶纤维素底物的乙酰化％可高至30％(每糖单元平均乙酰基数)。在一个实施方案中，所述乙酰化纤维素材料为0.1-30％，如0.5-20％，优选1-10％，如约5-10％，如约8％乙酰化。乙酰化可根据Technical Report NREL/TP-510-42618(2011年7月重新修订)中所述的NREL步骤和如“材料和方法”部分中所述来确定。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。纤维素材料的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719；Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能量作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹材。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％TWEENTM20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucoside glucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomiumthermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemicalproperties,J.Basic Microbiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH4.8，在含有0.01％20(聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚阴离子。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases,Trendsin Biotechnology15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulaseimprovement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Unionof Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulaseactivities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat和Bairoch,1996,Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom和Shoham,2003,Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，和pH，例如5.0或5.5进行测量。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃和合适的pH，例如5.0或5.5历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个方面，使用在总蛋白重量的2-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
发明详述
本发明涉及纤维素分解酶组合物；其用于水解乙酰化纤维素材料的用途；和使用本发明的纤维素分解酶组合物产生发酵产物的工艺。
本发明发现包含纤维素分解制备物的酶组合物增强乙酰化纤维素材料的转化。更具体而言，本发明人令人意想不到地发现当在纤维素分解制备物中包含乙酰木聚糖酯酶(AXE)，特别是来源于土生梭孢霉的乙酰木聚糖酯酶时，经预处理的乙酰化纤维素材料的转化得到增强。例如，实施例1显示乙酰木聚糖酯酶(AXE)当用于经预处理的乙酰化玉米秸秆浆的纤维素分解水解时，与用纤维素分解组合物但不用乙酰木聚糖酯酶(AXE)时相比，增强了葡萄糖和木糖产量。
本发明的酶组合物
在第一个方面，本发明涉及酶组合物，其包含纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物来源于木霉属(Trichoderma)的菌株，如里氏木霉(Humicola insolens)的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株，和/或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，如Chrysosporium lucknowense的菌株。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解制备物来源于里氏木霉的菌株。
纤维素分解制备物
所述纤维素分解制备物可包含一种或多种下述多肽，如酶：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，CBHI，CBHII，或其两种、三种、四种、五种、或六种的混合物。
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
在另一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，和木聚糖酶。
在另一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶和β-木糖苷酶。
在另一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，和CBHI。
在另一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII。
其它酶，如内切葡聚糖酶，亦可包含于所述纤维素分解制备物。
β-葡糖苷酶
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物可包含一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施方案中，所述β-葡糖苷酶可为来源于曲霉属(Aspergillus)，如米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株的酶，如公开于WO2002/095014的酶，或公开于WO2008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来源于烟曲霉的酶，如公开于WO2005/047499的酶，或烟曲霉β-葡糖苷酶变体。在一个实施方案中，在水解过程中亦可存在或添加β-葡糖苷酶。所述β-葡糖苷酶可为烟曲霉β-葡糖苷酶(例如WO2005/047499的SEQ ID NO:2)或其公开于WO2012/044915(通过提述并入本文)的变体，如具有下述取代的变体：F100D，S283G，N456E，F512Y。
在另一个实施方案中，所述β-葡糖苷酶来源于青霉属(Penicillium)的菌株，如公开于WO2007/019442的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物可包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61。在一个实施方案中，所述酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如来源于嗜热子囊菌属(Thermoascus)，如桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2005/074656的多肽；或来源于梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8公开于2005/074647的多肽；或来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2010/138754的多肽；或来源于源自青霉属的菌株，如埃默森青霉(Penicillium emersonii)的菌株的多肽，如公开于WO2011/041397的多肽。
木聚糖酶
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物可包含一种或多种木聚糖酶。在一个方面，所述纤维素分解制备物包含木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶，如来源于曲霉属的菌株，如来自烟曲霉的菌株的酶，如作为Xyl III公开于WO2006/078256的酶，或来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的酶，如作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785的酶(Xyl II)。
β木糖苷酶
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物可包含一种或多种β-木糖苷酶。在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含β-木糖苷酶，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶，如公开于共同待决的美国临时申请号61/526,833或PCT/US12/052163(实施例16和17)的酶，或来源于木霉属菌株，如里氏木霉的菌株的酶，如WO2011/057140中的SEQ ID NO:58的成熟多肽。
CBH I
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物可包含一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含纤维二糖水解酶I(CBHI)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶，如公开于WO2011/057140中的SEQ ID NO:2的Cel7A CBHI，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的酶。
CBH II
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物可包含一种或多种CBH II(纤维二糖水解酶II)。在一个实施方案中，纤维二糖水解酶II(CBHII)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶；或来源于木霉属，如里氏木霉的菌株，或来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
乙酰木聚糖酯酶(AXE)
除了纤维素分解制备物之外，所述酶组合物还包含乙酰木聚糖酯酶(AXE)。在一个实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
在另一个实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2010/108918的酶，或与WO2010/108918中的SEQ ID NO:2具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
在另一个实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如棘孢曲霉CBS101.43，如作为SEQ ID NO:5公开于WO95/02689的酶，或与WO95/02689中的SEQ ID NO:5具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
在一个实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/073709或作为本文中的SEQ ID NO:3的酶，或与WO2009/073709的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:3具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
在一个实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2010/108918或作为本文中的SEQ ID NO:2的酶，或与WO2010/108918的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:2具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
在一个优选实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶来源于梭孢壳属的菌株，更优选土生梭孢霉的菌株，甚至更优选作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中SEQ ID NO:1的酶。
纤维素分解制备物
如上所述，所述纤维素分解制备物可包含多种不同的多肽，如酶。
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中的Xyl II)。
在另一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499中的SEQ ID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)。
在另一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499中的SEQ ID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)为来源于土生梭孢霉、作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
在另一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含公开于WO2011/041397的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61多肽，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499中的SEQ ID NO:2)和烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256中的Xyl III)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)为来源于土生梭孢霉、作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
本发明的酶组合物可为任何适于使用的形式，例如，去除或未去除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解物，半纯化或纯化的酶组合物，或宿主细胞，例如木霉属宿主细胞，作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶组合物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶之间的比例
根据本发明，将乙酰木聚糖酯酶和纤维素分解制备物以使得乙酰化木素纤维素材料的水解得到改善的比例混合。
乙酰木聚糖酯酶的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解和/或半纤维素分解酶的混合物、乙酰化纤维素材料、乙酰化纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，用于同步糖化和发酵的酵母)。
在一个方面，添加至乙酰化纤维素材料的纤维素分解制备物的有效量是约0.01至约50.0mg，例如约1至约25mg，如约2至约10mg，如约4至约8mg蛋白每g/DS的纤维素材料。
在一个实施方案中，所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)以例如约0.01至约10mg，如0.05至约5mg，如0.1至约4mg酶蛋白每DS的纤维素材料的量使用。
在一个实施方案中，纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之间的比例是500:1至1:1，如50:1至2:1，如约4:1的范围。
在一个优选实施方案中，所述纤维素分解制备物来源于里氏木霉，且所述乙酰木聚糖酯酶来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作为SEQID NO:2公开于2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶，两者比例为500:1至1:1，如50:1至2:1，如约4:1。
本发明的水解方法
纤维素材料天然并非乙酰化的。然而，当对纤维素材料进行例如用酸，如乙酸的原材料，则发生乙酰化。此种乙酰化影响在水解过程中纤维素材料的酶促可消化性。在水解(亦称作糖化)过程中，将乙酰化纤维素材料水解以将纤维素和/或半纤维素降解为可发酵的糖，如葡萄糖，纤维二糖，木糖，木酮糖，阿拉伯糖，甘露糖，半乳糖，和/或可溶性寡糖。根据本发明，水解可使用本发明的酶组合物酶促进行。
在第二个方面，本发明涉及水解乙酰化纤维素材料的方法，其包括对乙酰化纤维素材料施以纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。在一个实施方案中，所述乙酰化纤维素材料是经预处理的纤维素材料。
乙酰化纤维素材料
乙酰化纤维素材料指与天然纤维素材料相比具有较高乙酰化程度的纤维素材料。所述乙酰化纤维素材料可为包含纤维素材料(如上所定义)的植物材料。通常乙酰化纤维素材料亦包含半纤维素材料，如木聚糖酶、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖与多种取代基形成复杂支化的结构。
在一个实施方案中，所述乙酰化纤维素材料是植物材料碎片(chip)，植物茎段(stem segment)和/或整个植物茎。在一个实施方案中，所述纤维素材料选自下组：芦竹、甘蔗渣、竹、玉米穗轴、玉米纤维、玉米秸秆、芒属(miscanthus)、橙皮、稻秆、柳枝稷、麦秆。在一个优选实施方案中，纤维素材料的来源是玉米秸秆、玉米穗轴和/或麦秆。在一个优选实施方案中，所述乙酰化纤维素材料是乙酰化玉米秸秆浆。
预处理。纤维素材料可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调节/调理(conditioning)。
可已对所述纤维素材料施以常规的预处理。常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、酸预处理如稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体和γ辐射预处理。优选酸预处理。
优选在水解之前预处理纤维素材料。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。
术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如酸预处理如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。优选包括酸预处理的预处理。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523；Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,见上文；Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙，在85-150℃的温度进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966；Mosier等,2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151；Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17；Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理优选以1-40％干物质，例如2-30％干物质，或5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
湿法氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-150℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物受切割。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素和木质素。
在一个方面，化学预处理优选作为酸预处理如稀酸处理，如连续稀酸处理进行。
酸处理优选使用乙酸进行，但也可以使用其它酸，如硫酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。
弱酸处理在优选1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至10wt％酸，例如0.05至5wt％酸或0.1至2wt％酸的范围内。将酸与纤维素材料接触，并在例如优选140-200℃，例如165-190℃范围内的温度保持1至60分钟的时间。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，例如20-70wt％或30-60wt％，如约40wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可例如与下述结合：汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、酸预处理如稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至400psi，例如约150至约250psi的范围的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，例如约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、使用蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的SundsHydrolyzer中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。
术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosic biomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for FuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS SymposiumSeries566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewableresources,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
优选的预处理包括化学预处理，物理预处理，或化学预处理和物理预处理。在一个实施方案中，对纤维素材料施以热机械制浆(thermomechanicallypulping)。在一个实施方案中，所述乙酰化纤维素材料已经热机械制浆。
在一个实施方案中，所述乙酰化纤维素材料通过预处理，包括酸预处理制备。
在一个实施方案中，所述乙酰化纤维素材料已通过在高温、高压和/或酸预处理下预处理纤维素材料来制备。
在一个实施方案中，所述酸预处理使用乙酸或其它酸实施。
在一个实施方案中，所述乙酰化纤维素材料已通过使用有机溶剂预处理如Acetosolv和Acetocell工艺预处理纤维素材料来制备。
在一个实施方案中，在预处理之后，将含有糖、酸和溶解的木质素的可溶性级分从乙酰化纤维素材料移除。
在一个实施方案中，乙酰化纤维素材料的水解在20至70℃，如30至60℃，优选45至55℃的温度，在4-6，如4.5-5.5范围的pH进行。在一个实施方案中，乙酰化纤维素材料以1-20(w/w)％的TS，如2-10(w/w)％TS(总固形物)，如约5(w/w)％TS存在。
在一个实施方案中，水解进行1至20日，优选5至15日。
根据本发明，水解使用本发明的酶组合物进行，所述组合物包含纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)，如定义于上文中的“本发明的酶组合物”部分。
水解在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料批式或连续的过程进行，其中将乙酰化纤维素材料逐渐补入，例如，含酶组合物的水解溶液中。
水解(即糖化)通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。温度优选约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至55℃的范围。pH优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约pH5.0至约pH5.5的范围。干燥固体含量优选约5至约50wt％，例如约10至约40wt％，或约20至约30wt％。
从乙酰化纤维素材料产生发酵产物的工艺
在第三个方面，本发明涉及使用本发明的酶组合物的工艺。
在一个优选实施方案中，本发明涉及从乙酰化纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括：
(a)通过对所述乙酰化纤维素材料施以本发明的酶组合物或根据本发明的水解方法水解所述材料；
(b)使用发酵生物进行发酵；和
(c)任选地回收所述发酵产物。
根据本发明的工艺，水解(即糖化)和发酵可分别或同时进行。在一个实施方案中，本发明的工艺可作为分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，或直接微生物转化(DMC)(有时也称为合并的生物加工(consolidated bioprocessing，CBP))进行。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，乙酰化纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan J.和Himmel M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research anddevelopment activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独的水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶法水解(糖化)，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶。
所述乙酰化纤维素材料可为如“乙酰化纤维素材料”部分描述的材料。水解依照“本发明的水解方法”部分进行。
发酵
可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的乙酰化纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
发酵微生物
术语“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。
以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和阿拉伯糖的生物体通过本领域已知方法可经遗传修饰而发酵戊糖。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Philippidis,1996,见上文)。
其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产生的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌的菌株。
在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridiumphytofermentans在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMTM AFT和XR(NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA)，ETHANOLREDTM酵母(Red Star/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann’s Yeast,Burns PhilpFood Inc.,USA)，FERMIOLTM(DSM Specialties)，GERT STRANDTM(GertStrand AB,Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho,1993,Cloning and improving theexpression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等,1998,Genetically engineeredSaccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy,1993,Xylosefermentation by Saccharomyces cerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiaestrains overexpressing the TKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphatepathway enzymes transketolase and transaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomycescerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle,FEMSYeast Research4:655-664；Beall等,1991,Parametric studies of ethanolproduction from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998,Metabolic engineering of bacteria forethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等,1995,Metabolicengineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonasmobilis,Science267:240-243；Deanda等,1996,Development of anarabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO2003/062430,xyloseisomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensi。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，例如约pH4-5、6或7。
在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，约32℃至约50℃，或约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可见于例如“The AlcoholTextbook”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编,Nottingham UniversityPress,United Kingdom1999)，其通过提述并入本文。
对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏经发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的工艺获得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，饮用乙醇，即可饮用的中性含酒精饮料，或工业乙醇。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process,Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物
根据本发明，术语“发酵产物”可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个(例如几个)羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丙三醇(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,和Jonas,R.,2002,The biotechnological production of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam和Singh,1995,Processes for fermentativeproduction of xylitol–a sugar substitute,Process Biochemistry30(2):117-124；Ezeji等,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping,World Journal ofMicrobiology and Biotechnology19(6):595-603。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard和Margaritis,2004,Empiricalmodeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and othermicrobial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka,Miya,和Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,WaterScience and Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan,1997,Anaerobicdigestion of biomass for methane production:A review,Biomass and Bioenergy,13(1-2),83-114。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个(例如几个)酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek,2003,见上文。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen和Lee,1997,Membrane-mediated extractivefermentation for lactic acid production from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
回收
在发酵之后，任选地使用本领域已知的任何方法回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的材料分离并纯化醇，如乙醇。可以获得纯度高达约96vol.％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
本发明通过下述段落进一步定义：
段1.一种酶组合物，其包含纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
段2.段1的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物来源于里氏木霉，特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
段3.段的酶组合物1或2，其中所述纤维素分解制备物包含β-葡糖苷酶，优选来源于曲霉属(Aspergillus)，如米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株的酶，如公开于WO2002/095014的酶，或公开于WO2008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来源于烟曲霉的酶，如公开于WO2005/047499的酶，或公开于共同待决的美国临时申请号61/388,997或WO2012/044915、具有下述取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D，S283G，N456E，F512Y；或来源于青霉属(Penicillium)的菌株，如公开于WO2007/019442的巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
段4.段1-3任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如来源于嗜热子囊菌属(Thermoascus)，如桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2005/074656的多肽；或来源于梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8描述于2005/074647的多肽；或来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2公开于WO2010/138754的多肽；或来源于源自青霉属的菌株，如埃默森青霉(Penicillium emersonii)的菌株的多肽，如公开于WO2011/041397的多肽。
段5.段1-4任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶，如来源于曲霉属的菌株，如来自烟曲霉的菌株的酶，如作为Xyl III公开于WO2006/078256的酶，或来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的酶，如作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785的酶(Xyl II)。
段6.段1-5任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含β-木糖苷酶，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶，如公开于共同待决的美国临时申请号61/526,833或PCT/US12/052163(实施例16和17)的酶，或来源于木霉属菌株，如里氏木霉的菌株的酶，如WO2011/057140中的SEQ IDNO:58的成熟多肽。
段7.段1-6任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶，如公开于WO2011/057140中的SEQ ID NO:2的Cel7A CBHI，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的酶。
段8.段1-7任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶；或来源于木霉属，如里氏木霉的菌株，或来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
段9.段1-8任一项的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段10.段1-8任一项的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2010/108918的酶，或与WO2010/108918中的SEQ ID NO:2具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段11.段1-8任一项的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如棘孢曲霉CBS101.43，如作为SEQ IDNO:5公开于WO1995/002689的酶，或与WO1995/002689中的SEQ ID NO:5具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段12.段1-8任一项的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/073709或作为本文中的SEQ ID NO:3的酶，或与WO2009/073709中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:3具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段13.段1-12任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
段14.段1-12任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，和木聚糖酶。
段15.段1-12任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶和β-木糖苷酶。
段16.段1-12任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，和CBHI。
段17.段1-12任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII。
段18.段1-17任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中的Xyl II)。
段19.段1-17任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)。
段20.段1-17任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)为来源于土生梭孢霉、作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段21.段1-17任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含公开于WO2011/041397的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61多肽，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)和烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256中的Xyl III)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)为来源于土生梭孢霉、作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段22.段1-21任一项的酶组合物，其中纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之间的比例是500:1至100:1，如50:1至2:1，如约4:1的范围。
段23.一种水解乙酰化纤维素材料的方法，其包括对乙酰化纤维素材料施以纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
段24.段23的方法，其中所述乙酰化纤维素材料是经预处理的纤维素材料。
段25.段23或24的方法，其中所述乙酰化纤维素材料是植物材料碎片(chip)，植物茎段(stem segment)和/或整个植物茎。
段26.段25的方法，其中所述纤维素材料选自下组：芦竹、甘蔗渣、竹、玉米穗轴、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、橙皮、稻秆、柳枝稷、麦秆。
段27.段26的方法，其中纤维素材料的来源是玉米秸秆、玉米穗轴和/或麦秆。
段28.段24-27任一项的方法，其中对纤维素材料的预处理是通过化学预处理，物理预处理，或化学预处理和物理预处理的预处理。
段29.段24-28任一项的方法，其中所述纤维素材料是经热机械制浆的植物材料。
段30.段24-29任一项的方法，其中所述乙酰化纤维素材料是经热机械制浆的植物材料，如乙酰化的玉米秸秆浆。
段31.段24-30任一项的方法，其中预处理所述纤维素材料包括用酸的预处理。
段32.段24-31任一项的方法，其中所述乙酰化纤维素材料已通过在高温、高压下用酸预处理纤维素材料来制备。
段33.段31或32的方法，其中所述酸预处理使用乙酸实施。
段34.段24-33任一项的方法，其中所述乙酰化纤维素材料已通过使用有机溶剂预处理如Acetosolv和Acetocell工艺预处理纤维素材料来制备。
段35.段24-34任一项的方法，其中在预处理之后，将含有糖、酸和溶解的木质素的可溶性级分从乙酰化纤维素材料移除。
段36.段24-35任一项的方法，其中水解在20至70℃，如30至60℃，优选45至55℃的温度，在4-6，如4.5-5.5范围的pH进行。
段37.段24-36任一项的方法，其中所述乙酰化纤维素材料以1-20(w/w)％的TS，如2-10(w/w)％TS(总固形物)，如约5(w/w)％TS存在。
段38.段24-37任一项的方法，其中水解进行1至20日，优选5至15日。
段39.段24-38任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物来源于里氏木霉，特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
段40.段24-39任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含β-葡糖苷酶，优选来源于曲霉属(Aspergillus)，如米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株的酶，如公开于WO2002/095014的酶，或公开于WO2008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来源于烟曲霉的酶，如公开于WO2005/047499的酶，或公开于共同待决的美国临时申请号61/388,997或WO2012/044915、具有下述取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D，S283G，N456E，F512Y；或来源于青霉属(Penicillium)的菌株，如公开于WO2007/019442的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
段41.段24-40任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如来源于嗜热子囊菌属(Thermoascus)，如桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2005/074656的多肽；或来源于梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8描述于2005/074647的多肽；或来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的多肽，如作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2公开于WO2010/138754的多肽；或来源于源自青霉属的菌株，如埃默森青霉的菌株的多肽，如公开于WO2011/041397的多肽。
段42.段24-41任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含木聚糖酶，优选GH10木聚糖酶，如来源于曲霉属的菌株，如来自烟曲霉的菌株的酶，如作为Xyl III公开于WO2006/078256的酶，或来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的酶，如作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785的酶(Xyl II)。
段43.段24-41任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含β-木糖苷酶，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶，如公开于共同待决的美国临时申请号61/526,833或PCT/US12/052163的酶，或来源于木霉属菌株，如里氏木霉的菌株的酶，如WO2011/057140中的SEQ ID NO:58的成熟多肽。
段44.段24-42任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与WO2009/042846中的SEQID NO:2具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段45.段24-43任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2010/108918或本文中的SEQ ID NO:2的酶，或与WO2010/108918中的SEQID NO:2或本文中的SEQ ID NO:2具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段46.段24-43任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如棘孢曲霉CBS101.43，如作为SEQ ID NO:5公开于WO1995/002689的酶，或与WO1995/002689中的SEQ ID NO:5具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段47.段24-43任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/073709或作为本文中的SEQ ID NO:3的酶，或与WO2009/073709中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:3具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段48.段24-47任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含纤维二糖水解酶I(CBHI)，如来源于曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的酶，或来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株的酶。
段49.段24-48任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含纤维二糖水解酶II(CBHII)，如来源于烟曲霉的酶；或来源于木霉属，如里氏木霉的菌株，或来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
段50.段24-49任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡聚糖酶。
段51.段24-49任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡聚糖酶，和木聚糖酶。
段52.段24-49任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡聚糖酶，木聚糖酶和β-木糖苷酶。
段53.段24-49任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡聚糖酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，和CBHI。
段54.段24-49任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡聚糖酶，木聚糖酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII。
段55.段24-54任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO2008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中的Xyl II)。
段56.段24-55任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)。
段57.段24-56任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61A多肽(WO WO2011/04139中的SEQ ID NO:2)，具有下述取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体(公开于美国临时申请号No.61/388,997或WO2012/044915)：F100D，S283G，N456E，F512Y，和烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256中公开的Xyl III)和来源于烟曲霉的菌株的β-木糖苷酶。
段58.段24-57任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物以约0.01至约50.0mg，例如约1至约25mg，如约2至10mg，如约4至约8mg蛋白每g/DS的纤维素材料的量添加。
段59.段24-58任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)以约0.01至约10mg，如0.05至约5mg，如0.1至约4mg酶蛋白每g/DS的纤维素材料的量使用。
段60.段24-59任一项的方法，其中纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之间的比例是500:1至1:1，如50:1至2:1，如约4:1的范围。
段61.段24-60任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)，且进一步包含来源于土生梭孢霉、作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的乙酰木聚糖酯酶(AXE)，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段62.段24-61任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含公开于WO2011/041397的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61多肽，具有下述取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体(公开于美国临时申请号No.61/388,997或WO2012/044915)：F100D，S283G，N456E，F512Y，和烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256中公开的Xyl III)，且进一步包含来源于土生梭孢霉、作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的乙酰木聚糖酯酶(AXE)，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
段63.一种从乙酰化纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括：
(a)通过对所述乙酰化纤维素材料施以段1-23任一项的酶组合物或根据段24-62任一项的水解方法水解所述材料；
(b)使用发酵生物进行发酵；和
(c)任选地回收所述发酵产物。
段64.段63的工艺，其中所述发酵产物是乙醇。
段65.段63或64的工艺，其中所述发酵生物是酵母，如酵母属的菌株，如酿酒酵母的菌株。
段66.段63-65任一项的工艺，其中所述纤维素材料是玉米秸秆浆。
材料和方法
酶：
-里氏木霉纤维素分解制备物
-作为SEQ ID NO:2描述于WO2005/074656的具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽。
-公开于WO2005/047499的烟曲霉β-葡糖苷酶。
-公开于WO2012/044915的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，具有下述取代：F100D，S283G，N456E，F512Y。
-作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785的棘孢曲霉木聚糖酶(Xyl II)。
-作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846或本文中的SEQ ID NO:1的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶。(P6GE)
-作为SEQ ID NO:2公开于WO2010/108918或本文中SEQ ID NO:2的棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶。(NP002824)
-公开于WO2011/057140中的SEQ ID NO:2的烟曲霉Cel7A CBH1。
-可从Novozymes A/S获得的烟曲霉CBH2。
-在共同待决的美国临时申请号61/526833或PCT/US12/052163(实施例16和17)中公开的烟曲霉β-木糖苷酶。
乙酰化纤维素材料：
含有约75％纤维素和11％木聚糖的乙酰化玉米秸秆浆从Archer DanielsMidland(ADM)，USA获得。
方法
纤维素材料中的乙酰基的确定
糖和乙酸基团可根据NREL方法测量(参见A.Sluiter等，“Determination ofStructural Carbohydrates和Lignin in Biomass，pp15-18-NREL/TP-510-42618，2011年7月重新修订)和nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf。
实施例
实施例1
使用AXE改善的纤维素和木聚糖转化
使用含有约75％纤维素和11％木聚糖的乙酰化玉米秸秆浆。基于总糖的乙酰化程度测量为约8％(每12.5糖单元1个乙酰基团)。玉米秸秆浆通过在高温和高压使用乙酸预处理玉米秸秆来制备。将所得的浆料通过固/液分离器(压力过滤)以去除含有糖、乙酸和溶解的木质素的可溶性级分。将不可溶的底物(乙酰化浆)用自来水洗涤至pH高于5.0，并将其在24孔(5mL)聚丙烯细胞生长板(Whatman Uniplate)中进行一式四份酶水解，所述水解在5g水解规模，2.5％固形物，50mM柠檬酸缓冲液，5.1的pH和50℃使用下述进行11日：
i)里氏木霉纤维素分解制备物，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(作为SEQ ID NO:2描述于WO2005/074656)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499)，和棘孢曲霉木聚糖酶(作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785(称为Xyl II)，其剂量为6mg蛋白/g纤维素；
ii)里氏木霉纤维素分解制备物，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(作为SEQ ID NO:2描述于WO2005/074656)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499)，和棘孢曲霉木聚糖酶(作为SEQ ID NO:5公开于WO94/21785(称为Xyl II)，其剂量为4.8mg蛋白/g纤维素；
iii)如上文ii)中所述的纤维素分解制备物(4.8mg蛋白/g纤维素)，连同1.2mg蛋白/g纤维素的棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶I(作为SEQ ID NO:2公开于WO2010/108918(NP000409))；
-如上文ii)中所述的纤维素分解制备物(4.8mg蛋白/g纤维素)，连同1.2mg蛋白/g纤维素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846(P6GE))。
在0.005M H2SO4中稀释的样品的糖浓度使用4.6x250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过如下测量：在65℃用0.005M H2SO4以0.6ml每分钟的流速洗脱，并通过积分来自折射率检测(1100HPLC，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)并通过纯糖样品校正的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号来定量。葡萄糖和木糖产量计算为基于起始纤维素和木聚糖输入和在酶水解之后获得的葡萄糖和木糖浓度的理论值的％。
在11日水解之后获得的结果示于表1，以及图1和图2。所述乙酰木聚糖酯酶显示趋向改善葡萄糖产量的活性，且具体而言，土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶显示改善纤维素转化为葡萄糖方面的显著益处(图1)。亦可见几种乙酰木聚糖酯酶和特别是土生梭孢霉除了改善来自经预处理的玉米秸秆的葡萄糖产量之外还可改善木糖产量。
表1：11日水解结果
实施例2
使用进一步包含土生梭孢霉AXE的纤维素分解制备物改善乙酰化玉米
秸秆浆的纤维素转化
使用含有约75％纤维素和11％木聚糖的乙酰化玉米秸秆浆。基于总堂的乙酰化程度测量为约8％(每12.5个糖单元1个乙酰基团)。玉米秸秆浆通过在高温和高压使用乙酸预处理玉米秸秆来制备。将所得的浆料通过固/液分离器(压力过滤)以去除含有糖、乙酸和溶解的木质素的可溶性级分。将不可溶的底物(乙酰化浆)用自来水洗涤至pH高于5.0，并将其在旋转培养箱(rotisserieincubator)中进行一式两份酶水解，所述水解在20g水解规模，5％固形物，50mM柠檬酸缓冲液，5.0的pH和50℃以相同量的总蛋白每g的纤维素使用下述进行3和6日：
i)里氏木霉纤维素分解制备物，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)，和棘孢曲霉木聚糖酶(公开于WO94/21785的Xyl II)，其剂量为6mg蛋白/g纤维素(图3中的纤维素1)；
ii)如上文i)中所述的纤维素分解制备物(5.7mg蛋白/g纤维素)，连同0.3mg蛋白/g纤维素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846(P6GE)，其为5％替换水平(replacement level)(图3中的纤维素酶1+AXE(5％替换))；
iii)如上文i)中所述的纤维素分解制备物(5.4mg蛋白/g纤维素)，连同0.6mg蛋白/g纤维素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846(P6GE)，其为10％替换水平(replacement level)(图3中的纤维素酶1+AXE(10％替换))；
iv)如上文i)中所述的纤维素分解制备物(5.1mg蛋白/g纤维素)，连同0.9mg蛋白/g纤维素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846(P6GE)，其为15％替换水平(replacement level)(图3中的纤维素酶1+AXE(15％替换))；
v)里氏木霉纤维素分解制备物，其含有烟曲霉Cel7A CBH I(公开于WO2011/057140中的SEQ ID NO:2)和CBH II，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，具有下述取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D，S283G，N456E，F512Y(WO2012/044915)，和烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256中的Xyl III)，其剂量为6mg/蛋白/g纤维素(图3中的实验纤维素酶2)；
vi)里氏木霉纤维素分解制备物，其含有烟曲霉CBH I和CBH II，具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，公开于美国临时申请号61/388,997的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256中的Xyl III)，和烟曲霉β-木糖苷酶(公开于共同待决的美国临时申请号61/526833或PCT/US12/052163(实施例16和17))，其剂量为6mg/蛋白/g纤维素(图3中的纤维素酶3)；
vii)如上文vi)中所述的纤维素酶(5.82mg蛋白/g纤维素)，连同0.18mg蛋白/g纤维素的土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶(作为SEQ ID NO:2公开于WO2009/042846(P6GE)，其为3％替换水平(replacement level)(图3中的纤维素酶3+AXE(3％替换))。
在0.005M H2SO4中稀释的样品的糖浓度使用4.6x250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过如下测量：在80℃用MilliQ-H2O以0.6ml每分钟的流速洗脱，并通过积分来自折射率检测(1100HPLC，Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)并通过纯糖样品校正的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号来定量。纤维素转化计算为基于起始纤维素和木聚糖输入和在酶水解之后获得的葡萄糖和木糖浓度的理论值的％。
在72小时和144小时水解之后获得的结果示于表2和图3。结果显示纤维素酶2和3在纤维素转化方面在6mg每g的纤维素的相同蛋白剂量下相对于纤维素酶1性能显示实质性改善。此外，通过土生梭孢霉乙酰木聚糖酯酶对实验纤维素酶3蛋白的3％替代将纤维素转化从约67.2％进一步增强至76.7％。
| 72小时纤维素转化(％) | 144小时纤维素转化(％) | |
| 纤维素酶1 | 27.3 | 41.4 |
| 纤维素酶1+AXE(5％替代) | 29.9 | 45.5 |
| 纤维素酶1+AXE(10％替代) | 31 | 45.7 |
| 纤维素酶1+AXE(15％替代) | 27.8 | 41.5 |
| 纤维素酶2 | 34.5 | 68.4 |
| 纤维素酶3 | 33.9 | 67.2 |
| 纤维素酶3+AXE(3％替代) | 41.1 | 76.7 |
表2：72小时和144小时的纤维素转化
Claims (20)
1.一种酶组合物，其包含纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
2.权利要求1的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)，特异腐质霉(Humicola insolens)或Chrysosporiumlucknowense。
3.权利要求1或2的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于梭孢壳属(Thielavia)的菌株，如土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的菌株，如作为SEQ ID NO:1公开于本文中的酶，或与本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
4.权利要求1-3任一项的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属(Aspergillus)的菌株，如棘孢曲霉(Aspergillus aculaetus)的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于本文中的酶，或与本文中的SEQ ID NO:2具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
5.权利要求1-4任一项的酶组合物，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉的菌株，如作为SEQ ID NO:3公开于本文中的酶，或与本文中的SEQ ID NO:3具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
6.权利要求1-5任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中公开的Xyl II)。
7.权利要求1-6任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61多肽，烟曲霉β-葡糖苷酶和棘孢曲霉木聚糖酶，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)为来源于土生梭孢霉、本文中的SEQ ID NO:1的酶，或与本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
8.权利要求1-6任一项的酶组合物，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉(Penicillium emersonii)GH61A多肽，烟曲霉β-葡糖苷酶和烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256中的Xyl III)，且所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)为来源于土生梭孢霉的酶，或与WO2009/042846中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
9.权利要求1-8任一项的酶组合物，其中纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之间的比例是500:1至100:1，如50:1至2:1，如约4:1的范围。
10.一种水解乙酰化纤维素材料的方法，其包括对乙酰化纤维素材料施以纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
11.权利要求10的方法，其中所述乙酰化纤维素材料是经预处理的纤维素材料。
12.权利要求10或11的方法，其中所述乙酰化纤维素材料是经热机械制浆的植物材料，如乙酰化的玉米秸秆浆。
13.权利要求10-12任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于梭孢壳属的菌株，如土生梭孢霉的菌株，如作为SEQ ID NO:1公开于本文中的酶，或与本文中的SEQ ID NO:1具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选至少95％，如至少96％，如至少97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
14.权利要求10-13任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于曲霉属的菌株，如棘孢曲霉的菌株，如作为SEQ ID NO:2公开于本文中的酶，或与本文中的SEQ ID NO:2具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
15.权利要求10-14任一项的方法，其中所述乙酰木聚糖酯酶(AXE)来源于腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，如作为SEQ ID NO:3公开于本文中的酶，或与本文中的SEQ ID NO:3具有至少80％，如至少85％，如至少90％，优选95％，如至少96％，如97％，如至少98％，如至少99％同一性的乙酰木聚糖酯酶。
16.权利要求10-15任一项的方法，其中所述纤维素分解制备物为里氏木霉纤维素分解制备物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61A多肽，烟曲霉β-葡糖苷酶变体，和来源于烟曲霉的菌株的β-木糖苷酶。
17.权利要求10-16任一项的方法，其中纤维素分解制备物和乙酰木聚糖酯酶(AXE)之间的比例是500:1至1:1，如50:1至2:1，如约4:1的范围。
18.一种从乙酰化纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括：
(a)通过对所述乙酰化纤维素材料施以权利要求1-9任一项的酶组合物来水解所述材料；
(b)使用发酵生物进行发酵；和
(c)任选地回收所述发酵产物。
19.权利要求18的工艺，其中所述发酵产物是乙醇。
20.权利要求18或19的工艺，其中所述乙酰化纤维素材料是玉米秸秆浆。
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