CN101909461A

CN101909461A - 具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

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Publication number: CN101909461A
Application number: CN2008801247517A
Authority: CN
Inventors: 米歇尔·马兰塔; 金伯利·布朗
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2007-12-06
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2028-12-03
Also published as: ES2490608T3; CN101909461B; BRPI0820615A2; EP2224822B1; US8338666B2; BRPI0820615B1; EP2224822A1; US20100043105A1; DK2224822T3; CA2707847A1; US8129590B2; WO2009073709A1; US20120149078A1

Abstract

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

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涉及生物材料保藏物

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发明背景

发明领域

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

相关技术描述

植物细胞壁多糖通常构成植物细胞壁的90％并且能够分成以下三组：纤维素、半纤维素和果胶。纤维素是细胞壁多糖的主要成分。半纤维素是植物细胞壁中第二丰富的成分。主要的半纤维素聚合物是木聚糖。植物细胞壁中发现的木聚糖的结构取决于它们的来源可能差异显著，但是它们总是含有β-1，4-连接的D-木糖主链。β-1，4-连接的D-木糖主链能够用多个侧基取代，所述侧基如L-阿拉伯糖(L-aribinose)、D-半乳糖、乙酰基、阿魏酰基(feruloyl)、对-香豆酰基(p-coumaroyl)和葡糖醛酸残基。

木聚糖主链的生物降解依赖于两类酶：内切木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)将木聚糖主链切割成较小的寡糖，这些寡糖能够进一步通过β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)降解成木糖。木聚糖的降解中涉及的其它酶包括，例如，乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和对-香豆酸酯酶。

乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)从乙酰木聚糖的β-D-吡喃木糖基残基(β-D-xylopyranosyl residue)上的2位和/或3位去除O-乙酰基。乙酰木聚糖在木聚糖的水解中发挥重要作用，因为所述乙酰侧基能够在空间上干扰切割主链的酶的接近。乙酰侧基的去除促进内切木聚糖酶的作用。基于序列相似性的糖酯酶分类体系产生了对13个家族的定义，其中的七个含有乙酰木聚糖酯酶(Henrissat B.，1991，Biochem.J.280：309-316，及Henrissat和Bairoch，1996，Biochem.J.316：695-696)。

Margolles-Clark等，1996，Eur.J.Biochem.237：553-560公开了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的乙酰木聚糖酯酶。Sundberg和Poutanen，1991，Biotechnol.Appl.Biochem.13：1-11公开了里氏木霉的两种乙酰木聚糖酯酶的纯化和性质。WO 2005/001036公开了来自里氏木霉的乙酰木聚糖酯酶基因。美国专利5,681,732号公开了来自黑曲霉(Aspergillus niger)的乙酰木聚糖酯酶基因。美国专利5,763,260号公开了改变乙酰化木聚糖的性质的方法。

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

发明内容

本发明涉及选自下组的具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽：

(a)多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中-高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和

(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(数个)氨基酸的变体。

本发明还涉及编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)多核苷酸，其在至少中-高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和

(d)多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(数个)氨基酸的变体。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，和产生具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的方法。

本发明还涉及抑制细胞中具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法，包括向所述细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

本发明还涉及用具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽降解含有木聚糖的材料的方法。

本发明还涉及包含编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的分离的多核苷酸的植物。

本发明还涉及产生具有乙酰木聚糖酯酶(活性)的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分包含编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-19或由SEQ ID NO：2的氨基酸1-19组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

附图简述

图1A与1B显示特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800 CE1乙酰木聚糖酯酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs：1和2)。预测的内含子序列以粗体加下划线表示。

图2显示pMMar6的限制图谱。

图3显示pHinsAXE2的限制图谱。

定义

乙酰木聚糖酯酶活性：术语“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定义为羧酸酯酶活性(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是按照本文实施例中描述的方法测定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶活性定义为能够在pH 5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2的成熟多肽的乙酰木聚糖酯酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

家族CE1或CE1：术语“家族CE1”或“CE1”在本文中定义为根据Coutinho和Henrissat，(1999)Carbohydrate-active enzymes：an integrateddatabase approach.于″Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering″，H.J.Gilbert，G Davies，B.Henrissat和B.Svensson编，The Royal Society ofChemistry，Cambridge，3-12页属于糖酯酶家族的多肽。

含有木聚糖的材料：术语“含有木聚糖的材料”在本文中定义为含有木聚糖作为成分的任何材料。木聚糖为含有β-1，4-连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖。4-O-甲基葡糖醛酸与阿拉伯糖侧链(连同乙酰基和阿魏酰基)通常以不同量存在。木聚糖为半纤维素的主要成分。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不合与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下实现：通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在的多肽。在一个优选的方面，基于预测SEQ ID NO：2的氨基酸1-19是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的真基酸20-377。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，基于预测SEQ ID NO：1的核苷酸1-57编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上)所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸58-1266。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定。使用的可选参数是：缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)来测定。使用的可选参数是：缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO：2的特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶或其成熟多肽，在tfasty检索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中具有小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(数个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有乙酰木聚糖酯酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQID NO：2的成熟多肽或其同源序列的至少310个氨基酸残基，更优选至少325个氨基酸残基，并且最优选至少340个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(数个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少930个核苷酸，更优选至少975个核苷酸，并且最优选至少1020个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％纯，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(数个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1或其同源序列的成熟多肽编码序列的修饰的多核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列或其同源序列来获得。

发明详述

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及包含下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性(下文称为“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸20至377，或其等位变体；或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸20至377。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸20至377或其等位变体，或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸20至377组成。

在第二个方面，本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选极低严紧条件、更优选低严紧条件、更优选中严紧条件、更优选中-高严紧条件、甚至更优选高严紧条件、和最优选非常高严紧条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor，New York)。SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可以编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，优选至少25个，更优选至少35个，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；它们的全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸58-1266。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)NRRL B-50067中的质粒pHinsAXE2中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50076中的质粒pHinsAXE2中含有的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严紧性)，更优选在50℃(低严紧性)，更优选在55℃(中严紧性)，更优选在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选在65℃(高严紧性)，并且最优选在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 48：1390)计算得出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算得出的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。参见本文多核苷酸部分。

在第四个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(或数个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽；或其同源序列。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，乙酰木聚糖酯酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氢基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffiing)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2的成熟多肽如SEQ ID NO：2的氨基酸20-377的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有乙酰木聚糖酯酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有乙酰木聚糖酯酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium

trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)或疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)多肽。

在一个更优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的特异腐质霉多肽。在一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的特异腐质霉DSM 1800多肽，例如，包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV 蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过遗传工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50076中所含质粒pHinsAXE2中的序列，或由该序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸58-1266或由SEQ ID NO：1的核苷酸58-1266组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50076中所含质粒pHinsAXE2中含有的成熟多肽编码序列或由该成熟多肽编码序列组成。本发明还包含编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，所述亚序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的SEQ IDNO：2的片段。

本发明还涉及突变的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成，其中突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从腐质霉属菌株，或另外的或相关的生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多核苷酸编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的乙酰木聚糖酯酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等，1992，见上；Smith等，1992，见上；Wlodaver等，1992，见上)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链，或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

本发明还涉及通过如下获得的分离的多核苷酸：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述互补链是SEQID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(数个)调控序列可操作地连接，所述调控序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸用于多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码分泌多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上描述。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至19或由SEQID NO：2的氨基酸1至19组成。在另一优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至57或由SEQ ID NO：1的核苷酸1至57组成。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前(多)肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转变为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(数个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy toauxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可使用将DNA引入宿主细胞的领域中已知的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolyica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，AcademicPress，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是腐质霉属的。在一个更优选的方面，所述细胞是特异腐质霉。在最优选的方面，所述细胞是特异腐质霉DSM 1800。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(数个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达载体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of PlantPhysiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular andGeneral Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其它的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

去除或减少乙酰木聚糖酯酶活性

本发明还涉及产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是被失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行核苷酸序列的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变来进行。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时培育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(数个)核苷酸或其转录或翻译所需的调节元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方式的例子是基于基因替代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，随后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。可能理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在一个特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述核苷酸序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养突变细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。

在另一方面，本发明涉及通过发酵产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无乙酰木聚糖酯酶活性的蛋白质产物的方法：在发酵之前、过程中或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制乙酰木聚糖酯酶活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。

在另一方面，本发明涉及通过如下生产基本上无乙酰木聚糖酯酶活性的蛋白质产物的方法：在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的pH和温度处理以实质上(substantially)减少乙酰木聚糖酯酶活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与乙酰木聚糖酯酶抑制剂处理组合使用。

依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的乙酰木聚糖酯酶活性。使用此方法可获得乙酰木聚糖酯酶活性的完全去除。

组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少60-70℃范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。

用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

本发明用于产生基本上无乙酰木聚糖酯酶的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人感兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。乙酰木聚糖酯酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白质如激素、生长因子、受体等。

可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等。

在一个另外的方面，本发明涉及基本上无乙酰木聚糖酯酶活性的蛋白质产物，其通过本发明的方法产生。

抑制具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法

本发明还涉及抑制本发明的多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的双链体核苷酸。

dsRNA优选是小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA(siRNA)。在另一优选的方面，dsRNA是用于抑制翻译的微RNA(miRNA)。

本发明还涉及用于抑制细胞中多肽表达的这些包含SEQ ID NO：1成熟多肽编码序列的部分的双链RNA(dsRNA)分子。虽然本发明不受限于任何特定作用机制，但dsRNA能进入细胞，并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括内源mRNA。当细胞接触dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA干扰(RNAi)的过程的降解。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默疗法。在一个方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi选择性地降解RNA的方法。所述方法可以在体外、在活体外(ex vivo)或在体内进行。在一个方面，dsRNA分子能够用于在细胞、器官或动物中产生功能丧失突变(loss-of-function mutation)。制备或使用选择性降解RNA的dsRNA分子的方法在本领域中公知，参见，例如，美国专利号6,506,559；美国专利号6,511,824；美国专利号6,515,109；和美国专利号6,489,127。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这样的多肽。术语“富含”表示所述组合物的乙酰木聚糖酯酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如，单组分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选的用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

用途

本发明还涉及使用具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的方法。

本发明的多肽可用于降解或修饰植物细胞壁或任何来源于植物细胞壁的含有木聚糖的材料。不同的用途的实例如下所述(对其它用途，参见WO2002/18561)。本发明的多肽的剂量与使用制备物的条件可基于本领域已知方法加以确定。

侧链的全部或部分去除促进木聚糖的酶法降解。本发明的多肽优选与其它木聚糖降解酶如木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸苷酶及其组合一同用于其中木聚糖待降解的工艺。例如，乙酰基可通过乙酰木聚糖酯酶去除；阿拉伯糖基可通过α-阿拉伯糖苷酶去除；阿魏酰基可通过阿魏酸酯酶去除，而葡糖醛酸基团通过α-葡糖醛酸苷酶来去除。由木聚糖酶，或木聚糖酶与侧链水解酶的组合释放的寡聚物可进一步由β-木糖苷酶降解为游离的木糖。本发明的多肽优选为包含一种或多种(数种)木聚糖降解酶，特别是木聚糖酶的组合物的组分。在下面所述的不同用途中，本发明的多肽优选与一种或多种(数种)木聚糖降解酶组合使用。

因而，本发明还涉及降解含有木聚糖的材料的方法，包括用具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽处理所述含有木聚糖的材料。在一个优选方面，所述含有木聚糖的材料进一步用木聚糖降解酶处理。所述木聚糖降解酶可选自下组：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸苷酶及其组合。

植物材料可经降解以改善不同种类的加工，促进纯化或提取除木聚糖外的组分，如自谷物纯化β-葡聚糖或β-葡聚糖寡聚物，改善饲料价值，减少水结合能力，改进废水工厂的可降解性，改善例如草和谷物到青贮饲料(ensilage)的转化率，等等。本发明的多肽可用于酶法水解不同的来源于植物细胞壁的材料或废料，例如，来自造纸的，或农业残余物如麦秆、玉米穗轴、玉米纤维、玉米全植株、坚果果壳、草、蔬菜外皮、豆荚、酒糟、糖甜菜浆等。所述多肽还可以用于修饰来源于植物细胞壁的材料的粘度。例如，所述多肽可以用于减少含有木聚糖的材料的粘度，以促进粘稠的含有木聚糖的材料的加工，如在分离小麦中。

本发明的多肽还可以与有限活性的其它分解木聚糖的酶一起使用以降解木聚糖供产生寡糖。所述寡糖可以用作填充剂(bulking agent)，如自谷物细胞壁材料释放的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)寡糖，或多少经部分纯化的来自谷物的阿拉伯木聚糖。

本发明的多肽还可以与其它分解木聚糖的酶组合使用以将木聚糖降解为木糖和其它单糖(美国专利5,658,765)。被释放的木糖可以转变为其它化合物。

本发明的多肽还可以用于降解木质纤维素生物质或转变为可发酵糖用于产生，例如，燃料、饮用乙醇和/或发酵产物(例如，酸、醇、酮、气体等)。所述多肽优选与其它木聚糖降解酶和纤维素酶组合物(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)组合使用。

本发明的多肽可同其它酶如葡聚糖酶一起使用以改善自富油植物材料提取油，例如自玉米胚提取玉米油。

本发明的多肽还可以用于焙烤以改善生面团的发面(development)、弹性和/或稳定性，和/或焙烤产物的体积、碎屑结构和/或保鲜性能。所述多肽可以用于自任何类型的面粉或粗粉(例如，基于小麦、黑麦、大麦、燕麦或玉米)制备的生面团或焙烤产物。用本发明的多肽产生的焙烤产物包括面包、面包卷、法国面包(baquette)等。就焙烤而言，本发明的多肽可用作仅有或主要的酶活性，或可以与其它酶如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，过氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶组合使用。

本发明的多肽还可以用于修饰动物饲料，且可以在体外(通过修饰所述饲料的组分)或在体内发挥其作用。可将所述多肽添加到含有多量阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖的动物饲料组合物中，例如，含有谷类如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米的饲料。当添加到饲料中时，所述多肽将改善植物细胞壁材料的体内降解，部分由于减少肠内粘度(Bedford等，1993，Proceedings of the 1stSymposium on Enzymes in Animal Nutrition，73-77页)，由此实现了动物对植物营养物利用的改善。因此，改善了所述动物的生长率和/或饲料转化比(即，摄入饲料的重量相对于重量增加)。

本发明的多肽还可以用于造纸与纸浆工业，尤其是在漂白过程中增强经漂白的浆的亮度，由此减少漂白阶段中使用的氯的量，并在回收纸工艺中增加浆的游离度(freeness)(Eriksson，1990，Wood Science and Technology 24：79-101；Paice等，1988，Biotechnol.和Bioeng.32：235-239，和Pommier等，1989，TappiJournal 187-191)。此外，所述多肽可以用于处理木质纤维素浆从而改善其可漂白性(bleachability)。对木质纤维素浆的处理可以，例如，如美国专利5,658,765、WO 93/08275、WO 91/02839和WO 92/03608的描述进行。

本发明的多肽还可以用于啤酒酿造，特别是改善含有，例如，大麦和/或高粱麦芽的麦芽汁的可滤性(filterability)(WO 2002/24926)。所述多肽可以以相同方式用作常规用于酿造的戊聚糖酶，例如，如等，1993，J.Inst.Brew.99：243-248；和EP 227159所描述。此外所述多肽可用于处理酿酒酒糟，即，来自啤酒麦芽汁产生的含有大麦或发芽大麦(malted barley)或其它谷物的残余物，从而改善所述残余物用于，例如，动物饲料的利用。

本发明的多肽可以用于分离植物细胞材料的组分，特别是谷类组分如小麦组分。特别感兴趣的是将小麦分离成谷蛋白和淀粉，即，具有可观商业利益的组分。所述分离工艺可通过使用本领域已知方法进行，方便地为作为水力旋流(hydroclone)或倾析(decanting)工艺进行的所谓打糊(batter)工艺(或湿磨工艺)。在打糊工艺中，起始材料为植物材料(如小麦)的稀释的可泵送的(pumpable)分散系以进行分离。在小麦分离工艺中，所述分散系通常从小麦粉与水制得。

本发明的多肽还可以用于制备水果或蔬菜汁以增加产量。

本发明的多肽还可以用作用于织物的酶法煮炼(scouring)系统的组分。

本发明的多肽还可以与其它酶功能组合用于洗衣洗涤剂应用。

信号肽

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，其中所述基因与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQID NO：2的氨基酸1到19，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至19组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。

在一个优选的方面，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至57或由SEQ ID NO：1的核苷酸1至57组成。

本发明还涉及包含这样的核苷酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包括组合以形成编码产物的两种以上多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含部分或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的蛋白质获得，其中一种或多种(几种)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程的变异。

蛋白质优选是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在一个更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以获得自任何原核、真核或其它来源。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

菌株

使用特异腐质霉DSM 1800作为编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的家族CE1基因的来源。将黑曲霉Mbin120菌株(WO 2004/090155)用于表达具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的特异腐质霉基因。

培养基

PDA平板由每升39克马铃薯右旋糖琼脂组成。

YP培养基由每升10g酵母提取物和20g Bacto Peptone(细菌用蛋白胨)组成。

COVE A尿素-乙酰胺+平板由每升20ml的COVAA盐溶液、220g山梨糖醇、10g葡萄糖、10ml的1M乙酰胺和30g细菌用琼脂组成；pH5.2。

COVE A盐溶液由每升26g KCl、26g MgSO₄、76g KH₂PO₄和50ml的COVE A痕量元素溶液组成。

COVE痕量元素溶液由每升0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g的CuSO₄·5H₂O、1.2g的FeSO₄·7H₂O、0.7g的MnSO₄·H₂O、0.8g的Na₂MoO₂·2H₂O和10g的ZnSO₄·7H₂O组成。

M410培养基由每升50g的麦芽糖、50g的葡萄糖、2g的MgSO₄·7H₂O、2g的KH₂PO₄、4g的柠檬酸无水粉末、8g的酵母提取物、2g的尿素、0.5g的AMG痕量金属溶液和0.5g的CaCl₂组成；pH 6.0。

AMG痕量金属溶液由每升14.3g的ZnSO₄·7H₂O、2.5g的CuSO₄·5H₂O、0.5g的NiCl₂·6H₂O、13.8g的FeSO₄·7H₂O、8.5g的MnSO₄·7H₂O和3g的柠檬酸组成。

LB培养基由每升10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物和5g的NaCl组成。

实施例1特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶的鉴定

L的蛋白质分级。使用HIPREP^TM 26/10 Desalting Column(脱盐柱)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)，首先将2mlL (Novozymes A/S，

Denmark)的等分试样缓冲液交换至含150mM氯化钠的20mM乙酸钠pH5中。然后使用具有20旋转柱及3,000道尔顿截留分子量膜(Vivascience AG，Hannover，Germany)的超滤将所得经缓冲液交换的材料(18.5ml)浓缩至3ml。然后将所述经缓冲液交换和浓缩的

L材料的2ml等分试样通过在HILOAD^TM 26/60SUPERDEX^TM200制备级大小排阻柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上通过用相同缓冲液的等度洗脱(isocratic elution)进行的大小排阻层析加以分级。将在280nm显示UV吸光度的级分合并为六个分别来自不同洗脱时间，每个总体积的范围为20-40ml的汇集物。使用具有

20旋转柱及3,000Da截留分子量膜的超滤将经汇集的级分浓缩至1-5ml。二十微升的每个经浓缩的汇集级分在CRITERION^TM 8-16％Tris-HCl SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)上根据生产商的推荐条件进行分离。使用PRECISION PLUS PROTEIN^TM标准物(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)作为分子量标记。所得凝胶用考马斯蓝(Coomassie Blue)(G250)蛋白质染料(BIO-SAFE^TM Coomassie Stain，Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行染色，并用刀片将可见的条带切出用于蛋白质鉴定分析。

对多肽的胶内消化(in-gel digestion)用于肽测序：使用

IILiquid Handling Robot(PerkinElmer Lite and Analytical Sciences，Boston，MA，USA)进行胶内消化。将30kDa的蛋白质凝胶条带用50μl的溶于100mM碳酸氢铵pH 8.0中的10mM二硫苏糖醇(DTT)还原30分钟。经还原后，将所述凝胶块用50μl的溶于100mM碳酸氢铵pH 8.0溶液中的55mM碘乙酰胺烷基化20分钟。允许经干燥的凝胶块在25μl每μl 50mM碳酸氢铵pH 8.0中含有6ng测序级胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)的胰蛋白酶消化溶液中在室温下溶涨(swell)30分钟，之后是在40℃消化8小时。上述每个反应步骤之后都用合适的溶液遵循生产商的标准规程进行多次洗涤与预洗涤。使用五十ul乙腈以使所述凝胶块在反应之间脱水，且将所述凝胶块在步骤之间空气干燥。用HPLC级水中的1％甲酸/2％乙腈抽提肽两次30分钟。将肽抽提溶液转移至96孔有缘的(skirted)PCR型板(ABGene，Rochester，NY，USA)，并且将其冷却至10-15℃并用96孔板盖(PerkinElmer Life and AnalyticalSciences，Boston，MA，USA)覆盖以防止蒸发。将板进一步储藏于4℃直至可进行质谱分析。

蛋白质鉴定。为了通过串联质谱述进行肽的从头测序，使用Q-TOFMICRO^TM(Waters Micromass MS Technologies，Milford，MA，USA)，一种混合型正交四极飞行时间质谱仪(hybrid orthogonal quadrupoletime-of-flight mass spectrometer)用于LC/MS/MS分析。Q-TOF MICRO^TM完全使用MASSLYNX^TM软件版本4.1(Waters Micromass MS Technologies，Milford，MA，USA)由微处理器控制。所述Q-TOF MICRO^TM配以ULTIMATE^TM毛细管和纳米流(nano-flow)HPLC系统，其与FAMOS^TM微型自动采样器和SWITCHOS^TM II柱变换装置(LCPackings/Dionex，Sunnyvale，CA，USA)偶联用于对试样进行浓缩与脱盐。将试样加载至装在注入回路(injection loop)中的保护柱(300μm ID X 5cm，PEPMAP^TM C18)上，并用0.1％甲酸水溶液以每分钟40μl用Switchos II泵洗涤2分钟。肽在75μm ID x 15cm，C18，3μm，

PEPMAP^TM纳米流融合的毛细管柱(LC Packings，San Francisco，CA，USA)上以175nl/分钟的流速，从175μl/分钟的分流(split flow)使用NAN-75校准器(Dionex，Sunnyvale，CA，USA)分离。在45分钟期间施加0.1％甲酸中5％到80％乙腈的分步洗脱梯度(step elution gradient)。在215nm处监视柱洗脱液，并通过装有纳米喷射接口(nanospray interface)的电喷射离子源(electrosprayion source)导入所述Q-TOF MICRO^TM中。

以检查扫描方式(survey scan mode)自m/z 400到1990的范围及MS到MS/MS的转换标准获取数据，以包括高于每秒10.0计数的离子强度和+2、+3和+4的电荷状态。用1.9秒的扫描时间和0.1秒的扫描间时间可获取多至4个同时洗脱物种的分析谱。通常使用45伏特的锥形电压(cone voltage)，而碰撞能量(collision energy)编程为根据洗脱肽的质量和电荷状态而改变，且在10-60伏特的范围内。所得的谱以自动的方式组合、平滑化(smoothed)并中心化(centered)，并产生峰列表(peak list)。所述峰列表针对所选的数据库使用PROTEINLYNX^TM Global Server 2.2.05软件(Waters Micromass MSTechnologies，Milford，MA，USA)和PEAKS Studio 4.5版本(SP1)(BioinformaticSolutions Inc.，Waterloo，Ontario，Canada)进行搜索。评价由PROTEINLYNX^TM和PEAKS Studio搜索所得的结果，并进一步通过评价每个目标离子的MS/MS谱来分析未鉴别的蛋白质，并通过鉴定y与b离子系列以及将质量差异与合适的氨基酸匹配来确定从头序列(de novo sequence)。

从由所述胶内消化的30kDa多肽凝胶条带回收的带多个电荷的肽离子获得肽序列。514.772m/z序列的带两个电荷的胰蛋白酶肽离子被确定为Asn-Ser-Tyr-Pro-Gly-Tyr-[Asp或Asn]-Gly-Arg(SEQ ID NO：4)。

实施例2：特异腐质霉DSM 1800基因组DNA提取

特异腐质霉DSM 1800在PDA平板上在45℃生长到汇合。自所述PDA平板切下三个4mm²的方块，将其接种至在带挡板的125ml摇瓶中的25ml的含有2％葡萄糖的YP培养基中，并在41℃以200rpm的振荡温育2天。通过使用

(Calbiochem，La Jolla，CA，USA)过滤，在去离子水中洗涤两次，并在液氮下冷冻来收获菌丝体。将冷冻的菌丝体通过杵和臼磨碎至细粉，并使用

Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离总DNA。

实施例3：自特异腐质霉DSM 1800分离乙酰木聚糖酯酶的部分片段

使用Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer Program(共有-简并杂合寡核苷酸引物程序)(CODEHOP；Rose等，1998，Nucleic Acids Research26：1628-1635)，针对在实施例1中鉴定出的肽设计如下所示的简并引物：

引物HiFAE-degF：

5’-WSNYTNCARCARGTNTGGAAYTGGGGNGCNAAY-3’(SEQ ID NO：5)

简并引物HiFAE-degF的蛋白质翻译：

XXQQVWNWGA(SEQ ID NO：6)

引物HiFAE-degR：

5′-GGCGGCGGCCGTCRTANCCNGGRTA-3’(SEQ ID NO：7)

简并引物HiFAE-degR的蛋白质翻译：

YPGYDGRR

为获取所述特异腐质霉的乙酰木聚糖酯酶基因的初始DNA片段，扩增反应物(25μl)由作为模板的117ng的特异腐质霉DSM 1800基因组DNA，每种0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，每种50pmol的HiFAE-degR引物和HiFAE-degF引物，1XGC-Melt LA缓冲液(ClontechLaboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，以及1.25单位的

GC Genomic聚合酶混合物组成。扩增使用

5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)以下述程序进行：94℃预变性1分钟；30个循环，每个循环在94℃的变性温度30秒；60℃的退火温度30秒；72℃延伸90秒；并最后在72℃延伸5分钟。

通过在TBE(每升10.8g的Tris碱、5.5g的硼酸和4ml的0.5M EDTA pH8.0)缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物。自凝胶切出大约1.1kb的PCR产物条带，使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示加以纯化，并进行测序。根据测序结果发现HiFAE-degF引物在扩增反应中并不结合，而HiFAE-degR引物则与两端结合。获取了编码肽片段的部分序列，所述片段与来自费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)的推定的乙酰木聚糖酯酶(Uniprot：A1DBP9)同源。

实施例4：全长特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶基因的鉴定

自特异腐质霉DSM 1800使用GENOMEWALKER^TM Universal Kit(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)根据生产商的指示鉴定全长家族CE1乙酰木聚糖酯酶基因。简言之，来自特异腐质霉DSM 1800的总基因组DNA分别用四种不同的保留平端的限制酶(Dra I、Eco RV、PvuII和Stu I)消化。然后将每批经消化的基因组DNA分别连接至GENOMEWALKER^TM Adaptor(衔接头)(Clontech Laboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)以产生四个文库。然后在使用两个如下所示基因特异性引物的PCR反应中采用这四个文库作为模板，一个用于初步PCR，而一个用于通过编码所述乙酰木聚糖酯酶C-末端的3’端扩增所述片段下游的二次PCR。基于与其它乙酰木聚糖酯酶的序列同源性，看起来编码所述乙酰木聚糖酯酶N-末端的5’端包含在实施例3所述的初始片段内。基于如实施例3所述获得的来自特异腐质霉的部分乙酰木聚糖酯酶基因序列设计下述引物：

引物Hins_AXE_GSP1_F1(初步)：

5′-CTACACGGGCACTGTTGCTGGCTGGAA-3′(SEQ ID NO：8)

引物Hins_AXE_GSP2_F3(二次)：

5′-ACACTGGGCCAGGACGGCGCTCGATAT-3′(SEQ ID NO：9)

初步扩增反应物由在25μl的终体积中1μl(大约6ng)的每种文库作为模板，每种0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol的Adaptor Primer1(衔接头引物1)(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，50pmol的引物Hins_AXE_GSP1_F1，1X

GC-Melt LA缓冲液(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，以及1.25单位的

GC Genomic聚合酶混合物组成。所述扩增反应使用

5333以下述程序进行：在95℃预变性1分钟；5个循环，每个在95℃的变性温度25秒；在72℃退火和延伸5分钟；7个循环，每个在95℃的变性温度25秒；在72℃退火和延伸5分钟；32个循环，每个循环在95℃的变性温度25秒；在67℃退火和延伸5分钟；以及在67℃最终延伸7分钟。

二次扩增反应物由在25μl的终体积中的1μl每种初步PCR产物作为模板，每种0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol的衔接头引物2(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，50pmol的引物Hins_AXE_GSP2_F3，1XGC-Melt LA缓冲液，以及1.25单位的

GC Genomic聚合酶混合物组成。扩增反应使用

5333以下述程序进行：在95℃预变性1分钟；5个循环，每个在95℃的变性温度25秒；在72℃退火和延伸5分钟；20个循环，每个循环在95℃的变性温度25秒；在67℃退火和延伸5分钟；以及在67℃最终延伸7分钟。

通过在TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离所得反应产物。自PvuII文库，自凝胶切出1kb和1.8kb的产物，使用

凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA，USA)根据生产商的指示将其纯化，并测序。

PCR片段的DNA测序用Perkin-Elruer Applied Biosystems Model 377XLAutomated DNA测序仪使用染料终止物化学方法(dye-terminator chemistry)(Giesecke等，1992，见上)和引物步移策略进行。衔接头引物2和引物Hins_AXE_GSP2_F3用于测序。

仔细检查核苷酸序列数据的质量，并将所有序列在PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助下相互比较。将PCR片段序列结果与实施例3中描述的来自特异腐质霉的部分乙酰木聚糖酯酶基因序列进行比较和比对。基于在这个实施例和实施例3中获得的基因片段构建了基因模型，其允许以其它同源乙酰木聚糖酯酶确定基因的5’和3’末端。

实施例5：克隆特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶基因和构建黑曲霉表达载体

设计如下所示的两个合成寡核苷酸引物以自实施例2中制备的基因组DNA PCR扩增特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶基因。使用InFusion克隆试剂盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)将所述片段直接克隆入表达载体pBM120a(WO 2006/078256)。

HinsAXEBDinfnterm：

5′-ACACAACTGGCC

-3′(SEQ ID NO：10)

HinsAXEBDinfCtermendPacI：

5′-CAGTCACCTCTAGTTA

-3′(SEQ ID NO：11)

粗体字母代表编码序列。剩余的序列与pBM120a的插入位点同源。

将五十皮摩尔的上述每种引物用于由25μl终体积中的80ng的特异腐质霉基因组DNA，1X

GC-Melt LA缓冲液，每种0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，以及1.25单位的GC Genomic聚合酶混合物组成的PCR反应物。扩增反应使用

5333以下述程序进行：一个循环在94℃1分钟；三十个循环，每个在94℃30秒，58℃30秒，和72℃90秒；以及70℃最终延伸5分钟。然后使加热块(heat block)处于4℃浸泡循环(soak cycle)。

通过在TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离翻译产物，其中自所述凝胶切出大约1.2-1.3kb的产物条带，并使用

凝胶提取试剂盒根据生产商的指示进行纯化。

将质粒pBM120a用Nco I和Pac I消化，通过在TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并使用

疑胶提取试剂盒根据生产商的指示进行纯化。

所述基因片段和经消化的载体使用InFusion Cloning Kit连接在一起得到pMMar6(图2)，其中乙酰木聚糖酯酶基因的转录置于来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子杂合体(NA2-tpi启动子)的控制下。连接反应物(20μl)由1X InFusion缓冲液(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1X BSA(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1μl的InFusion酶(1∶10稀释)(BDBiosciences，Palo Alto，CA，USA)，106ng的经Nco I和Pac I消化的pBM120a，以及208ng的纯化特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶PCR产物组成。所述反应液在室温下温育30分钟。使用二μl的反应液根据生产商的指示转化大肠杆菌L10

Gold Supercompetent(超感受态)细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。通过限制性消化检测出含有pMMar6的大肠杆菌转化体，并使用

9600(QLAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶基因在pMMar6中的插入通过用Perkin-Elmer AppliedBiosystems Model 377XL Automated DNA测序仪使用染料终止化学(Giesecke等，1992，见上)和引物步移策略进行的DNA测序来确认。引物996271 Na2tpi启动子fwd和引物996270AMGrev，如下所示，用于测序。

996271 Na2tpi启动子fwd：

5′-ACTCAATTTACCTCTATCCACACTT-3′(SEQ.ID NO：12)

996270 AMG rev：

5′-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3′(SEQ.ID NO：13)

将含有pMMar6的克隆挑入2x50ml的每ml含有100μg的氨苄青霉素的LB培养基中，并在250ml的玻璃瓶中在37℃和200rpm振荡下生长过夜。使用

Midi Kit根据生产商的指示自培养液中分离质粒pMMar6。用Pme I消化质粒pMMar6，用在TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，且使用

疑胶提取试剂盒根据生产商的指示纯化含有所述乙酰木聚糖酯酶基因的片段用于转化黑曲霉MBin120原生质体。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将同样的大约1.2-1.3kb PCR片段克隆入

2.1-

载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)以产生pHinsAXE2(图3)。pHinsAXE2中的特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶基因插入物通过DNA测序确认。大肠杆菌pHinsAXE2在2007年11月20日保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心，Peoria，IL，USA。

实施例6：表征编码家族CE1乙酰木聚糖酯酶的特异腐质霉基因组序列

仔细检查核苷酸序列数据(实施例5)的质量，并在PHRED/PHRAP软件(University ofWashington，Seattle，WA，USA)的协助下将所有序列相互比较。

核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)示于图1A和1B。基因组片段编码377个氨基酸的多肽，由两个预测的73bp和62bp内含子所打断。全长编码序列和成熟编码序列的％G+C含量分别为60.4％和60.5％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测出19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白质包含358个氨基酸，分子量为38.5kDa。预测的酯酶聚羟基丁酸解聚酶域出现在氨基酸43到257，而预测的纤维素结合域在氨基酸341到377。基于推导的氨基酸序列，乙酰木聚糖酯酶看起来属于根据Coutinho和Henrissat，1999，见上的糖酯酶家族CE1。

氨基酸序列的比较性的配对全局比对(comparative pairwise globalalignment)使用EMBOSS的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)及缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62矩阵确定。所述比对显示特异腐质霉家族CE1乙酰木聚糖酯酶基因的成熟多肽的推导的氨基酸序列与细丽毛壳(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶的推测的氨基酸序列(GeneSeqP登录号AAB82124)分享72.4％的同一性(排除缺口)。

实施例7：在黑曲霉MBin120中转化并表达特异腐质霉家族CE1乙酰木聚糖酯酶基因

特异腐质霉家族CE1乙酰木聚糖酯酶基因在黑曲霉MBin120中表达。黑曲霉MBin120原生质体根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备。使用5μg的经Pme I消化的pMMar6转化黑曲霉MBin120。

用经Pme I消化的pMMar6转化黑曲霉MBin120产生大约45个转化体。将二十五个转化体分离至单独的COVE A尿素-乙酰胺+平板上。自二十五个转化体的汇集的COVE A尿素-乙酰胺+平板切下两个3平方mm的琼脂块，并将其分别接种于125ml塑料摇瓶中的25ml的M410培养基中，并在34℃和250rpm的振荡下温育。在温育5日后，将来自每个培养物的6μl上清在CRITERION^TM 8-16％Tris-HCl SDS-PAGE凝胶上用

细胞(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据根据生产商的指示进行分析。所得的凝胶用BIO-SAFE^TM考马斯染料进行染色。

所述培养物的SDS-PAGE谱显示大约一半的转化体具有大约50kDa的主要条带。选取一个称为黑曲霉MMar204的转化体用于在黑曲霉中表达具有乙酰木聚糖酯酶活性的特异腐质霉多肽。

实施例8：发酵黑曲霉MMar204

摇瓶培养基由每升70g的蔗糖和100g的大豆浓缩物组成。痕量金属溶液由每升13.8g的FeSO₄·7H₂O、14.3g的ZnSO₄·7H₂O、11.6g的MnSO₄·H₂O、2.5g的CuSO₄·5H₂O、0.5g的NiCl₂·6H₂O以及3.3g的一水合柠檬酸组成。

将一百ml的摇瓶培养基分别添加至四个500ml摇瓶中。所述摇瓶每个接种以200μl的黑曲霉MMar204甘油孢子储液(glycerol spore stock)并在30℃在定轨振荡器上以220rpm温育72小时。来自四个摇瓶中每一个的五十ml的摇瓶培养液用于接种3升的发酵容器。

分批发酵培养基(fermentation batch medium)由每升250g的葡萄糖、5g的(NH₄)₂SO₄、2.5g的KH₂PO₄、0.5g的CaCl₂·2H₂O、2g的MgSO₄·7H₂O、3g的K₂SO₄、1g的柠檬酸、1ml的消泡剂以及0.75ml的痕量金属溶液组成。所述痕量金属溶液由每升13.8g的FeSO₄·7H₂O、14.3g的ZnSO₄·7H₂O、11.6g的MnSO₄·H₂O、2.5g的CuSO₄·5H₂O、0.5g的NiCl₂·6H₂O以及3.3g的一水合柠檬酸组成。发酵补料培养液由每千克406g的麦芽糖、0.5g的一水合柠檬酸与1ml的消泡剂组成。

将总共2升的分批发酵培养基添加入Applikon Biotechnology二升玻璃夹套发酵罐(Applikon Biotechnology，Schiedam，Netherlands)中。发酵补料培养基以0至4g/l/hr的速率剂量添加185小时的时间。所述发酵容器保持在34℃的温度，且使用Applikon 1030控制系统(Applikon Biotechnology，Schiedam，Netherlands)将其pH值控制为5.1+/-0.1的设定值。将空气以1vvm的速率添加到容器中，并用以1100rpm旋转的Rushton叶轮搅拌培养液。在发酵结束时，自该容器收获全部培养液，并以3000xg离心以去除生物质。所得上清经灭菌过滤并储藏于5到10℃。

实施例9：纯化具有乙酰木聚糖酯酶活性的特异腐质霉多肽

来自实施例8所述的发酵培养液的上清首先经缓冲液交换至20mM MESpH6中，并使用由Ultrapump II、ULTRARESERVOIR^TM 5L、和10000Da截留分子量的ULTRASETTE^TM 10K Omega切向流过滤膜(Pall Corporation，EastHills，NY，USA)组成的Pall Filtron切向流过滤系统(tangential flow filtrationsystem)浓缩。然后将所得经缓冲液交换的材料(150ml)在用20mM MES pH6平衡的120ml SP SEPHAROSE^TM Big Beads(大珠)树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上进行纯化，然后用0-1M氯化钠的线性梯度进行洗脱。收集级分并在280nm处监测。在280nm具有UV吸收的级分的2.5μl等分试样在CRITERION^TM 8-16％Tris-HCl SDS-PAGE凝胶上根据生产商的指示进行分析。使用PRECISION PLUS PROTEIN^TM标准物作为分子量标记。所述凝胶用BIO-SAFE^TM考马斯染色。将在55kDa处显示对应于特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶的条带的级分合并以产生高于90％纯度的纯化的乙酰木聚糖酯酶(130ml)。

使用乙酸对硝基苯酯作为底物(Sigma-Aldrich Chemical co.，Inc.，St Louis，MO，USA)对所述特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶的酶活性进行分析。活性分析在96孔

微量滴定板(Corning Inc.，Corning，NY，USA)中进行。起初在DMSO中制备100mM乙酸对硝基苯酯溶液，然后在含有0.01％

20的50mM乙酸钠pH 5.0中稀释为1mM溶液。然后通过将纯化的特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶等分试样添加至所述1mM乙酸对硝基苯酯悬浮液中来进行起始酶反应，导致最终底物浓度为0.5mM乙酸对硝基苯酯。允许所述反应在环境温度(25℃)进行10分钟，在此时添加1M Tris-HCl pH 8.0，且通过使用SPECTRAMAX^TM 340PC平板阅读器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)测量在405nm处吸光度的增加来确定释放的乙酸对硝基苯酯阴离子的量。纯化的蛋白质浓度使用Microplate BCA^TM Protein Assay Kit(Pierce，Rockford，IL，USA)确定。一个单位的乙酰木聚糖酯酶活性定义为能够在pH5，25℃每分钟释放1μmol的乙酸对硝基苯酯阴离子的酶量。

确定所述特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶具有每mg酶15.4单位的活性。

实施例10：特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶的热稳定性

所述纯化的特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶(实施例9)的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)使用A VP-DSC(MicroCal Inc.，Northampton，MA，USA)根据生产商的指示在50mM乙酸钠pH 5.0中确定。

热变性温度，Td，取为在以程序设计的在20℃开始的每小时90℃加热速率加热酶溶液后获得的热分析图(Cp对T)中变性峰(主要吸热峰)的顶部。在这些条件下，乙酰木聚糖酯酶的Td为71(+/-1)℃。

实施例11：特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶对经预处理的玉米纤维的水解的作用

评价了特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶对经预处理的玉米纤维的水解的作用。玉米纤维为来自玉米仁湿磨的部分。玉米纤维是去除了淀粉与进一步加工后留下的种皮和残余的胚乳。玉米纤维通过在140℃高压灭菌150分钟来进行预处理。在所述物质中阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的量使用下述方法确定为每kg干物质175、317和261g。

阿拉伯糖和木糖通过使用稀盐酸进行糖水解来加以确定。将经预处理的玉米纤维转移至125ml锥形瓶中，并稀释至含有约10％的干物质。将所得玉米纤维样本在油浴中在100℃预加热。通过添加5ml的2M盐酸在100℃处理2小时来开始水解。在温育后，将所述烧瓶在冰上冷却，并以4M氢氧化钠中和。用0.2微米注射器式滤器(Sartorius AG，Goettingen，Germany)过滤样本，并在

系统(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA，USA)上分析阿拉伯糖和木糖。通过对所述经预处理的玉米纤维样本进行两步硫酸水解来进行确定葡萄糖。将三ml的72％硫酸添加至压力管(Ace Glass，Inc.，Vineland，NJ，USA)中大约300mg的干玉米纤维中。将样本混合并置于30℃水浴中60分钟。每5到10分钟搅拌样本。在60分钟后，移除所述样本，并添加84ml的去离子水。将样本置于高压灭菌器中，并在121℃加热1小时。在冷却后，将所述样本过滤以去除残余的固体，并通过添加碳酸钙进行中和。用

系统根据下述方法确定葡萄糖浓度。将样本(10μl)加载到装有与CARBOPAC^TM PA1保护柱(4x50mm)(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA，USA)组合的

CARBOPAC^TM PA1分析柱(4x250mm)(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA，USA)的DIONEX

系统。单糖用10mM氢氧化钾以每分钟1ml的流速进行等度分离，并通过处于脉冲安培测量模式(pulsed amperiometric mode)的脉冲电化学检测器(pulsedelectrochemical detector)进行检测。电极的电势经程序设计为+0.1伏特(t＝0-0.4秒)到-2.0伏特(t＝0.41-0.42秒)到0.6伏特(t＝0.43秒)以及最终-0.1伏特(t＝0.44-0.50秒)，而将所得信号自t＝0.2-0.4秒进行积分。阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的混合物(每种组分的浓度：每升0.0050-0.075g)用作标准物。

用里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物(包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热霉(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽和米曲霉β-葡萄糖苷酶融合物的里氏木霉培养液；PCT/US2008/065417)和里氏木霉β-木糖苷酶来进行经预处理的玉米纤维的水解。通过Rasmussen等，2006，Biotechnology andBioengineering 94：869-876描述的使用米曲霉标准培养方法在米曲霉中表达来重组获得里氏木霉β-木糖苷酶。所述特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶如实施例9所描述的来获得。

所述经预处理的玉米纤维的水解在2ml

试管(EppendorfAG，Germany)中在50℃的温度和5.0的pH在50mM琥珀酸中进行。将样本在

Comfort(Eppendorf AG，Germany)中温育，其对每个样本进行不断加热和混合。使用的底物量为在2ml的总样本体积中的2.5w/w％。除添加所述里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物和里氏木霉β-木糖苷酶外，将来自特异腐质霉的乙酰木聚糖酯酶以每g干物质1mg酶的酶加载量添加。所述里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物以每g干物质5mg酶的加载量添加，而里氏木霉β-木糖苷酶以每g干物质1mg酶的加载量添加。在24小时后通过在加热块(Techne Inc.，Burlington NJ，USA)中将所述样本在100℃加热10分钟来终止水解。

通过高压液相层析法使用与具有

515泵、MPSAMillipore膜，

717Plus自动进样器、

柱加热器模块和

2410RI检测器(Waters Corporation，Milford，MA，USA)的前置柱(Micro-Guard Cation H Refill Cartridges，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)串行偶联的两个

HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)进行乙酸的定量。所述层析在60℃以0.4ml/分钟流速的0.005M硫酸进行。

使用下述公式通过确定自所述底物释放的糖量占起始时添加的糖量的百分比来计算转化率。用样本数据的等方差(equal variance)和双尾(two-tailed)分布来进行T-检验。

转化率(％)＝(水解物中的糖量/添加的底物中的糖量)x100

将经预处理的玉米纤维当以每克干物质1mg的酶的酶加载量添加来自特异腐质霉的乙酰木聚糖酯酶连同每克干物质1mg酶的里氏木霉β-木糖苷酶和每克干物质5mg酶的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物时的转化率，与仅添加每克干物质1mg酶的来自里氏木霉的β-木糖苷酶和每克干物质5mg酶的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物时的转化率进行比较，显示相对转化率由100.0显著(p≤0.0519)增加为109.9(表1)。

表1

通过将特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶添加至里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物和里氏木霉β-木糖苷酶的组合中，自底物释放的乙酸由100.0显著(P≤0.0004)增加为236.0(表2)。

表2

实施例12：特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶对四乙酰D-木糖的水解的作用

评价了特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶对四乙酰D-木糖(D-xylose tetraacetate)的水解的作用。特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶如实施例9所描述获得。

四乙酰D-木糖(Benn Chemicals，Dielsdorf，Switzerland)的水解在1.5ml管中以50℃的温度和5.0的pH在50mM琥珀酸中进行48小时。将样本在

Comfort中温育，其对每个样本进行不断加热和混合。使用的底物量为1ml的浓度为1w/w％的四乙酰D-木糖。将对照样本(1ml的底物)与特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶样本(1ml底物+7μl的酶)进行比较。特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶以0.5mg特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶/g干固体的酶加载量添加。在48小时后通过在加热块中在100℃加热样本10分钟来终止水解。

通过HPLC如实施例11所述来分析乙酸的量。向1ml底物(1w/w％的四乙酰D-木糖)添加0.5mg的特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶，得到89.2μmol/ml的计算的释放(表3)。特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶导致的乙酸释放由对照样本(1.9μmol/ml)和特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶样本(91.1μmol/ml)的浓度计算。

表3

样本	乙酸浓度(μmol/ml)	由酶释放的乙酸(μmol/ml)
			对照	1.9
特异腐质霉乙酰木聚糖酯酶	91.1	89.2

生物材料的保藏

依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心/农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection/Agricultural Research Culture Collection)，北区研究中心(Northern Regional Research Center)，Peoria，Illinois，61604，并给予下述的登录号：

保藏物登录号保藏日期

大肠杆菌pHinsAXE2 NRRL B-50076 2007年11月20日

所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由外国专利法律决定授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了题述申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施题述发明的许可，实施题述发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

通过下述编号的段落进一步描述了本发明：

[1]一种具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(d)变体，其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(数个)氨基酸的SEQID NO：2的成熟多肽。

[2]段落1的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列。

[3]段落2的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列。

[4]段落3的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[5]段落4的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[6]段落5的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[7]段落6的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少97％同一性的氨基酸序列。

[8]段落1的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶的片段，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶的片段组成。

[9]段落8的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。

[10]段落8的多肽，其包含SEQ ID NO：2的成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。

[11]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中-高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[12]段落11的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[13]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列。

[14]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。

[15]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。

[16]段落15的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

[17]段落16的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。

[18]段落17的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列具有至少97％同一性的核苷酸序列。

[19]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列组成。

[20]段落19的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

[21]段落19的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。

[22]段落1的多肽，其中所述多肽为SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(数个)氨基酸的变体。

[23]段落1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含于质粒pHinsAXE2中，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50076中。

[24]段落1-23任一所述的多肽，其中所述成熟多肽为SEQ ID NO：2的氨基酸20到377。

[25]段落1-24任一所述的多肽，其中所述成熟多肽编码序列为SEQ IDNO：1的核苷酸58到1266。

[26]分离的多核苷酸，其包含编码段落1-25任一所述的多肽的核苷酸序列。

[27]段落26的分离多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

[28]核酸构建体，其包含段落26或27的多核苷酸，所述多核苷酸可操作连接于一个或多个(数个)在表达宿主中指导该多肽产生的控制序列。

[29]重组表达载体，其包含段落28的核酸构建体。

[30]重组宿主细胞，其包含段落28的核酸构建体。

[31]产生段落1-25任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于该多肽产生的条件下培养细胞，其以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所述多肽。

[32]产生段落1-25任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

[33]产生亲本细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码段落1-25任一所述多肽的核苷酸序列，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

[34]突变体细胞，由段落33的方法产生。

[35]段落34的突变体细胞，进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。

[36]产生蛋白质的方法，包括：(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养段落35的突变体细胞；和(b)回收该蛋白质。

[37]段落26或27所述的分离的多核苷酸，其通过如下获得：(a)在至少中-高严紧条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所述杂交多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

[38]段落37的分离的多核苷酸，其通过如下获得：(a)在至少高严紧条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离所述杂交多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

[39]段落37或38所述的分离的多核苷酸，其中所述成熟多肽编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸58到1266。

[40]产生多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的突变体核苷酸序列，包括：(a)将至少一个突变导入SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中，其中所述突变体核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成的多肽；和(b)回收所述包含所述突变体核苷酸序列的多核苷酸。

[41]突变体多核苷酸，由段落40的方法产生。

[42]产生多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的段落41的突变体多核苷酸的细胞；和(b)回收所述多肽。

[43]产生段落1-25任一所述多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

[44]转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码段落1-25任一所述的多肽的多核苷酸转化。

[45]双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落26或27的多核苷酸的亚序列，其中任选地所述dsRNA为siRNA或miRNA分子。

[46]段落45的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多双链体核苷酸。

[47]在细胞中抑制具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法，其包括对所述细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含段落26或27的多核苷酸的亚序列。

[48]段落47的方法，其中所述dsRNA在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多双链体核苷酸。

[49]核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因可操作连接于编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1到19，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1到19组成，其中所述基因对所述核苷酸序列为外源的。

[50]重组表达载体，其包含段落49的核酸构建体。

[51]重组宿主细胞，其包含段落49的核酸构建体。

[52]产生蛋白质的方法，包括：(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养段落51所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

[53]降解含有木聚糖的材料的方法，其包括用段落1-25任一所述的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽处理所述含有木聚糖的材料。

[54]段落53的方法，进一步包括用木聚糖降解酶处理所述含有木聚糖的材料。

[55]段落54的方法，其中所述木聚糖降解酶选自下组：木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其组合。

[56]段落53-55任一所述的方法，其中所述含有木聚糖的材料为动物饲料。

[57]段落53-55任一所述的方法，其中所述含有木聚糖的材料为Kraft浆。

[58]段落53-55任一所述的方法，其中所述含有木聚糖的材料为纤维素生物质或木质纤维素生物质。

在本文中描述和要求保护的发明在范围上并不受本文公开的特定方面所限，因为这些方面意欲作为本发明的数个方面的说明。任何等同的方面意欲在本发明的范围内。事实上从前述的描述中，除本文中显示和描述的那些之外，多种对本发明的修改对本领域技术人员是显而易见的。这样的修改亦意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。

Claims

1.一种具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其选自下组：

2.权利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。

3.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列组成。

4.权利要求1的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含于质粒pHinsAXE2中，所述质粒包含于大肠杆菌NRRL B-50076中。

5.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-4中任一项所述的多肽的核苷酸序列。

6.核酸构建体，其包含权利要求5的多核苷酸，所述多核苷酸可操作连接于一个或多个(数个)控制序列，所述控制序列指导该多肽在表达宿主中产生。

7.重组宿主细胞，其包含权利要求7的核酸构建体。

8.产生权利要求1-4中任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所得多肽。

9.产生权利要求1-4中任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和(b)回收所得多肽。

10.产生亲本细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

11.通过权利要求10的方法产生的突变体细胞。

12.产生权利要求1-4中任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

13.转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码权利要求1-4中任一项所述的多肽的多核苷酸转化。

14.双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含权利要求5的多核苷酸的亚序列，其中任选地所述dsRNA为siRNA或miRNA分子。

15.在细胞中抑制具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法，其包括对所述细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含权利要求5的多核苷酸的亚序列。

16.核酸构建体，其包含可操作连接于编码信号肽的核苷酸序列的编码蛋白质的基因，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1到19，或由SEQID NO：2的氨基酸1到19组成，其中所述基因对所述核苷酸序列是外源的。

17.重组宿主细胞，其包含权利要求16的核酸构建体。

18.产生蛋白质的方法，包括：(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养权利要求17的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

19.降解含有木聚糖的材料的方法，其包括用权利要求1-4中任一项的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽处理所述含有木聚糖的材料。

20.权利要求19的方法，进一步包含用木聚糖降解酶处理所述含有木聚糖的材料。