JP2001054383A - アセチルキシランエステラーゼ活性を有するタンパク質及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 耐酸性や耐熱性に優れた、新規なアセチルキ
シランエステラーゼ活性を有するタンパク質を提供する
こと。 【解決手段】 アセチルキシランエステラーゼ活性を有
するタンパク質が、ケトミウム・グラシレの如きケトミ
ウム属の真菌を用いて生産される。また、そのようなタ
ンパク質を動物飼料組成物に含有させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、アセチルキシランエステラーゼ
活性を有するタンパク質及びそれをコードするＤＮＡに
係り、特に、真菌：ケトミウム（Chaetomium）属（ケタ
マカビ属）の菌株を用いて得られる、アセチルキシラン
エステラーゼ活性を有するタンパク質、換言すればアセ
チルキシランエステラーゼと、そのようなタンパク質を
コードするＤＮＡ配列に関するものである。

【０００２】

【背景技術】従来から、植物組織の細胞壁の堅い構造
が、セルロース及びヘミセルロースの存在によるもので
あることは、よく知られているところである。そして、
その中で、ヘミセルロースは、キシラン、ペクチン、リ
グニンからなるものであって、その主成分となるものは
キシランであるが、このキシランは、Ｄ−キシロピラノ
ースがβ−１，４結合したホモポリマー主鎖を有してい
る。そして、その主鎖の水酸基には、Ｌ−アラビノー
ス、４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸、酢酸、フェル
ラ酸及びｐ−クマル酸等が結合しているが、その結合の
程度は、起源となる植物により大きく異なり、各種の特
徴を示している。また、それらの結合によって、植物組
織中のキシランの酵素分解が著しく妨害されることとな
るのであり、その結果、家畜等の動物に与えられる飼料
において、そのような動物に対する飼料の栄養価が低
い、農産廃棄物が多い等の問題を内在している。

【０００３】ところで、現在、家畜等の動物に与えられ
る飼料の分解吸収率を上昇せしめるために、キシラナー
ゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシロシダーゼ、グルク
ロニダーゼ等のキシラナーゼ剤を飼料に添加する方法が
採用されているが、それは、キシランの分解には、未だ
充分ではなかったのである。

【０００４】尤も、そのようなキシラナーゼ剤と共に、
更に、アセチルキシランエステラーゼを飼料に添加すれ
ば、相乗的によい結果が得られることが、特開平５−１
２３１７３号公報において明らかにされており、そこで
は、真菌由来のアセチルキシランエステラーゼとして、
アスペルギルス属、トリコデルマ属、又はシゾフィルム
属由来のものの存在が示されている。

【０００５】

【解決課題】ここにおいて、本発明者らは、アセチルキ
シランエステラーゼを飼料添加物として有利に用いるべ
く、耐酸性、耐熱性を有するアセチルキシランエステラ
ーゼを得るために、その生産菌を真菌類に求め、鋭意検
索した結果、ケトミウム・グラシレ（Chaetomium graci
le）で代表されるケトミウム属（ケタマカビ属）の菌株
が、目的とするアセチルキシランエステラーゼを有利に
生産し得ることを見出したのである。

【０００６】従って、本発明の解決課題とするところ
は、新規なアセチルキシランエステラーゼ、換言すれば
新規なアセチルキシランエステラーゼ活性を有するタン
パク質を提供することにあり、また、そのようなタンパ
ク質をコードするＤＮＡフラグメントを提供することに
あり、更に、耐酸性、耐熱性に優れたアセチルキシラン
エステラーゼ活性を有する、飼料添加物として有用なタ
ンパク質を提供することにある。

【０００７】

【解決手段】そして、本発明は、かくの如き課題の解決
のために、真菌ケトミウム属由来のアセチルキシランエ
ステラーゼ活性を有するタンパク質を、その要旨とする
ものであり、そこにおいては、かかる真菌として、ケト
ミウム・グラシレが有利に採用されることとなるのであ
る。

【０００８】また、本発明は、後掲の配列表の配列番
号：１にて示されるＮ末アミノ酸配列を有するアセチル
キシランエステラーゼ活性を有するタンパク質を、その
要旨とするものである。

【０００９】なお、かかるタンパク質は、アセチルキシ
ランエステラーゼをコードするＤＮＡの発現生成物であ
るところから、本発明にあっては、また、上述の如きタ
ンパク質をコードするＤＮＡフラグメントをも、その要
旨としているのであり、特に、後掲の配列表の配列番
号：２にて示される塩基配列を有するＤＮＡフラグメン
トであることを特徴としている。

【００１０】加えて、本発明にあっては、前述の如き本
発明に従うタンパク質を、飼料添加物として用いるとこ
ろにも、大きな特徴を有するものであって、前述したタ
ンパク質又は該タンパク質と共に、他のキシラン分解酵
素を含有せしめてなる動物飼料組成物をも、その要旨と
しているのである。

【００１１】

【発明の実施の形態】要するに、本発明は、アセチルキ
シランエステラーゼ生産菌として、真菌類であるケトミ
ウム属（ケタマカビ属：Chaetomium）の菌株が、アセチ
ルキシランエステラーゼ生産性に優れていることを見出
したことに基づいて完成されたものであり、従って、そ
のような菌株を常法に従って培養することにより、目的
とするアセチルキシランエステラーゼ活性を有するタン
パク質（アセチルキシランエステラーゼからなる酵素）
を得ることが出来るのである。なお、そのようなタンパ
ク質は、培養物より公知の手法にて採取、精製されるこ
ととなる。

【００１２】また、かかるタンパク質の生産に有用であ
る、ケトミウム属の菌株としては、代表的には、ケトミ
ウム・グラシレ（Chaetomium gracile）が用いられる
が、その他にも、ケトミウム・アルボアレヌルム（Chae
tomium alboarenulum ）、ケトミウム・グロボサム（Ch
aetomium globosum ）、ケトミウム・サーモフィラム
（Chaetomium thermophilum ）等の公知の菌株を挙げる
ことが出来る。それら後の３つの菌株の染色体ＤＮＡ
と、先のケトミウム・グラシレより得たアセチルキシラ
ンエステラーゼ遺伝子とが、ハイブリダイズすることが
確認されていることよりして、それら菌株は、何れも、
同様な特性を有しているものと認められるのである。

【００１３】ところで、アセチルキシランエステラーゼ
生産性を高めるためには、アセチルキシランエステラー
ゼをコードするＤＮＡのクローニング、シークエンスを
行なう必要があり、そのためには、次のような操作が採
用される。先ず、アセチルキシランエステラーゼをコー
ドするＤＮＡフラグメントを、ケトミウム属の菌株から
得られる染色体ＤＮＡより選び出し、ベクターに組み込
み、組換えプラスミドを取得した後、その組換えプラス
ミドを導入した形質転換体を構築するという方法によ
り、ＤＮＡを取得するのである。

【００１４】そして、このようにして得られたアセチル
キシランエステラーゼをコードするＤＮＡは、後述する
実施例の決定法に従って、後掲の配列表の配列番号：２
にて示される塩基配列を有していることが、明らかとな
っている。

【００１５】なお、具体的には、上記の如くしてＤＮＡ
を取得するに際しては、先ず、ケトミウム属の菌株、例
えばケトミウム・グラシレの菌体を凍結粉砕し、ＳＤＳ
処理の後、フェノール処理を繰り返し、そしてエタノー
ル沈殿法により、ＤＮＡ・ＲＮＡ混合物からなる糸状の
塊を得る。次いで、このＤＮＡ・ＲＮＡ混合物の塊を溶
解した後、リボヌクレアーゼ処理を行なってＲＮＡを分
解せしめ、再びエタノール沈殿法によって、染色体ＤＮ
Ａを得るようにする。その後、その染色体ＤＮＡを制限
酵素で消化せしめ、得られたＤＮＡ断片をλファージＤ
ＮＡとライゲーションし、更に、パッケージング、大腸
菌への感染、プラークハイブリダイゼーションを行なっ
て、目的とするＤＮＡを含むファージを選択するのであ
る。そして、このファージＤＮＡより、目的遺伝子を、
制限酵素により切り出した後、ベクタープラスミドＤＮ
Ａとライゲーションして、組換えプラスミドを得るので
ある。次いで、この組換えプラスミドＤＮＡを大腸菌に
取り込ませて、形質転換体を得、更に、その得られた形
質転換体の中から、アセチルキシランエステラーゼをコ
ードするＤＮＡフラグメントを組み込んだプラスミドＤ
ＮＡを保持する形質転換体大腸菌を選択するのである。

【００１６】また、本発明に従うタンパク質を生産性よ
く得るには、上記したＤＮＡを適当な受容菌、例えば大
腸菌やケトミウム属、アスペルギルス（Aspergillus ）
属の真菌、サッカロミセス（Saccharomyces ）属の酵母
等に入れ、発現させれば、真菌ケトミウム属由来のＤＮ
Ａの発現生成物であるアセチルキシランエステラーゼを
得ることが出来るのである。

【００１７】そして、かくの如くして得られたアセチル
キシランエステラーゼ活性を有するタンパク質、換言す
ればアセチルキシランエステラーゼ（酵素）は、キシラ
ンの脱アセチル化のために、有効に利用され、またキシ
ランを分解する諸工程で、好適に用いられることとなる
が、また、それは、他のキシラン分解酵素類、例えばキ
シラナーゼ類、アラビノフラノシダーゼ類、キシロシダ
ーゼ類、グルクロニダーゼ類等と組み合わせて、有利に
用いられることとなる。

【００１８】特に、本発明に従って得られるアセチルキ
シランエステラーゼは、後の実施例においても明らかに
されるように、ｐＨ３において、中性域の６割以上の活
性を残存する耐酸性を有しているところから、飼料添加
物として、単独で或いは上記した他のキシラン分解酵素
と組み合わされて、優れた特徴を発揮するのである。即
ち、飼料添加物は、家畜等の動物に摂取されると、胃中
で低ｐＨ条件下にさらされることとなるが、本発明によ
って提供されるアセチルキシランエステラーゼは、家畜
等の動物の胃液の低ｐＨ下においても失活し難い性質を
有しており、それによって、内臓内における飼料中キシ
ランの分解が効果的に進行せしめられ得て、その吸収率
が上昇することとなる他、更には廃棄物の減少にもつな
がることとなるのである。

【００１９】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更
に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、その
ような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるも
のではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、
当業者の知識に基づき、種々なる変更、修正、改良等を
加えられ得るものであることが理解されるべきである。
なお、以下の実施例においては、制限酵素として、Ｂａ
ｍＨＩを用い、またベクタープラスミドＤＮＡとして
は、ｐＵＣ１１８を使用した例として、示されている。
また、実施例中の百分率は、特に断わりのない限り、何
れも重量基準にて示されるものである。

【００２０】（１）ケトミウム・グラシレの培養 ケトミウム・グラシレＩＦＯ６５６８株のスラント５×
５ｍｍ片を、５００ｍＬの三角フラスコを用いて、１０
０ｍＬの１／２ＳＰ培地（２．８％スターチ、０．９％
ペプトン、０．１％塩化カルシウム二水塩、０．０７５
％硫酸マグネシウム七水塩、０．０５％リン酸二水素カ
リウム、及び０．０２５％塩化カリウム）に植菌した
後、３０℃で３日間、２００ｒｐｍで振とう培養し、本
培養の種とした。

【００２１】そして、固体培養の場合にあっては、上記
の種を滅菌水で８０倍に希釈し、その８ｍＬを、５００
ｍＬの三角フラスコ内に収容した、オートクレーブ滅菌
した１０ｇの小麦ふすまに移植せしめ、水分が均一にな
るようによく攪拌した後、３０℃で４日間、培養するこ
とにより、行なった。培地原料１ｇあたり１．１単位の
活性を得た。

【００２２】また、液体培養に際しては、５００ｍＬの
三角フラスコを使用して、１ｍＬの前記した種を、１０
０ｍＬのキシランを炭素源とした液体培地（０．４％硝
酸ナトリウム、０．２％リン酸二カリウム、０．１％硫
酸マグネシウム七水塩、０．１％塩化カリウム、０．０
０２％硫酸第一鉄、０．４％キシラン、ｐＨ６．８）若
しくは１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩
化ナトリウム及び１％グルコースからなる栄養培地（ｐ
Ｈ７．１）に植菌し、３０℃で４〜６日間、２００ｒｐ
ｍで振とう培養することにより、実施した。培養液１０
ｍＬあたり２．５単位の活性を得た。

【００２３】（２）アセチルキシランエステラーゼの精
製 上記の固体培養により得られた麹を、三角フラスコから
掻き出し、そのようなフラスコの６０本分をまとめ、粉
砕した後、ロート型の抽出槽に充填した。次いで、かか
る抽出槽の上部から３７℃の水を加え、約４時間をかけ
て、ゆっくり抽出し、抽出液３０００ｍＬを得た後、Ｕ
Ｆ膜（カットオフ値：１００００；独国ミリポア社製）
により、５４０ｍＬにまで濃縮した。そして、その濃縮
液に、９５％エタノールを、エタノール濃度が７０％に
なるまで加えた。生じた沈殿を遠心分離で回収し、１０
００ｍＬの１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶解せ
しめた後、エタノール、塩類を除くために、ＵＦ膜によ
り脱塩濃縮を行なった。なお、この脱塩濃縮は、以下の
ようにして行なった。先ず、沈殿溶解液を濃縮し、およ
そ５００ｍＬになったら１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）を５００ｍＬ加え、再び濃縮を行なう。この操作を
繰り返し、濃縮液の電導度が５０μＳ／ｃｍ以下になる
まで続け、濃縮液６４０ｍＬを得た。

【００２４】次いで、かかる濃縮液を、５ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した樹脂充填吸着カラム
（φ４５ｍｍ×Ｌ４５０ｍｍ：東ソー株式会社製ＤＥＡ
Ｅ TOYOPEARL ６５０Ｃ）に吸着させた後、０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で溶出し、アセチルキシランエステラーゼを回収した。
更に、この得られた活性画分を、透析により電導度を低
下せしめた後、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平
衡化した吸着カラム（φ２５ｍｍ×Ｌ８０ｍｍ：スウェ
ーデン国ファルマシア社製ＤＥＡＥ sepharose Fast F
low ）にチャージし、雑タンパクを吸着させ、アセチル
キシランエステラーゼを素通り画分として得た。更に、
この活性画分をＵＦ膜により３０ｍＬにまで濃縮し、凍
結乾燥を行ない、部分精製物粉末２ｇを得た。この得ら
れた粉末は、４０ｕ／ｇ・solid のアセチルキシランエ
ステラーゼ活性を有し、その比活性は、２６０ｕ／ｇ・
protein であった。

【００２５】（３）アセチルキシランエステラーゼ活性
測定法 −基質の調製− アセチルキシランエステラーゼ活性の測定時に基質とし
て使用されるアセチルキシランは、市販されていないと
ころから、ここでは、キシランを用い、それをアセチル
化することにより、アセチルキシランを得た。なお、か
かる基質としてのアセチルキシランの調製は、Johnson
らの文献［K.G.Johnson et.al.,Methodsin Enzymol.,
１６０，５５１〜５６０（１９８８）］を参考にして、
以下のようにして行なった。即ち、先ず、カラマツより
調製したキシラン１２ｇを３２０ｍＬのジメチルスルホ
キシドに懸濁させた後、５５℃まで加温し、キシランを
溶解した。更にその後、２．５ｇの四ホウ酸四カリウム
四水塩を加え、１０分間攪拌した。次いで、予め６０℃
に温めておいた無水酢酸２５０ｍＬを加えた後、加熱を
やめ、攪拌しながら放熱させた。室温まで冷えた後、透
析チューブに移し、ジメチルスルホキシド及び酢酸が抜
けるまで、流水に対して５日間透析を行ない、更に蒸留
水に対し、２４時間透析を行なった。そして、アルカリ
により、ｐＨを６．０に調整した後、凍結乾燥を行な
い、目的とするアセチルキシラン粉末１３ｇを得た。

【００２６】−活性測定− 上記の方法で合成したアセチルキシランを用い、それが
１０％濃度となるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．０）で溶解する。次いで、その０．３ｍＬを試験管
に分注し、酵素液の０．１５ｍＬを加えて、３７℃でイ
ンキュベートする。そして、正確に１５分の経過の後、
２．５５ｍＬのエタノールを加え、氷水中で１時間冷却
した後、遠心分離し、その上清を０．１％リン酸で１０
倍に希釈せしめ、更に、０．４５μｍメンブランフィル
タ（独国：ミリポア社製）で濾過せしめ、更にＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフィ）にて遊離した酢酸を定量
する。活性表示は、上記の条件で１分間に１μｍｏｌの
酢酸を遊離する酵素量を１単位（ｕ）とした。

【００２７】なお、ＨＰＬＣの測定条件は、以下の通り
である。カラム：Waters Organic acid column φ７．
８×３００ｍｍ（Nihon Waters社製）、ガードカラム：
Waters Organic acid column用 φ６．０×５０ｍｍ
（Nihon Waters社製）、溶媒：０．１％リン酸、流速：
０．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２００ｎｍ、カラム温度：
８０℃。

【００２８】（４）アセチルキシランエステラーゼのＮ
末端アミノ酸配列の決定 前記実験（２）において、ケトミウム・グラシレ培養液
より得たアセチルキシランエステラーゼの部分精製物を
用い、それを、レムリ（ Laemmli）法で処理した後、１
２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用した電
気泳動を行なった。そして、その電気泳動したゲルから
アセチルキシランエステラーゼタンパクをエレクトロプ
ロッティングして、気相配列決定装置を使用し、常法に
従って、Ｎ末端のアミノ酸配列を決定した。そして、そ
の決定したＮ末端アミノ酸配列を、後掲の配列表におい
て、配列番号：１として示した。

【００２９】（５）アセチルキシランエステラーゼの酵
素化学的性質 先の実験（２）において得られた、ケトミウム・グラシ
レ株からのアセチルキシランエステラーゼ部分精製物に
ついて、その酵素化学的性質、具体的には至適ｐＨ、ｐ
Ｈ安定性、至適温度及び温度安定性について、それぞ
れ、以下の如くして測定した。

【００３０】ａ）至適ｐＨ 各種緩衝液を用いて、ｐＨ１〜８の基質溶液と酵素溶液
を調製した後、それぞれの溶液について、３７℃で、各
ｐＨ条件下における活性測定を行ない、至適ｐＨを調べ
た。その結果を図１に示すが、至適ｐＨは、ｐＨ６〜７
であることが認められる。

【００３１】ｂ）ｐＨ安定性 各種緩衝液を用いて、ｐＨ２〜６の種々なる酵素溶液を
調製し、そしてそれら溶液を３７℃の温度に２０時間放
置した。その後、残存する活性を測定し、その結果を図
２に示した。かかる図２の結果から明らかなように、ｐ
Ｈ３では、６割以上の残存活性を示し、更にｐＨ２で
も、２割の残存活性を示している。

【００３２】ｃ）至適温度 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて基質溶液
及び酵素溶液を、それぞれ、調製した。そして、それぞ
れの溶液について、２０〜８０℃で活性測定を行ない、
その至適温度を調べた。得られた結果を図３に示すが、
５０〜６０℃で高い活性を示すことが認められる。

【００３３】ｄ）温度安定性 ０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、酵素
溶液を調製した。次いで、その得られた酵素溶液を、４
０〜８０℃の各種温度に１５分間放置した後、３７℃
で、残存する活性を測定した。その結果を、図４に示
す。かかる図４から明らかなように、６０℃で８２％、
７０℃で５５％の残存活性を示すことが、認められた。

【００３４】（６）アセチルキシランエステラーゼをコ
ードする染色体ＤＮＡの抽出 ケトミウム・グラシレ株を、１％ペプトン、０．５％酵
母エキス、０．５％塩化ナトリウム、及び２％グルコー
スを含んだ培地１００ｍＬに植菌し、５００ｍＬの三角
フラスコを用いて、３０℃で４日間、２００ｒｐｍに
て、振とう培養した。かかる培養の後、３Ｇ１ガラスフ
ィルタで集菌し、その得られた菌体３ｇを冷却した乳鉢
に移して、液体窒素を用いて凍結粉砕した。次いで、そ
の粉砕した菌体に、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（以下、ＴＥと略称する：ｐＨ７．６）２
ｍＬを加えて、懸濁し、更に、２ｍＬの溶菌溶液（２％
ＳＤＳ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液、ｐＨ７．０）を加えて、ゆっくり攪拌し、数分
間室温に放置した。

【００３５】次いで、かかる室温下に放置された懸濁液
に対して、１２００×Ｇにて、１０分間遠心分離を実施
し、その上清を回収して、それに、２ｍＬのフェノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２
４：１の混液を加え、攪拌した後、更に１２０００×Ｇ
にて、５分間遠心分離した。更に、その得られた上清に
対して、５ｍＬの冷エタノールを加え、−８０℃に１０
分間放置した後、１２０００×Ｇにて、１５分間遠心分
離を実施した。沈殿を、１０ｍＬの冷７０％エタノール
で洗浄した後、減圧乾燥した。

【００３６】そして、その得られた精製物（沈殿）を２
ｍＬのＴＥを加えて溶解せしめ、更に、リボヌクレアー
ゼ５０μｇを加えて、３７℃で、１時間、インキュベー
トした。その後、フェノール：クロロホルム：イソアミ
ルアルコール＝２５：２４：１の混液の２ｍＬを加え、
１２０００×Ｇにて、５分間遠心分離を施し、その上清
を取り出した。更に、かかる遠心分離操作をもう一度繰
り返した。得られた上清に、クロロホルム：イソアミル
アルコール＝２４：１の混液の２ｍＬを加え、１２００
０×Ｇにて、５分間の遠心分離を行ない、更に、その得
られた上清に、０．２ｍＬの５Ｍ塩化ナトリウムと５ｍ
Ｌの冷エタノールを加え、−８０℃にて、１０分間、放
置した後、再び、１２０００×Ｇにて１５分間の遠心分
離を実施した。

【００３７】かくして得られた沈殿を、冷７０％エタノ
ールで洗浄した後、減圧乾燥することにより、目的とす
るケトミウム・グラシレの染色体ＤＮＡ１．１ｍｇを得
た。また、かかる沈殿を０．６ｍＬのＴＥへ溶解し、染
色体ＤＮＡ溶液を得た。

【００３８】（７）ケトミウム・グラシレ染色体ＤＮＡ
ライブラリーの作成及び目的遺伝子の選択 上記の実験（６）にて得られたケトミウム・グラシレ株
の染色体ＤＮＡ５μｇを用い、それを、制限酵素：Ｂａ
ｍＨＩの１２単位を加えた制限酵素用緩衝液［５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化ナト
リウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレ
イトール］の１０μＬ中において、３７℃で１時間、部
分分解せしめた。次いで、この部分分解した染色体ＤＮ
Ａの１μｇと１μｇのλ Dash II predigested Ｂａｍ
ＨＩ（米国 : STRATAGENE 社製）を、TaKaRa DNA ligat
ion system ver. １（宝酒造株式会社製）を使用して、
１５℃で１８時間、ライゲーションを行なった。

【００３９】次いで、この得られたライゲーション溶液
の４μＬと、Gigapack III Gold Packaging Extract
（米国 : STRATAGENE 社製）を使用し、λファージタン
パクへのパッケージングを行ない、ファージ液を得た。

【００４０】次いで、かかるファージ液の７μＬを、１
０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液でＯＤ６６０（６６０ｎｍ
の波長で測定した濁度）を０．０５に調整した、０．２
ｍＬの受容菌：大腸菌液に加え、３７℃で１５分間イン
キュベートした。その後、３ｍＬの０．５％寒天を含む
ＬＢ培地を加え、１．５％寒天を含むＬＢ培地プレート
上に広げて、３７℃で２０時間培養した。ファージが大
腸菌に感染すると、大腸菌が溶菌し、プラークが生じ
る。そのプラークを生じたプレートを４℃で１時間冷却
し、寒天上にナイロンメンブランを２分間載せ、ファー
ジＤＮＡをメンブランに吸着させた。その後、かかるメ
ンブランを、変性溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．
５Ｎ水酸化ナトリウム）で２分間、中和溶液（１．５Ｍ
塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．
０）で５分間、リンス溶液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、
０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．２Ｍトリス塩酸緩
衝液、ｐＨ７．５）で３０秒間、順次、振とうした。濾
紙で水分を除き、ラップに包み、１分間紫外線を当て
て、ＤＮＡをメンブランに固定した。

【００４１】そして、プローブは、アスペルギルス・ニ
ガーのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子を使用し、
ＥＣＬ直接核酸標識検出システム（米国 : Amersham 社
製ＥＣＬ direct nucleic acid labeling and detectio
n system ）を用い、プラークハイブリダイゼーション
を、添付プロトコルに従って行なった。強いシグナルを
示したプラークをピペットで取り、１０ｍＭ硫酸マグネ
シウム溶液の５０μＬに懸濁し、ファージ液とした。更
に、このファージ液を使用し、同様に、大腸菌に感染せ
しめた後、引き続き、プラークハイブリダイゼーション
を行なった。そして、それをもう一度繰り返し、ファー
ジ１０株を単離した。

【００４２】（８）ファージＤＮＡの調製及びサザンハ
イブリダイゼーション 受容菌：大腸菌を、１０ｍＭの硫酸マグネシウムを含む
ＬＢ培地の２０ｍＬに植菌し、３０℃で１８時間振とう
培養した後、遠心分離により、菌体を回収し、１０ｍＬ
の１０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液で懸濁して、受容菌液
とした。

【００４３】次いで、この得られた受容菌液の０．５ｍ
Ｌに、１０μＬの単離したファージのファージ液を加
え、３０℃で１５分間インキュベートした。その後、１
０ｍＬの１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地を加
え、３７℃で７時間、振とう培養した。次いで、１２０
００×Ｇで５分間遠心分離して、その上清を別のチュー
ブに移し、これに、２０μｇのＤＮａｓｅＩと４０μｇ
のＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で３０分間インキュベー
トした。その後、６ｍＬの２．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む２０％ポリエチレングリコール６０００溶液を加え、
４℃で１８時間放置した後、１２０００×Ｇで１０分
間、遠心分離した。

【００４４】次いで、かかる遠心分離により得られた沈
殿を、０．１Ｍ塩化ナトリウム、８ｍＭ硫酸マグネシウ
ム、０．０１％ゼラチンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）の３ｍＬで溶解し、更に３ｍＬのクロ
ロホルムを加えて攪拌した後、その上清を回収した。更
に、その上清に、ＥＤＴＡ及びＳＤＳを加え、２０ｍＭ
のＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳの濃度となるように調整
した後、５５℃で５分間インキュベートした。そして、
等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル＝２５：２４：１の混液で処理し、１２０００×Ｇに
て、５分間、遠心分離することにより、上清を得た。こ
の上清を、更に等量のクロロホルム：イソアミルアルコ
ール＝２４：１の混液で処理し、１２０００×Ｇにて、
５分間、遠心分離した。更に、この得られた上清に、
０．２ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウムと５ｍＬの冷エタノー
ルを加え、−８０℃に１０分間、放置した後、１５００
×Ｇにて１０分間遠心分離し、更に、その沈殿を冷７０
％エタノールで洗浄した後、減圧乾燥せしめ、更に、そ
の得られた沈殿を２００μＬのＴＥで溶解した。

【００４５】また、ファージＤＮＡの２μｇを、制限酵
素：ＢａｍＨＩの１２単位を加えた制限酵素用緩衝液１
０μＬ中で、３７℃、１時間分解せしめた。次いで、そ
の分解物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、
ナイロンメンブランへトランスファーした。そして、ア
スペルギルス・ニガーのアセチルキシランエステラーゼ
遺伝子をプローブとして、前記ＥＣＬ直接核酸標識検出
システムを使用し、サザンハイブリダイゼーションを、
そのようなシステムに添付のプロトコルに従って行なっ
た。選択した１０株のファージのうち、何れにもハイブ
リダイズするバンドが認められた。そしてそのうち、最
も強いシグナルを示したファージの一つを、更なる試験
に供した。

【００４６】（９）組換えプラスミドを用いた大腸菌の
形質転換 ベクターとして使用するプラスミド：ｐＵＣ１１８のＤ
ＮＡ１μｇを、制限酵素：ＢａｍＨＩの１２単位を加え
た制限酵素用緩衝液の１０μＬ中で３７℃、１時間分解
した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動した。そし
て、そのようなアガロースゲルより、GENECLEAN II kit
(米国：BIO 101 社製）を使用して、粘着末端をもった
プラスミド：ｐＵＣ１１８ ＤＮＡ溶液１０μＬを得
た。

【００４７】次いで、上記実験（８）で得た２０μｇの
ファージＤＮＡを、制限酵素：ＢａｍＨＩの１２単位を
加えた制限酵素用緩衝液５０μＬ中で、３７℃、１８時
間分解した。同様に、電気泳動と GENECLEAN II kit を
使用して、アガロースゲルより１０μＬの目的ＤＮＡ溶
液を得た。１μＬのプラスミド：ｐＵＣ１１８ＤＮＡ溶
液と２μＬの目的ＤＮＡ溶液を混合した後、その混合液
に、ＤＮＡ LigationKit Ver.1 （宝酒造株式会社製）
を使用して、１５℃で１８時間インキュベートすること
により、ベクターと目的ＤＮＡを連結させた組換えプラ
スミド溶液を得た。

【００４８】大腸菌：エシェリシア・コリ（Escherichi
a coli）ＨＢ１０１株のコンピテントセル懸濁液０．１
ｍＬに、１０μＬの組換えプラスミド溶液を加え、氷中
に４５分間放置した。次いで、４２℃の恒温槽に１分間
置くことにより、ヒートショックを実施し、直ちに氷中
で２分間冷却した。その後、０．９ｍＬのＬＢ培地を加
えて、３７℃で１時間培養した後、それを５０μｇ／ｍ
Ｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地のプレート（１．５
％寒天）に広げ、３７℃で１６時間培養した。そして、
その生育したコロニーを、５０μｇ／ｍＬアンピシリン
を含んだＬＢ培地の２ｍＬに植菌し、３７℃で１８時
間、振とう培養を行なった。

【００４９】かかる培養の後、菌体を集め、０．３５ｍ
ＬのＳＥＴＴ［１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、８％シュクロース、０．５％ポリオキシエチレン
（１０）オクチルフェニルエーテル、５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ］で懸濁した。更に、２５μＬの１０ｍｇ／ｍＬリゾ
チーム溶液を加え、攪拌した後、沸騰水で４０秒間熱処
理し、次いで、１２０００×Ｇにて５分間遠心分離を行
なった。生じた白い沈殿を取り除き、４０μＬの３Ｍ酢
酸ナトリウムと４２０μＬのイソプロパノールを加え、
激しく攪拌した。更に、４℃で、１２０００×Ｇにて５
分間遠心分離し、得られた沈殿を減圧乾燥した。

【００５０】次いで、かかる得られた沈殿を、５０μＬ
のＴＥで溶解し、５μＬの１０ｍｇ／ｍＬのリボヌクレ
アーゼを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
その後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール＝２５：２４：１の混液で処理し、１２００
０×Ｇにて、５分間の遠心分離を実施した。更に、その
得られた上清に、４０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムと２０
０μＬの冷エタノールを加えた後、−８０℃に１０分
間、放置した。その後、１２０００×Ｇにて５分間遠心
分離し、その得られた沈殿を冷７０％エタノールで洗っ
た後、減圧乾燥した。更に、その得られた沈殿を２０μ
ＬのＴＥで溶解し、組換えプラスミドＤＮＡ溶液とし
た。この１μＬのＤＮＡ溶液に、制限酵素：ＢａｍＨＩ
の１２単位を加えた制限酵素用緩衝液１０μＬ中で、３
７℃で、３０分間インキュベートし、その反応の後、
０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、そして、エ
チジウムブロマイドで染色することによって、トランス
イルミネーターで発色させ、染色体ＤＮＡフラグメント
のバンドの存在を確認した。そして、この染色体ＤＮＡ
フラグメントのバンドが生じた菌株を選択した。

【００５１】（１０）組換え体プラスミドを使用した真
菌の形質転換 アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae, arg
B^- ）株を１００ｍＬのペプトン・デキストリン培地
（２％デキストリン、１％ペプトン、０．５％リン酸二
水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム）に植菌
し、３０℃で４日間培養した後、菌体をガラスフィルタ
で回収した。その得られた菌体の約１ｇに、１０ｍＬの
プロトプラスト化溶液［０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、５ｍｇ／ｍＬ Lysin
g Enzyme（細胞壁分解酵素：Sigma 社製）、５ｍｇ／ｍ
Ｌ cellulase R-10 （SERVA 社製）] を加え、３０℃で
５時間振とうした。次いで、ガラスフィルタを用いた濾
過操作により、未分解部分を取り除き、得られた濾液を
７００×Ｇで５分間、遠心分離した。この遠心分離操作
にて得られた沈殿を、２０ｍＬの０．８Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液で懸濁し、７００×Ｇで５分間、遠心分離し、更
に、これを２回繰り返した。かくして得られた沈殿を、
１０ｍＬの溶液Ｉ［０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）］で懸濁し、７００×Ｇにて５分間、遠心分離する
ことにより、菌体を集め、受容菌とした。更に、この受
容菌プロトプラストを、前記溶液Ｉと溶液II［４０％ポ
リエチレングリコール４０００、５０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）］の４：
１混合液で懸濁し、プロトプラスト溶液とした。

【００５２】次いで、かかるプロトプラスト溶液の０．
２ｍＬに、先の実験（９）で得た組換えプラスミドＤＮ
Ａの３μＬを加え、３０分間、氷冷した後、１ｍＬの前
記溶液IIを加え、よく混合せしめ、室温に２０分間放置
した。次いで、前記溶液Ｉの１０ｍＬを加えて攪拌した
後、遠心分離により、プロトプラストを集め、０．８Ｍ
塩化ナトリウムを含む最少培地（０．２％硝酸ナトリウ
ム、０．１％リン酸二カリウム、０．０５％硫酸マグネ
シウム七水塩、０．０５％塩化カリウム、０．００１％
硫酸第一鉄、３％蔗糖）プレート（寒天１．５％）上に
広げ、その上を、同培地（寒天０．５％を含む）で重層
せしめ、３０℃で培養した。そして、この培養により生
育した形質転換株を、１０ｍＬの最少培地に植菌し、３
０℃で６日間静置培養した後、遠心分離により、菌体を
取り除き、上清のアセチルキシランエステラーゼ活性を
測定した結果、組換え体プラスミドを保持する真菌の生
産する酵素は、１０ｍＬの培養液当たり、５単位であっ
た。

【００５３】（１１）ケトミウム・グラシレのアセチル
キシランエステラーゼ遺伝子の配列決定 先の実験（９）で得たｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイト
に、アセチルキシランエステラーゼ遺伝子を導入した組
換えプラスミドＤＮＡを用い、サイクルシークエンス法
により、塩基配列を決定した。なお、かかる組換えプラ
スミドは、先の実験（１０）において導入した遺伝子が
アセチルキシランエステラーゼをコードすると確認出来
たものである。そして、かかるサイクルシークエンス法
により決定された塩基配列が、配列番号：２として、後
に示されている。

【００５４】（１２）他のケトミウム属菌株のサザンハ
イブリダイゼーション 前記の実験（６）と同様な手法に従って、ケトミウム・
アルボアレヌルム、ケトミウム・グロボサム、又はケト
ミウム・サーモフィラムより、染色体ＤＮＡ溶液を得
た。次いで、ケトミウム・グラシレと共に、上記菌株の
それぞれの染色体ＤＮＡ２０μｇを用いて、それらを、
制限酵素：ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、及びＰ
ｓｔＩの何れか１種類の１２単位を加えた制限酵素用緩
衝液の１０μＬ中において、３７℃で、１８時間分解し
た。更にその後、その分解物を０．８％アガロースゲル
で電気泳動した後、ナイロンメンブランへトランスファ
ーした。そして、配列番号：２に示した塩基配列をもつ
ケトミウム・グラシレのアセチルキシランエステラーゼ
遺伝子をプローブとして、前記したＥＣＬ直接核酸標識
検出システムを使用し、サザンハイブリダイゼーション
を、そのようなシステムに添付のプロトコルに従って行
なった。

【００５５】かかるサザンハイブリダイゼーションの結
果が、図５に示されており、そこでは、レーンの中で、
黒くなっている部分が、プローブがハイブリダイズした
部分を示している。従って、この図５より明らかなよう
に、得られたシグナルの濃さに差はあるが、ケトミウム
属の３種の何れの菌株の染色体ＤＮＡにもハイブリダイ
ズするバンドが認められるところから、ケトミウム・グ
ラシレと似たような塩基配列を有し、更には同様な特性
を有していると考えられるのである。

【００５６】なお、図５においては、レーン１：λ／Ｈ
ｉｎｄIII マーカー、レーン２：ケトミウム・グラシ
レ、ＢａｍＨＩ、レーン３〜６：ケトミウム・アルボア
レヌルム、順にＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、Ｐ
ｓｔＩ、レーン７〜１０：ケトミウム・グロボサム、順
にＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、レー
ン１１〜１４：ケトミウム・サーモフィラム、順にＢａ
ｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、レーン１
５：λ／ＨｉｎｄIII マーカーについて、それぞれの結
果を示している。

【００５７】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、アセチルキシランエステラーゼ活性に優れた
タンパク質（酵素）が有利に提供され、また、そのよう
なタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントが提供さ
れ得るのであり、しかも、そのようなアセチルキシラン
エステラーゼ活性は、耐酸性や耐熱性に優れているとこ
ろから、家畜等の動物の胃液の低ｐＨ下においても、失
活され難いものであるところから、動物の内臓内におけ
る飼料中のキシランの分解が、より効果的に進行し、そ
の吸収率が上昇する他、廃棄物の減少にもつながる等の
特徴を発揮するものである。

【００５８】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Thr Leu Thr Gln Val Thr Asn Phe 1 5

【００５９】 配列番号：２ 配列の長さ：２１６７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ケトミウム・グラシレ（ Chaetomium gracile ） 菌名：ＩＦＯ６５６８ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：855..2010 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：855..929 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：930..2007 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号: CAAT signal 存在位置：572..576 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号: CAAT signal 存在位置：685..688 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号: TATA signal 存在位置：767..771 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号: intron 存在位置：1545..1593 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCCTCGAACC CTTTCGTGTC CACTGCAACA TCTTGGCTGC TGGAACTGGG GATGCTCTGA 60 TGCTACCCAG CTGGTGGGAT TGCATGTTCC CGTCGTCCGG TCCGTGGTGT TGAACGCAGA 120 AGCGAGCCGG GTATCGACGA GAAATGTCAG AATTTGCGAA AACAGGAATT TACATCTTTC 180 GGCAGTTGCG AAAGTTTAGC TTCGAGAACG TGCGTCGAAG GGAAGAGAAC ATTACTTGGG 240 GTGGTCCTGC GCCTTTCCTG GTGGGGCTTA CTGTAGTCTT GTAACGAATT CAAGCTCCGC 300 CGGCAACTGA GCAGGACTAA GACCTCCATT CTGCTCCTCC CGTGTTTCAA GCTACTGATC 360 CGCCATCCGT TGGGAGTCCA CGAACACGGC AAAATTTTAT TTCACTAAAA TGAATATCAT 420 GTTGCCATCT CACCGTCTGA CAGCGAGCAT TCTCTTAGCC TTCTCCAGCT TCACTCCTGC 480 CACCCGGGGG CTTCATCCAG AGGGCTCCCG AGAATGAACA GAACCGCAAA CCTTAGCCCC 540 GGGAAGACCG CAGCCTAGAT CGGGGAGGAT GCCAATGACA GGCATCCCTG TGCCGTCTCT 600 ACGGTTGATC CGGAGCTCTA CCGTCCGACA GCCAACGCCC GCCCGCCTGG TCTCCTCACG 660 CTGGACCGCT CCGATGTCAC GGTGCAATGA TACGCCATGG AAATCACCCA AAATGTACAT 720 AGTAGCTCTC GGCGGCTGGT TAGTATGCAG GGTACGACAG CGAAGCTATA AGAGGCAACG 780 GCACGCACTG CGGCAATCAT GATGGCGATC AGCAAGCATC AGGTCACAGG AGTCAATCTC 840 AACCGCCGTC CGTC ATG AAA GTG TCC GCC ATC GTC TCG AGC CTT CTG GCT 890 Met Lys Val Ser Ala Ile Val Ser Ser Leu Leu Ala -25 -20 -15 CTG GCC CCA TTC TCA GTC GCC GCT GAG ATC GTC AAG CGG GCC ACC CTC 938 Leu Ala Pro Phe Ser Val Ala Ala Glu Ile Val Lys Arg Ala Thr Leu -10 -5 1 ACC CAG GTG ACC AAC TTC GGC TCA AAC CCT TCG GGT GCC AGG ATG TAC 986 Thr Gln Val Thr Asn Phe Gly Ser Asn Pro Ser Gly Ala Arg Met Tyr 5 10 15 ATC TAC GTC CCC GAC AAG CTG CAG TCC AAC CCG GCG ATC CTC ACT GCC 1034 Ile Tyr Val Pro Asp Lys Leu Gln Ser Asn Pro Ala Ile Leu Thr Ala 20 25 30 35 GTC CAT TAC TGC ACC GGC ACC GCC AAC GCC TTC TAT ACT GGC ACC CCC 1082 Val His Tyr Cys Thr Gly Thr Ala Asn Ala Phe Tyr Thr Gly Thr Pro 40 45 50 TAT GCT CGC CTG GCC GAT CAG TAC GGC TTC ATC GTC ATC TAC CCA GAA 1130 Tyr Ala Arg Leu Ala Asp Gln Tyr Gly Phe Ile Val Ile Tyr Pro Glu 55 60 65 TCG CCT CAC GAC GGC GGC TGC TGG GAT GTC TCG TCT CGG GCC ACC CTC 1178 Ser Pro His Asp Gly Gly Cys Trp Asp Val Ser Ser Arg Ala Thr Leu 70 75 80 ACC CAC AAT GGC GGC GGC GAC AGC AAC TCG ATC GCC AAC ATG GTG ACT 1126 Thr His Asn Gly Gly Gly Asp Ser Asn Ser Ile Ala Asn Met Val Thr 85 90 95 TAC ACC ATC AAC CAG TAC AAA GCC GAC CGT AAC CGC GTC TTC GTG GCT 1274 Tyr Thr Ile Asn Gln Tyr Lys Ala Asp Arg Asn Arg Val Phe Val Ala 100 105 110 115 GGT ACC AGC TCT GGC GCC ATG ATG ACC AAC GTC CTT TCT GCA ACC TAC 1322 Gly Thr Ser Ser Gly Ala Met Met Thr Asn Val Leu Ser Ala Thr Tyr 120 125 130 CCG GAT CTC TTC AAG GCT GCT AGT GCT TAT GCG GGC GTC CCT GCT GGC 1370 Pro Asp Leu Phe Lys Ala Ala Ser Ala Tyr Ala Gly Val Pro Ala Gly 135 140 145 TGC TTC TAC ACG GGC ACC GTG GCT GGT TGG AAC GAC ACC TGC GCC AAG 1418 Cys Phe Tyr Thr Gly Thr Val Ala Gly Trp Asn Asp Thr Cys Ala Lys 150 155 160 GGT CAG TCC GTC ACC ACC CAG AGC GCA TGG GCT CAG ACC GCT CTG AAC 1466 Gly Gln Ser Val Thr Thr Gln Ser Ala Trp Ala Gln Thr Ala Leu Asn 165 170 175 ATG TAC CCC GGC TAC ACC GGC CCA CGC CCC AAG ATG TTG ATC CAC CAC 1514 Met Tyr Pro Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Pro Lys Met Leu Ile His His 180 185 190 195 GGC TCG GCC GAC ACG ACC ATC TAC CCC CAG GTAAGATAGC CTGCTCGAGT 1564 Gly Ser Ala Asp Thr Thr Ile Tyr Pro Gln 200 205 CCGAAGTTCG TGAAGTTAAC ATTCCCCAG AAC TTC AAC GAG ACC CTC AAG CAG 1617 Asn Phe Asn Glu Thr Leu Lys Gln 210 TGG GCT GGT GTC TTG GGC TAC ACC TAC GGC CAG CCC CAG CAG ACC CTC 1665 Trp Ala Gly Val Leu Gly Tyr Thr Tyr Gly Gln Pro Gln Gln Thr Leu 215 220 225 CCC GGC AAC CCC TCG TCC GAG TAC ACC AAG TAT GTG TAC GGG CCG AAC 1713 Pro Gly Asn Pro Ser Ser Glu Tyr Thr Lys Tyr Val Tyr Gly Pro Asn 230 235 240 245 CTG GTC GGC ATC TAC GGT ACG GGT ATC ACC CAC AAT ATC CCT GTC GAC 1761 Leu Val Gly Ile Tyr Gly Thr Gly Ile Thr His Asn Ile Pro Val Asp 250 255 260 GGC GCC GGT GAC ATG GAG TGG TTC GGC ATC ACC GGC TCC AGC ACC CCG 1809 Gly Ala Gly Asp Met Glu Trp Phe Gly Ile Thr Gly Ser Ser Thr Pro 265 270 275 ACG ACC ACC AGC ACT GCC CCT GGC ACC ACG AGC ACG AGC ACC AAG TCC 1857 Thr Thr Thr Ser Thr Ala Pro Gly Thr Thr Ser Thr Ser Thr Lys Ser 280 285 290 TCC AGC ACC AGC ACC GCC CCT ACC TCG GGT CCT TCT GGT TGT ACT TCC 1905 Ser Ser Thr Ser Thr Ala Pro Thr Ser Gly Pro Ser Gly Cys Thr Ser 295 300 305 GCT CGC TGG GGT CAG TGT GGG GGC ATC GGC TGG ACT GGA TGC ACC GTT 1953 Ala Arg Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Cys Thr Val 310 315 320 325 TGC GCT TCC CCG TGG AAG TGC ACC TAT GCC AAC GAC TGG TAC TCG CAG 2001 Cys Ala Ser Pro Trp Lys Cys Thr Tyr Ala Asn Asp Trp Tyr Ser Gln 330 335 340 TGC TTG TAAGGCTCTG GAGAGACGTC TTGGAAGCTA GCGACGAGGA TGCGGACAGA 2057 Cys Leu 343 AACCTCTCGG CGAGGGGTAG ATATAGCTGG TCATGATCAC TGTACATAAC GGCTGCATTG 2117 TACAATAAAG AATCCCCTCA CTATAAGTTT ACCCGATTTG TAGCAAGCTT 2167

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例の実験（５）において求められたアセチ
ルキシランエステラーゼの至適ｐＨを示すグラフであ
る。

【図２】実施例の実験（５）において求められたアセチ
ルキシランエステラーゼのｐＨ安定性を示すグラフであ
る。

【図３】実施例の実験（５）において求められたアセチ
ルキシランエステラーゼの至適温度を示すグラフであ
る。

【図４】実施例の実験（５）において求められたアセチ
ルキシランエステラーゼの熱安定性を示すグラフであ
る。

【図５】実施例の実験（１２）において求められたサザ
ンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山住 卓夫 愛知県安城市昭和町19番10号 新日本化学 工業株式会社内 Ｆターム(参考） 2B150 AA01 AB01 AC15 AC37 DC23 DF11 4B024 AA07 BA11 CA02 DA11 EA04 GA11 4B050 CC03 DD03 LL10

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 真菌ケトミウム属由来のアセチルキシラ
   ンエステラーゼ活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 前記真菌が、ケトミウム・グラシレであ
   る請求項１記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号：１にて示されるＮ末
   アミノ酸配列を有する、アセチルキシランエステラーゼ
   活性を有するタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１乃至請求項３の何れかに記載の
   タンパク質をコードするＤＮＡフラグメント。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号：２にて示される塩基
   配列を有するＤＮＡフラグメント。
6. 【請求項６】 請求項１乃至請求項３の何れかに記載の
   タンパク質、又は該タンパク質と共に、他のキシラン分
   解酵素を含有せしめたことを特徴とする動物飼料組成
   物。