FI110614B - Sieniperäisten asetyyliksylaaniesteraasien kloonaus, ekspressio ja käyttö - Google Patents

Description

110614

Sieniperäisten asetyyliksylaaniesteraasien kloonaus, eks-pressio ja käyttö

Tekniikan tausta 5 Tämä keksintö koskee molekyylibiologian alaa. Erityisesti keksintö koskee sienten asetyyliksylaaniesteraasia koo-daavan DNA-sekvenssin kloonausta ja ekspressiota. Tämä keksintö tarjoaa käyttöön rekombinantti-asetyyliksy-laaniesteraasin, joka on saatu tätä proteiinia koodaavan 10 kloonatun DNA-sekvenssin ekspressiolla. Näin saatua proteiinia käytetään rehuissa tai paperimassassa olevan ksy-laanin hajotukseen.

Keksinnön tausta 15 Kasvisolukoiden soluseinien jäykän rakenteen saavat aikaan ksyläänit yhdessä muiden hemiselluloosien, pektii-nien, selluloosan ja ligniinin kanssa. Ksyläänit muodostavat pääasiallisen hemiselluloosan, useimmat ksyläänit ovat heteropolysakkarideja, joilla on 1,4-sidottujen β-D-20 ksylopyranoosiyksiköiden muodostama homopolymeerinen pää- ketju. Kasvin alkuperä määrää spesifisen ksyläänin substituutioiden märän ja tyypin. Ksylaanien on havaittu sisältävän monia erilaisia sivuketjuja, joista L-arabinoo- : si, D-glukuronihappo tai sen 4-O-metyylieetteri ja etik- • · · ! 25 ka-, p-kumariini- ja koniferyylihapot ovat tunnetuimmat.

• · · • · • · · ·

On oletettu, että sekä asetyyli että arabinosyylisubsti- ‘ ’ tuentit lisäävät hemiselluloosan liukoisuutta vähentämäl- lä molekyylien välisten aggregaatioiden mahdollisuutta, : 3 0 nämä substituentit ovat kuitenkin samanaikaisesti vaikea este kasvisolukoiden entsymaattiselle hajotukselle. On esimerkiksi esitetty, että asetylointi inhiboi kasvien polysakkaridien pilkkoutuvuutta märehtijöissä. Poutanen ja Puis (1989) (kirjassa Biogenesis and Biodegradation of : ” 35 Plant Cell Wall Polymers (Lewis, N. ja Paice, M., toim.) ACS Symp. Ser. 399: 630 - 640), ovat osoittaneet, että ··· Trichoderma reesein tärkein ksy lanaasi ei kykene depoly- « « · · merisoiraaan asetyloitua liukoista ksylaania. Grohmann et 2 110614 ai. (1989) (Appi. Biochem. Biotechnol. 20/21: 45 - 61) ovat osoittaneet, että kemiallisen deasetylaation jälkeen ksylaani on 5 - 7 kertaa pilkkoutuvampi märehtijöissä.

5 Esteraasit (EC 3.1.1.6) luokitellaan niiden substraatti-spesifisyyden mukaan. Koska yleensä on vaikeaa määrittää näiden entsyymien luonnollista substraattia, luokitus on ongelmallinen, ja tätä ongelmaa suurentaa se, että este-raaseja esiintyy luonnossa laajalti. Tämän vuoksi ei ole 10 yllättävää, että vaikka ksylaania deasetyloivien entsyymien olemassaolo on saattanut olla ennustettavaa, ottaen huomioon, että erilaisilla synteettisillä substraateilla toimivien mikrobiesteraasien esiintyminen on ollut kauan tunnettua, vasta vähän aikaa sitten osoitettiin asetyy-15 liksylaaniesteraasien olemassaolo.

Biely et ai. (1985, FEBS Lett. 186: 80 - 84) osoitti ase-tyyliksylaaniesteraasien olemassaolon (sienten) sellulo-lyyttisissä ja hemisellulolyyttisissä järjestelmissä: 20 Trichoderma reesei. Aspergillus niger. Schizophvllum commune ja Aureobasidium pullulans. Verrattuna kasvien ja eläinten esteraaseihin, nämä sieniesteraasit osoittavat : korkeaa spesifistä aktiivisuutta asetyloitua glukuronok- sylaania kohtaan, ja ne nimettiin sen vuoksi asetyyliksy-25 laaniesteraaseiksi.

.·.; Jatkotutkimuksia sienten asetyyliesteraaseista on esitet- ty. Poutanen et ai. (1988, Appi. Microbiol. Biotechnol.

' 28: 419 - 425 ja 1990, Appi. Microbiol. Biotechnol. 33: 30 506 - 510) kuvasivat T. reesein asetyyliksylaanieste- raasien puhdistuksen ja karakterisoinnin. Ksylaanin ent-* symaattinen deasetylaatio käyttäen puhdistettua asetyy- liksylaaniesteraasia, johti jäljelle jäävän polymeerira-.*··. kenteen saostumiseen. Tämän vaikutuksen vuoksi asetyy- • 35 liesteraasia ei käytetä yksin ensimmäisenä entsyyminä ·*·· asetyloitujen ksylaanien hajotuksessa. Suurin ksyloosi- saanto asetyloidusta ksylaanista saatiin ksylanaasin, /3- 3 110614 ksylosidaasin ja asetyyliksylaaniesteraasin synergisti-sellä toiminnalla.

Jotta saavutettaisiin käytännössä hyödynnettävä ksylaa-5 nien pilkkoutuminen, on olemassa tarve suurille määrille entsyymejä, jotka osallistuvat näiden voimakkaasti subs-tituoitujen molekyylien entsymaattiseen hydrolyysiin.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön tavan saada suuria määriä sienten asetyyliksylaaniesteraaseja, haluttaessa puhtaas-10 sa muodossa.

Yhteenveto keksinnöstä Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota käyttöön sie-nialkuperää olevia puhdistettuja ja eristettyjä asetyy-15 liksylaaniesteraaseja. Tämä proteiini on sienten asetyy-liksylaaniesteraasia koodaavan geenin ekspression tuote.

Tämä keksintö tarjoaa edelleen käyttöön rakenteet asetyy-liksylaaniesteraasia koodaavan sekvenssin mikrobeissa 20 tapahtuvaa ekspressiota varten, käyttäen joko sen luontaisia säätelysekvenssejä tai vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa käyttäen geeniä, joka on toiminnallisesti lii-: v tetty säätelyalueisiin, kuten promoottori, erityksen joh- tosekvenssi ja lopetussignaalit, jotka on valittu halutun ·;··· 25 ekspressioisännän mukaan.

: Edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota käyt- !,.* töön ekspressioisännät, jotka on transformoitu tämän kek- ' sinnön mukaisilla ekspressiorakenteilla, niin että isän- 30 nät kykenevät sienialkuperää olevien asetyyliksylaanies-“· "· teraasien yliekspressioon ja, jos halutaan, niiden eri- ν’ ‘ tykseen.

Vielä edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota 35 käyttöön menetelmät suurten määrien asetyyliksylaanieste- • raasia tuottamiseksi.

4 110614 Tämä keksintö tarjoaa vielä käyttöön menetelmän rehun sulavuuden lisäämiseksi siten, että menetelmässä lisätään rehuun tehokas määrä asetyyliksylaaniesteraasia. Tämä keksintö tarjoaa myöskin käyttöön menetelmän vähentää 5 ksylaania sisältävien koostumusten viskositeettia siten, että lisätään tehokas määrä asetyyliksylaaniesteraasia.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön edelleen menetelmän ligniinin vapauttamiseksi sulfaattimassasta paperituotteiden 10 valmistuksessa.

Lvhvt esitys kuvien sisällöstä

Kuva 1 esittää restriktiokartan 3,4 ke:n Sstl DNA-frag-mentista, joka sisältää Aspergillus niaerin axeA-aeenin. 15

Kuva 2 esittää etikkahapon (HAc) ja ksyloosioligomeerien (X,, X2, X3 ja X4) vapautumisen 0,2-prosenttisesta (w/v) höyrytetystä koivun puun ksylaaniliuoksesta asetyylieste-raasin (1 μg/ml) ja endo-(l,4)-/3-ksylanaasi I:n (0,1 20 Mg/ml) yhdistetyn toiminnan seurauksena.

Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Rihmasienet tunnetaan laajalti niiden kapasiteetista erittää suuria määriä erilaisia hydrolyyttisiä entsyyme-·:··· 25 jä, kuten a-amylaaseja, proteaaseja ja glukoamylaaseja, ....: ja erilaisia kasvien soluseiniä hajottavia entsyymejä, .·. : kuten sellulaaseja, hemisellulaaseja ja pektinaaseja.

Tämä keksintö kuvaa puhdistetun ja eristetyn DNA-molekyy-. . 30 Iin, joka käsittää sienialkuperää olevan asetyyliksy- laaniesteraasin geenisekvenssin ja sen geneettiset va-*·’ ' riantit. Geneettiset variantit ovat niitä DNA-sekvensse- ·*·.. jä, jotka koodaavat mutanttiasetyyliksylaaniesteraaseja.

Tämän keksinnön piiriin kuuluvat myös sienten DNA-sek-•( 35 venssit, jotka hybridisoituvat tässä esitettyjen sekvens- ··'· sien kanssa ankarissa olosuhteissa, ja jotka ekspressoi- “· taessa tuottavat proteiinia, joka osoittaa esteraasiak- 5 110614 tiivisuutta. Erityisesti A_;_ nigerin asetyyliksylaanieste-raasigeenin, eristetty yhdessä esimerkeistä, osoitettiin hybridisoituvan T. reesein kromosomaalisen DNA:n kanssa.

5 Tähän keksintöön kuuluvat myös homologiset tai heterolo-giset isännät, jotka on transformoitu edellä kuvatut DNA-sekvenssit sisältävillä yhdistelmä-DNA-molekyyleillä. "Homologisella isännällä" tarkoitetaan lajia, josta geeni on saatu. "Heterologiselle isännälle" on ominaista, että 10 se on muu kuin se lähde, josta geeni on saatu. Heterolo-giset isännät voidaan valita bakteereista, hiivoista tai sienistä. Määritelmiä homologinen ja heterologinen käytetään myös säätelysekvenssien yhteydessä. Tässä tapauksessa "homologinen" tarkoittaa säätelysekvenssejä, jotka 15 ovat luontaisia kloonatulle geenille, ja "heterologinen" säätelysekvenssejä muista geeneistä tai samasta geenistä, joka on saatu eri lajista.

Erityisen kiinnostavia asetyyliksylaaniesteraaseja ovat 20 ne, jotka saadaan seuraaviin sukuihin kuuluvista sienistä: Asoeraillus. Trichoderma ja Schizophvllum. Edullisia lajeja ovat Trichoderma reesei, Aspergillus niger ja :.'-i Schizophvllum commune.

• · • · * » » ·:··· 25 Asetyyliksylaaniesteraasiaktiivisuutta osoittavia sieniä voidaan käyttää proteiinin eristämiseen menetelmillä, ,·. : jotka ovat alalla hyvin tunnettuja. Esitetyissä esimer- • · · keissä käytetään Aspergillus nigeriä asetyyliksylaanies- » · » teraasin lähteenä.

. . 30 • Asetyyliksylaaniesteraasi tuotetaan viljelemällä Asper- V * gillus-kantaa. Proteiini puhdistetaan tunnetuilla mene- telmillä, ja puhdistuksen saanto saatetaan sopivaan ak- » .*·*. tiivisuusanalyysiin.

\ 35 • · ·

Proteiinirakenteen karakterisoinnin ensimmäisessä vai-*! heessa määritetään osa eristetyn proteiinin aminohap- β 110614 posekvenssistä. Kun käytetään N-terminaalisten aminohappojen sekvensointitekniikkoja, tämä voi olla kypsän proteiinin N-terminaalinen osa, mutta tämä voi myös olla N-pää sisäisestä peptidistä, joka on saatu puhdistetun pro-5 teiinin pilkkomisen jälkeen spesifisellä proteinaasilla, kuten trypsiini, kymotrypsiini jne. tai kemiallisella reagenssilla, esim. CNBr. Kun käytetään C-pään sekven-sointimenetelmiä, on mahdollista määrittää proteiinin tai peptidien C-terminaaliset sekvenssit. Kun tällainen sek-10 venssi on tunnettu, on mahdollista johtaa tähän sekvenssiin perustuva nukleotidikoetin. Edullisesti tämä koetin on suunniteltu vastaamaan sellaista osaa proteiinista, joka sisältää aminohappoja, joita koodaavat vähän degeneraatiota osoittavat kodonit.

15 Tällä tavoin saadut koettimet voivat olla leimattuja, ja niitä voidaan käyttää hybridisaatiossa cDNA:sta tai geno-misesta kirjastosta saatujen kloonien kanssa. Vektori eristetään klooneista, jotka osoittavat positiivisen hyb-20 ridisaatiosignaalin, ja insertin nukleotidisekvenssi määritetään. Hybridisaatio ja sekvensointi voidaan toistaa, ellei löydetä täysipituista kloonia. Täysipituisia kloo-'· ‘.j neja voidaan saada myös yhdistämällä osittain päällekkäi- ·.*·.: siä restriktiofragmentteja, jotka kaikki koodaavat osaa ··,··· 25 halutusta proteiinisekvenssistä. Saatu DNA-sekvenssi voi- daan kloonata sopivissa ekspressiovektoreissa. Jos se on : tarkoituksenmukaista, se voi liittyä ekspressioisäntäor- t a · >;·, ganismin valintaan. Tämä kloonaus voidaan myös suorittaa määrittämättä nukleotidisekvenssiä, tällöin luultavasti , . 30 kuitenkin luodaan ei-optimaalinen rakenne. Edullisia eks- » · · ’· · pressioisäntiä voivat olla bakteerit, hiivat tai sienet.

* t · ’·' * Erityisesti käytetään Kluvveromvcesiä. Bacillusta, Asper- ·*·.. qillusta tai E.colia.

» , 35 Ekspression säätelemiseksi säätelyalueet kloonataan sei- * · · laisella tavalla, että geeni on toiminnallisesti liitet- » · » tynä niihin. Näinä säätelyalueina voidaan käyttää homolo- 7 110614 gisia ja heterologisia promoottoreita, operaattoreita, tehostajia, signaalisekvenssejä ja ribosomaalisia sitoutumiskohtia. Edelleen geeni voidaan kloonata itserepli-koituvassa vektorissa, tai se voidaan liittää isäntäor-5 ganismin genomiin, edullisesti käytetään useampia geenin kopioita.

Saatua geeniä voidaan lopulta puolestaan käyttää koettimena, hybridisoitumaan lähisukuisista lajeista saatujen 10 DNA-kirjastojen kanssa. Erityisesti A. niaerin asetyyli- ksylaaniesteraasigeenin, joka eristettiin yhdessä esimerkeistä, osoitettiin hybridisoituvan T. reesein kro-mosomaaliseen DNA:hän.

15 Esimerkeissä kuvataan Aspergillus niaeristä saadun 3,4 ke:n Sstl DNA-fragmentin kloonaus ja ekspressio. Ekspres-sio toteutetaan käyttäen täydellistä geeniä A. niaerissä.

Kuten edellä on kuvattu, asetyyliksylaaniesteraasia voi-20 daan käyttää ksylaanin deasetylointiin. Koska havaittiin, että asetyyliksylaaniesteraasin aktiivisuus yksittäisenä entsyyminä voi johtaa saadun polymeerin saostumiseen, on I '.· edullisinta käyttää entsyymiä yhdessä muiden ksylaania pilkkovien entsyymien kanssa, kuten ksylanaasien, ara- i · ;··· 25 binofuranosidaasien, ksylosidaasien ja glukuronidaasien kanssa, näiden ollessa edullisesti valitut ryhmästä, jo- (·, ; hon kuuluvat ksylanaasi, α-arabinofuranosidaasi, /3-ksy- * · » λ.’ losidaasi ja α-glukuronidaasi. Esimerkissä 5 kuvataan t » · * asetyyliksylaaniesteraasin ja /3-(1,4)-ksylanaasin ja /3- 30 (1,4)-ksylosidaasin yhdistetty vaikutus.

» t » * * * » » < t * V ' Asetyyliksylaaniesteraaseja voidaan edullisesti käyttää 4 prosesseissa, joissa tulee hajottaa ksylaania. Deasylaa-/··. tioreaktion seurauksena ksylääni tulee helpommin saavu- 35 tettavaksi ksylanaaseille.

•14»

* I

t · ·

4 » I

• » 8 110614

Spesifisiin asetyyliksylaaniesteraasien sovellutuksiin, tai tämän entsyymin sovellutuksiin yhdessä muiden ksylaa-nia hajottavien entsyymien kanssa kuuluvat; - eläinten rehun esikäsittely sulavuuden parantami- 5 seksi, - näiden entsyymien lisääminen rehuun 'käsittelemällä in situ', - hedelmämehujen ja oluen käsittely, jotta parannetaan reologisia ominaisuuksia ja kirkkautta, 10 - paperimassan ja (jäte-) paperin prosessointi, jot ta parannetaan valkaisu- ja vedenpoistoprosessia.

Yleisesti ottaen tätä entsyymiä, tai tämän entsyymin yhdistelmiä muiden entsyymien kanssa, voidaan käyttää pilk-15 komaan biologista soluseinämateriaalia, jotta edistetään sulavuutta tai juoksevuusominaisuuksia teollisuuden sovellutuksissa, jotka liittyvät hedelmämehujen tai oluen valmistukseen.

20 Toinen tärkeä näkökohta, joka koskee asetyyliksylaanies-teraasin käyttöä rehuissa, on sen vaikutus viskositeettiin.

: Ksyläänin deasetylaatio vähentää rehun aineosien liukoi- 25 suutta, ja siten viskositeetti pienenee. Tämä johtaa kä-iti<; sittelyn helppouden lisääntymiseen, ja pentosaanien pie- . . nentyneeseen ravinteisuutta vähentävään vaikutukseen.

I I < • · · Tämän mukaisesti tämä keksintö tarjoaa käyttöön eläinten • « · ’·* ' rehukoostumuksia, jotka sisältävät asetyyliksylaanieste- 30 raasia.

• · · • · · Edelleen, ksylaanin saavutettavuus ksylanaaseille lisään- :·. tyy. Tämä on tärkeää ligniinin vapauttamisessa paperimas- sasta. Yleensä sulfaattimassa käsitellään ksylanaaseilla, • · 35 jotta poistetaan ligniini paperituotteiden valmistukses-ta. Ksylaanin korkean asetylaatiotason vuoksi ksylanaasia ei käytetä optimaalisesti. Ksylanaasien tehokkuus lisään # 110614 tyy suuresti, kun massa käsitellään asetyyliksylaanieste-raasilla joko ennen tai samanaikaisesti kuin ksylanaasi-käsittely.

5 Edellä esitetyn mukaisesti tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän rehun sulavuuden parantamiseksi, jota menetelmää luonnehtii, että tehokas määrä asetyyliksylaanieste-raasia lisätään rehuun. Tämä keksintö tarjoaa myös käyttöön menetelmän ksylaania sisältävien koostumusten visio kositeetin vähentämiseksi, jossa menetelmässä lisätään tehokas määrä asetyyliksylaaniesteraasia. Tämä keksintö tarjoaa myös käyttöön menetelmän ligniinin vapauttamiseksi sulfaattimassasta paperituotteiden valmistuksessa.

15 Seuraavat esimerkit tarjotaan valaisemaan keksintöä, eikä niiden ole tarkoitus rajoittaa tämän keksinnön piiriä millään tavalla.

Kokeellinen osa 20 Puskurit ia kantaliuokset

Sopivia kantaliuoksia käytettiin esimerkeissä kuvatuissa kokeissa.

• · · t*. ; Seuraavat kantaliuokset tehtiin Maniatis'in et ai. mukaan ‘ ! 25 ('Molecular Cloning' Cold Spring Harbor, 1982 ja 1989, 2.

. painos); « · · * · ’· TE-puskuri, 20 x SSC, hybridisaatiopuskuri, 100 x Den- *.* " hardtin liuos, SM-puskuri, 50 x TAE-puskuri, DNA:n pipe- 30 tointipuskuri (ksyleenisyanoli ja bromofenolisini), ·*/·· NCZYM-alusta, LB-alusta. Ligaatiopuskuri valmistettiin, kuten entsyymin tuottaja on esittänyt.

% ·

Muut liuokset sisälsivät seuraavat aineosat; •;·" 35 5 x RNB 1000 ml:aa kohti: , ;i‘ 121,10 g Tris, 73,04 g NaCl, 95,10 g EGTA, pH 8,5 10 110614

Visniac-liuos: 10 g EDTA, 4,4 g ZnS04x7H20, 1,0 g MnCl2x4H20 0,32 g CoC12x6H20, 0,32 g CuS04x5H20 0,22 g (NH4)6Μο7024χ4Η20, 1,47 g CaCl2x2H20 5 1,0 g FeS04x7H20, pH 4,0 (Visniac ja Santer, 1957, Bact. Rev., 21: 195 - 213)

Minimialusta. 1000 ml:aa kohti: 6,0 g NaNOj, 1,5 g KH2P04, 0,5 g MgS04x7H20 10 0,5 g KCl, 1 ml Visniac-liuosta hiilenlähde, kuten esitetty, pH 6,0

Esimerkeissä käytetyt kannat: E. coli JM101 (Yanisch-Perron et ai., 1985, Gene 33: 103) 15 E. coli LE 392 (Murray, 1977, Mol. Gen. Genet. 150: 53 -58)

Aspergillus niger N402 (Goosen et ai., 1987, Curr. Genet. 11: 499 - 503)

Aspergillus niger N593 (Goosen et ai., 1987, supra) 20

Esimerkeissä käytetyt vektorit: pUC9 (Vieirra ja Messing, 1982, Gene 19: 259 - 268 ja ; · j Yanisch-Perron et ai., 1985) : M13mpl8/M13mpl9 (Messing, 3., 1983, IOIC: 10 - 78, Nor- >>>>: 25 rander et ai., 1983, Gene 26: 101 - 106) . . Asetvvliesteraasianalvvsi: *; ’· Analyysi tehtiin, kuten Biely et ai. (1985, supra) ovat « · · *·* kuvanneet. Entsyymi liuos (10 - 50 μΐ) sekoitettiin 1 ml: n 30 juuri valmistettua kyllästettyä 4-nitrofenyyliasetaatti-:,‘*i liuosta (SIGMA) kanssa 0,2 M fosfaattipuskurissa, pH 6,5 : ja inkuboitiin 22 °C:ssa. 4-nitrofenolin vapautumista ;·’ seurattiin fotometrisesti 410 nm:ssa ajan funktiona. Yksi yksikkö asetyyliesteraasaktiivisuutta hydrolysoi 1 μιηοο-35 Iin substraattia minuutissa.

11 110614

Entsyymit

Endo-(l,4)-0-ksylanaasi I, II, III (E.C. 3.2.1.8) ja β- (1,4)-ksylosidaasi (E.C. 3.2.1.37) puhdistettiin, kuten Kormelink et ai. ovat kuvanneet (1990, julkaisussa Proc.

5 5th European Congress on Biomass and Bioenergy, Lissabon 9 - 13.10.1989) Aspergillus awamorista CMI 142717.

Asetvvliesteraasin ia ksvlaania hajottavien entsyymien yhdistetty vaikutus 10 Etikkahapon ja ksyloosioligomeerien vapautuminen määritettiin HPLC:llä höyrytetyn koivupuun ksylaanin hajotuksen jälkeen asetyyliesteraasin ja endo-(1,4)-/8-ksylanaasi I:n, endo-(1,4)-/3-ksylanaasi II:n, endo-(1,4)-/3-ksylanaasi III:n ja /3-(l,4)-ksylosidaasin toiminnan jälkeen yksin 15 tai yhdistettynä. 0,2 % (w/v) höyrytettyä koivun ksylaa-niliuosta inkuboitiin 1,0 /xg/ml asetyyliesteraasin ja 0,1 μg/ml endo- (1,4) -/3-ksylanaasi I:n, endo- (1,4) -/3-ksylanaasi II:n, endo-(1,4) -/3-ksylanaasi III:n tai /3-(1,4)-ksy-losidaasin kanssa 30 °C:ssa. Pilkkoutumista seurattiin 20 ajanjaksolla 0-8 tuntia. Reaktio lopetettiin laittamalla näyte 5 minuutiksi kiehuvaan vesihauteeseen.

Höyrytetty koivupuu valmistettiin, kuten Puis et ai.

! (1985, Appi. Microbiol. Biotechnol. 22: 416 - 423) ovat ’ 25 kuvanneet.

‘ * HPLC - neutraalit sokerit :.‘*i Endo-(1,4)-/3-ksylanaasi I:n, II:n, III:n, /3-(1,4)-ksy- · losidaasin ja asetyyliesteraasin vaikututuksella yksin 30 tai yhdessä höyrytetystä koivupuusta vapautetut neutraa-;*·.· lit sokerit määritettiin HPLC:llä. Näytteet esikäsitel- tiin Pb(N03)2:lla Voragenin et ai. mukaisesti (1986, Food Hydrocolloids 1: 65 - 70) ja injektoitiin CH-Pb-pylvää-: " seen (Merck, Darmstadt, Saksan Liittotasavalta), eluoi- '···* 35 tiin millipore-vedellä (0,4 ml/min) 85 °C:ssa. Sokerit ·· määritettiin Shodex SE-61 Rl-detektori 11a.

12 110614

Esimerkit Esimerkki I

A. nigerin asetyyliksylaaniesteraasin ΑΧΕ I puhdistus 5 Aspergillus niger-kannan DS16813 kasvatuksen jälkeen viljelmä sentrifugoitiin ja supernatantti konsentroitiin ultrasuodattamalla. 73 ml:n näyte lisättiin DEAE-tris-akryyli- (IBF) pylvääseen (XK 50 Pharmacia-pylväs, joka oli täytetty 400 ml:11a DEAE-trisakryyliä ja puskuroitu 10 Tris-HCl:lla 0,05 M, pH 7,8) ja eluoitiin lineaarisella gradientilla 0,0 - 1,0 M NaCl Tris-HCl:ssa 0,05 M, pH 7,8. Fraktiot analysoitiin asetyyliesteraasiaktiivisuuden suhteen, kuten edellä on kuvattu.

15 Asetyyliesteraasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja lisättiin semipreparatiiviseen DEAE-HPLC-pyl-vääseen (Waters DEAE 5 PW 21,5 mm x 15 cm), joka oli tasapainotettu fosfaatilla 0,05 M, pH 7,5. Eluutio tehtiin lineaarisella 0,0 - 1,0 M NaCl-gradientilla samassa pus-20 kurissa. Lopullinen puhdistus tehtiin analyyttisellä DEAE-HPLC-py1väällä (sama kuin edellä, mutta tässä tapauksessa 7,5 mm x 7,5 cm) tai käyttämällä SDS-PAA-gee-. . : lielektroforeesia. Saatuja fraktioita käytettiin amino- .·. : happosekvensointiin sellaisenaan, tai proteiini pilkot- "I 25 tiin ensin sopivalla proteolyyttisellä entsyymillä. Jäl-. kimmaisessä tapauksessa saadut peptidit erotettiin . . HPLC:llä ennen aminohapposekvensoinnin suorittamista.

'·* * Esimerkki 1.2 30 Asetyyliksylaaniesteraasin N-pään ja sisäisten peptidien ·*,*·· aminohapposekvensointi ;·[ A. nigerin asetyyliksylaaniesteraasin ΑΧΕ I N-pään amino happosekvensointi käyttämällä Applied Biosystems kaasu-35 faasisekvensoijaa, antoi seuraavan sekvenssin: 13 110614

Ser-Gly-Ser-Leu-Gln-Gln-Val-Thr-Asp-Phe-Gly-Asp-Asn-Pro-Thr-Asn-Val-(Gly)-Met-Tyr-(Ile) (kaava 1)

Asetyyliksylaaniesteraasin ΑΧΕ I CNBr-peptidien aminohap-5 posekvenssin määritys HPLC:tä käyttäen tehdyn erottelun jälkeen antoi seuraavat sekvenssit: CNBr-peptidi 1:

Tyr-Ile-Tyr-Val-Pro-Asn-Asn-Leu-Ala-Ser-Asn-Pro-Gly-Ile-10 Val-Val-Ala-Ile-His-Tyr (kaava 2) CNBr-peptidi 2: ?-Ser-Gly-Tyr-Ser-Gly-Ser-Phe-Pro-Thr-?-Gln-(Ile)-Tyr-(His/Thr)-(Ser)-Gly-(Ser)-(Ser)-Asp- (kaava 3) 15

Esimerkki 2 A.nigerin genomisen kirjaston seulonta asetyyliksy-laaniesteraasigeenin sunteen (axeA) ja geenin eristys 20 Esimerkki 2.1

Synteettisten oligonukleotidien 32P-leimaus . . : Esimerkissä 1.2 esitettyä aminohapposekvenssiä (kaava 1) ,·. ; käytettiin johdettaessa oligonukleotidiseoksia, jotka ‘ ! 25 vastasivat N-terminaalista aminohapposekvenssiä. Oli- . gonukleotidit syntetoitiin fosfoamidiittimenetelmällä, [ * jonka ovat kuvanneet Crea et ai. (1979, Tetrahedron Lett.

” 5: 395 - 398) käyttäen Applied Biosystems oligonukleoti- '·’ ‘ disyntetoijaa.

30 Käytettiin seuraavaa oligonukleotidiseosta;

I I I

GGATTATCIC CAAAATCIGT IACCTGCTG 29 (kaava 4)

G G G G

lopullisessa konsentraatiossa 37 pmol oligonukleotidia per μΐ.

35 14 110614 Tämä oligonukleotidiseos leimattiin reaktioseoksessa, jolla oli seuraava koostumus; 37 pmol oligonukleotidi-seosta, 66 mM Tris-HCl:oa pH 7,6, 1 mM ATP:ta, 1 mM sper-midiiniä, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitolia, 200 Mg/ml 5 BSA, 34 pmol r1 2 3 4 5 6-P ATP (NEN, 600 Ci/mMol) ja 30 U T4-poly-nukleotidikinaasia (BRL) lopullisessa tilavuudessa 50 μΐ. Reaktio lopetettiin lisäämällä 4 μΐ 0,5 M EDTA:a, pH 8,0. Leimattua oligonukleotidiseosta käytettiin ilman puhdistusta edelleen, genomisen kirjaston seulomiseen (esimerk-10 ki 2.3) ja Southern-blottingeissa (esimerkit 2.5 ja 2.6).

Esimerkki 2.2

Aspergillus niger-kannan DS16813 (CBS 323.90) genomisen kirjaston rakentaminen 15 DNA Aspergillus niger-kannasta DS16813 (talletettu talletuslaitokseen Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Alankomaat, 20.7.1990 (CBS 323.90), eristettiin käyttämällä Graaffin et ai. menetelmää (1988, Curr. Ge-20 net. 13: 315 - 321). Lyhyesti, yli yön kasvatettu rihmasto kerättiin talteen ja varastoitiin -80 °C:seen. Nukleiinihapot eristettiin hajottamalla 0,5 g jäädytettyä rih-: ·, mastoa mikro-membraanihajottajalla (microdismembrator) ;\j (Braun). Rihmastojauhe uutettiin uuttopuskurilla, joka 25 sisälsi: 1 ml tri-isopropyylinaftaleenisulfonihappoa (TNS) (20 . . mg/ml) , 1 ml p-aminosalisyylihappoa (PAS) (120 mg/ml) ja * · · 0,5 ml 5 x RNB-puskuria, ja joka tasapainotettiin 1,5 * · · ’·* * ml: 11a fenolia. Uuttopuskuri lisättiin rihmasto jauheeseen ja tehtiin fenoli/kloroformi, kloroformiuutto. DNA eris- 2 • · 3 tettiin sen jälkeen etanolisaostuksella. RNA poistettiin V : liuoksesta käsittelemällä RNaasi A:11a.

4 i · · 5 ,···, DNA, joka oli eristetty Aspergillus nigeristä DS16813, 6 kuten edellä on kuvattu, pilkottiin osittain Sau 3A:lla. ...!* Saadut fragmentit kokofraktioitiin elektroforeesilla 0,4- ’·.’· prosenttisessa agaroosissa TAE:ssa. Fragmentit, joiden 15 110614 koko oli 14 - 22 kb, otettiin talteen geelistä leikkaamalla oikea alue geelistä ja elektroeluoimalla sen jälkeen.

5 Fragmentit ligatoitiin bakteriofagi lambda EMBL 3:n Bam-HI-käsivarsiin, hankittu Promegalta, käyttäen tavanomaista menettelyä. Ligatoitu DNA pakattiin in vitro käyttäen Gigapak II Gold -pakkausuutetta (Stratagene), ja maljat-tiin E. coli-kannalle LE392 käyttäen NZYCM-alustaa toi-10 mittajän ohjeiden mukaisesti.

Täten saatu primaarinen kirjasto titrattiin ja amplifioi-tiin. Tehtiin faagivarasto, joka sisälsi noin 1010 pfu/ml.

15 Esimerkki 2.3 A. niaerin genomisen kirjaston seulonta axeA-geenin suhteen.

A. niaerin genominen kirjasto rakennettiin edellä kuva-20 tulla tavalla. Jotta saadaan axeA-geeni, 3 x 103 pfu per malja maljataan NZYCM top-agaroosille, joka sisältää 0,7 % agaroosia, neljälle läpimitaltaan 85 mm NZYCM-maljalle ; ·,· (1,2-prosenttinen agar) , kuten on kuvattu (Maniatis et j ai., 1982, supra, s. 64), käyttäen E. coli-kantaa LE392 25 mal jausbakteerina.

* « « t · . . Maljojen yli yön 37 °C:ssa kestäneen inkubaation jälkeen I I | tehtiin kaksi replikaa kustakin maljasta HybondN+-suodat-·’ * timille (Amersham), kuten Maniatis et ai. ovat kuvanneet 30 (1982, supra, S. 320 - 321).

* * S » » V : Suodattimien kostutuksen jälkeen 3 x SSCrssä niitä pes- :·. tiin 60 minuuttia huoneenlämmössä 65 °C:ssa kaksi tuntia * · * ,···. esihybridisaatiopuskurissa, joka sisälsi; 6 x SSC, 0,5 % * · 35 SDS, 10 x Denhardfin liuosta ja 100 μg/ml lämpödenatu-roitua lohen maidin DNA:ta (Boehringer Mannheim) . Kahden tunnin esihybridisaation jälkeen puskuri korvattiin hyb- 16 110614 ridisaatiopuskurilla, joka on identtinen esihybridisaa-tiopuskurin kanssa, paitsi että tämä puskuri ei sisällä lohen maidin DNA:ta, vaan 32P-leimattua oligonukleoti-diseosta, kaava I, joka on valmistettu kuten esimerkissä 5 2.1 on kuvattu. Suodattimia hybridisoitiin 18 tuntia lo pullisessa lämpötilassa 47 °C, joka saavutettiin hitaasti alkulämpötilasta 65 °C.

Hybridisaation jälkeen suodattimet pestiin 2 x SSCtllä, 10 minkä jälkeen suodattimet pestiin esilämmitetyssä hybri-disaatiopuskurissa 47 °C:ssa. Lopulta suodattimia pestiin kahdesti 30 minuutin ajan 56 °C:ssa 6 x SSC:ssä, 0,5-pro-senttisessa natriumpyrofosfaatissa. Ilmakuivatut suodattimet teipattiin arkille Whatman 3MM-paperia, avainnos-15 merkit tehtiin radioaktiivisella musteella ja Whatman-paperi ja suodattimet peitettiin Saran Wrapilla.

Hybridisoituvat plakit tunnistettiin ja nimettiin lambda^, - lambda„c7. Kukin positiivinen plakki poimittiin 20 maljalta Pasteur-pipettiä käyttäen ja faagit eluoitiin agarpalasta 1 ml:aan SM-puskuria, joka sisälsi 20 μΐ kloroformia, kuten Maniatis et ai. (1982, supra, s. 64 ovat : kuvanneet). Saadut faagit puhdistettiin toistamalla edel- lä kuvattu menettely käyttäen suodatinreplikoita maljoil-...·; 25 ta, jotka sisälsivät 50 - 100 plakkia eristettyjä faage- ja.

> * *

Puhdistuksen jälkeen faageja kasvatettiin maljaamalla 5 x ’ 103 faagia NZYCM-alustalle. Inkubaation jälkeen yli yön 30 37 °C:ssa saatiin maljoja, joilla plakit olivat yhteen- ’· "< kasvaneet; näistä maljoista eluoitiin faagit lisäämällä 5 v : ml SM-puskuria ja säilyttämällä maljoja 2 tuntia 4 °C:ssa toistuvassa ravistelussa. Supernatantin keräämisen jäl-keen pipetillä, bakteerit poistettiin liuoksesta sentri- » > 35 fugoimalla 4 000 x g 10 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatant- • t * ··· tiin lisättiin 0,3 % kloroformia ja pfu:ien määrä lasket- *. *: tiin. Nämä faagivarastot sisältävät noin 1010 pfu/ml.

17 110614

Esimerkki 2.4 DNA:n eristys bakteriofagi lambdasta.

Kutakin eristetyistä faageista kasvatettiin yhdistämällä 5 5xl09 E. coli-kannan LE392 bakteeria 300 Ml:ssa SM-pusku- ria 2xl06 pfu:n kanssa 15 minuutin ajan. Inkubaation jälkeen infektoituja bakteereja käytettiin ymppäämään 100 ml esilämmitettyä (37 °C) NZYCM-alustaa ja inkuboitiin sen jälkeen 9-12 tuntia 37 °C:ssa New Brunswick pyöröravis-10 telijassa 250 rpm, minkä ajan jälkeen bakteerit olivat lyysoituneet. Bakteerijäte poistettiin sentrifugoimalla 10 minuuttia 10 krpm 4 °C:ssa Sorvali high speed -sentri-fugissa. Faagit saostettiin saadusta supernatantista (100 ml) lisäämällä 10 g polyetyleeniglykoli-6000:tta ja 15 11/7 g NaClria ja pitämällä liuosta 4 °C:ssa yli yön.

Saostuneet faagit kerättiin sentrifugoimalla 14 000 x g 4 °C:ssa 20 minuuttia. Supernatantti poistettiin imulla, ja loput liuoksesta poistettiin paperipyyhkeellä. Faagit suspendoitiin huolellisesti uudelleen 4 mitään SM-pusku-20 ria ja uutettiin kerran samalla määrällä kloroformia.

Ennen kuin DNA uutettiin faagipartikkeleista, DNA ja RNA, : · f jotka olivat peräisin lyysatuista bakteereista, poistet- « · j tiin inkuboimalla faagisuspensiota DNaasi I:llä ja RNaasi % * 25 A:lla (kumpaakin 100 μq/ml) 30 minuutin ajan 37 °C:ssa.

« i

Faagi-DNA vapautettiin sen jälkeen faageista lisäämällä » · . . EDTAta lopulliseen konsentraatioon 20 mM, kun taas prote- • · iini poistettiin liuoksesta uuttamalla kahdesti samalla t · » määrällä fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia (25:24:1).

30 Faasien erottelun jälkeen sentrifugoimalla, käyttäen Sor- \ vall-sentrifugia (14 000 x g, 10 min) , vesifaasi uutet- ♦ * * V * tiin kerran samalla määrällä kloroformia/isoamyylialkoho- i lia (24:1). Faasit erotettiin sentrifugoimalla, minkä i > · ,···, jälkeen DNA saostettiin vesifaasista lisäämällä 0,1 tila- • · 35 vuutta 5 M natriumperkloraattia ja 0,1 tilavuutta isopro- i panolia, ja inkuboimalla jäissä 30 minuuttia. DNA otet- * » ·. ·; tiin talteen sentrifugoimalla 10 min 4 °C:ssa (14 000 x 18 110614 g). Supernatantti poistettiin imulla, minkä jälkeen DNA suspendoitiin uudelleen 400 μΐιββη TE-puskuria. DNA saos-tettiin vielä kerran tästä liuoksesta lisäämällä 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia ja 2 tilavuutta etanolia.

5 DNA kerättiin sentrifugoimalla 10 minuuttia 4 °C:ssa (14 000 x g). Supernatantti poistettiin imulla, jäljelle jäänyt pelletti kuivattiin lyhyessä ajassa tyhjiössä, minkä jälkeen DNA suspendoitiin uudelleen 125 nl:aan TE-puskuria, joka sisälsi 0,1 μg/ml RNaasi A:ta. Tämä puh-10 distusmenettely johti noin 10 - 100 μg:n DNA:ta eristykseen joka faagista.

Esimerkki 2.5 axeA:n sisältävien faagien restriktioanalyysi.

15

Faagien lambda^ - lambda^ eristetty DNA analysoitiin Southern-analyysillä käyttäen seuraavia restriktioentsyy-mejä; EcoRI. HinDIII, Sohi ja HinCII. DNA:ta pilkottiin 3 tuntia 37 °C:ssa reaktioseoksessa, joka koostui seuraa-20 vista liuoksista; 5 μΐ (»1 μg) DNA-liuosta; 2 μΐ soveltuvaa 10 x reaktiopuskuria (BRL); 10 U restriktioentsyy-miä (BRL) ja steriiliä tislattua vettä, jotta saatiin :.**i lopullinen tilavuus 20 μΐ. Pilkkomisen jälkeen DNA saos- : ·.: tettiin lisäämällä 0,1 tilavuutta 3 M NaAc ja 2 tilavuut- ·:··· 25 ta etanolia. DNA kerättiin sentrifugoimalla 10 min huo- neenlämmössä (14 000 x g) . Supernatantti poistettiin .·. : imulla, jäljelle jäänyt pelletti kuivattiin lyhyesti tyh- jiössä ja suspendoitiin uudelleen steriiliin tislattuun * ♦ · veteen. Sen jälkeen kun oli lisätty 4 μΐ DNA:n pipetoin-. . 30 tipuskuria, näytteitä inkuboitiin 10 min 65 °C:ssa ja '· · jäähdytettiin nopeasti jäissä ennen näytteiden pipetoi- ’·' ’ mistä 0,6-prosenttiseen agaroosigeeliin TAE-puskuriin.

DNA-fragment it erotettiin elektroforeesilla 25 V:lla 15 -18 tuntia.

’·’ 35 ·;·· Elektroforeesin jälkeen DNA siirrettiin ja denaturoitiin t t » *· '· alkalisella tyhjiöblottauksella (VacuGene XL, Pharmacia 19 110614 LKB) nylonmembraanille (Gene Bind 45, Pharmacia LKB), kuten ohjekirjassa on kuvattu (s. 25 - 26) ja sen jälkeen esihybridisoitiin ja hybridisoitiin käyttäen leimattua oligonukleotidiseosta, kaava 1, kuten esimerkissä 2.1 on 5 kuvattu, ja hybridisaatio-olosuhteita, jotka on kuvattu esimerkissä 2.2. Hybridisaatiokuvio saatiin altistamalla Kodak XAR-5 röntgenfilmi 18 tunniksi -70 °C:ssa käyttäen tehostinlevyj ä.

10 Saaduista tuloksista päätellään, että seitsemästä eristetystä kloonista viiden DNA hybridisoituu oligonukleoti-diseoksen kanssa, joka saatiin N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä. Kaikissa viidessä kloonissa havaittiin olevan fragmentit, jotka olivat peräisin samasta genomi-15 sesta alueesta. Kattavammassa Southern-analyysissä, käyttäen entsyymejä Bqlll. EcoRV, Ncol, PstI, SstI ja Xbal. rakennettiin tämän genomisen alueen osittainen restrik-tiokartta. Tästä kokeesta voidaan päätellä, että 3,4 ke:n SstI-fragmentti sisältää A. niqerin axeA-geenin.

20

Esimerkki 2.6 A. niqerin axeA-geenin alakloonaus.

• · · » · ·’,*·· Faagista lambda^ eristettiin 3.4 ke:n Sstl-fragmentti 25 pilkkomalla faagi-DNA SstI:llä ja erottamalla fragmentit ·:··· kuten esimerkissä 2.4 on kuvattu. Fragmentti pilkottiin :\J agaroosigeelistä, minkä jälkeen se otettiin talteen aga- roosipalasta elektroeluutiolla käyttämällä ISCO-kuppeja.

• · ·

Dialyysimembraani asetettiin tämän kupin sekä suureen . . 30 että pieneen säiliöön, kuppi täytettiin 0,005 x TAE:11a ja agaroosipala asetettiin kupin suureen säiliöön. Tämän \ * jälkeen kuppi asetettiin elektroeluutiolaitteeseen, suuri | säiliö katodikammioon, joka sisälsi TAE:ta, ja pieni säi- liö anodikammioon, joka sisälsi TAE/3 M NaCl:ia. Frag-35 mentteja elektroeluoitiin 100 V:lla 2 tunnin ajan. Tämän Ί”, ajan jälkeen kuppi otettiin elektroeluutiolaitteesta ja ’· '· puskuri poistettiin suuresta säiliöstä, kun taas pienestä 20 110614 säiliöstä puskuri poistettiin vain yläosasta. Jäljelle jäänyttä puskuria (200 μΐ), joka sisälsi DNA-fragmentit, dialysoitiin kupissa tislattua vettä vastaan, 30 minuutin ajan. Lopulta DNA saostettiin lisäämällä 0,1 tilavuutta 5 3 M NaAc, pH 5,6 ja 2 tilavuudella kylmää (-20 eC) eta nolia. DNA kerättiin sentrifugoimalla (Eppendorf-sentri-fugi) 30 minuuttia 14 000 x g 4 °C:ssa. Supernatantin poiston jälkeen DNA-pelletti kuivattiin käyttäen Savant Speedvac vakuumisentrifugia. DNA liuotettiin 10 Miraan 10 TE-puskuria ja konsentraatio määritettiin agaroosielekt-roforeesilla käyttäen tunnettuja konsentraatioita Lambda-DNArta vertailunäytteinä ja etidiumbromidivärjäystä DNA:n osoittamiseksi.

15 Saatu fragmentti ligatoitiin vektoriin pEMBL18, joka oli pilkottu SstI:llä ja defosforyloitu alkalisella fosfataa-silla, joka oli valmistettu seuraavalla tavalla; 1 μΐ (1 Mg/μΙ) pEMBL18:aa sekoitettiin 2 μ1:η 10 x reakt. 10 (BRL), 1 μ1:η (1 U/μΙ) SstI ja 16 μ1:η steriiliä tislat-20 tua vettä kanssa. DNA:ta pilkottiin 1 tunti 37 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 0,5 μΐ alkalista fosfataasia (1 U/μΙ) (Pharmacia LKB), mitä seurasi inkubaatio edel-leen 37 °C:ssa vielä 30 minuuttia. Linearisoitu vektori :/·· eristettiin 0,6-prosenttisesta agaroosigeelistä, kuten ·:··: 2 5 edellä on kuvattu.

: 3,4 ke:n Sstl-fragmentti ligatoitiin vektoriin, joka saa- tiin plasmidista pIM150 seuraavalla menettelytavalla.

• · · 100 ng pEMBL18-fragmenttia sekoitettiin seuraavien kans-. , 30 sa: 100 ng 3,4 ke:n SstI-fragmenttia ja 4 μΐ 5 x ligaa-

;>t· tiopuskuria (koostumus; 500 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM

’·] ' MgCl2, 10 mM ATP, 10 mM ditiotreitolia, 25 % PEG-6000) , ja 1 μΐ (1,2 U/μΙ) DNA-ligaasia (BRL) lisättiin tähän seok-seen lopulliseen tilavuuteen 20 μΐ. Inkubaation jälkeen, *. 35 16 tuntia 14 °C:ssa, seos laimennettiin 100 Miraan ste-

I »4 I

·". rillillä vedellä. 10 μΐ laimennettua seosta käytettiin transformoimaan E. coli-kannan JM101 vastaanottavat so- 21 110614 lut, jotka oli valmisteltu CM1, CM2 -menetelmällä, kuten on kuvattu Pharmacian ohjekirjassa M13 kloonaus/sekven-sointimenetelmälle. Saaduista pesäkkeistä valittua kuutta kasvatettiin yli yön LB-alustalla, joka sisälsi 100 μq/ml 5 ampisilliinia. Viljelmistä eristettiin plasmidi-DNA Ma-niatis'in et ai. (1982, s. 368 - 369) kuvaamalla alkali-sella lyysimenetelmällä, jota käytettiin restriktioana-lyysiin, kuten esimerkissä 2.4 on kuvattu, valitsemaan klooni, joka sisälsi halutun plasmidin. Plasmidi-DNA 10 eristettiin suuressa mittakaavassa 500 ml viljelmistä plasmidin pIM150 sisältävää E. coli-kantaa JM101, jota kasvatettiin ampisilliinia 100 μq/ml sisältävällä LB-alustalla (Maniatis et ai., 1982, s. 86). Plasmidi puhdistettiin CsCl-sentrifugoinnilla, fenoloitiin, saostet-15 tiin etanolilla ja liuotettiin 400 μΐ^βη TE:tä. Saanto oli noin 500 μq.

Plasmidia pIM150 analysoitiin edelleen restriktioentsyy-meillä, ja saatiin restriktiokartta, joka on esitetty 20 kuvassa 1.

Tämä plasmidi talletettiin talletuslaitokseen Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS) , Baarn, Alankomaat EL. coli:ssa DH5a 11.3.1991 numerolla CBS 157.91.

*:··: 25 •:··: Esimerkki 3 :\j A. niqerin axeA-geenin sekvenssin määritys.

A. nigerin axeA-geenin sekvenssi, sen promoottori-sääte-^ . 30 lyalue, geenin rakenneosa ja lopetusalue, määritettiin alakloonaamalla fragmentit pIM150:stä M13mpl8/mpl9:aan, ’·’ ' yhdessä spesifisten oligonukleotidien käytön kanssa aluk- : keina sekvensointireaktioissa. 1

Nukleotidisekvenssianalyysiä varten eristettiin restrik-tiofragmentit, kuten esimerkissä 2.5 on kuvattu ja kloo-’· ' nättiin bakteriofagi M13 mpl8/19 RF DNA-vektoreissa (Mes- 22 110614 sing, 1983, supra; Norrander et al., supra, 1983), jotka oli pilkottu sopivilla restriktioentsyymeillä, kuten esimerkissä 2.5 on kuvattu. Nukleotidisekvenssit määritettiin dideoksinukleotidi-ketjunpäätösmenetelmällä (Sanger 5 et ai., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463 - 5467) käyttäen Pharmacia T7 DNA-polymeraasisekvensointipakkaus-ta. Tietokoneanalyysi tehtiin käyttäen PC/GENE -ohjelmaa. Määritetty sekvenssi on esitetty SEKV. ID. nro 7:na (sekvenssi luettelossa) . Intronien asema johdettiin konsensus-10 sekvenssin perusteella 5'- ja 3'-liitoskohdista.

Esimerkki 4

Kloonatun axeA-geenin ekspressio A. niger-kannassa N593.

15 Esimerkki 4.1 axeA-geenin liittäminen A. niaer-kantaan N593 kotransfor-maatiolla.

Plasmidi pIM150, saatu esimerkissä 2.5 kuvatulla tavalla, 20 vietiin A. niaeriin kotransformoimalla A. niger-kanta N593 (A. niger-kannan N402 pyr'-mutantti) käyttäen A. ni-gerin pvrA:ta valintamerkkinä plasmidissa pGW635 (Goosen ·*.'·· et ai., 1989, Mol. Gen. Genet. 219: 282 - 288) ja plasmi- : dia pIMl50 kotransformaatioplasmidina.

·:··: 25

Rihmastosta valmistettiin protoplastit kasvattamalla A_s.

: niger-kantaa N593 minimialustalla, johon oli lisätty 0,5 ·;·, % hiivauutetta, 0,2 % kasaminohappoja, 50 mM glukoosia ja 10 mM uridiinia, 20 tuntia 30 °C:ssa. A. niger-kannan , . 30 N593 protoplastien valmistaminen ja transformaatiomenet- • · tely tehtiin, kuten Goosen et ai., 1987 (supra) ovat ku- '·* ‘ vanneet. Saadut pyr+-transformantit analysoitiin axeA- *·.. geenin ekspression suhteen Western blot -analyysillä.

·, 3 5 Esimerkki 4.2 ·;·: Transformanttien seulonta axeA-geenin ekspression suh- '· teen.

23 110614

Esimerkissä 4.1 saadut transformantit analysoitiin axeA-geenituotteen, ΑΧΕ I -proteiinin, muodostuksen suhteen. Valittiin kaksikymmentä transformanttia, ja niitä kasvatettiin 72 tuntia alustalla, joka sisälsi litraa kohti; 5 30 g koivupuun ksylaania (Roth); 6 g NaN03, 0,5 g KC1, 0,5 g MgS04 x 7H20, 0,5 g CaCl2, 1,5 g KH2P04 ja 0,1 g hii-vauutetta ja 1 ml/1 Visniac-liuosta (pH 6,0). Kasvatuksen jälkeen rihmasto poistettiin suodattamalla, ja viljelmä-suodos analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo-10 reesilla käyttäen geeliä, joka sisälsi 12 % akryyliami- dia. ΑΧΕ I -proteiini osoitettiin nitroselluloosalla, sen jälkeen kun oli tehty elektroblottaus ja inkubaatio poly-klonaalisilla vasta-aineilla, jotka oli aikaansaatu esimerkissä 1.1 kuvatulla tavalla puhdistettua ΑΧΕ I -prote-15 iinia vastaan. Sitoutunut vasta-aine osoitettiin, kun oli inkuboitu vuohi-antikaniini-vasta-aineen kanssa, joka oli liitetty alkaliseen fosfataasiin, Bioradin ohjekirjan mukaisesti .

20 Neljä analysoiduista kahdestakymmenestä transformantista ylituotti ΑΧΕ I -proteiinia tällä menetelmällä määritettynä. Proteiini erittyi alustaan. Analysoiduista trans-formanteista valittiin yksi, joka antoi suurimmat saannot ·’/·· ΑΧΕ I -proteiinia, transformantti Tr AIO.

·:··: 25 •:··j Esimerkki 5 .‘. j Asetyyliksylaaniesteraasin ja endo-(l,4) -/3-ksylanaasin, ja vastaavasti β- (1,4) -ksylosidaasin yhdistetty vaikutus.

t I | . , 30 0,2-prosenttista (w/v) höyrytettyä koivupuun ksylaani- < · · liuosta inkuboitiin asetyyliesteraasin kanssa, sekä yh-distelmien asetyyliesteraasia ja joko endo-(l,4)-j8-ksy-lanaasi I:tä, endo-(l,4) -j3-ksylanaasi II: ta, endo-(l,4)-β-ksylanaasi III:a tai jS-(l,4)-ksylosidaasia kanssa. Ai-35 kakäyrät (kuten endo- (1,4) -/8-ksy lanaasi lie on esitetty ; kuvassa 2) osoittavat, että endo-(1,4)-j0-ksylanaasi I, Il • · ja III alkavat vapauttaa huomattavia määriä ksyloosia ja 24 110614 ksyloosioligomeerejä (X2, X3 ja X4) vasta kun suurin osa asetyyliryhmistä on vapautettu. Asetyyliesteraasi ei vapauta enempää etikkahappoa kuin käytettynä yhdessä ksy-laania hajottavien entsyymien kanssa. Ksyloosin vapautu-5 roinen 0- (1,4) -ksylosidaasilla höyrytetystä koivupuun ksy-laanista on hidasta mutta vakaata.

Ilman asetyyliksylaaniesteraasia endo-(lf4)-jS-ksylanaasit ja 0-(l,4)-ksylosidaasi eivät pilko höyrytettyä koivupuun 10 ksylaania, se on, ne eivät vapauta huomionarvoisia määriä Xl:tä, X2:ta, X3:a ja X4:ää. Asetyyliryhmät voivat sen vuoksi estää endo-(l,4) -0-ksylanaasien tai 0-(1,4) -ksy-losidaasin entsyymiaktiivisuuden.

15 Jotta tehostettaisiin höyrytetyn koivun puun ksylaanin hajotusta, vertailevat tutkimukset tehtiin inkuboimalla höyrytettyä koivupuun ksylaania 24 tuntia ainoastaan ase-tyyliesteraasin, endo-(1,4)-0-ksylanaasi I:n, endo-(1,4)-0-ksylanaasi II:n, endo-(l,4)-0-ksylanaasi III:n tai 0-20 (1,4)-ksylosidaasin kanssa, ja yhdistelmien asetyylieste- raasia ja näitä ksylaania hajottavia entsyymejä kanssa. Myöskin toteutettiin esi-inkubaatiot asetyyliesteraasin ·.’·.· kanssa 1 tunnin ajan, mitä seurasi 24 tunnin inkubaatiot ksylaania hajottavien entsyymien kanssa. Taulukossa 1 ·:**: 25 esitetään tulokset etikkahapon, ksyloosin ja ksyloosioli- ·:·*: gomeerien vapautumisesta 24 tunnin inkubaation jälkeen.

I I (

Asetyyliksylaaniesteraasi vapauttaa 2,60 - 2,80 ja 4,30 /xmoolia/ml asetyyliryhmiä 1 tunnin ja vastaavasti 24 tun-. . 30 nin jälkeen (4,30 μιηοο1Ϊ3/ιη1 vastaa kaikkien asetyyliryh- mien vapautumista 80 - 90-prosenttisesti). Käyttämällä *, * ksylaania hajottavien entsyymien ja asetyyliksylaanieste- j raasien yhdistelmää ei tapahdu lisääntymistä etikkahapon vapautumisen alkutasossa.

35

Ilman asetyyliksylaaniesteraasia endo-(1,4)-0-ksylanaasit • · ja 0-(1,4)-ksylosidaasi A. avamorista eivät vapauta, tai 25 110614 vapauttavat vain hyvin pieniä määriä ksyloosioligomeerejä höyrytetystä koivun puun ksylaanista (se on Xt tai Xlf X2 ja X3, β-(1,4)-ksylosidaasilla ja vastaavasti endo-(1,4)-/3-ksylanaasi I:llä). Yhdessä asetyyliksylaaniesteraasin 5 kanssa nämä ksylaania hajottavat entsyymit vapauttavat melko suuria määriä ksyloosioligomeerejä 24 tunnin inku-baation jälkeen. Kuitenkin, esikäsittelemällä höyrytettyä koivupuun ksylaania asetyyliesteraasilla vain 1 tunti, ksyloosioligomeerien määrä on jonkin verran alhaisempi.

10 Asetyyliksylaaniesteraasin ja ksylaania hajottavien entsyymien yhdistelmä vapauttaa siten suurimmat määrät X,:tä, X2:ta, X3:a ja X4:ää. Tämä eroavaisuus voidaan selittää ksyloosioligomeerien linearisaatiolla höyrytetyn koivun puun ksylaanin deasetylaatiossa. Jos suuremmat ksyloosi-15 oligomeerit eivät pilkkoudu pienemmiksi oligomeereiksi ksylaania hajottavilla entsyymeillä, suuret ksyloosioli-gomeerit voivat aggregoitua tämän linearisaation seurauksena, ja aiheuttaa saostumisen. Tämä saostuma on vähemmän altis hajotukselle (Poutanen et ai., 1989 ja 1990).

20 Tässä esitetyistä tuloksista on selvää, että asetyyliryh-mien alkuvapautumisella asetyyliesteraasin avulla luodaan ·.*·: uusia kohtia polysakkaridienkaan, näiden kohtien ollessa V·· soveltuvia endo-(l,4)-j8-ksylanaasien sitoutumiselle. To- 25 siseikka, että puhdistetut ksylaania hajottavat entsyymit ·:··· Aspergillus awamorista eivät pilkkoneet höyrytettyä koi- : vupuun ksylaania merkittävästi, vastaa Poutasen et ai.

(supra) havaintoja, että raakauute A. avamorista ei pilk- » » · konut höyrytettyä koivupuun ksylaania merkittävästi.

.·. : 30

Taulukko 1 ’ Etikkahapon, ksyloosin ja ksyloosioligomeerien vapautumi- | nen 0,2 -prosenttisesta (w/v) höyrytetystä koivupuun ksy- laaniliuoksesta asetyyliesteraasin, 1,0 Mg/ml, vaikutuk-35 sella yksin ja yhdessä endo-(1,4)-β-ksylanaasi I:n, endo- (1,4)-β-ksylanaasi II:n, endo-(1,4)-β-ksylanaasi III:n • ’· tai /3-(l,4)-ksylosidaasin kanssa, 0,1 μg/ml.

110614 26

Inkubaation tyyppi Tuotteen muodostus

Etikkahappo1 X2 X22 X32 X42 5 Nolla 0,0 0,008 0,002 0,003 0,000 AE 4,30

Endo I 0,06 0,022 0,027 0,079 0,000 10 Endo II 0,12 0,010 0,011 0,011 0,000

Endo III 0,02 0,010 0,010 0,011 0,000 0-ksylosidaasi 0,16 0,065 0,000 0,000 0,000 AE + Endo I 4.30 0,043 0,210 0,265 0,048 15 AE + Endo II 4,30 0,010 0,104 0,252 0,105 AE + Endo III 4,30 0,020 0,209 0,222 0,054 AE+/3-ksylosidaasi 4,30 0,237 0,006 0,007 0,006 AE3+Endo4 I 2,64 0,03 6 0,149 0,253 0,063 20 AE3+Endo4 II 2,76 0,010 0,038 0,080 0,045 AE3+Endo4 III 2,55 0,012 0,067 0,077 0,042 AE3+|3-ksylosidaasi42,99 0,113 0,005 0,005 0,000 1 μιηοΐ/ml 4 Esi-inkubaatio 24 h 25 2 mg/ml 3 Esi-inkubaatio 1 h \ · ·

Esimerkki 6

Asetyyliksylaaniesteraasiaktiivisuuden tutkiminen in vit- ,·. : 30 ro olosuhteissa, jotka simuloivat siipikarjan ruoansula- ... tuskanavaa • » · » » » : '·* 1,1 grammaa rehua ja rehun aineosia (asetyyliksylaanies-

teraasin kanssa tai ilman sitä) inkuboitiin 1 tunti 50 mM

35 natriumasetaattipuskurissa, pH 5,5, 39 °C:ssa, joka simu-. loi kananpojan kupua. Kun pH oli laskettu 3,0:aan Helillä ja lisätty 5 ml pepsiiniliuosta (Merck: 5,28 g/1), seosta 27 110614 inkuboitiin 1,5 tuntia 39 °C:ssa, kuten mahassa. Lintujen ohutsuolta simuloitiin nostamalla pH 6,5:een lisäämällä natriumfosfaattia (2,5 ml, IM) ja 2,5 ml pankreatiinia/-sappihappoja. Toisen 1,5 tunnin inkubaation jälkeen 5 39 °C:ssa seos sentrifugoitiin, pelletti kuivattiin ja sen paino määritettiin. Eroa käsiteltyjen ja käsittelemättömien pellettien painossa käytettiin mittana entsy-maattiselle aktiivisuudelle standardioloissa.

10 Esimerkkeinä rehun aineosista vehnänleseitä ja maissijauhoja inkuboitiin asetyyliksylaaniesteraasin kanssa edellä esitetyn kuvauksen mukaisesti. Kuiva-aineen sulavuutta parannettiin monella prosentilla.

15 Tämä osoittaa, että asetyyliksylaaniesteraasia voidaan käyttää muun kuin puusta peräisin olevan hemiselluloosa-aineksen hajotuksessa.

• 1 · f < · 4 I I I I t M < « * 1 · III I I » » » » < 4 « I k 1 * · ·

t I

t 1 · t * 1 ·

I I

* » 1 » • · i 110614 28

SEKVENSSILUETTELO

SEKV. ID. NRO: 1 SEKVENSSITYYPPI: aminohappo-5 SEKVENSSIN PITUUS: 21 aminohappoa TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: N-terminaaliset aminohapot asetyyliksy- laaniesteraasista ORGANISMI: Aspergillus niger 10

Ser Gly Ser Leu Gin Gin Vai Thr Asp Phe Gly 1

Asp Asn Pro Thr Asn Vai (Gly) Met Tyr (Ile) 12 21 15 SEKV. ID. NRO: 2 SEKVENSSITYYPPI: aminohappo-SEKVENSSIN PITUUS: 20 aminohappoa TOPOLOGIA: lineaarinen 20 MOLEKYYLITYYPPI: CNBr-peptidin N-terminaaliset aminohapot asetyyliksylaaniesteraasista (CNBR-peptidi 1) ORGANISMI: Aspergillus niger

* I I

• » * · < »

Tyr Ile Tyr Vai Pro Asn Asn Leu Ala Ser Asn ;*·: 25 1 :··,· Pro Gly Ile Vai Vai Ala Ile His Tyr 12 20 • · t i » t c · I * * SEKV. ID. NRO: 3 i<t . 30 SEKVENSSITYYPPI: aminohappo- ’·,/ SEKVENSSIN PITUUS: 20 aminohappoa < i » *, * TOPOLOGIA: lineaarinen ! MOLEKYYLITYYPPI: CNBr-peptidin N-terminaaliset aminohapot ί asetyyliksylaaniesteraasista (CNBR-peptidi 2) • ft 35 ORGANISMI: Aspergillus niger MM » *

• · I

» I I

110614 29 ? Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Pro Thr ? 1 11 Gin (lie) Tyr (His/Thr) (Ser) Gly (Ser) (Ser) Asp 12 20 5 SEKV. ID. NRO: 4 SEKVENSSITYYPPI: nukleotidi-SEKVENSSIN PITUUS: 29 nukleotidia TOPOLOGIA: lineaarinen 10 MOLEKYYLITYYPPI: oligonukleotidiseos, johdettu asetyyli- ksylaaniesteraasin N-terminaalisista aminohapoista ORGANISMI: Aspergillus niaer

GGATTATCIC CAAAATCIGT IACCTGCTG 29 15 G G G G

SEKV. ID. NRO: 5 SEKVENSSITYYPPI: nukleotidi-SEKVENSSIN PITUUS: 20 nukleotidia 20 TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: oligonukleotidiseos, johdettu asetyyli-ksylaaniesteraasin N-terminaalisista aminohapoista . . : ORGANISMI: Aspergillus niaer • * · ’ : 25 CCAAAATCIG TIACTTGTTG 20

G G G G

• · SEKV. ID. NRO: 6 • · · v : SEKVENSSITYYPPI: nukleotidi- 30 SEKVENSSIN PITUUS: 20 nukleotidia : \: TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: oligonukleotidiseos, johdettu asetyyli-ksylaaniesteraasin CNBr-peptidin 1 N-terminaalisista ami-nohapoista ·;·’ 35 ORGANISMI: Aspergillus niaer » » · 30 110614

TTATTIGGIA CATAGATATA 20 G G G G

SEKV. ID. NRO: 7 5 SEKVENSSITYYPPI: nukleotidi-, ja vastaava proteiini SEKVENSSIN PITUUS: 1943 emäsparia TOPOLOGIA: lineaarinen MOLEKYYLITYYPPI: genominen DNA ALKUPERÄINEN LÄHDE 10 ORGANISMI: Aspergillus niger VÄLITÖN LÄHDE KOKEISSA SOLULINJAN NIMI: E. coli JM101::pGW150 YKSITYISKOHDAT: 606 - 612 TATA-signaali 15 534 - 538 CCAAT-box 713 - 1756 koodaava sekvenssi 918 - 970 introni l 1228 - 1305 introni 2 713 - 800 prepropeptidi 20 801 - 1756 kypsä peptidi OMINAISUUDET: Aspergillus niaerin asetyyliksylaanieste-raasin (axe A) geeni AA ATATGTCTTT TATTACCTTG TTCTGTTGAC TGGTGCATTA CTTAAAACTA 52 • · • i ·:**: GAACAGTTGT TCAAACACAA GTTGGACCTA TACCTGTCAT AACTCGCCTC 102 • · :*·,·; GTCGCGTTAT TCATCATGCA AAAACTATCC GTTATCAGCG CCGGGAGTAT 152 • · « • · · t · · ACTCCCAAGA AGCTCACTCA CATGCAAAGA AATGTGCCGA TTGCTTAAGC 202 i · * TTTACCCCAG ATTATTCCGT AACCATATAT CCATTCTGGC TGAATACCGG 252 • · » » t · • '·· CTATTTGATG CTGCATACTC TCACATTCCG CACAGCCGCC AGTGTGAAGA 3 02 • · · ATCACCAGTG GTCCAGCCCT GCAGTGGCTC TAACGGGATC TGTTACGGAG 352 TTCGGCCCGC AACGTCGATC TCTAACCATT TCGATCTGGA GTTCCCACTC 402 3i 110614 CGTGCCGTCT ATCCCAGACT CCTCATGTCG GAGCTGTCAC GGCTGTCACA 452 TTAGCCCTGC TTAATTTCCG TGATGAAATC AGCCTACACT GTCATTTCTA 502 TGTCTAGACC ACTGCCAAAT ACCCACTGAA CCCAATACTT CCCACAACTA 552 TAGAAACATA CTATTACTCC ATAATGTTTC AATTTACCCG CTCTCTGCAG 602 CGCTATAAAT CGTCTTCAAA TCCTCTGGCG TCTTTCCTAC TGCCCAAGCT 652 GCATCTCTTT TCACCTAGCA GGATTCAAGC GTAGTGCCTA GCACGGCAGA 702 AGAAACCACC 712 ATG CTA CTA TCA ACC CAC CTC CTC TTC GTC ATC ACC ACC TTC TTA 757

Met Leu Leu Ser Thr His Leu Leu Phe Val lie Thr Thr Phe Leu -25 -20 -15 ACC TCC CTC CTC CAC CCC ATC GCC GCC CAT GCT GTC AAG CGC AGT 802

Thr Ser Leu Leu His Pro lie Ala Ala His Ala Val Lys Arg Ser -10 -5 15 • GGC AGT CTT CAA CAG GTC ACC GAT TTC GGT GAC AAC CCT ACA AAT 847

Gly Ser Leu Gin Gin Val Thr Asp Phe Gly Asp Asn Pro Thr Asn ’· 10 15 20 ! ' GTA GGC ATG TAC ATC TAC GTG CCT AAC AAC TTG GCC TCA AAT CCA 892 ;*·.· Val Gly Met Tyr lie Tyr Val Pro Asn Asn Leu Ala Ser Asn Pro 25 30 35 GGT ATC GTG GTT GCA ATC CAC TAC TGTACG TTCCCCCACA TTTCTACAAT 942 Gly lie Val Val Ala lie His Tyr 40 : ·.· ATAAACCACA ATACTAAGCA TGGCATAG GC ACC GGT ACC GGC CCC GGC TAC993 ,···, Leu Thr Gly Thr Gly Pro Gly Tyr '.·· 45 50 : TAC AGC GCC TCC CCC TAC GCC ACC CTC TCC GAG CAA TAC GGC TTT 1038 • ' Tyr Ser Ala Ser Pro Tyr Ala Thr Leu Ser Glu Gin Tyr Gly Phe 55 60 65 32 110614 ATC GTG ATC TAC CCG TCC AGO CCA TAC TCC GGT GGC TGT TGG GAC 1083

Ile Val lie Tyr Pro Ser Ser Pro Tyr Ser Gly Gly Cys Trp Asp 70 75 80 GTG AGT TCA CAG GCA ACG TTA ACA CAC AAC GGG GGC GGA AAC AGT 1128

Val Ser Ser Gin Ala Thr Leu Thr His Asn Gly Gly Gly Asn Ser 85 90 95 AAC TCC ATT GCC AAC ATG GTC ACC TGG ACG ATT AGC GAG TAC GGG 1173

Asn Ser lie Ala Asn Met Val Thr Trp Thr lie Ser Glu Tyr Gly 100 105 110 GCC GAT AGT AGC AAG GTG TTC GTG ACG GGA TCG AGT TCG GGG GCT 1218

Ala Asp Ser Ser Lys Val Phe Val Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ala 115 120 125 ATG TTG ACG GTATTTCCTC TTCCCTTCCA ACCGTTCCCC CTCTCTACAA 1267

Met Leu Thr 129 ATTAAAATAG TAAAAGTTGT GCATGCTAAT AAAATTAG AAC GTA ATG GCA 1317

Asn Val Met Ala 133 GCA ACC TAC CCC GAA CTC TTC GCC GCC GCC ACC GTC TAC TCC GGA 1362

Ala Thr Tyr Pro Glu Leu Phe Ala Ala Ala Thr Val Tyr Ser Gly 140 145 GTC TCA GCC GGG TGC TTC TAC TCG AAC ACC AAC CAA GTA GAT GGA 14 07 ·.* Val Ser Ala Gly Cys Phe Tyr Ser Asn Thr Asn Gin Val Asp Gly 150 155 160 :·*: TGG AAT TCC ACT TGC GCC CAG GGT GAT GTA ATC ACC ACC CCC GAG 1452 ,·. ; Trp Asn Ser Thr Cys Ala Gin Gly Asp Val lie Thr Thr Pro Glu 165 170 175 • · · • · · ‘ CAC TGG GCC AGT ATT GCA GAG GCA ATG TAC TCG GGA TAC TCA GGA 1497

His Trp Ala Ser lie Ala Glu Ala Met Tyr Ser Gly Tyr Ser Gly .·. : 180 185 190 • · · AGT CGT CCA AGG ATG CAG ATC TAC CAC GGT ACT CTC CAT ACG ACG 154 2

Ser Arg Pro Arg Met Gin lie Tyr His Gly Thr Leu His Thr Thr 195 200 205 CTG TAT CCT CAG AAC TAC TAT GAG ACG TGC AAG CAG TGG TCT GGA 1587

Leu Tyr Pro Gin Asn Tyr Tyr Glu Thr Cys Lys Gin Trp Ser Gly ·;· 210 215 220 :Λ: GTG TTT GGA TAT GAT TAT AGC GCA CCG GAG AAG ACG GAG GCG AAT 1632

Val Phe Gly Tyr Asp Tyr Ser Ala Pro Glu Lys Thr Glu Ala Asn 225 230 235 33 1106 1 4 ACC CCA CAG ACG AAT TAC GAG ACG ACG ATT TGG GGA GAT AGT CTG 1677

Thr Pro Gin Thr Asn Tyr Glu Thr Thr lie Trp Gly Asp Ser Leu 240 245 250 CAG GGA ATC TTC GCG ACA GGC GTG GGT CAT ACG GTG CCG ATT CAT 1722

Gin Gly Ile Phe Ala Thr Gly Val Gly His Thr Val Pro lie His 255 260 265 GGG GAT AAG GAT ATG GAG TGG TTT GGG TTT GCT TGATTGGATG 1765

Gly Asp Lys Asp Met Glu Trp Phe Gly Phe Ala 270 275 279 ATCGAATGGT TTAGCCTGGG GGTATCTCGG AACCGGGAAT GATGAAACTT 1815 CTGAAGTATG ATATGTTAAC GATATCGCGT CAACGAGCGT TTGTTGAAGC 1865 TTTAGTGTGT AATGTGGAGT ATGAGCAAAA TGTGCGCTGC CCGTGTCTGA 1915 TGCCAAAACC AATGCAGCAC AAGAGCTC 1943

Claims (9)

1. Rekombinantti-DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että fragmentti koodaa proteiinia, jolla on asetyyliksy-5 laaniesteraasiaktiivisuutta, joka DNA-fragmentti on esitetty sekvenssissä nro 7, tai on sieni-DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu mainitun sekvenssin kanssa ankarissa olosuhteissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinantti-DNA-frag- mentti, tunnettu siitä, että sieni valitaan joukosta, johon kuuluvat seuraavat suvut: Aspergillus, Trichoderma ja Schizophyllum.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen rekombinantti-DNA-frag mentti, tunnettu siitä, että sieni valitaan joukosta, johon kuuluvat seuraavat lajit: Trichoderma reesei, Aspergillus niger ja Schizophyllum commune.

4. Ekspressiovektori, joka sisältää minkä tahansa patent- : tivaatimuksista 1-3 mukaisen DNA-fragment in, tunnettu siitä, että DNA-fragmentti on liittynyt toiminnallisesti ekspression säätelysekvensseihin. ] 25 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen ekspressiovektori, tun- '· " nettu siitä, että säätelysekvenssit ovat heterologiset • a · V; kloonatulle DNA-fragmentille.

6. Mikrobi-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on trans- • · ·*’*: 30 formoitu ekspressiovektorilla, joka sisältää asety/liksy- laaniesteraasiaktiivisuutta omaavaa proteiinia koodaavan, patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-fragmentin. • a : 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen transformoitu mikrobi- 35 isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu on Aspergillus, Bacillus tai Kluyveromyces. 110614

8. Menetelmä asetyyliksylaaniesteraasiaktiivisuutta omaavan proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että: a) viljellään mikrobi-isäntää, joka on transformoitu eks-5 pressiovektorilla, joka sisältää asetyyliksylaanieste- raasiaktiivisuutta omaavaa proteiinia koodaavan, patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-fragmentin, olosuhteissa, jotka saavat aikaan asetyyliksylaaniesteraasin tuoton, b) valinnaisesti otetaan talteen asetyyliksylaaniesteraa-10 si viljelmästä.

9. Plasmidi pIM150 (CBS 157.91).

15 Patentkrav