JPH05123173A - 真菌由来のアセチルキシランエステラーゼのクローニング、発現および利用 - Google Patents
真菌由来のアセチルキシランエステラーゼのクローニング、発現および利用Info
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- JPH05123173A JPH05123173A JP4110616A JP11061692A JPH05123173A JP H05123173 A JPH05123173 A JP H05123173A JP 4110616 A JP4110616 A JP 4110616A JP 11061692 A JP11061692 A JP 11061692A JP H05123173 A JPH05123173 A JP H05123173A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 真菌アセチルキシランエステラーゼをコード
するＤＮＡ のクローニングおよび発現、該ＤＮＡ の
発現により得られる組み換えアセチルキシランエステラ
ーゼ並びにその使用法を提供することを目的とする。 【構成】 アセチルキシランエステラーゼ活性を有する
タンパクをコードする組み換えＤＮＡ フラグメント、
該フラグメントを含む発現ベクター、該ベクターにより
形質転換された微生物宿主細胞、該微生物宿主細胞を培
養する工程を含むアセチルキシランエステラーゼ活性を
有するタンパクの製法、並びに該タンパクまたはこれと
他のキシラン分解性酵素との組み合わせを使用する、試
料消化能の増進法、クラフトパルプからのリグニンの除
去法、キシラン含有粗製物の粘度低下法および該タンパ
クを含む試料粗製物。
するＤＮＡ のクローニングおよび発現、該ＤＮＡ の
発現により得られる組み換えアセチルキシランエステラ
ーゼ並びにその使用法を提供することを目的とする。 【構成】 アセチルキシランエステラーゼ活性を有する
タンパクをコードする組み換えＤＮＡ フラグメント、
該フラグメントを含む発現ベクター、該ベクターにより
形質転換された微生物宿主細胞、該微生物宿主細胞を培
養する工程を含むアセチルキシランエステラーゼ活性を
有するタンパクの製法、並びに該タンパクまたはこれと
他のキシラン分解性酵素との組み合わせを使用する、試
料消化能の増進法、クラフトパルプからのリグニンの除
去法、キシラン含有粗製物の粘度低下法および該タンパ
クを含む試料粗製物。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は分子生物学の分野に係わ
る。特に、本発明は真菌のアセチルキシランエステラー
ゼをコードするＤＮＡ 配列のクローニングおよび発現
に関する。本発明はこのタンパクをコードするクローニ
ングしたＤＮＡ 配列の発現により得られる組み換えア
セチルキシランエステラーゼを提供する。かくして得ら
れたタンパクは飼料またはパルプのキシラン分解におい
て利用される。
る。特に、本発明は真菌のアセチルキシランエステラー
ゼをコードするＤＮＡ 配列のクローニングおよび発現
に関する。本発明はこのタンパクをコードするクローニ
ングしたＤＮＡ 配列の発現により得られる組み換えア
セチルキシランエステラーゼを提供する。かくして得ら
れたタンパクは飼料またはパルプのキシラン分解におい
て利用される。
【０００２】
【従来の技術】植物組織の細胞壁の堅い構造はキシラ
ン、他のヘミセルロース、ペクチン、セルロースおよび
リグニンの存在によるものである。キシランは主なヘミ
セルロースを形成し、殆どのキシランは１，４−結合β
−Ｄ−キシロピラノース単位のホモポリマー主鎖をもつ
ヘテロ多糖類である。起原となる植物は特定のキシラン
の置換の程度およびその型を決定する。キシランは多く
の異なる側鎖を含むことが分かっており、特にＬ−アラ
ビノース、Ｄ−グルクロン酸またはその４−０−メチル
エーテル、および酢酸、ｐ−クマル酸およびフェルラ酸
が最も顕著なものである。アセチルおよびアラビノシル
置換体両者は、分子間凝集の可能性を減ずることにより
そのヘミセルロースの溶解度を増大することが示唆され
ていたが、これらの置換体は同時に植物組織の酵素分解
を著しく妨害する。例えば、アセチル化は反芻動物にお
ける植物多糖類の消化性を阻害することが報告されてい
る。プタネン＆パルス（Ｐｏｕｔａｎｅｎ ａｎｄ Ｐ
ｕｌｓ）は、ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，１９８９，
３９９，ｐｐ．６３０−６４０，ルイス（Ｌｅｗｉｓ）
Ｎ．およびパイス（Ｐａｉｃｅ）Ｍ．編の植物細胞壁ポ
リマーの生物発生および生物分解（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｎ ｏｆＰｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）と題する
論文において、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の主なキシラナーゼがアセチ
ル化可溶性キシランを解重合し得ないことを示した。グ
ローマン（Ｇｒｏｈｍａｎｎ）等は、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，２０
／２１，ｐｐ．４５−６１において、化学的脱アセチル
化後には、キシランは反芻動物により５〜７倍も消化性
となることを示した。
ン、他のヘミセルロース、ペクチン、セルロースおよび
リグニンの存在によるものである。キシランは主なヘミ
セルロースを形成し、殆どのキシランは１，４−結合β
−Ｄ−キシロピラノース単位のホモポリマー主鎖をもつ
ヘテロ多糖類である。起原となる植物は特定のキシラン
の置換の程度およびその型を決定する。キシランは多く
の異なる側鎖を含むことが分かっており、特にＬ−アラ
ビノース、Ｄ−グルクロン酸またはその４−０−メチル
エーテル、および酢酸、ｐ−クマル酸およびフェルラ酸
が最も顕著なものである。アセチルおよびアラビノシル
置換体両者は、分子間凝集の可能性を減ずることにより
そのヘミセルロースの溶解度を増大することが示唆され
ていたが、これらの置換体は同時に植物組織の酵素分解
を著しく妨害する。例えば、アセチル化は反芻動物にお
ける植物多糖類の消化性を阻害することが報告されてい
る。プタネン＆パルス（Ｐｏｕｔａｎｅｎ ａｎｄ Ｐ
ｕｌｓ）は、ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，１９８９，
３９９，ｐｐ．６３０−６４０，ルイス（Ｌｅｗｉｓ）
Ｎ．およびパイス（Ｐａｉｃｅ）Ｍ．編の植物細胞壁ポ
リマーの生物発生および生物分解（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ ａｎｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｎ ｏｆＰｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）と題する
論文において、トリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄ
ｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の主なキシラナーゼがアセチ
ル化可溶性キシランを解重合し得ないことを示した。グ
ローマン（Ｇｒｏｈｍａｎｎ）等は、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，２０
／２１，ｐｐ．４５−６１において、化学的脱アセチル
化後には、キシランは反芻動物により５〜７倍も消化性
となることを示した。
【０００３】エステラーゼ（ＥＣ３．１．１．６）はそ
の基質特異性に従って分類される。これらの酵素に対す
る天然の基質を決定することは一般に困難であるので、
この分類は問題があり、かつこの問題はエステラーゼが
天然に広範に出現することから更に顕著となる。従っ
て、長い間知られていた種々の合成基質に作用すること
が知られている微生物起原のエステラーゼの存在の観点
から、キシランを脱アセチル化する酵素の存在が予想さ
れるかも知れないが、最近になって初めてアセチ、キシ
ランエステラーゼの存在が明らかとなった。ビーリー
（Ｂｉｅｌｙ）等は、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８
５，１８６，ｐｐ．８０−８４において、真菌のセルロ
ース分解およびヘミセルロース分解系：トリコデルマリ
ーゼイ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ Ｎｉｇｅｒ）、シゾフィルムコムネ（Ｓｃｈｉｚｏ
ｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）およびオーレオバシ
ディウムプルーランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ
ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）におけるアセチルキシランエステ
ラーゼの存在を立証した。植物および動物のエステラー
ゼを比較すると、これらの真菌由来のエステラーゼはア
セチル化グルクロノキシランに対する高い特異的活性を
示し、かつその結果としてアセチルキシランエステラー
ゼと命名された。
の基質特異性に従って分類される。これらの酵素に対す
る天然の基質を決定することは一般に困難であるので、
この分類は問題があり、かつこの問題はエステラーゼが
天然に広範に出現することから更に顕著となる。従っ
て、長い間知られていた種々の合成基質に作用すること
が知られている微生物起原のエステラーゼの存在の観点
から、キシランを脱アセチル化する酵素の存在が予想さ
れるかも知れないが、最近になって初めてアセチ、キシ
ランエステラーゼの存在が明らかとなった。ビーリー
（Ｂｉｅｌｙ）等は、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８
５，１８６，ｐｐ．８０−８４において、真菌のセルロ
ース分解およびヘミセルロース分解系：トリコデルマリ
ーゼイ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ Ｎｉｇｅｒ）、シゾフィルムコムネ（Ｓｃｈｉｚｏ
ｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）およびオーレオバシ
ディウムプルーランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ
ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）におけるアセチルキシランエステ
ラーゼの存在を立証した。植物および動物のエステラー
ゼを比較すると、これらの真菌由来のエステラーゼはア
セチル化グルクロノキシランに対する高い特異的活性を
示し、かつその結果としてアセチルキシランエステラー
ゼと命名された。
【０００４】真菌由来のアセチルエステラーゼに関する
研究が更に報告されている。プタネン等は、Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８
８，２８，ｐｐ．４１９−４２５およびｉｂｉｄ，１９
９０，３３，ｐｐ．５０６−５１０において、Ｔ．リー
ゼイ由来のアセチルキシランエステラーゼの精製および
特徴付けを記載している。精製したアセチルキシランエ
ステラーゼを使用したキシランの酵素的脱アセチル化は
残りのポリマー構造の沈澱を生じた。この作用のため
に、アセチルエステラーゼはアセチル化キシラン類の分
解における単独で第一の酵素として使用されることはな
い。アセチル化キシランからの最高のキシロース収率は
キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアセチルキシ
ランエステラーゼの相乗効果により得られた。キシラン
類の実際上有用な分解を達成するためには、これらの高
度に置換された分子の酵素加水分解に関与する酵素を大
量に使用する必要がある。本発明は、場合によっては精
製された形状で、大量の真菌由来のアセチルキシランエ
ステラーゼを得る方法を提供する。
研究が更に報告されている。プタネン等は、Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８
８，２８，ｐｐ．４１９−４２５およびｉｂｉｄ，１９
９０，３３，ｐｐ．５０６−５１０において、Ｔ．リー
ゼイ由来のアセチルキシランエステラーゼの精製および
特徴付けを記載している。精製したアセチルキシランエ
ステラーゼを使用したキシランの酵素的脱アセチル化は
残りのポリマー構造の沈澱を生じた。この作用のため
に、アセチルエステラーゼはアセチル化キシラン類の分
解における単独で第一の酵素として使用されることはな
い。アセチル化キシランからの最高のキシロース収率は
キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアセチルキシ
ランエステラーゼの相乗効果により得られた。キシラン
類の実際上有用な分解を達成するためには、これらの高
度に置換された分子の酵素加水分解に関与する酵素を大
量に使用する必要がある。本発明は、場合によっては精
製された形状で、大量の真菌由来のアセチルキシランエ
ステラーゼを得る方法を提供する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】そこで、本発明の目的の一つは精製かつ単離
された、真菌由来のアセチルキシランエステラーゼを提
供することにある。このタンパクは真菌アセチルキシラ
ンエステラーゼをコードする遺伝子の発現生成物であ
る。本発明の目的は、更にアセチルキシランエステラー
ゼをコードする配列の天然調節配列を使用するか、ある
いは別の態様では調節領域、例えば所定の発現宿主に依
存して選択されるプロモータ、分泌リーダーおよびター
ミネータシグナルに機能可能に結合した遺伝子を使用し
た、該アセチルキシランエステラーゼをコードする配列
の微生物発現用の構築物を提供することにある。本発明
の目的は、更に本発明の発現構築物により形質転換され
た発現宿主を提供することにあり、該宿主は過重発現
（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）可能であり、しかも
場合により真菌起原のアセチルキシランエステラーゼの
分泌を可能とする。本発明の更に別の目的は、大量のア
セチルキシランエステラーゼを製造する方法を提供する
ことにある。本発明は、更に有効量のアセチルキシラン
エステラーゼを飼料に添加することを特徴とする飼料の
消化能を増大する方法を提供する。更に、本発明は有効
量のアセチルキシランエステラーゼを添加することを特
徴とするキシラン含有組成物の粘度を低下させる方法を
提供することを目的とする。本発明は、更に紙製品の調
製における、クラフトパルプからリグニンを除去する方
法を提供することにある。
めの手段】そこで、本発明の目的の一つは精製かつ単離
された、真菌由来のアセチルキシランエステラーゼを提
供することにある。このタンパクは真菌アセチルキシラ
ンエステラーゼをコードする遺伝子の発現生成物であ
る。本発明の目的は、更にアセチルキシランエステラー
ゼをコードする配列の天然調節配列を使用するか、ある
いは別の態様では調節領域、例えば所定の発現宿主に依
存して選択されるプロモータ、分泌リーダーおよびター
ミネータシグナルに機能可能に結合した遺伝子を使用し
た、該アセチルキシランエステラーゼをコードする配列
の微生物発現用の構築物を提供することにある。本発明
の目的は、更に本発明の発現構築物により形質転換され
た発現宿主を提供することにあり、該宿主は過重発現
（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）可能であり、しかも
場合により真菌起原のアセチルキシランエステラーゼの
分泌を可能とする。本発明の更に別の目的は、大量のア
セチルキシランエステラーゼを製造する方法を提供する
ことにある。本発明は、更に有効量のアセチルキシラン
エステラーゼを飼料に添加することを特徴とする飼料の
消化能を増大する方法を提供する。更に、本発明は有効
量のアセチルキシランエステラーゼを添加することを特
徴とするキシラン含有組成物の粘度を低下させる方法を
提供することを目的とする。本発明は、更に紙製品の調
製における、クラフトパルプからリグニンを除去する方
法を提供することにある。
【０００６】菌糸状真菌は種々の加水分解酵素、例えば
α−アミラーゼ、プロテアーゼおよびグルコアミラー
ゼ、および種々の植物細胞壁分解酵素、例えばセルラー
ゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼを大量に分泌す
る能力のために広く知られている。本発明は真菌由来の
アセチルキシランエステラーゼの配列を含む精製かつ単
離されたＤＮＡ 分子並びにその遺伝的変異体を記載す
る。遺伝的変異体は変異アセチルキシランエステラーゼ
をコードするこれらのＤＮＡ 配列である。本発明はま
た示された配列とハイブリダイズされ、かつ発現の際に
エステラーゼ活性を呈するタンパクを生ずる真菌ＤＮＡ
配列をも包含する。特に、実施例の一つにおいて単離
されたＡ．ニガーアセチルキシランエステラーゼ遺伝子
はＴ．リーゼイの染色体ＤＮＡ とハイブリダイズする
ことが示された。本発明は、また上記のＤＮＡ配列を含
む組み換えＤＮＡ 分子により形質転換された相同また
は非相同宿主にも関連する。「相同宿主」なる用語は該
遺伝子を得た種を意味し、「非相同宿主」とは該遺伝子
を得た起原以外の宿主を意味する。非相同宿主は細菌、
酵母または真菌から選択できる。用語「相同」および
「非相同」は調節配列についても使用される。この場
合、「相同」とはクローン化遺伝子に対する元の調節配
列を意味し、「非相同」とは他の遺伝子から得た調節配
列または他の種から得た同一の遺伝子を意味する。特に
興味のあるアセチルキシランエステラーゼはアスペルギ
ルス、トリコデルマ、シゾフィルム族の真菌から得たも
のである。好ましい種はアスペルギルスニガー、トリコ
デルマリーゼイおよびシゾフィルムコムネである。
α−アミラーゼ、プロテアーゼおよびグルコアミラー
ゼ、および種々の植物細胞壁分解酵素、例えばセルラー
ゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼを大量に分泌す
る能力のために広く知られている。本発明は真菌由来の
アセチルキシランエステラーゼの配列を含む精製かつ単
離されたＤＮＡ 分子並びにその遺伝的変異体を記載す
る。遺伝的変異体は変異アセチルキシランエステラーゼ
をコードするこれらのＤＮＡ 配列である。本発明はま
た示された配列とハイブリダイズされ、かつ発現の際に
エステラーゼ活性を呈するタンパクを生ずる真菌ＤＮＡ
配列をも包含する。特に、実施例の一つにおいて単離
されたＡ．ニガーアセチルキシランエステラーゼ遺伝子
はＴ．リーゼイの染色体ＤＮＡ とハイブリダイズする
ことが示された。本発明は、また上記のＤＮＡ配列を含
む組み換えＤＮＡ 分子により形質転換された相同また
は非相同宿主にも関連する。「相同宿主」なる用語は該
遺伝子を得た種を意味し、「非相同宿主」とは該遺伝子
を得た起原以外の宿主を意味する。非相同宿主は細菌、
酵母または真菌から選択できる。用語「相同」および
「非相同」は調節配列についても使用される。この場
合、「相同」とはクローン化遺伝子に対する元の調節配
列を意味し、「非相同」とは他の遺伝子から得た調節配
列または他の種から得た同一の遺伝子を意味する。特に
興味のあるアセチルキシランエステラーゼはアスペルギ
ルス、トリコデルマ、シゾフィルム族の真菌から得たも
のである。好ましい種はアスペルギルスニガー、トリコ
デルマリーゼイおよびシゾフィルムコムネである。
【０００７】アセチルキシランエステラーゼ活性を有す
る真菌は当分野で周知の方法によりタンパクを単離する
のに利用できる。ここに提示する実施例では、アスペル
ギルスニガーを該アセチルキシランエステラーゼの起原
として使用した。このアセチルキシランエステラーゼは
該アスペルギルス菌株を培養することにより生成され
る。このタンパクは公知の方法で精製され、該精製の収
率は適当な活性アッセイにより得られる。このタンパク
構造の特徴付けの第一工程として、該単離タンパクのア
ミノ酸配列の一部を決定する。Ｎ−末端アミノ酸配列決
定技術を使用した場合、このアミノ酸配列部分は該成熟
タンパクのＮ−末端部分であるが、これはまた特定のプ
ロテイナーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン等あ
るいは化学試薬、例えばＣＮＢｒにより該精製タンパク
を消化した後に得られる内部ペプチドのＮ−末端である
可能性もある。Ｃ−末端配列決定法を使用した場合、該
タンパクまたはペプチドのＣ−末端配列を決定できる。
このような配列の１種は公知であり、この配列を基にし
てヌクレオチドプローブを誘導できる。好ましくは、こ
のプローブは、殆ど縮退を示さないコドンによりコード
されるアミノ酸を含むタンパクの一部に対して工夫され
る。このような方法で得られるこのプローブは標識し
て、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからのクローン
とハイブリダイズするのに使用できる。正のハイブリダ
イゼーションシグナルを示すクローンから、ベクターを
単離し、該インサートのヌクレオチド配列を決定する。
完全な長さのクローンが見出されない場合には、ハイブ
リダイゼーションおよび配列決定を繰り返すことができ
る。また、完全な長さのクローンは全て所定のタンパク
配列の一部をコードするオーバーラッピング制限フラグ
メントを組み合わせることにより得ることができる。こ
の得られたＤＮＡ 配列は適当な発現ベクター内でクロ
ーニングできる。発現宿主微生物の選択が適当である場
合、このクローニングは、またヌクレオチド配列を決定
することなしに実施できるが、この方法は多分最適でな
い構築物を与えるであろう。好ましい発現宿主は細菌、
酵母または真菌であり得る。具体的には、クルイベロマ
イセス、バチルス、アスペルギルスまたはＥ．コリを使
用する。
る真菌は当分野で周知の方法によりタンパクを単離する
のに利用できる。ここに提示する実施例では、アスペル
ギルスニガーを該アセチルキシランエステラーゼの起原
として使用した。このアセチルキシランエステラーゼは
該アスペルギルス菌株を培養することにより生成され
る。このタンパクは公知の方法で精製され、該精製の収
率は適当な活性アッセイにより得られる。このタンパク
構造の特徴付けの第一工程として、該単離タンパクのア
ミノ酸配列の一部を決定する。Ｎ−末端アミノ酸配列決
定技術を使用した場合、このアミノ酸配列部分は該成熟
タンパクのＮ−末端部分であるが、これはまた特定のプ
ロテイナーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン等あ
るいは化学試薬、例えばＣＮＢｒにより該精製タンパク
を消化した後に得られる内部ペプチドのＮ−末端である
可能性もある。Ｃ−末端配列決定法を使用した場合、該
タンパクまたはペプチドのＣ−末端配列を決定できる。
このような配列の１種は公知であり、この配列を基にし
てヌクレオチドプローブを誘導できる。好ましくは、こ
のプローブは、殆ど縮退を示さないコドンによりコード
されるアミノ酸を含むタンパクの一部に対して工夫され
る。このような方法で得られるこのプローブは標識し
て、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからのクローン
とハイブリダイズするのに使用できる。正のハイブリダ
イゼーションシグナルを示すクローンから、ベクターを
単離し、該インサートのヌクレオチド配列を決定する。
完全な長さのクローンが見出されない場合には、ハイブ
リダイゼーションおよび配列決定を繰り返すことができ
る。また、完全な長さのクローンは全て所定のタンパク
配列の一部をコードするオーバーラッピング制限フラグ
メントを組み合わせることにより得ることができる。こ
の得られたＤＮＡ 配列は適当な発現ベクター内でクロ
ーニングできる。発現宿主微生物の選択が適当である場
合、このクローニングは、またヌクレオチド配列を決定
することなしに実施できるが、この方法は多分最適でな
い構築物を与えるであろう。好ましい発現宿主は細菌、
酵母または真菌であり得る。具体的には、クルイベロマ
イセス、バチルス、アスペルギルスまたはＥ．コリを使
用する。
【０００８】この発現を調節するために、調節領域を、
該遺伝子が機能可能にこれらと結合するようにクローニ
ングされる。これらの調節領域の中で、相同および非相
同プロモータ、オペレータ、エンハンサ、シグナル配列
およびリボソーム結合サイトが使用できる。更に、該遺
伝子は自己複製型ベクター上にクローン化でき、あるい
は該宿主微生物のゲノムに組み込むことができ、好まし
くはより多くの該遺伝子を使用する。最後に、この得ら
れた遺伝子は、関連種から得られたＤＮＡ ライブラリ
ーとハイブリダイズするためのプローブとして使用でき
る。具体的には、実施例の一つにおいて単離されたＡ．
ニガーのアセチルキシランエステラーゼはＴ．リーゼイ
の染色体ＤＮＡ とハイブリダイズすることが示され
た。実施例において、アスペルギルスニガーから得た
３．４ ｋｂＳｓｔｌＤＮＡフラグメントのクローニン
グおよび発現が立証された。この発現はＡ．ニガーにお
ける完全な遺伝子を使用して達成される。
該遺伝子が機能可能にこれらと結合するようにクローニ
ングされる。これらの調節領域の中で、相同および非相
同プロモータ、オペレータ、エンハンサ、シグナル配列
およびリボソーム結合サイトが使用できる。更に、該遺
伝子は自己複製型ベクター上にクローン化でき、あるい
は該宿主微生物のゲノムに組み込むことができ、好まし
くはより多くの該遺伝子を使用する。最後に、この得ら
れた遺伝子は、関連種から得られたＤＮＡ ライブラリ
ーとハイブリダイズするためのプローブとして使用でき
る。具体的には、実施例の一つにおいて単離されたＡ．
ニガーのアセチルキシランエステラーゼはＴ．リーゼイ
の染色体ＤＮＡ とハイブリダイズすることが示され
た。実施例において、アスペルギルスニガーから得た
３．４ ｋｂＳｓｔｌＤＮＡフラグメントのクローニン
グおよび発現が立証された。この発現はＡ．ニガーにお
ける完全な遺伝子を使用して達成される。
【０００９】上記の如く、アセチルキシランエステラー
ゼはキシランの脱アセチル化のために利用できる。単一
の酵素としてのアセチルキシランエステラーゼの活性は
生成するポリマーの沈澱を生ずる可能性があるので、こ
の酵素を他のキシラン分解酵素類、例えばキシラナーゼ
類、アラビノフラノシダーゼ類、キシロシダーゼ類およ
びグルクロニダーゼ類、好ましくはキシラナーゼ、α−
アラビノフラノシダーゼ、β−キシロシダーゼおよびα
−グルクロニダーゼと組み合わせて使用することが好ま
しい。実施例５においては、アセチルキシランエステラ
ーゼとβ−（１，４）−キシラナーゼおよびβ−（１，
４）−キシロシダーゼの組み合わせ作用を立証する。ア
セチルキシランエステラーゼは、好ましくはキシランを
分解する諸工程で使用できる。この脱アセチル化反応の
結果として、キシランはより一層キシラナーゼに受容さ
れ易くなる。アセチルキシランエステラーゼまたはこの
酵素と他のキシラン分解酵素との組み合わせの特定の用
途は、消化性を増進するための動物飼料の前処理、その
場での処理のために飼料へのこれら酵素の添加、レオロ
ジー特性および清澄度の改良のための果汁およびビール
の処理、漂白および脱水工程を改善するためのパルプお
よび（廃）紙の加工を包含する。
ゼはキシランの脱アセチル化のために利用できる。単一
の酵素としてのアセチルキシランエステラーゼの活性は
生成するポリマーの沈澱を生ずる可能性があるので、こ
の酵素を他のキシラン分解酵素類、例えばキシラナーゼ
類、アラビノフラノシダーゼ類、キシロシダーゼ類およ
びグルクロニダーゼ類、好ましくはキシラナーゼ、α−
アラビノフラノシダーゼ、β−キシロシダーゼおよびα
−グルクロニダーゼと組み合わせて使用することが好ま
しい。実施例５においては、アセチルキシランエステラ
ーゼとβ−（１，４）−キシラナーゼおよびβ−（１，
４）−キシロシダーゼの組み合わせ作用を立証する。ア
セチルキシランエステラーゼは、好ましくはキシランを
分解する諸工程で使用できる。この脱アセチル化反応の
結果として、キシランはより一層キシラナーゼに受容さ
れ易くなる。アセチルキシランエステラーゼまたはこの
酵素と他のキシラン分解酵素との組み合わせの特定の用
途は、消化性を増進するための動物飼料の前処理、その
場での処理のために飼料へのこれら酵素の添加、レオロ
ジー特性および清澄度の改良のための果汁およびビール
の処理、漂白および脱水工程を改善するためのパルプお
よび（廃）紙の加工を包含する。
【００１０】一般に、この酵素または該酵素と他の酵素
との組み合わせは生物学的細胞壁を分解して果汁または
ビールの調製に係わる工業的用途における消化性または
流動特性の増進のために利用できる。飼料におけるアセ
チルキシランエステラーゼの使用に関するもう一つの重
要な局面はその粘度に及ぼす作用である。キシランの脱
アセチル化は該飼料成分の溶解度を減じ、かつそれによ
って粘度は減少する。このことは取り扱いの容易性を増
し、ペントサン類の低い反栄養（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉ
ｔｉｏｎａｌ）作用をもたらす。これに従って、本発明
はアセチルキシランエステラーゼを含有する飼料組成物
を提供する。更に、キシラナーゼに対するキシランの受
容性が増大する。このことは、パルプからリグニンを除
去する上で重要である。一般に、クラフトパルプは紙製
品の調製中にリグニンを除去する目的でキシラナーゼで
処理される。キシランの高いアセチル化度のために、キ
シラナーゼは最適には利用されない。キシラナーゼの有
効性は、キシラナーゼ処理の前または該処理と同時にパ
ルプをアセチルキシランエステラーゼで処理することに
より著しく増大する。上記の事実に従って、本発明は有
効量のアセチルキシランエステラーゼを飼料に添加する
ことを特徴とする該飼料の消化能を増進する方法を提供
する。本発明は、また有効量のアセチルキシランエステ
ラーゼを添加することを特徴とするキシラン含有組成物
の粘度を減ずる方法をも提供する。本発明は、更に紙製
品の調製において、クラフトパルプからリグニンを除去
する方法をも提供する。以下の実施例は例示の目的で与
えられるものであり、何等本発明を限定するものではな
い。
との組み合わせは生物学的細胞壁を分解して果汁または
ビールの調製に係わる工業的用途における消化性または
流動特性の増進のために利用できる。飼料におけるアセ
チルキシランエステラーゼの使用に関するもう一つの重
要な局面はその粘度に及ぼす作用である。キシランの脱
アセチル化は該飼料成分の溶解度を減じ、かつそれによ
って粘度は減少する。このことは取り扱いの容易性を増
し、ペントサン類の低い反栄養（ａｎｔｉ−ｎｕｔｒｉ
ｔｉｏｎａｌ）作用をもたらす。これに従って、本発明
はアセチルキシランエステラーゼを含有する飼料組成物
を提供する。更に、キシラナーゼに対するキシランの受
容性が増大する。このことは、パルプからリグニンを除
去する上で重要である。一般に、クラフトパルプは紙製
品の調製中にリグニンを除去する目的でキシラナーゼで
処理される。キシランの高いアセチル化度のために、キ
シラナーゼは最適には利用されない。キシラナーゼの有
効性は、キシラナーゼ処理の前または該処理と同時にパ
ルプをアセチルキシランエステラーゼで処理することに
より著しく増大する。上記の事実に従って、本発明は有
効量のアセチルキシランエステラーゼを飼料に添加する
ことを特徴とする該飼料の消化能を増進する方法を提供
する。本発明は、また有効量のアセチルキシランエステ
ラーゼを添加することを特徴とするキシラン含有組成物
の粘度を減ずる方法をも提供する。本発明は、更に紙製
品の調製において、クラフトパルプからリグニンを除去
する方法をも提供する。以下の実施例は例示の目的で与
えられるものであり、何等本発明を限定するものではな
い。
【００１１】
【実施例】バッファー溶液および原液 以下の実施例に記載する実験では適当な原液を使用す
る。以下の原液をマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等
の「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）」、コールドスプリングハーバー、１９８２お
よび１９８９年、第２版に記載の方法に従って調製し
た。ＴＥバッファー、２０ｘＳＳＣ、ハイブリダイゼー
ションバッファー、１００ｘデンハーツ（Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ）溶液、ＳＭバッファー、５０ＸＴＡＥバッフ
ァー、ＤＮＡ含有バッファー（キシレンシアノールおよ
びブロモフェノールブルー）、ＮＣＺＹＭ 培地、ＬＢ
培地。連結用バッファーは酵素供給者により指示された
ようにして調製した。その他の溶液は以下の成分を含ん
でいた。５ｘＲＮＢ（１０００ｍｌ当たり） ：１２１．１０ｇの
トリス（Ｔｒｉｓ）、７３．０４ｇのＮａＣｌ、９５．
１０ｇのＥＧＴＡ、ｐＨ８．５。ビスニャック（Ｖｉｓｎｉａｃ）溶液 ：１０ｇのＥＤＴ
Ａ、４．４ｇのＺｎＳ０４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのＭｎ
Ｃｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ
２Ｏ、０．３２ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２２ｇ
の（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ、１．４７ｇの
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ、ｐＨ４．０（ビスニャックおよびサンター（Ｓａｎ
ｔｅｒ），Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．，１９５７，２１，ｐ
ｐ．１９５−２１３）。最小培地（１０００ｍｌ当たり）： ６．０ｇのＮａＮＯ
３、１．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＫＣｌ、１ｍｌのビスニャック溶
液、指定されたような炭素源、ｐＨ ６．０。
る。以下の原液をマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等
の「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）」、コールドスプリングハーバー、１９８２お
よび１９８９年、第２版に記載の方法に従って調製し
た。ＴＥバッファー、２０ｘＳＳＣ、ハイブリダイゼー
ションバッファー、１００ｘデンハーツ（Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ）溶液、ＳＭバッファー、５０ＸＴＡＥバッフ
ァー、ＤＮＡ含有バッファー（キシレンシアノールおよ
びブロモフェノールブルー）、ＮＣＺＹＭ 培地、ＬＢ
培地。連結用バッファーは酵素供給者により指示された
ようにして調製した。その他の溶液は以下の成分を含ん
でいた。５ｘＲＮＢ（１０００ｍｌ当たり） ：１２１．１０ｇの
トリス（Ｔｒｉｓ）、７３．０４ｇのＮａＣｌ、９５．
１０ｇのＥＧＴＡ、ｐＨ８．５。ビスニャック（Ｖｉｓｎｉａｃ）溶液 ：１０ｇのＥＤＴ
Ａ、４．４ｇのＺｎＳ０４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのＭｎ
Ｃｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ
２Ｏ、０．３２ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２２ｇ
の（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ、１．４７ｇの
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２
Ｏ、ｐＨ４．０（ビスニャックおよびサンター（Ｓａｎ
ｔｅｒ），Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．，１９５７，２１，ｐ
ｐ．１９５−２１３）。最小培地（１０００ｍｌ当たり）： ６．０ｇのＮａＮＯ
３、１．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＫＣｌ、１ｍｌのビスニャック溶
液、指定されたような炭素源、ｐＨ ６．０。
【００１２】実施例で使用する菌株：Ｅ．コリ，ＪＭ
１０１（ヤニッシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎ）等，Ｇｅｎｅ，１９８５，３３，ｐ．１０
３）；Ｅ．コリ，ＬＥ ３９２（ムレイ（Ｍｕｒｒａ
ｙ），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７７，１５
０，ｐｐ．５３−５８）；アスペルギルスニガーＮ４０
２（グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，１９８７，１１，ｐｐ．４９９−５０３）；アス
ペルギルスニガーＮ５９３（グーセン等、ｉｂｉｄ，１
９８７）。実施例で使用するベクター ：ｐＵＣ９（ビエイラおよび
メッシング（Ｖｉｅｉｒｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ），Ｇｅｎｅ，１９８２，１９， ｐｐ．２５９−２
６８およびヤニッシュ−ペロン等，１９８５）；Ｍ１３
ｍｐ１８／Ｍ１３ｍｐ１９（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ）Ｊ．，ＩＯＩＣ：１９８３，ｐｐ．１０−７８；モ
ランダー（Ｍｏｒｒａｎｄｅｒ）等，Ｇｅｎｅ，１９８
３，２６，ｐｐ．１０１−１０６）。
１０１（ヤニッシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎ）等，Ｇｅｎｅ，１９８５，３３，ｐ．１０
３）；Ｅ．コリ，ＬＥ ３９２（ムレイ（Ｍｕｒｒａ
ｙ），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７７，１５
０，ｐｐ．５３−５８）；アスペルギルスニガーＮ４０
２（グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，１９８７，１１，ｐｐ．４９９−５０３）；アス
ペルギルスニガーＮ５９３（グーセン等、ｉｂｉｄ，１
９８７）。実施例で使用するベクター ：ｐＵＣ９（ビエイラおよび
メッシング（Ｖｉｅｉｒｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ），Ｇｅｎｅ，１９８２，１９， ｐｐ．２５９−２
６８およびヤニッシュ−ペロン等，１９８５）；Ｍ１３
ｍｐ１８／Ｍ１３ｍｐ１９（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ）Ｊ．，ＩＯＩＣ：１９８３，ｐｐ．１０−７８；モ
ランダー（Ｍｏｒｒａｎｄｅｒ）等，Ｇｅｎｅ，１９８
３，２６，ｐｐ．１０１−１０６）。
【００１３】アセチルエステラーゼアッセイ：このアッ
セイはビーリー（Ｂｉｅｌｙ）等（１９８５，上記文
献）により記載された如きものである。酵素溶液（１０
−５０μｌ）を１ｍｌの新たに調製した４−ニトロフェ
ニル酢酸（シグマ社（ＳＩＧＭＡ））を０．２Ｍの燐酸
バッファー（ｐＨ６．５）に溶解した飽和溶液と混合
し、２２゜Ｃでインキュベートした。４−ニトロフェノ
ールの遊離は時間の関数として４１０ｎｍにおける分光
測定により追跡した。アセチルエステラーゼ活性の１単
位は１分以内に１μモルの該基質を加水分解する。酵素 ：エンド−（１，４）−β−キシラナーゼ（Ｅ．
Ｃ．３．２．１．８）およびβ−（１，４）−キシロシ
ダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３７）を、アスペルギル
スアワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）ＣＭ１ １４２７１７か
ら、コルメリンク（Ｋｏｒｍｅｌｉｎｋ）等により第５
回バイオマスおよびバイオエネルギーに関するヨーロッ
パ会議会報（Ｐｒｏｃ．５ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃ
ｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｅｎｅｒｇｙ）リスボン９−１３，１９８９年１０
月，１９９０）に記載の如く精製した。アセチルエステラーゼとキシラン−分解酵素の組み合わ
せ作用 ：酢酸およびキシロースオリゴマーの遊離を蒸気
処理したカンバ材キシランを、アセチルエステラーゼお
よびエンド−（１．４）−β−キシラナーゼＩ、エンド
−（１’４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩＩおよびβ−（１，４）−
キシロシダーゼの単独または組み合わせにより分解した
後、ＨＰＬＣにより決定した。０．２％（ｗ／ｖ）の蒸
気処理したカンバ材キシラン溶液を１．０μｇ／ｍｌの
アセチルエステラーゼおよび０．１μｇ／ｍｌのエンド
−（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，４）−β
−キシラナーゼＩＩＩまたはβ−（１，４）−キシロシ
ダーゼと共に３０゜Ｃにてインキュベートした。この分
解は０〜８時間に渡り行った。該試料を沸騰水浴中に５
分間入れることによりこの反応を停止した。蒸気処理し
たカンバ材はパルス（Ｐｕｌｓ）等のＡｐｐｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８５，２
２，ｐｐ．４１６−４２３に記載の方法で調製した。
セイはビーリー（Ｂｉｅｌｙ）等（１９８５，上記文
献）により記載された如きものである。酵素溶液（１０
−５０μｌ）を１ｍｌの新たに調製した４−ニトロフェ
ニル酢酸（シグマ社（ＳＩＧＭＡ））を０．２Ｍの燐酸
バッファー（ｐＨ６．５）に溶解した飽和溶液と混合
し、２２゜Ｃでインキュベートした。４−ニトロフェノ
ールの遊離は時間の関数として４１０ｎｍにおける分光
測定により追跡した。アセチルエステラーゼ活性の１単
位は１分以内に１μモルの該基質を加水分解する。酵素 ：エンド−（１，４）−β−キシラナーゼ（Ｅ．
Ｃ．３．２．１．８）およびβ−（１，４）−キシロシ
ダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３７）を、アスペルギル
スアワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）ＣＭ１ １４２７１７か
ら、コルメリンク（Ｋｏｒｍｅｌｉｎｋ）等により第５
回バイオマスおよびバイオエネルギーに関するヨーロッ
パ会議会報（Ｐｒｏｃ．５ｔｈ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃ
ｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｅｎｅｒｇｙ）リスボン９−１３，１９８９年１０
月，１９９０）に記載の如く精製した。アセチルエステラーゼとキシラン−分解酵素の組み合わ
せ作用 ：酢酸およびキシロースオリゴマーの遊離を蒸気
処理したカンバ材キシランを、アセチルエステラーゼお
よびエンド−（１．４）−β−キシラナーゼＩ、エンド
−（１’４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩＩおよびβ−（１，４）−
キシロシダーゼの単独または組み合わせにより分解した
後、ＨＰＬＣにより決定した。０．２％（ｗ／ｖ）の蒸
気処理したカンバ材キシラン溶液を１．０μｇ／ｍｌの
アセチルエステラーゼおよび０．１μｇ／ｍｌのエンド
−（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，４）−β
−キシラナーゼＩＩＩまたはβ−（１，４）−キシロシ
ダーゼと共に３０゜Ｃにてインキュベートした。この分
解は０〜８時間に渡り行った。該試料を沸騰水浴中に５
分間入れることによりこの反応を停止した。蒸気処理し
たカンバ材はパルス（Ｐｕｌｓ）等のＡｐｐｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８５，２
２，ｐｐ．４１６−４２３に記載の方法で調製した。
【００１４】ＨＰＬＣ−中性糖：蒸気処理したカンバ材
キシランに対するエンド−（１，４）−β−キシラナー
ゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびβ−（１，４）−キシロシダ
ーゼ並びにアセチルエステラーゼの単独および組み合わ
せ作用により遊離される中性糖をＨＰＬＣにより測定し
た。試料はボラーゲン（Ｖｏｒａｇｅｎ）等（Ｆｏｏｄ
Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，１９８６，１，ｐｐ．６
５−７０）の方法に従ってＰｂ（ＮＯ３）２で前処理
し、かつＣＨ−Ｐｂカラム（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、
ダルムシュタット，ＦＲＧ）に注入し、ミリポアフィル
タ処理した水（０．４ｍｌ／分）で８５゜Ｃにて溶出し
た。糖はショデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＳＥ−６１ＲＩ
検出器で検出した。
キシランに対するエンド−（１，４）−β−キシラナー
ゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびβ−（１，４）−キシロシダ
ーゼ並びにアセチルエステラーゼの単独および組み合わ
せ作用により遊離される中性糖をＨＰＬＣにより測定し
た。試料はボラーゲン（Ｖｏｒａｇｅｎ）等（Ｆｏｏｄ
Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，１９８６，１，ｐｐ．６
５−７０）の方法に従ってＰｂ（ＮＯ３）２で前処理
し、かつＣＨ−Ｐｂカラム（メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、
ダルムシュタット，ＦＲＧ）に注入し、ミリポアフィル
タ処理した水（０．４ｍｌ／分）で８５゜Ｃにて溶出し
た。糖はショデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＳＥ−６１ＲＩ
検出器で検出した。
【００１５】実施例１：Ａ．ニガーアセチルキシランエ
ステラーゼＡＸＥ Ｉの精製および特徴付け。 実施例１．１：Ａ．ニガーアセチルキシランエステラー
ゼＡＸＥ Ｉの精製アスペルギルスニガー ＤＳ１６８１３の育成後、該培養
物を遠心分離し、その上澄を限外濾過により濃縮した。
７３ｍｌの試料をＤＥＡＥ−トリスアクリル（ＩＢＦ）
カラム（ＤＥＡＥ−トリスアクリル４００ｍｌで満たさ
れ、ｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌで緩衝した
ＸＫ５０ファルマーシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラ
ム）に適用し、ｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ
中の０．０−１．０ Ｍ ＮａＣｌ線形勾配で溶出し
た。上記の如くアセチルエステラーゼ活性につき得られ
た画分をアッセイした。アセチルエステラーゼ活性をも
つ画分を集め、０．０５Ｍ燐酸バッファー（ｐＨ７．
５）で平衡化した半分取ＤＥＡＥＨＰＬＣ カラム（ウ
ォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＤＥＡＥ ５ ＰＷ；２
１．５ｍｍ×１５ｃｍ）に適用した。溶出は同一のバッ
ファー中の０．０−１．０Ｍ ＮａＣｌ線形勾配で実施
した。最終的な精製は分析用ＤＥＡＥ ＨＰＬＣカラム
（上記のものと同様であるが、この場合のサイズは７．
５ｍｍ×７．５ｃｍ）により、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動により実施した。得られた画分をそのまま、
または該タンパクをまず適当なタンパク分解酵素により
消化した後アミノ酸配列決定に使用した。後者の場合に
おいて、得られたペプチドは該アミノ酸配列決定の前に
ＨＰＬＣを通して分離した。
ステラーゼＡＸＥ Ｉの精製および特徴付け。 実施例１．１：Ａ．ニガーアセチルキシランエステラー
ゼＡＸＥ Ｉの精製アスペルギルスニガー ＤＳ１６８１３の育成後、該培養
物を遠心分離し、その上澄を限外濾過により濃縮した。
７３ｍｌの試料をＤＥＡＥ−トリスアクリル（ＩＢＦ）
カラム（ＤＥＡＥ−トリスアクリル４００ｍｌで満たさ
れ、ｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌで緩衝した
ＸＫ５０ファルマーシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラ
ム）に適用し、ｐＨ７．８の０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ
中の０．０−１．０ Ｍ ＮａＣｌ線形勾配で溶出し
た。上記の如くアセチルエステラーゼ活性につき得られ
た画分をアッセイした。アセチルエステラーゼ活性をも
つ画分を集め、０．０５Ｍ燐酸バッファー（ｐＨ７．
５）で平衡化した半分取ＤＥＡＥＨＰＬＣ カラム（ウ
ォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＤＥＡＥ ５ ＰＷ；２
１．５ｍｍ×１５ｃｍ）に適用した。溶出は同一のバッ
ファー中の０．０−１．０Ｍ ＮａＣｌ線形勾配で実施
した。最終的な精製は分析用ＤＥＡＥ ＨＰＬＣカラム
（上記のものと同様であるが、この場合のサイズは７．
５ｍｍ×７．５ｃｍ）により、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ電気泳動により実施した。得られた画分をそのまま、
または該タンパクをまず適当なタンパク分解酵素により
消化した後アミノ酸配列決定に使用した。後者の場合に
おいて、得られたペプチドは該アミノ酸配列決定の前に
ＨＰＬＣを通して分離した。
【００１６】実施例１．２：アセチルキシランエステラ
ーゼのＮ−末端および内部ペプチドのアミノ酸配列決
定：アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）の気相配列決定装置を使用したＡ．
ニガーのアセチルキシランエステラーゼＡＸＥ ＩのＮ
−末端のアミノ酸配列決定により、以下の配列が明らか
となった。 Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ｖ
ａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−（Ｇｌｙ）−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−（Ｉｌｅ）
（式１） ＨＰＬＣを使用した分離後の、アセチルキシランエステ
ラーゼＡＸＥ ＩのＣＮＢｒペプチドのアミノ酸配列決
定により、以下の配列が明らかとなった。 ＣＮＢｒペプチド１：Ｔｙｒ−ＩＩｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−
（式２） ＣＮＢｒペプチド２：？−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−？−
Ｇｌｎ（Ｉｌｅ）−Ｔｙｒ−（Ｈｉｓ／Ｔｈｒ）−（Ｓ
ｅｒ）−Ｇｌｙ−（Ｓｅｒ）−（Ｓｅｒ）−Ａｓｐ−
（式３）
ーゼのＮ−末端および内部ペプチドのアミノ酸配列決
定：アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）の気相配列決定装置を使用したＡ．
ニガーのアセチルキシランエステラーゼＡＸＥ ＩのＮ
−末端のアミノ酸配列決定により、以下の配列が明らか
となった。 Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ｖ
ａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−（Ｇｌｙ）−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−（Ｉｌｅ）
（式１） ＨＰＬＣを使用した分離後の、アセチルキシランエステ
ラーゼＡＸＥ ＩのＣＮＢｒペプチドのアミノ酸配列決
定により、以下の配列が明らかとなった。 ＣＮＢｒペプチド１：Ｔｙｒ−ＩＩｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−
（式２） ＣＮＢｒペプチド２：？−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−？−
Ｇｌｎ（Ｉｌｅ）−Ｔｙｒ−（Ｈｉｓ／Ｔｈｒ）−（Ｓ
ｅｒ）−Ｇｌｙ−（Ｓｅｒ）−（Ｓｅｒ）−Ａｓｐ−
（式３）
【００１７】実施例２：アセチルキシランエステラーゼ
遺伝子（ａｘｅＡ）に対するＡ．ニガーゲノムライブラ
リーのスクリーニングおよび該遺伝子の単離 実施例２．１：合成オリゴヌクレオチドの３２Ｐ−標
識：実施例１．２（式１）に示したアミノ酸配列はＮ−
末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチド混合物
を誘導するのに使用した。該オリゴヌクレオチドは、ク
レア（Ｃｒｅａ）等により、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．，１９７９，５，ｐｐ．３９５−３９８に記
載のホスホアミダイト法により、アプライドバイオシス
テムズ社のオリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成
した。以下のオリゴヌクレオチド混合物を、１μｌ当た
り３７ｐＭ（ピコモル）なるオリゴヌクレオチドの最終
濃度で使用した。 ＧＧＡＴＴＡＴＣＩＣ ＣＡＡＡＡＴＣＩＧＴ ＩＡＣＣＴＧＣＴＧ ２９ （式４） Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ このオリゴヌクレオチド混合物を、３７ ｐＭのオリゴ
ヌクレオチド混合物、６６ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）・
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのスペ
ルミジン、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのジチオス
レイトール、２００ μｇ／ｍｌのＢＳＡ、３４ ｐＭ
のγ−３２Ｐ ＡＴＰ（ＮＥＮ，６０００Ｃｉ／ｍＭ）
および３０Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲ
Ｌ）なる組成の反応混合物中で、最終体積５０μｌで標
識した。この反応はｐＨ８．０の４μｌの０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡを添加することにより停止させた。この標識オリ
ゴヌクレオチド混合物は更に精製することなくゲノムラ
イブラリー（実施例２．３）のスクリーニングにおいて
およびサザンブロッティング（実施例２．５および２．
６）で使用した。
遺伝子（ａｘｅＡ）に対するＡ．ニガーゲノムライブラ
リーのスクリーニングおよび該遺伝子の単離 実施例２．１：合成オリゴヌクレオチドの３２Ｐ−標
識：実施例１．２（式１）に示したアミノ酸配列はＮ−
末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチド混合物
を誘導するのに使用した。該オリゴヌクレオチドは、ク
レア（Ｃｒｅａ）等により、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．，１９７９，５，ｐｐ．３９５−３９８に記
載のホスホアミダイト法により、アプライドバイオシス
テムズ社のオリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成
した。以下のオリゴヌクレオチド混合物を、１μｌ当た
り３７ｐＭ（ピコモル）なるオリゴヌクレオチドの最終
濃度で使用した。 ＧＧＡＴＴＡＴＣＩＣ ＣＡＡＡＡＴＣＩＧＴ ＩＡＣＣＴＧＣＴＧ ２９ （式４） Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ このオリゴヌクレオチド混合物を、３７ ｐＭのオリゴ
ヌクレオチド混合物、６６ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）・
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのスペ
ルミジン、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのジチオス
レイトール、２００ μｇ／ｍｌのＢＳＡ、３４ ｐＭ
のγ−３２Ｐ ＡＴＰ（ＮＥＮ，６０００Ｃｉ／ｍＭ）
および３０Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲ
Ｌ）なる組成の反応混合物中で、最終体積５０μｌで標
識した。この反応はｐＨ８．０の４μｌの０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡを添加することにより停止させた。この標識オリ
ゴヌクレオチド混合物は更に精製することなくゲノムラ
イブラリー（実施例２．３）のスクリーニングにおいて
およびサザンブロッティング（実施例２．５および２．
６）で使用した。
【００１８】実施例２．２：アスペルギルスニガー菌株
ＤＳ１６８１３（ＣＢＳ ３２３．９０）のゲノムライ
ブラリーの構築：アスペルギルスニガーＤＳ１６８１３
（セントラールビューローブールシメルカルチャーズ
（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈ
ｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ），オランダ、バーン（Ｂ
ａａｒｎ）に１９９０年６月２０日付けで寄託した（Ｃ
ＢＳ３２３．９０））をグラーフ（Ｇｒａａｆｆ）等
（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８８，１３，ｐｐ．３
１５−３２１）により記載された手順を使用して単離し
た。簡単に言えば、一夜育成した菌糸体を収穫し、−８
０℃で保存した。核酸をマイクロ膜分離装置（ｍｉｃｒ
ｏｄｉＳｍｅｍｂｒａｔｏｒ；ブラウン（Ｂｒａｕ
ｎ））を使用して０．５ｇの凍結菌糸体を崩壊すること
により単離した。この菌糸体粉末を、１ｍｌのトリイソ
プロピルナフタレンスルフォン酸（ＴＮＳ）（２０ｍｇ
／ｍｌ）、１ｍｌのｐ−アミノサリチル酸（ＰＡＳ）
（１２０ｍｇ／ｍｌ）および０．５ｍｌの５ｘＲＮＢバ
ッファーを含み、１．５ｍｌのフェノールで平衡化した
抽出バッファーで抽出した。この抽出バッファーを該菌
糸体粉末に添加し、フェノール／クロロホルム、クロロ
ホルム抽出を実施した。該ＤＮＡ を次いでエタノール
沈澱法により単離した。ＲＮＡ はＲＮアーゼＡにより
処理することにより該溶液から除去した。アスペルギル
スニガーＤＳ１６８１３から上記の如く単離したＤＮＡ
をＳａｕ３Ａにより部分的に消化した。生成するフラ
グメントをＴＡＥ中で０．４％アガロースゲル上での電
気泳動によりサイズ分画を行った。サイズ１４ｋｂ〜２
２ｋｂのフラグメントを、該ゲルの適当な領域を切断
し、次いで電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）
することにより該ゲルから回収した。該フラグメント
を、標準的手順で、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入
手したバクテリオファージλＥＭＢＬ ３ ＢａｍＨＩ
アーム（ａｒｍｓ）により接合した。この接合ＤＮＡ
を、ギガパックＩＩゴールド（Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｉ
Ｉ Ｇ０ｌｄ）パッケージング抽出物（ストラタジーヌ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して試験管内でパッケ
ージングし、製造業者の指示に従ってＮＺＹＣＭ培地を
使用してＥ．コリＬＥ ３９２上にプレーティングし
た。かくして得た一次ライブラリーを滴定し、増殖させ
た。約１０１０ｐｆｕ／ｍｌを含むファージストックを
作製した。
ＤＳ１６８１３（ＣＢＳ ３２３．９０）のゲノムライ
ブラリーの構築：アスペルギルスニガーＤＳ１６８１３
（セントラールビューローブールシメルカルチャーズ
（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈ
ｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ），オランダ、バーン（Ｂ
ａａｒｎ）に１９９０年６月２０日付けで寄託した（Ｃ
ＢＳ３２３．９０））をグラーフ（Ｇｒａａｆｆ）等
（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８８，１３，ｐｐ．３
１５−３２１）により記載された手順を使用して単離し
た。簡単に言えば、一夜育成した菌糸体を収穫し、−８
０℃で保存した。核酸をマイクロ膜分離装置（ｍｉｃｒ
ｏｄｉＳｍｅｍｂｒａｔｏｒ；ブラウン（Ｂｒａｕ
ｎ））を使用して０．５ｇの凍結菌糸体を崩壊すること
により単離した。この菌糸体粉末を、１ｍｌのトリイソ
プロピルナフタレンスルフォン酸（ＴＮＳ）（２０ｍｇ
／ｍｌ）、１ｍｌのｐ−アミノサリチル酸（ＰＡＳ）
（１２０ｍｇ／ｍｌ）および０．５ｍｌの５ｘＲＮＢバ
ッファーを含み、１．５ｍｌのフェノールで平衡化した
抽出バッファーで抽出した。この抽出バッファーを該菌
糸体粉末に添加し、フェノール／クロロホルム、クロロ
ホルム抽出を実施した。該ＤＮＡ を次いでエタノール
沈澱法により単離した。ＲＮＡ はＲＮアーゼＡにより
処理することにより該溶液から除去した。アスペルギル
スニガーＤＳ１６８１３から上記の如く単離したＤＮＡ
をＳａｕ３Ａにより部分的に消化した。生成するフラ
グメントをＴＡＥ中で０．４％アガロースゲル上での電
気泳動によりサイズ分画を行った。サイズ１４ｋｂ〜２
２ｋｂのフラグメントを、該ゲルの適当な領域を切断
し、次いで電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）
することにより該ゲルから回収した。該フラグメント
を、標準的手順で、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入
手したバクテリオファージλＥＭＢＬ ３ ＢａｍＨＩ
アーム（ａｒｍｓ）により接合した。この接合ＤＮＡ
を、ギガパックＩＩゴールド（Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｉ
Ｉ Ｇ０ｌｄ）パッケージング抽出物（ストラタジーヌ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して試験管内でパッケ
ージングし、製造業者の指示に従ってＮＺＹＣＭ培地を
使用してＥ．コリＬＥ ３９２上にプレーティングし
た。かくして得た一次ライブラリーを滴定し、増殖させ
た。約１０１０ｐｆｕ／ｍｌを含むファージストックを
作製した。
【００１９】実施例２．３：ａｘｅＡ遺伝子用のＡ．ニ
ガーゲノムライプラリーのスクリーニング：Ａ．ニガー
ゲノムライブラリーを上記のようにして構築した。ａｘ
ｅＡ遺伝子を得るために、プレート当たり３ｘ１０３ｐ
ｆｕを、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の上記文
献，１９８２，ｐ．６４に記載の如く、プレーティング
細菌としてＥ．コリＬＥ ３９２を使用して、４つの８
５ｍｍ径のＮＺＹＣＭ（１．２％寒天）プレート上で、
０．７％のアガロースを含むＮＺＹＣＭ トパガロース
（ｔｏｐａｇａｒｏｓｅ）中にプレーティングした。該
プレートの３７℃での一夜のインキュベーション後、各
プレートの２種のレプリカをハイボンド（Ｈｙｂｏｎ
ｄ）Ｎ＋フィルタ（アマーシャム（Ａｍｓｈａｍ）上
に、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の上記文献，
１９８２，ｐｐ．３２０−３２１ に記載の如く作製し
た。３ｘＳＳＣ中で該フィルタを湿潤した後、該フィル
タを室温にて３ｘＳＳＣ 中で６０分間洗浄した。該フ
ィルタを、６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１０ｘデンハ
ーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ）溶液および１００μｇ／
ｍｌの熱変性ヘーリング精液ＤＮＡ（ベーリンガーマン
ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
含む予備ハイブリダイゼーションバッファー中で２時間
６５℃にて予備ハイブリダイゼーションした。２時間の
予備ハイブリダイゼーション後、該バッファーをハイブ
リダイゼーションバッファー（これは該予備ハイブリダ
イゼーションバッファーと同様であるがこのバッファー
はヘーリング精液ＤＮＡ を含まず、かつ実施例２．１
に記載のように調製した式１の３２ｐ−標識オリゴヌク
レオチド混合物を含有する）で置換した。このフィルタ
を、初期温度６５°Ｃから徐々に到達する最終温度４７
°Ｃにて１８時間ハイブリダイゼーションした。
ガーゲノムライプラリーのスクリーニング：Ａ．ニガー
ゲノムライブラリーを上記のようにして構築した。ａｘ
ｅＡ遺伝子を得るために、プレート当たり３ｘ１０３ｐ
ｆｕを、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の上記文
献，１９８２，ｐ．６４に記載の如く、プレーティング
細菌としてＥ．コリＬＥ ３９２を使用して、４つの８
５ｍｍ径のＮＺＹＣＭ（１．２％寒天）プレート上で、
０．７％のアガロースを含むＮＺＹＣＭ トパガロース
（ｔｏｐａｇａｒｏｓｅ）中にプレーティングした。該
プレートの３７℃での一夜のインキュベーション後、各
プレートの２種のレプリカをハイボンド（Ｈｙｂｏｎ
ｄ）Ｎ＋フィルタ（アマーシャム（Ａｍｓｈａｍ）上
に、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の上記文献，
１９８２，ｐｐ．３２０−３２１ に記載の如く作製し
た。３ｘＳＳＣ中で該フィルタを湿潤した後、該フィル
タを室温にて３ｘＳＳＣ 中で６０分間洗浄した。該フ
ィルタを、６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１０ｘデンハ
ーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ）溶液および１００μｇ／
ｍｌの熱変性ヘーリング精液ＤＮＡ（ベーリンガーマン
ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を
含む予備ハイブリダイゼーションバッファー中で２時間
６５℃にて予備ハイブリダイゼーションした。２時間の
予備ハイブリダイゼーション後、該バッファーをハイブ
リダイゼーションバッファー（これは該予備ハイブリダ
イゼーションバッファーと同様であるがこのバッファー
はヘーリング精液ＤＮＡ を含まず、かつ実施例２．１
に記載のように調製した式１の３２ｐ−標識オリゴヌク
レオチド混合物を含有する）で置換した。このフィルタ
を、初期温度６５°Ｃから徐々に到達する最終温度４７
°Ｃにて１８時間ハイブリダイゼーションした。
【００２０】ハイブリダイゼーションの後、該フィルタ
をまず２ｘＳＳＣ で洗浄し、その後該フィルタを予め
４７°Ｃに加温したハイブリダイゼーションバッファー
で洗浄した。最後に、該フィルタを５６°Ｃにて３０分
間２度６ｘＳＳＣ、０．０５％ ピロリン酸ナトリウム
で洗浄した。風乾した該フィルタをファットマン（ｗｈ
ａｔｍａｎ）３ＭＭ紙のシート上にテープで張りつけ、
キーマークを放射性インクで形成し、該ファットマン紙
およびフィルタをサランラップで覆った。ハイブリダイ
ズプラークを、強化スクリーンを使用して−７０°Ｃに
て７２時間コダック（Ｋｏｄａｋ） ＸＡＲ Ｘ−線フ
ィルムの露光により同定した。７個のハイブリダイズプ
ラークが同定され、それぞれをλａｘｅ１〜λａｘｅ７
と命名した。各正のプラークをパスツールピペットを使
用して該プレートから取り出し、マニアティス等（上記
文献，１９８２，ｐｐ．６４）に記載のように２０μｌ
のクロロホルムを含有するＳＭバッファー１ｍｌ中で寒
天プラグからファージを溶出した。得られたファージ
を、単離ファージの５０−１００プラークを含むプレー
トから、フィルタレプリカを使用して上記の手順を繰り
返すことにより精製した。精製した後、該ファージを、
その５ｘ１０３個をＮＺＹＣＭ 培地にプレーティング
することにより増殖させた。３７°Ｃにて一夜インキュ
ベートした後、密集プレートを得、そこから該ファージ
を５ｍｌのＳＭバッファーを添加することにより溶出
し、間欠的に振盪しつつ４°Ｃにて２時間該プレートを
保存した。ピペットを使用して上澄を集めた後、細菌を
４°Ｃにて１０分間４，０００ｘｇにて遠心処理するこ
とにより該溶液から分離した。該上澄に０．３％クロロ
ホルムを添加し、ｐｆｕの数を測定した。これらのファ
ージストックは約１０１０ｐｆｕ／ｍｌを含む。
をまず２ｘＳＳＣ で洗浄し、その後該フィルタを予め
４７°Ｃに加温したハイブリダイゼーションバッファー
で洗浄した。最後に、該フィルタを５６°Ｃにて３０分
間２度６ｘＳＳＣ、０．０５％ ピロリン酸ナトリウム
で洗浄した。風乾した該フィルタをファットマン（ｗｈ
ａｔｍａｎ）３ＭＭ紙のシート上にテープで張りつけ、
キーマークを放射性インクで形成し、該ファットマン紙
およびフィルタをサランラップで覆った。ハイブリダイ
ズプラークを、強化スクリーンを使用して−７０°Ｃに
て７２時間コダック（Ｋｏｄａｋ） ＸＡＲ Ｘ−線フ
ィルムの露光により同定した。７個のハイブリダイズプ
ラークが同定され、それぞれをλａｘｅ１〜λａｘｅ７
と命名した。各正のプラークをパスツールピペットを使
用して該プレートから取り出し、マニアティス等（上記
文献，１９８２，ｐｐ．６４）に記載のように２０μｌ
のクロロホルムを含有するＳＭバッファー１ｍｌ中で寒
天プラグからファージを溶出した。得られたファージ
を、単離ファージの５０−１００プラークを含むプレー
トから、フィルタレプリカを使用して上記の手順を繰り
返すことにより精製した。精製した後、該ファージを、
その５ｘ１０３個をＮＺＹＣＭ 培地にプレーティング
することにより増殖させた。３７°Ｃにて一夜インキュ
ベートした後、密集プレートを得、そこから該ファージ
を５ｍｌのＳＭバッファーを添加することにより溶出
し、間欠的に振盪しつつ４°Ｃにて２時間該プレートを
保存した。ピペットを使用して上澄を集めた後、細菌を
４°Ｃにて１０分間４，０００ｘｇにて遠心処理するこ
とにより該溶液から分離した。該上澄に０．３％クロロ
ホルムを添加し、ｐｆｕの数を測定した。これらのファ
ージストックは約１０１０ｐｆｕ／ｍｌを含む。
【００２１】実施例２．４：バクテリオファージλから
のＤＮＡ の単離：該単離したファージの各々を、２＊
１０６ｐｆｕと、３００μｌのＳＭバッファー中の５＊
１０９ Ｅ．コリＬＥ ３９２細菌とを１５分間結合す
ることにより増殖した。インキューション後、該感染細
菌を予め加温（３７°Ｃ）したＮＺＹＣＭ 培地１００
ｍｌに接種し、次いで２５０ｒｐｍにてニューブランス
ウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）回転シェーカ
ー中で、３７°Ｃにて９〜１２時間インキキュベート
し、その後該細菌を溶解した。この細菌デブリスを、ソ
ルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）高速遠心機内で４°Ｃにて１
０分間１０ｋｒｐｍにて遠心処理して分離した。該ファ
ージを得られた上澄（１００ｍｌ）から１０ｇのポリエ
チレングリコール−６０００および１１．７ｇのＮａＣ
ｌを添加することにより沈澱させ、該溶液を４°Ｃにて
一夜保存した。該沈澱ファージを４°Ｃにて２０分間１
４，０００ｘｇにて遠心処理することにより集めた。上
澄を吸引により除去し、一方残りの液体を紙タオルを使
用して除いた。該ファージを４ｍｌのＳＭバッファーに
注意深く再懸濁し、１回等体積のクロロホルムで抽出し
た。
のＤＮＡ の単離：該単離したファージの各々を、２＊
１０６ｐｆｕと、３００μｌのＳＭバッファー中の５＊
１０９ Ｅ．コリＬＥ ３９２細菌とを１５分間結合す
ることにより増殖した。インキューション後、該感染細
菌を予め加温（３７°Ｃ）したＮＺＹＣＭ 培地１００
ｍｌに接種し、次いで２５０ｒｐｍにてニューブランス
ウィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）回転シェーカ
ー中で、３７°Ｃにて９〜１２時間インキキュベート
し、その後該細菌を溶解した。この細菌デブリスを、ソ
ルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）高速遠心機内で４°Ｃにて１
０分間１０ｋｒｐｍにて遠心処理して分離した。該ファ
ージを得られた上澄（１００ｍｌ）から１０ｇのポリエ
チレングリコール−６０００および１１．７ｇのＮａＣ
ｌを添加することにより沈澱させ、該溶液を４°Ｃにて
一夜保存した。該沈澱ファージを４°Ｃにて２０分間１
４，０００ｘｇにて遠心処理することにより集めた。上
澄を吸引により除去し、一方残りの液体を紙タオルを使
用して除いた。該ファージを４ｍｌのＳＭバッファーに
注意深く再懸濁し、１回等体積のクロロホルムで抽出し
た。
【００２２】該ファージ粒子からＤＮＡ を抽出する前
に、溶解した細菌由来のＤＮＡ およびＲＮＡを、３７
°Ｃにて３０分間、ＤＮアーゼＩおよびＲＮアーゼＡ
（いずれも１００μｇ／ｍｌ）と共に該ファージ懸濁液
をインキュベーションすることにより除去した。次い
で、該ファージＤＮＡ を最終濃度２０ｍＭまでＥＤＴ
Ａを添加することにより該ファージから遊離させ、一方
で該タンパクを、２回等体積のフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し
て該溶液から除去した。ソルバル遠心機を使用（１４，
０００ｘｇ；１０分間）して遠心処理することによって
該相を分離した後、水性相を２回等体積のクロロホルム
／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。これ
ら相を遠心処理により分離し、その後該ＤＮＡ を該水
性相から０．１容の５Ｍ過塩素酸ナトリウムおよび０．
１容のイソプロパノールを添加し、３０分間氷上でイン
キュベーションすることにより沈澱させた。このＤＮＡ
を４°Ｃにて１０分間遠心処理（１４，０００ｘｇ）
して回収した。上澄を吸引により除去し、その後該ＤＮ
Ａ を４００μｌのＴＥバッファー中に再懸濁した。こ
のＤＮＡ をもう一度０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムお
よび２容のエタノールを添加して該溶液から沈澱させ
た。このＤＮＡ を４°Ｃにて１０分間遠心処理（１
４，０００ｘｇ）して回収した。上澄を吸引により除去
し、残りのペレットを真空下で手短に乾燥し、その後該
ＤＮＡ を０．１μｇ／ｍｌのＲＮアーゼを含む１２５
μｌのＴＥバッファー中に再懸濁した。この精製処理に
より各ファージから約５０−１００μｇのＤＮＡ が単
離された。
に、溶解した細菌由来のＤＮＡ およびＲＮＡを、３７
°Ｃにて３０分間、ＤＮアーゼＩおよびＲＮアーゼＡ
（いずれも１００μｇ／ｍｌ）と共に該ファージ懸濁液
をインキュベーションすることにより除去した。次い
で、該ファージＤＮＡ を最終濃度２０ｍＭまでＥＤＴ
Ａを添加することにより該ファージから遊離させ、一方
で該タンパクを、２回等体積のフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し
て該溶液から除去した。ソルバル遠心機を使用（１４，
０００ｘｇ；１０分間）して遠心処理することによって
該相を分離した後、水性相を２回等体積のクロロホルム
／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。これ
ら相を遠心処理により分離し、その後該ＤＮＡ を該水
性相から０．１容の５Ｍ過塩素酸ナトリウムおよび０．
１容のイソプロパノールを添加し、３０分間氷上でイン
キュベーションすることにより沈澱させた。このＤＮＡ
を４°Ｃにて１０分間遠心処理（１４，０００ｘｇ）
して回収した。上澄を吸引により除去し、その後該ＤＮ
Ａ を４００μｌのＴＥバッファー中に再懸濁した。こ
のＤＮＡ をもう一度０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムお
よび２容のエタノールを添加して該溶液から沈澱させ
た。このＤＮＡ を４°Ｃにて１０分間遠心処理（１
４，０００ｘｇ）して回収した。上澄を吸引により除去
し、残りのペレットを真空下で手短に乾燥し、その後該
ＤＮＡ を０．１μｇ／ｍｌのＲＮアーゼを含む１２５
μｌのＴＥバッファー中に再懸濁した。この精製処理に
より各ファージから約５０−１００μｇのＤＮＡ が単
離された。
【００２３】実施例２．５： ａｘｅＡ含有ファージの
制限分析：ファージλａｘｅ１〜λａｘｅ７の単離ＤＮ
Ａ を制限酵素ＥｃｏＲＩ； ＨｉｎｄＩＩＩ； Ｓｐ
ｈＩ；およびＨｉｎＣＩＩを使用して、サザン分析法に
より分析した。このＤＮＡ を、５μｌ（約１μｇ）の
ＤＮＡ 溶液、２μｌの適当な１０Ｘ 反応バッファー
（ＢＲＬ）、１０ Ｕの制限酵素（ＢＲＬ）を含み滅菌
蒸留水で最終体積２０μｌとした反応混合物中で３７°
Ｃにて３時間消化した。消化後、該ＤＮＡ を０．１容
の３ＭＮａＡｃおよび２容のエタノールを添加して沈澱
させた。このＤＮＡ を、室温にて１０分間遠心処理
（１４，０００ｘｇ）して回収した。上澄を吸引により
除去し、残りのペレットを真空下で手短に乾燥し、その
後該ＤＮＡを滅菌蒸留水中に再懸濁した４μｌのＤＮＡ
含有バッファーを添加した後、該試料を６５°Ｃにて
１０分間インキュベーションし、即座に氷で冷やし、次
いで該試料をＴＡＥ バッファー中の０．６％アガロー
スゲル上に担持させた。ＤＮＡ フラグメントを２５Ｖ
にて１５〜１８時間電気泳動することにより分離した。
電気泳動後、該ＤＮＡ を指示マニュアル（ｐｐ．２５
−２６）に記載のようにアルカリ真空ブロッティング
（バクジーヌ（Ｖａｃｕｇｅｎｅ）ＸＬ；ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＬＫＢ）により転移かつ変性
し、次いで実施例２．１に記載の如く式１の標識オリゴ
ヌクレオチド混合物を使用してまた実施例２．２に記載
の如きハイブリダイゼーション条件下で予備ハイブリダ
イズし、かつハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを、強化スクリーンを使用して、−７０°
Ｃにて１８時間コダックＸＡＲ−５Ｘ−線フィルムの露
光により得た。得られた結果から、単離された７種のク
ローンのうち５種のＤＮＡ はＮ−末端アミノ酸配列由
来のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするものと結
論ずけられる。５種のクローンの全てにおいて、同一の
ゲノム領域由来のフラグメントが見出された。酵素Ｂｇ
ｌｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｓｔＩお
よびＸｂａＩを使用したより広範なサザン分析では、こ
のゲノム領域の部分制限マップが作製された。この実験
から、３．４ｋｂのＳｓｔＩフラグメントがＡ．ニガー
ａｘｅＡ遺伝子を含むことを結論ずけている。
制限分析：ファージλａｘｅ１〜λａｘｅ７の単離ＤＮ
Ａ を制限酵素ＥｃｏＲＩ； ＨｉｎｄＩＩＩ； Ｓｐ
ｈＩ；およびＨｉｎＣＩＩを使用して、サザン分析法に
より分析した。このＤＮＡ を、５μｌ（約１μｇ）の
ＤＮＡ 溶液、２μｌの適当な１０Ｘ 反応バッファー
（ＢＲＬ）、１０ Ｕの制限酵素（ＢＲＬ）を含み滅菌
蒸留水で最終体積２０μｌとした反応混合物中で３７°
Ｃにて３時間消化した。消化後、該ＤＮＡ を０．１容
の３ＭＮａＡｃおよび２容のエタノールを添加して沈澱
させた。このＤＮＡ を、室温にて１０分間遠心処理
（１４，０００ｘｇ）して回収した。上澄を吸引により
除去し、残りのペレットを真空下で手短に乾燥し、その
後該ＤＮＡを滅菌蒸留水中に再懸濁した４μｌのＤＮＡ
含有バッファーを添加した後、該試料を６５°Ｃにて
１０分間インキュベーションし、即座に氷で冷やし、次
いで該試料をＴＡＥ バッファー中の０．６％アガロー
スゲル上に担持させた。ＤＮＡ フラグメントを２５Ｖ
にて１５〜１８時間電気泳動することにより分離した。
電気泳動後、該ＤＮＡ を指示マニュアル（ｐｐ．２５
−２６）に記載のようにアルカリ真空ブロッティング
（バクジーヌ（Ｖａｃｕｇｅｎｅ）ＸＬ；ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＬＫＢ）により転移かつ変性
し、次いで実施例２．１に記載の如く式１の標識オリゴ
ヌクレオチド混合物を使用してまた実施例２．２に記載
の如きハイブリダイゼーション条件下で予備ハイブリダ
イズし、かつハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを、強化スクリーンを使用して、−７０°
Ｃにて１８時間コダックＸＡＲ−５Ｘ−線フィルムの露
光により得た。得られた結果から、単離された７種のク
ローンのうち５種のＤＮＡ はＮ−末端アミノ酸配列由
来のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするものと結
論ずけられる。５種のクローンの全てにおいて、同一の
ゲノム領域由来のフラグメントが見出された。酵素Ｂｇ
ｌｌＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｓｔＩお
よびＸｂａＩを使用したより広範なサザン分析では、こ
のゲノム領域の部分制限マップが作製された。この実験
から、３．４ｋｂのＳｓｔＩフラグメントがＡ．ニガー
ａｘｅＡ遺伝子を含むことを結論ずけている。
【００２４】実施例２．６： Ａ．ニガーａｘｅＡ遺伝
子のサブクローニング：ファージλａｘｅから、該３．
４ｋｂのＳｓｔＩフラグメントが該ファージＤＮＡ を
ＳｓｔＩで消化し、該フラグメントを上記実施例２．４
における如く分離することにより得られた。このフラグ
メントを該アガロースゲルから切り出し、その後ＩＳＣ
Ｏカップを使用した電気溶出により該アガロース切片か
ら回収した。このカップの大きなおよび小さな容器両者
に透析膜を取りつけ、該カップを０．００５ｘＴＡＥ
で満たし、該アガロース切片を該カップの大きな容器に
入れた。次いで、該カップを電気溶出装置に入れた。こ
こで大きな容器はＴＡＥ を含むカソード室に入れ、一
方小さな容器はＴＡＥ／３Ｍ ＮＡＣｌ を含むアノー
ド室に入れた。このフラグメントを１００Ｖで２時間電
気溶出した。この期間の経過後、該カップを該電気溶出
装置から取り出し、バッファーを大きな容器から取り出
し一方小さな容器からは上部のバッファーのみを除去し
た。該ＤＮＡ フラグメントを含む残りのバッフャー
（２００μｌ）は３０分間に渡り蒸溜水に対して該カッ
プ中で透析した。最後に該ＤＮＡを０．１容の３ＭＮａ
Ａｃ（ｐＨ５．６）および２容の冷エタノール（−２０
゜Ｃ）の添加により沈澱させた。このＤＮＡを、４゜Ｃ
にて、３分間１４，０００ｘｇで遠心処理（エッペンド
ルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機）して回収した。上
澄の除去後、該ＤＮＡペレットをサバントスピードバッ
ク（Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄｖａｃ）真空遠心機を使
用して乾燥した。このＤＮＡを１μｌのＴＥバッハァー
に溶解し、基準として既知濃度のλＤＮＡ を使用しま
たＤＮＡ を検出するためにエチジウムブロミド染色を
利用した、アガロース電気泳動によりその濃度を測定し
た。
子のサブクローニング：ファージλａｘｅから、該３．
４ｋｂのＳｓｔＩフラグメントが該ファージＤＮＡ を
ＳｓｔＩで消化し、該フラグメントを上記実施例２．４
における如く分離することにより得られた。このフラグ
メントを該アガロースゲルから切り出し、その後ＩＳＣ
Ｏカップを使用した電気溶出により該アガロース切片か
ら回収した。このカップの大きなおよび小さな容器両者
に透析膜を取りつけ、該カップを０．００５ｘＴＡＥ
で満たし、該アガロース切片を該カップの大きな容器に
入れた。次いで、該カップを電気溶出装置に入れた。こ
こで大きな容器はＴＡＥ を含むカソード室に入れ、一
方小さな容器はＴＡＥ／３Ｍ ＮＡＣｌ を含むアノー
ド室に入れた。このフラグメントを１００Ｖで２時間電
気溶出した。この期間の経過後、該カップを該電気溶出
装置から取り出し、バッファーを大きな容器から取り出
し一方小さな容器からは上部のバッファーのみを除去し
た。該ＤＮＡ フラグメントを含む残りのバッフャー
（２００μｌ）は３０分間に渡り蒸溜水に対して該カッ
プ中で透析した。最後に該ＤＮＡを０．１容の３ＭＮａ
Ａｃ（ｐＨ５．６）および２容の冷エタノール（−２０
゜Ｃ）の添加により沈澱させた。このＤＮＡを、４゜Ｃ
にて、３分間１４，０００ｘｇで遠心処理（エッペンド
ルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機）して回収した。上
澄の除去後、該ＤＮＡペレットをサバントスピードバッ
ク（Ｓａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄｖａｃ）真空遠心機を使
用して乾燥した。このＤＮＡを１μｌのＴＥバッハァー
に溶解し、基準として既知濃度のλＤＮＡ を使用しま
たＤＮＡ を検出するためにエチジウムブロミド染色を
利用した、アガロース電気泳動によりその濃度を測定し
た。
【００２５】得られたフラグメントをＳｓｔＩで消化し
たベクターｐＥＭＢＬ１８に連結し、以下のように調製
したアルカリホスファターゼにより脱ホスホリル化し
た。即ち、該アルカリホスファターゼは、１μｌ（１μ
ｇ／μｌ）のｐＥＭＢＬ１８を２μｌの１０ｘリアクト
（Ｒｅａｃｔ）１０（ＢＲＬ）、１μｌ（１μ／μｌ）
のＳｓｔＩおよび１６μｌの滅菌蒸留水と混合した。こ
のＤＮＡを３７゜Ｃにて１時間消化し、次いで０．５μ
ｌのアルカリホスファターゼ（１Ｕ／μｌ）（ファルマ
シアＬＫＢ）を添加し、更に３０分間３７゜Ｃにてイン
キュベーションした。線状化したこのベクターを上記の
ように０．６％アガロースゲルから単離した。該２．４
ｋｂＳｓｔＩフラグメントをプラスミドｐＩＭ１５０か
ら得たベクターに、以下のように連結した。即ち、１０
０ｎｇのｐＥＭＢＬ１８フラグメントを１００ｍｇの
３．４ｋｂＳｓｔＩフラグメントおよび４μｌ５＊連結
バッファー（組成：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．６；１００ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのＡＴＰ；
１０ｍＭのジチオスレイトール；２５％ＰＥＧ−６００
０）と共に混合し、かつ１μ（１．２Ｕ／μｌ）のＤＮ
Ａリガーゼ（ＢＲＬ）を最終体積が２０μｌとなるよう
に該混合物に添加した。１４゜Ｃにて１６時間インキュ
ベーションした後、該混合物を滅菌水で１００μｌまで
希釈した。該希釈混合物１０μｌを受容能のあるＥ．コ
リＪＭ１０１細胞を形質転換するのに使用した。該細胞
はＭ１３クローニング／配列決定装置用のファルマシア
のマニュアルに記載のようにＣＭ１、ＣＭ２法により調
製した。選択したコロニー６種を１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含有するＬＢ培地中で一夜育成した。
たベクターｐＥＭＢＬ１８に連結し、以下のように調製
したアルカリホスファターゼにより脱ホスホリル化し
た。即ち、該アルカリホスファターゼは、１μｌ（１μ
ｇ／μｌ）のｐＥＭＢＬ１８を２μｌの１０ｘリアクト
（Ｒｅａｃｔ）１０（ＢＲＬ）、１μｌ（１μ／μｌ）
のＳｓｔＩおよび１６μｌの滅菌蒸留水と混合した。こ
のＤＮＡを３７゜Ｃにて１時間消化し、次いで０．５μ
ｌのアルカリホスファターゼ（１Ｕ／μｌ）（ファルマ
シアＬＫＢ）を添加し、更に３０分間３７゜Ｃにてイン
キュベーションした。線状化したこのベクターを上記の
ように０．６％アガロースゲルから単離した。該２．４
ｋｂＳｓｔＩフラグメントをプラスミドｐＩＭ１５０か
ら得たベクターに、以下のように連結した。即ち、１０
０ｎｇのｐＥＭＢＬ１８フラグメントを１００ｍｇの
３．４ｋｂＳｓｔＩフラグメントおよび４μｌ５＊連結
バッファー（組成：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．６；１００ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのＡＴＰ；
１０ｍＭのジチオスレイトール；２５％ＰＥＧ−６００
０）と共に混合し、かつ１μ（１．２Ｕ／μｌ）のＤＮ
Ａリガーゼ（ＢＲＬ）を最終体積が２０μｌとなるよう
に該混合物に添加した。１４゜Ｃにて１６時間インキュ
ベーションした後、該混合物を滅菌水で１００μｌまで
希釈した。該希釈混合物１０μｌを受容能のあるＥ．コ
リＪＭ１０１細胞を形質転換するのに使用した。該細胞
はＭ１３クローニング／配列決定装置用のファルマシア
のマニュアルに記載のようにＣＭ１、ＣＭ２法により調
製した。選択したコロニー６種を１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含有するＬＢ培地中で一夜育成した。
【００２６】この培養物から、プラスミドＤＮＡを、マ
ニアティス等（１９８２，ｐｐ．３６８−３６９）によ
り記載されたアルカリ溶解法を使用して単離した。これ
を実施例２．４に記載のような制限分析で使用して、所
定のプラスミドを含むクローンを選別した。プラスミド
ＤＮＡ は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ培地中で育成したプラスミドｐＩＭ１５０を含有す
る５００ｍｌのＥ．コリＪＭ１０１培養物から大規模で
単離した（マニアティス等，１９８２，ｐ．８６）。こ
のプラスミドをＣｓＣｌ遠心処理し、フェノール変性
し、エタノール沈澱し、かつ４００μｌ ＴＥに溶解す
ることにより精製した。収率は約５００μｇであった。
このプラスミドｐＩＭ１５０を、更に図１に示した制限
マップに見られる制限酵素により分析した。このプラス
ミド（Ｅ．コリＤＨ５α中）をオランダ国、バーンのＣ
ＢＳに、１９９１年３月１１日付けでＣＢＳ１５７．９
１なる寄託番号の下で寄託した。
ニアティス等（１９８２，ｐｐ．３６８−３６９）によ
り記載されたアルカリ溶解法を使用して単離した。これ
を実施例２．４に記載のような制限分析で使用して、所
定のプラスミドを含むクローンを選別した。プラスミド
ＤＮＡ は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
ＬＢ培地中で育成したプラスミドｐＩＭ１５０を含有す
る５００ｍｌのＥ．コリＪＭ１０１培養物から大規模で
単離した（マニアティス等，１９８２，ｐ．８６）。こ
のプラスミドをＣｓＣｌ遠心処理し、フェノール変性
し、エタノール沈澱し、かつ４００μｌ ＴＥに溶解す
ることにより精製した。収率は約５００μｇであった。
このプラスミドｐＩＭ１５０を、更に図１に示した制限
マップに見られる制限酵素により分析した。このプラス
ミド（Ｅ．コリＤＨ５α中）をオランダ国、バーンのＣ
ＢＳに、１９９１年３月１１日付けでＣＢＳ１５７．９
１なる寄託番号の下で寄託した。
【００２７】実施例３：Ａ．ニガーａｘｅＡ遺伝子の配
列決定Ａ．ニガーａｘｅＡ 遺伝子の配列（そのプロモーター調
節配列、該遺伝子の構造部分および終止領域）を、配列
決定反応におけるプライマーとして特定のオリゴヌクレ
オチドを使用して、Ｍ１３ｍｐ１８／ｍｐ１９中のｐＩ
Ｍ１５０からのフラグメントのサブクローニングにより
決定した。ヌクレオチド配列分析のために、制限フラグ
メントを実施例２．５に記載の如く単離し、バクテリオ
ファージＭ１３ｍｐ１８／１９ＲＦＤＮＡ ベクター
（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ），上記文献，１９８
３；およびノランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）等、上記
文献，１９８３）にクローニングし、実施例２．５に記
載の如く適当な制限酵素で消化した。ヌクレオチド配列
は、ファルマシアＴ７ＤＮＡ ポリメラーゼ配列決定キ
ットを使用して、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法（サ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４，ｐｐ．５４６
３−５４６７こより決定した。コンピュータ解析をＰＣ
／ＧＥＮＥ プログラムを使用して実施した。決定され
た配列を（配列リストに）ＳＥＱ ＩＤＮＯ：７として
与えた。イントロンの位置は５’および３’スプライス
サイトに対する共通配列に基づいて誘導した。
列決定Ａ．ニガーａｘｅＡ 遺伝子の配列（そのプロモーター調
節配列、該遺伝子の構造部分および終止領域）を、配列
決定反応におけるプライマーとして特定のオリゴヌクレ
オチドを使用して、Ｍ１３ｍｐ１８／ｍｐ１９中のｐＩ
Ｍ１５０からのフラグメントのサブクローニングにより
決定した。ヌクレオチド配列分析のために、制限フラグ
メントを実施例２．５に記載の如く単離し、バクテリオ
ファージＭ１３ｍｐ１８／１９ＲＦＤＮＡ ベクター
（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ），上記文献，１９８
３；およびノランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）等、上記
文献，１９８３）にクローニングし、実施例２．５に記
載の如く適当な制限酵素で消化した。ヌクレオチド配列
は、ファルマシアＴ７ＤＮＡ ポリメラーゼ配列決定キ
ットを使用して、ジデオキシヌクレオチド鎖終止法（サ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４，ｐｐ．５４６
３−５４６７こより決定した。コンピュータ解析をＰＣ
／ＧＥＮＥ プログラムを使用して実施した。決定され
た配列を（配列リストに）ＳＥＱ ＩＤＮＯ：７として
与えた。イントロンの位置は５’および３’スプライス
サイトに対する共通配列に基づいて誘導した。
【００２８】実施例４：Ａ．ニガーＮ５９３におけるク
ローン化ａｘｅＡ遺伝子の発現 実施例４．１：Ａ．ニガーＮ５９３へのａｘｅＡ遺伝子
の同時形質転換による導入 実施例２．５で得たプラスミドｐＩＭ１５０を、プラス
ミドｐＧＷ６３５（グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９８９，２１９，ｐｐ．２
８２−２８８）上の選択マーカーとしてＡ．ニガーｐｙ
ｒＡを、および同時形質転換プラスミドとしてプラスミ
ドｐＩＭ１５０を使用して、Ａ．ニガーＮ５９３（Ａ．
ニガーＮ４０２のｐｙｒ変異体）の同時形質転換により
Ａ．ニガー中に導入した。０．５％酵母抽出液、０．２
％カサミノ酸、５０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのウ
リジンを補充した最小培地上でＡ．ニガーＮ５９３を３
０゜Ｃにて２０時間育成することにより、原形質体を菌
糸体から調製した。Ａ．ニガーＮ５９３の原形質体の調
製および形質転換手順はグーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等の
上記の文献（１９８７）に記載のように実施した。得ら
れたＰＹＲ＋形質転換体をウエスタンブロット分析によ
り該ａｘｅＡ遺伝子の発現について分析した。
ローン化ａｘｅＡ遺伝子の発現 実施例４．１：Ａ．ニガーＮ５９３へのａｘｅＡ遺伝子
の同時形質転換による導入 実施例２．５で得たプラスミドｐＩＭ１５０を、プラス
ミドｐＧＷ６３５（グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９８９，２１９，ｐｐ．２
８２−２８８）上の選択マーカーとしてＡ．ニガーｐｙ
ｒＡを、および同時形質転換プラスミドとしてプラスミ
ドｐＩＭ１５０を使用して、Ａ．ニガーＮ５９３（Ａ．
ニガーＮ４０２のｐｙｒ変異体）の同時形質転換により
Ａ．ニガー中に導入した。０．５％酵母抽出液、０．２
％カサミノ酸、５０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのウ
リジンを補充した最小培地上でＡ．ニガーＮ５９３を３
０゜Ｃにて２０時間育成することにより、原形質体を菌
糸体から調製した。Ａ．ニガーＮ５９３の原形質体の調
製および形質転換手順はグーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等の
上記の文献（１９８７）に記載のように実施した。得ら
れたＰＹＲ＋形質転換体をウエスタンブロット分析によ
り該ａｘｅＡ遺伝子の発現について分析した。
【００２９】実施例４．２：ａｘｅＡ遺伝子の発現に関
する形質転換体のスクリーニング 実施例４．１で得た形質転換体をａｘｅＡ遺伝子生成
物、ＡＸＥＩタンパクの形成につき解析した。２０種の
形質転換体を選択し、１ｌ当たり３０ｇのカンバ材キシ
ラン（ロス（Ｒｏｔｈ））、６ｇのＮａＮＯ３、０．５
ｇのＫＣｌ、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５
ｇのＣａＣｌ２、１．５ｇのＫＨ２ＰＯ４および０．１
ｇの酵母抽出液並びに１ｍｌ／１のビスニャック溶液
（ｐＨ６．０）を含む培地上で７２時間培養した。育成
した後、該菌糸体を濾過により分離し、該培養物濾液
を、１２％のアクリルアミドを含有するゲルを使用した
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し
た。ＡＸＥＩタンパクを、エレクトロブロッティング
し、実施例１．１に記載のように精製した該ＡＸＥＩタ
ンパクに対して生成したポリクローナル抗体と共にイン
キュベートした後、ニトロセルロース上で検出した。該
結合した抗体は、バイオラド指示マニュアルに従ってア
ルカリホスファターゼと複合化した山羊−抗−兎抗体と
共にインキュベートした後検出した。この方法により検
出したところ、分析した２０種の形質転換体のうちの４
種が該ＡＸＥＩタンパクを過重生産した。このタンパク
は培地中に分泌された。分析された形質転換体の１種
（形質転換体ＴｒＡ１０）が該ＡＸＥＩタンパクを最大
収率で与えるものとして選別された。
する形質転換体のスクリーニング 実施例４．１で得た形質転換体をａｘｅＡ遺伝子生成
物、ＡＸＥＩタンパクの形成につき解析した。２０種の
形質転換体を選択し、１ｌ当たり３０ｇのカンバ材キシ
ラン（ロス（Ｒｏｔｈ））、６ｇのＮａＮＯ３、０．５
ｇのＫＣｌ、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５
ｇのＣａＣｌ２、１．５ｇのＫＨ２ＰＯ４および０．１
ｇの酵母抽出液並びに１ｍｌ／１のビスニャック溶液
（ｐＨ６．０）を含む培地上で７２時間培養した。育成
した後、該菌糸体を濾過により分離し、該培養物濾液
を、１２％のアクリルアミドを含有するゲルを使用した
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し
た。ＡＸＥＩタンパクを、エレクトロブロッティング
し、実施例１．１に記載のように精製した該ＡＸＥＩタ
ンパクに対して生成したポリクローナル抗体と共にイン
キュベートした後、ニトロセルロース上で検出した。該
結合した抗体は、バイオラド指示マニュアルに従ってア
ルカリホスファターゼと複合化した山羊−抗−兎抗体と
共にインキュベートした後検出した。この方法により検
出したところ、分析した２０種の形質転換体のうちの４
種が該ＡＸＥＩタンパクを過重生産した。このタンパク
は培地中に分泌された。分析された形質転換体の１種
（形質転換体ＴｒＡ１０）が該ＡＸＥＩタンパクを最大
収率で与えるものとして選別された。
【００３０】実施例５：アセチルキシランエステラーゼ
とそれぞれエンド−（１，４）−β−キシラナーゼおよ
びβ−（１，４）−キシロシダーゼとの併用作用 ０．２％（ｗ／ｖ）の蒸気処理したカンバ材キシラン溶
液をアセチルエステラーゼおよびアセチルエステラーゼ
とエンド−（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−
（１，４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩＩ、またはβ−（１，４）
−キシロシダーゼの組み合わせを所定の時間インキュベ
ートした。時間曲線（図２にエンド−（１，４）−β−
キシラナーゼにつき図示したように）は、アセチル基の
殆どが遊離した後にのみ、エンド−（１，４）−β−キ
シラナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩは有意な量のキシロー
スおよびキシロースオリゴマー（Ｘ２，Ｘ３およびＸ
４）を遊離し始めることを示している。該アセチルエス
テラーゼは、キシラン分解性酵素と組み合わせて使用し
た場合よりも多くの酢酸を遊離しない。蒸気処理された
カンバ材キシランからのβ−（１，４）キキシロシダー
ゼによるキシロースの遊離はゆっくりであるが定常的で
ある。アセチルキシランエステラーゼの不在下では、エ
ンド−（１，４）−β−キシラナーゼおよびβ−（１，
４）−キシロシダーゼは蒸気処理されたカンバ材キシラ
ンを分解しない。即ち、これらは有意な量のＸ１、Ｘ
２、Ｘ３およびＸ４を遊離しない。アセチル基は、従っ
てエンド−（１，４）−β−キシラナーゼまたはβ−
（１，４）−キシロシダーゼの酵素活性を遮蔽する可能
性がある。
とそれぞれエンド−（１，４）−β−キシラナーゼおよ
びβ−（１，４）−キシロシダーゼとの併用作用 ０．２％（ｗ／ｖ）の蒸気処理したカンバ材キシラン溶
液をアセチルエステラーゼおよびアセチルエステラーゼ
とエンド−（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−
（１，４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩＩ、またはβ−（１，４）
−キシロシダーゼの組み合わせを所定の時間インキュベ
ートした。時間曲線（図２にエンド−（１，４）−β−
キシラナーゼにつき図示したように）は、アセチル基の
殆どが遊離した後にのみ、エンド−（１，４）−β−キ
シラナーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩは有意な量のキシロー
スおよびキシロースオリゴマー（Ｘ２，Ｘ３およびＸ
４）を遊離し始めることを示している。該アセチルエス
テラーゼは、キシラン分解性酵素と組み合わせて使用し
た場合よりも多くの酢酸を遊離しない。蒸気処理された
カンバ材キシランからのβ−（１，４）キキシロシダー
ゼによるキシロースの遊離はゆっくりであるが定常的で
ある。アセチルキシランエステラーゼの不在下では、エ
ンド−（１，４）−β−キシラナーゼおよびβ−（１，
４）−キシロシダーゼは蒸気処理されたカンバ材キシラ
ンを分解しない。即ち、これらは有意な量のＸ１、Ｘ
２、Ｘ３およびＸ４を遊離しない。アセチル基は、従っ
てエンド−（１，４）−β−キシラナーゼまたはβ−
（１，４）−キシロシダーゼの酵素活性を遮蔽する可能
性がある。
【００３１】蒸気処理したカンバ材キシランの分解を強
調するために、それぞれ単独のアセチルエステラーゼ、
エンド−（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−
（１，４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩＩまたはβ−（１，４）−
キシロシダーゼと共に、およびアセチルエステラーゼと
これらのキシラン分解酵素との組み合わせと共に蒸気処
理したカンバ材キシランを２４時間インキュベートする
ことにより比較実験を行った。また、アセチルエステラ
ーゼとの１時間に及ぶ予備インキュベーション、次いで
該キシラン分解酵素との１および２４時間に渡るインキ
ュベーションを行った。表１は２４時間のインキュベー
ション後の酢酸、キシロースおよびキシロースオリゴマ
ーの遊離の結果を示す。該アセチルキシランエステラー
ゼはそれぞれ１および２４時間後にアセチル基２．６０
−２．８０および４．３０μｍｏｌ／ｍｌを遊離する
（４．３０μｍｏｌ／ｍｌは全アセチル基の８０−９０
％の遊離に等しい）。アセチルエステラーゼとキシラン
分解酵素との組み合わせの使用により、酢酸の遊離に対
する初期速度の増加はない。
調するために、それぞれ単独のアセチルエステラーゼ、
エンド−（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−
（１，４）−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，
４）−β−キシラナーゼＩＩＩまたはβ−（１，４）−
キシロシダーゼと共に、およびアセチルエステラーゼと
これらのキシラン分解酵素との組み合わせと共に蒸気処
理したカンバ材キシランを２４時間インキュベートする
ことにより比較実験を行った。また、アセチルエステラ
ーゼとの１時間に及ぶ予備インキュベーション、次いで
該キシラン分解酵素との１および２４時間に渡るインキ
ュベーションを行った。表１は２４時間のインキュベー
ション後の酢酸、キシロースおよびキシロースオリゴマ
ーの遊離の結果を示す。該アセチルキシランエステラー
ゼはそれぞれ１および２４時間後にアセチル基２．６０
−２．８０および４．３０μｍｏｌ／ｍｌを遊離する
（４．３０μｍｏｌ／ｍｌは全アセチル基の８０−９０
％の遊離に等しい）。アセチルエステラーゼとキシラン
分解酵素との組み合わせの使用により、酢酸の遊離に対
する初期速度の増加はない。
【００３２】アセチルキシランエステラーゼが存在しな
い場合、Ａ．アワモリからのエンド−（１，４）−β−
キシラナーゼ類とβ−（１，４）−キシロシダーゼとは
蒸気処理したカンバ材キシランからのキシロースオリゴ
マー（即ち、それぞれβ−（１，４）−キシロシダーゼ
およびエンド−（１，４）−β−キシラナーゼＩにより
Ｘ１またはＸ１、Ｘ２およびＸ３）の遊離は殆どないか
または僅かに痕跡程度であった。アセチルキシランエス
テラーゼと組み合わせた場合、これらのキシラン分解酵
素は２４時間のインキュベーション後に妥当な量のキシ
ロースオリゴマーを遊離した。しかし、アセチルエステ
ラーゼによる僅かに１時間の蒸気処理したカンバ材キシ
ランの予備処理によっては、キシロースオリゴマーの量
は幾分減少する。かくして、アセチルエステラーゼとキ
シラン分解酵素との組み合わせは最大量のＸ１、Ｘ２、
Ｘ３およびＸ４を遊離する。この食い違いは蒸気処理し
たカンバ材キシランの脱アセチル化により該キシロース
オリゴマーが線状化されることで説明できる。該キシラ
ン分解酵素によりより小さなオリゴマーに分解されない
場合、より高級なキシロースオリゴマーはこの線状化の
結果として凝集し、かつ沈澱を生ずる可能性がある。こ
の沈澱は分解を受け難い（プタネン（Ｐｏｕｔａｎｅ
ｎ）等，１９８９および１９９０）。ここに示された結
果から、該アセチルエステラーゼによるアセチル基の初
期遊離により、新たなサイトがエンド−（１，４）−β
−キシラナーゼの結合に適した該多糖の主鎖上に生成さ
れることが明らかである。精製されたＡ．アワモリから
のキシラン分解酵素がそれ程蒸気処理されたカンバ材キ
シランを分解しなかったという事実は、Ａ．アワモリの
粗調製物がそれ程蒸気処理されたカンバ材キシランを分
解しなかったというプタネン（Ｐｏｕｔａｎｅｎ）等
（上記文献）による発見と一致する。
い場合、Ａ．アワモリからのエンド−（１，４）−β−
キシラナーゼ類とβ−（１，４）−キシロシダーゼとは
蒸気処理したカンバ材キシランからのキシロースオリゴ
マー（即ち、それぞれβ−（１，４）−キシロシダーゼ
およびエンド−（１，４）−β−キシラナーゼＩにより
Ｘ１またはＸ１、Ｘ２およびＸ３）の遊離は殆どないか
または僅かに痕跡程度であった。アセチルキシランエス
テラーゼと組み合わせた場合、これらのキシラン分解酵
素は２４時間のインキュベーション後に妥当な量のキシ
ロースオリゴマーを遊離した。しかし、アセチルエステ
ラーゼによる僅かに１時間の蒸気処理したカンバ材キシ
ランの予備処理によっては、キシロースオリゴマーの量
は幾分減少する。かくして、アセチルエステラーゼとキ
シラン分解酵素との組み合わせは最大量のＸ１、Ｘ２、
Ｘ３およびＸ４を遊離する。この食い違いは蒸気処理し
たカンバ材キシランの脱アセチル化により該キシロース
オリゴマーが線状化されることで説明できる。該キシラ
ン分解酵素によりより小さなオリゴマーに分解されない
場合、より高級なキシロースオリゴマーはこの線状化の
結果として凝集し、かつ沈澱を生ずる可能性がある。こ
の沈澱は分解を受け難い（プタネン（Ｐｏｕｔａｎｅ
ｎ）等，１９８９および１９９０）。ここに示された結
果から、該アセチルエステラーゼによるアセチル基の初
期遊離により、新たなサイトがエンド−（１，４）−β
−キシラナーゼの結合に適した該多糖の主鎖上に生成さ
れることが明らかである。精製されたＡ．アワモリから
のキシラン分解酵素がそれ程蒸気処理されたカンバ材キ
シランを分解しなかったという事実は、Ａ．アワモリの
粗調製物がそれ程蒸気処理されたカンバ材キシランを分
解しなかったというプタネン（Ｐｏｕｔａｎｅｎ）等
（上記文献）による発見と一致する。
【００３３】
【表１】単独および組み合わせた１．０μｇ／ｍｌのア
セチルエステラーゼおよび０．１μｇ／ｍｌのエンド−
（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−（１，４）
−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，４）−β−キ
シラナーゼＩＩＩまたはβ−（１，４）−キシロシダー
ゼの作用による０．２％（ｗ／ｖ）蒸気処理したカンバ
材キシラン溶液からの酢酸、キシロースおよびキシロー
スオリゴマーの遊離
セチルエステラーゼおよび０．１μｇ／ｍｌのエンド−
（１，４）−β−キシラナーゼＩ、エンド−（１，４）
−β−キシラナーゼＩＩ、エンド−（１，４）−β−キ
シラナーゼＩＩＩまたはβ−（１，４）−キシロシダー
ゼの作用による０．２％（ｗ／ｖ）蒸気処理したカンバ
材キシラン溶液からの酢酸、キシロースおよびキシロー
スオリゴマーの遊離
【００３４】実施例６：家禽の消化管を模した条件下で
のアセチルキシランエステラーゼ活性の試験管内テスト １．１ｇの試料または試料成分（アセチルキシランエス
テラーゼの存在下または不在下で）を３９゜Ｃにて、ｐ
Ｈ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中で１時
間インキュベートして、鶏のそのうを模倣した。ＨＣｌ
によりｐＨを３．０に低下し、かつ５ｍｌのペフシン溶
液（メルク（Ｍｅｒｃｋ）；５．２８ｇ／ｌ）を添加し
た後、該混合物を胃における如く３９゜Ｃにて１．５時
間インキュベートした。鳥類の小腸はリン酸ナトリウム
（２．５ｍｌ１Ｍ）および２．５ｍｌのパンクレアチン
／胆汁酸を添加してｐＨを６．５まで上昇させることに
より模倣した。３９゜Ｃにて更に１．５時間インキュベ
ートした後該混合物を遠心処理した。得られたペレット
を乾燥し、その重量を測定した。処理および未処理物質
のペレットの重量における差異を標準的な条件下で、酵
素活性のために測定した。試料成分の例として小麦糠お
よび玉濁黍粉末を、上記の記載に従ってアセチルキシラ
ンエステラーゼと共にインキュベートした。乾燥品の消
化能は数％改良された。このことは、アセチルキシラン
エステラーゼが木材由来のヘミセルロース材料以外の分
解においても利用できることを示している。 配列リスト ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１ 配列の型：アミノ酸 配列の長さ：２１アミノ酸 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＮ−末
端アミノ酸 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：２ 配列の型：アミノ酸 配列の長さ：２０アミノ酸 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＣＮＢ
ｒペプチド（ＣＮＢｒペプチド１）のＮ−末端アミノ酸 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：３ 配列の型：アミノ酸 配列の長さ：２０アミノ酸 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＣＮＢ
ｒペプチド（ＣＮＢｒペプチド２）のＮ−末端アミノ酸 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２９ヌクレオチド 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼＮ−末端アミ
ノ酸由来のオリゴヌクレオチド混合物 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｅｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２０ヌクレオチド 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼＮ−末端アミ
ノ酸由来のオリゴヌクレオチド混合物 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：６ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２０ヌクレオチド 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＣＮＢ
ｒペプチド１のＮ−末端アミノ酸由来のオリゴヌクレオ
チド混合物 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：７ 配列の型：対応するタンパクを有するヌクレオチド 配列の長さ：１９４３塩基対 形体：線状 分子の型：ゲノムＤＮＡ 起原となる微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）直接的実験上の起原 セルラインの名称：Ｅ．コリＪＭ１０１：：ｐＧＷ１５
０ 特徴： ６０６〜６１２ＴＡＴＡシグナル ５３４〜５３８ ＣＣＡＡＴ ボックス ７１３〜１７５６コード配列 ９１８〜９７０イントロン１ １２２８〜１３０５イントロン２ ７１３〜８００ プレプロペプチド ８０１〜１７５６成熟ペプチド 性質：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）アセチルキシランエステラーゼ（ａｘｅ
Ａ）遺伝子
のアセチルキシランエステラーゼ活性の試験管内テスト １．１ｇの試料または試料成分（アセチルキシランエス
テラーゼの存在下または不在下で）を３９゜Ｃにて、ｐ
Ｈ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中で１時
間インキュベートして、鶏のそのうを模倣した。ＨＣｌ
によりｐＨを３．０に低下し、かつ５ｍｌのペフシン溶
液（メルク（Ｍｅｒｃｋ）；５．２８ｇ／ｌ）を添加し
た後、該混合物を胃における如く３９゜Ｃにて１．５時
間インキュベートした。鳥類の小腸はリン酸ナトリウム
（２．５ｍｌ１Ｍ）および２．５ｍｌのパンクレアチン
／胆汁酸を添加してｐＨを６．５まで上昇させることに
より模倣した。３９゜Ｃにて更に１．５時間インキュベ
ートした後該混合物を遠心処理した。得られたペレット
を乾燥し、その重量を測定した。処理および未処理物質
のペレットの重量における差異を標準的な条件下で、酵
素活性のために測定した。試料成分の例として小麦糠お
よび玉濁黍粉末を、上記の記載に従ってアセチルキシラ
ンエステラーゼと共にインキュベートした。乾燥品の消
化能は数％改良された。このことは、アセチルキシラン
エステラーゼが木材由来のヘミセルロース材料以外の分
解においても利用できることを示している。 配列リスト ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１ 配列の型：アミノ酸 配列の長さ：２１アミノ酸 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＮ−末
端アミノ酸 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：２ 配列の型：アミノ酸 配列の長さ：２０アミノ酸 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＣＮＢ
ｒペプチド（ＣＮＢｒペプチド１）のＮ−末端アミノ酸 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：３ 配列の型：アミノ酸 配列の長さ：２０アミノ酸 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＣＮＢ
ｒペプチド（ＣＮＢｒペプチド２）のＮ−末端アミノ酸 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：４ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２９ヌクレオチド 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼＮ−末端アミ
ノ酸由来のオリゴヌクレオチド混合物 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｅｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：５ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２０ヌクレオチド 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼＮ−末端アミ
ノ酸由来のオリゴヌクレオチド混合物 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：６ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２０ヌクレオチド 形体：線状 分子の型：アセチルキシランエステラーゼからのＣＮＢ
ｒペプチド１のＮ−末端アミノ酸由来のオリゴヌクレオ
チド混合物 微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ） ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：７ 配列の型：対応するタンパクを有するヌクレオチド 配列の長さ：１９４３塩基対 形体：線状 分子の型：ゲノムＤＮＡ 起原となる微生物：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）直接的実験上の起原 セルラインの名称：Ｅ．コリＪＭ１０１：：ｐＧＷ１５
０ 特徴： ６０６〜６１２ＴＡＴＡシグナル ５３４〜５３８ ＣＣＡＡＴ ボックス ７１３〜１７５６コード配列 ９１８〜９７０イントロン１ １２２８〜１３０５イントロン２ ７１３〜８００ プレプロペプチド ８０１〜１７５６成熟ペプチド 性質：アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）アセチルキシランエステラーゼ（ａｘｅ
Ａ）遺伝子
【図１】図１はアスペルギルスニガー ａｘｅＡ遺伝子
を含む３．４ｋｂ Ｓｓｔ１ＤＮＡフラグメントの制限
マップを示す図である。
を含む３．４ｋｂ Ｓｓｔ１ＤＮＡフラグメントの制限
マップを示す図である。
【図２】図２はアセチルエステラーゼ（１μｇ／ｍｌ）
およびエンド−（１，４）β−−キシラナーゼＩ（０．
１μｇ／ｍｌ）の併用作用による０．２％（ｗ／ｖ）蒸
気処理したカンバ材キシラン溶液からの酢酸（ＨＡｃ）
およびキシロースオリゴマー（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３および
Ｘ４）の遊離を示す図である。
およびエンド−（１，４）β−−キシラナーゼＩ（０．
１μｇ／ｍｌ）の併用作用による０．２％（ｗ／ｖ）蒸
気処理したカンバ材キシラン溶液からの酢酸（ＨＡｃ）
およびキシロースオリゴマー（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３および
Ｘ４）の遊離を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/18 ＺＮＡ 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ Ｃ１２Ｓ 3/08 7732−4Ｂ Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｚ 7199−3Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 ジエイコブ ヴイツセル オランダ国 6703セーカー ワーヘニンヘ ン ヒンケロールドスウエツヒ ５ (72)発明者 ヘンリエツタ カタリーナ フアン デン ブルーク オランダ国 6713エヌカー エデ アンナ フアン ビユーレンラーン 48 (72)発明者 フランソワ ストロジイー フランス国 62790 レフオレス リユー エミール バスリー 47 (72)発明者 フエリツクス イエー エム コルメリン ク オランダ国 6721イエーカー ベネコム ドルプスストラート 12アー (72)発明者 ヨハネス コルネリス ペトリユース ボ ーンマン オランダ国 2024ヘーエム ハーレム ネ プチユーニユスストラート 17
Claims (17)
- 【請求項１】 アセチルキシランエステラーゼ活性を有
するタンパクをコードする組み換えＤＮＡ フラグメン
ト。 - 【請求項２】 該フラグメントが真菌由来のものである
請求項１記載の組み換えＤＮＡ フラグメント。 - 【請求項３】 該真菌がアスペルギルス、トリコデルマ
およびシゾフィルム族を含む群から選ばれる請求項２記
載の組み換えＤＮＡ フラグメント。 - 【請求項４】 該真菌がトリコデルマリーゼイ、アスペ
ルギルスニガーおよびシゾフィルムコムネからなる種か
ら選ばれる請求項３記載の組み換えＤＮＡフラグメン
ト。 - 【請求項５】 請求項１〜４の何れかに記載のＤＮＡ
フラグメントを含み、該ＤＮＡ フラグメントが機能可
能に発現調節配列に結合している発現ベクター。 - 【請求項６】 該調節配列が該クローン化ＤＮＡ フラ
グメントに対して非相同である請求項５記載の発現ベク
ター。 - 【請求項７】 アセチルキシランエステラーゼ活性を有
するタンパクをコードするＤＮＡ フラグメントを含む
発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細胞。 - 【請求項８】 該宿主細胞がアスペルギルス、バチルス
またはクルイベロマイセスである請求項７記載の形質転
換された微生物宿主細胞。 - 【請求項９】 ａ） アセチルキシランエステラーゼ活
性を有するタンパクをコードするＤＮＡ フラグメント
を含む発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細
胞を、アセチルキシランエステラーゼの生産を生ずる条
件下で培養し、 ｂ） 場合により、該培養物からアセチルキシランエス
テラーゼを回収する工程を含む、アセチルキシランエス
テラーゼ活性を有するタンパクの製造法。 - 【請求項１０】 請求項９記載の方法により得たアセチ
ルキシランエステラーゼ活性を有するタンパク。 - 【請求項１１】 請求項９記載の方法により得たタンパ
ク、または場合により該タンパクと他のキシラン分解酵
素との混合物を使用することを含むキシランの分解方
法。 - 【請求項１２】 該他のキシラン分解酵素がキシラナー
ゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシロシダーゼ、グルク
ロニダーゼからなる群から選ばれる請求項１１記載の方
法。 - 【請求項１３】 有効量のアセチルキシランエステラー
ゼを飼料に添加することを特徴とする該飼料の消化能を
増進する方法。 - 【請求項１４】 アセチルキシランエステラーゼ活性を
有するポリペプチドを含有することを特徴とする動物飼
料組成物。 - 【請求項１５】 有効量のアセチルキシランエステラー
ゼを添加したことを特徴とする、キシラン含有組成物の
粘度低下法。 - 【請求項１６】 紙製品の調製において、クラフトパル
プからリグニンを除去するための、アセチルキシランエ
ステラーゼ活性を有するポリペプチドの使用。 - 【請求項１７】 プラスミドｐＩＭ１５０（ＣＢＳ １
５７．９１）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL91200579.0 | 1991-03-18 | ||
| EP91200579 | 1991-03-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05123173A true JPH05123173A (ja) | 1993-05-21 |
| JP3229006B2 JP3229006B2 (ja) | 2001-11-12 |
Family
ID=8207555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11061692A Expired - Fee Related JP3229006B2 (ja) | 1991-03-18 | 1992-03-18 | 真菌由来のアセチルキシランエステラーゼのクローニング、発現および利用 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5426043A (ja) |
| EP (1) | EP0507369B1 (ja) |
| JP (1) | JP3229006B2 (ja) |
| AT (1) | ATE166386T1 (ja) |
| CA (1) | CA2063352C (ja) |
| DE (1) | DE69225522T2 (ja) |
| DK (1) | DK0507369T3 (ja) |
| ES (1) | ES2120428T3 (ja) |
| FI (1) | FI110614B (ja) |
| IE (1) | IE920841A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014064484A (ja) * | 2012-09-25 | 2014-04-17 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | キシロオリゴ糖を資化し得る遺伝子組み換え酵母、該遺伝子組み換え酵母の選別方法、及び該遺伝子組み換え酵母を用いるエタノール製造方法 |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962286A (en) * | 1992-06-01 | 1999-10-05 | Anastassiadis; Savas | Process for the production of gluconic acid with a strain of Aureobasidium pullulans (de bary) Arnaud |
| DK83993D0 (ja) * | 1993-07-13 | 1993-07-13 | Novo Nordisk As | |
| US5922561A (en) * | 1994-10-03 | 1999-07-13 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Genes encoding signal recognition particle of Aspergillus niger |
| GB9505479D0 (en) * | 1995-03-17 | 1995-05-03 | Danisco | Enzyme |
| US6750051B2 (en) | 2001-04-10 | 2004-06-15 | University Of Kentucky Research Foundation | Compositions and methods for enhancing fiber digestion |
| JP4769724B2 (ja) | 2003-05-29 | 2011-09-07 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 新規トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）遺伝子 |
| DK2195421T3 (en) * | 2007-09-28 | 2015-12-14 | Novozymes As | Polypeptides with acetylxylanesteraseaktivitet and polynucleotides encoding them |
| WO2009065935A1 (en) * | 2007-11-22 | 2009-05-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having acetylxylan esterase activity and polynucleotides encoding same |
| BRPI0820615B1 (pt) * | 2007-12-06 | 2020-05-12 | Novozymes A/S | Célula microbiana hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de acetil-xilano esterase, método para produzir uma proteína e método de degradar um material contendo xilano |
| JP5690713B2 (ja) * | 2008-03-21 | 2015-03-25 | ダニスコ・ユーエス・インク | バイオマスの加水分解促進用ヘミセルラーゼ強化組成物 |
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