【発明の詳細な説明】
新規な酵素製剤及びその製造方法
発明の分野
本発明は独特な酵素的特徴を有する酵素製剤に関する。Trichoderma種のメン
バーを遺伝的に操作することによりこの酵素製剤を生産する方法が開示されてい
る。本製剤は高濃度のキシラナーゼ酵素群を含有し、パルプ工業と製紙工業にお
いて特に有用である。
発明の背景
セルロースはグルコース基がβ−1,4結合によって連結された線状多糖類であ
る。自然界では、セルロースは通常リグニン及び例えばキシランやグルコマンナ
ンなどのヘミセルロースと会合している。パルプ工業と製紙工業においては、木
材の科学的パルプ化（蒸煮）でリグニンの大部分を抽出除去して、どうにか使え
るセルロースパルプ製品を得ている。しかしながら、ここで得られるパルプは、
少量のリグニンが蒸煮後なおパルプ中に残存しているのが主原因で、褐色を呈し
ている。この残存リグニンは、典型的には塩素系化学薬剤と抽出段階を組み合わ
せる多段漂白方法でこれまで除去されてきた。塩素系化学薬品の使用の減少又は
完全回避が望まれる時には、過酸化物、酸素及びオゾンもまた使用されている。
ヘミセルラーゼはパルプの酵素補助漂白に使用可能で、その次の漂白で化学薬
品の使用量を削減したりパルプの白さを増加させるようにする(Kantelinen等，
国際パルプ漂白会議(International Pulp Bleaching Conference), Tappi論文
集，1-5頁(1988)；Viikari等，Paper and Timber 7:384-379(1991)；およびKan
telinen等，”クラフトパルプの漂白における酵素”，工科博士号論文集，フィ
ンランド工業研究センター，ＶＴＴ出版114，エスポー，1992年）。この使用で
は当然のことながら、ヘミセルラーゼは、セルロース繊維を損傷するセルラーゼ
を含んでいてはならない。
ヘミセルロース加水分解酵素を一連の異なる漂白に使用することはW089/08738
，
EP383,999, W091/02791, EP395,792, EP386,888及びW091/05908で知られている
。
ヘミセルロース分解酵素の他の工業的応用は熱メカニカル（機械）パルプ製造
にあり、ここでは、ヘミセルロース分解酵素の使用目的はエネルギー消費の低減
である。ヘミセルロース分解酵素は再生（リサイクル）パルプの排水改善又は溶
解パルプの製造に使用され得る（Viikari等，”ヘミセルラーゼの工業的応用”
，Saddler, J. 編集，森林及び農業廃棄物(Bioconversion of Forest and Agric
ultural Wastes), CAB International社，米国(1993年））。
機械パルプから水分の除去を改善するためにヘミセルロース分解酵素を使用す
ることはEP 260,040, EP 334,739，EP 351,655及び DE 4,000,558で知られてい
る。
生物量（バイオマス）の加水分解で液体燃料又は化学薬品を作ろうとする時に
は、セルロースとヘミセルロースの両方とも転化することが高収率を得るために
必須である(Viikari等，”ヘミセルラーゼの工業的応用”，Saddler, J. 編集，
森林及び農業廃棄物の生物転化(Bioconversion of Forest and Agricultural Wa
stes), CAB International社，米国(1993年))。
飼料工業においても又、高級β−グルカンとヘミセルロースを含有する基質を
分解する為に、適切に組み合わせた酵素活性体を使用する必要がある。
種々の応用においてヘミセルロース分解酵素の使用を経済的に実現可能にする
ためには、この酵素の生産コストを下げねばならない。この意味する所は、産生
水準が高くなければならないし且つ高価な精製工程は含まれない事である。最も
経済的な方策は、培養上澄み液が必要な活性体に富んでいて且つ副次的活性体は
極微量成分となるように、生産の菌株と条件を選択する事であろう。
従って、注文に合わせた、即ち、使用する工業の目的に限定して設計された独
特な酵素的特徴を有し、なお且つ、例えば、要求された酵素を産生するが望まし
くない酵素は測定されない程度にしか産生しない様に修飾されている微生物の培
地から、直接に費用効果的な様式で得られるような酵素製剤に対しては明らかな
需要がある。
キシランはキシロースとアラビノースから主として成る複雑なヘテロポリマー
である。キシランは、アセチル基及びアラビノースとメチルグルクロン酸の残基
で置換されていることもあるβ−1,4結合のキシロピラノース単位から成るバッ
クボーンを有する (Timell, T. E. 等，Wood Sci. Technol. 1：45-70(1967)）
。キシランは、セルロースに次いで、植物バイオマス中に二番目に最も多く存在
する炭水化物部分である。数多くの酵素がキシランの完全加水分解の為にはに必
要であり、最も重要な酵素はエンド−β−キシラナーゼ群に属する (Biely,P.,T
rends Biotechnol 3 : 286-290 (1985)； Dekker，R.F.H.，Hignehi, T．編集，
木材成分の生合成と生分解(Biosynthesis and biodegradation of wood compone
nts) (Academic Press 社，オーランド)，505-533頁 (1985年); Woodward, J.,
Top Enzyme Ferment．Biotechnol. 8 : 9-30 (1984)) 。
いろいろな微生物がキシランを分解し得るとともに、キシラナーゼは原核生物
と真核生物の両方に見出されている (Dekker, R.F.H., Richards, G.N., Adv.Ca
rbohydrate Chem. Biochem. 32：277-352 (1976)) 。キシラン分解微生物は種々
のキシラナーゼを屡々生産し、これら糖分子の種々の結合を攻撃する。最近の総
説 (Bastawde, K.B., World J. Microbiol．Biotechnol. 8 : 353-368 (1992))
で、Bastawdeは微生物エンドキシラナーゼの性質と作用機作に関する現在の知識
を編集した。細菌由来のこのような酵素の分子クローン化についてはいくつかの
報告があるが（例えば Ghangas, G.S.等，J.Bacteriol. 171 : 2963-2969 (1989
)； Lin,L.-L., Thimson, J.A., Mol. Gen. Genet. 228 : 55-61 (1991); Share
ck, F. 等，Gene 107 : 75-82 (1991)； Scheirlinck, T．等，Appl Microbial
Biotechnol. 33 : 534-541 (1990)； Whitehead, T.R., Lee.D.A., Curr. Mic
robiol. 23 : 15-19 (1991)) 、真菌由来のものは数少ない (Boucher, F. 等，N
ucIeic Acids Res. 16 : 9874 (1988); Ito, K. 等，Biosci. Biotec. Biochem.
56 : 906-912 (1992); Maat, J. 等，Visser, J. 等編集， キシラン及びキシ
ラナーゼ (Xylans and Xylanases) (Elsevier Science社，アムステルダム）, 3
49ー360頁 (1992年); van den Broeck, H. 等，"真菌由来のキシラナーゼ遺伝子
のクローン化及び発現 (Cloning and expression of xylanase genes from fung
al origin),” EP 463,706 A1 (1992))。
Ｔrichoderma reesei はセルロース分解酵素とキシラン分解酵素を効率的に産
生する (Suominen, P. 等，Kuwahara, M., Shimada, M. 編集，パルプ及び製紙
工業における生物工学 (Biotechnology in Pulp and Paper Industry) (ユニ(Un
i)出版株式会社、東京），439-445頁 (1992年); Tenkanen, M. 等, Enzyme Micr
ob. Technol. 14 : 566-574 (1992))。
Trichoderma reesei はまた天然の置換キシランを完全に加水分解するのに必
要な全ての酵素を産生する (Poutanen, K. 等, J. Biotechnol. 6 : 49-60 (198
7)) 。種々のエンド−β−1,4-キシラナーゼがTrichodermaの培養濾液から精製
されている(Baker, C.J．等，Phytopathology 67 : 1250-1258 (1977)；Hromova
, M. 等，Arch. Microbiol．144 : 307-311 (1986); John and Schmit, Method
ｓ Enzymol. 16OA: 662-671 (1988); Lappalainen, A., Biotechnol. Appl. Bi
ochem. 8 : 437-448 (1986); Sinner and Dietrichs, Holzforschung 29 : 207-
214 (1975); Tan, L.U.L. 等，Enzyme Micob. Technol. 7 : 425-430 (1985); W
ood and McCrae, Carbohydr. Res. 148 : 321-330 (1986))。等電点をｐＨ5.5（
エンドキシラナーゼI）とｐＨ9.0（エンドキシラナーゼII）に有する二つの特異
的なT.reeseiのエンドキシラナーゼが特性化されている（Tenkanen,M.等，Enzym
e Microb.Technol.14:566-574(1992)）。
例えば酵素補助パルプ漂白用の酵素混合物を産生する様な、効果的な微生物、
特に真菌性のキシラナーゼ産生菌が必要である（Kantelinen,A.等，” ヘミセ
ルラーゼ及び漂白におけるその潜在的役割（Hemicellulases and Their Potent
ialRole in Bleaching）”，国際パルプ漂白会議 （Int.Pulp Bleaching Confe
rence），Tappi論文集1ー9頁（1988年）； Lahtinen,T.等，”クラフトパルプ漂
白における選択的Trichoderma酵素製剤の使用（Using Selective Trichoderma E
nzymePreparations in Kraft Pulp Bleaching)，”Kuwahara and Shimada編集，
パルプ及び製紙工業における生物工学(Biotechnology in Pulp and Paper Indus
try)，ユニ(Uni)出版株式会社、東京，129-137頁（1992年）； Viikari,L.等，
”酵素漂白（Bleaching with Enzymes），”パルプ及び製紙工業における生物工
学(Biotechnology in Pulp and Paper Industry)，第三回国際会議論文集，スト
ック
ホルム，67-69頁（1986年）； Viikari,L.等，第四回国際木材及びパルプ会議論
文集，パリ１（4th Int.Symp.Wood and Pulping Chemistry,Paris 1):151-154頁
（1987年））。
発明の要約
多量のヘミセルロース分解酵素を経済的に生産し且つ他の木材と植物成分を分
解する酵素と理想的に配合できるようなこの種の酵素を生産する事の重要性に鑑
みて、本発明者等は、組換え生産による関連酵素の大量資源としてヘミセルロー
ス分解酵素への応用に有用である様な宿主の設計に、組換えDNA技法を使用する
事を検討した。
これらの研究により、大量の望ましい酵素、好ましくは大量のヘミセルロース
分解酵素を発現する真菌宿主の開発に到った。
これらの研究は又、大量の望ましい酵素、好ましくはヘミセルロース分解酵素
、を発現するのみでなくセルラーゼ分解系の少なくとも一つの酵素成分を欠く真
菌宿主の開発をもたらした。
本発明の目的は、高水準のキシラナーゼ活性を発現し得るTrichoderma属に所
属する真菌宿主、又は、その機能に加えてセルラーゼ活性を部分的又は完全に欠
く真菌宿主を提供する事である。
本発明のもう一つの目的は、高水準のキシラン分解酵素とある種のセルロース
分解酵素、好ましくはエンドグルカナーゼ、を産生するが、その機能に加えて他
のセルラーゼ活性を部分的又は完全に欠き、且つ好ましくはセロビオース加水分
解酵素を欠く真菌宿主を提供する事である。
さらに本発明の目的は、この様なヘミセルラーゼ活性に富み、又は、これに加
えて或る種のセルロース分解酵素を部分的又は完全に欠く酵素組成物を提供する
事にある。
本発明のもう一つの目的は、Trichodermaからキシラナーゼ遺伝子を分離しク
ローン化する事である。
最後に、本発明のもう一つの目的は、その様なTrichodermaキシラナーゼを含み
そして発現する新しい宿主（植物、酵母、真菌又は細菌）を提供する事である。
図面の簡単な説明
図１は、遺伝子を欠失させる一般的戦術を示す。
図２は、pALK475の5.7kb(KpnI)挿入因子の制限地図を示す。x1n2遺伝子の場所
は矢印でマークしている。サブクローンpALK573,pALK574,pALK570およびpALK476
中の挿入因子は別々の線で示されている。この断片の5'末端でのSmaＩ部位はpUC
19のポリリンカーに由来する。
図３は、T.reesei x1n2遺伝子［SEQ ID No.:1:］のヌクレオチド配列を示す。
コーディング領域は大文字で表されている[SEQ ID No.:2:]。精製タンパク質か
ら得られるペプチド配列は下線で表示されている；二重下線で表示されている配
列はPCRプライマーを調製するのに使用された。TATAボックスは点々で示してい
る。想定上のシグナル切断部位は矢印（↑）で、又Ｎ−糖鎖形成の想定部位は三
角印（▼）でマークされている。成熟タンパク質のＮ−末端は矢印（→）で示さ
れている。活性部位に関わると提案されている二つのグルタミン酸は四角に囲ん
である。
図４は、xIn2遺伝子をcbh1座に標的するためのプラスミドであるpALK476プラ
スミドを示している。このx1n2遺伝子は自己プロモーターの制御下にある。
図５は、形質転換に用いられるpLK476断片を示している。1.9kb cbhl5'−フラ
ンキング領域(ScaI-EcoRI)はcbh1-コーディング領域の2.2kb上流に由来し、1.8k
b 3'ー領域(Bam HI-Eco RI)はcbh1-コーディング領域末端の1.4kb下流に由来す
る。amdS遺伝子はp3SR2(3.1kb Spe1-Xba Ｉ断片）に由来しx1n2遺伝子はpALK47
5（5.0kb SmaＩ断片、図２参照）に由来したものである。断片中のx1n2遺伝子
のプロモーター区域は2.3kbの大きさである。
図６は、T.reesei VTT-D-79125の生産水準に対比させて計算した図５の形質転
換体の相対的なキシラナーゼ生産水準を示す。棒グラフはそれぞれの宿主株の形
質転換体間の生産水準について平均値と変動幅を示している。各形質転換体は一
つのフラスコで生育させた。試験した形質転換体の番号は（CBHI+/-）： T.rees
ei VTT-D-79125 19/38,ALK02221 16/26およびALK012721 22/31であった。
図７は、pALK174(x1n2遺伝子はcbh1 プロモーターに融合している）の構成
を示す。関連する制限部位のみが示されている。
図８は、pALK174形質転換体におけるキシラナーゼ活性の相対的な生産増加を
示す。
図９は、pALK572の2.3kb EcoR Ｉ挿入因子の制限地図を示す。x1n1遺伝子の場
所は矢印でマークされている。
図１０は、T.ressei x1n1遺伝子[SEQ ID No.:3:]のヌクレオチド配列を示す。
コーディング領域は大文字で表されている[SEQ ID No.:4:]。精製タンパク質か
ら得られるペプチド配列は下線で表示されている；二重下線で表示されている配
列はPCRプライマーを調製するのに使用された。TATAボックスは点々で示してい
る。想定上のシグナル切断部位は矢印（↑）でマークされている。成熟タンパク
質のＮ−末端は矢印（→）で示されている。活性部位に関わると提案されている
二つのグルタミン酸は四角に囲んである。
図１１は、プラスミドpALK807(x1n2遺伝子はcbh1プロモーターに融合している
）の構成を示す。関連する制限部位のみが示されている。
図１２は、CBHI負の形質転換体VTT-D-87312のFPLC分析を示す；図１２Ａは、
それと未形質転換宿主との比較を示す。
図１３は、プラスミドpALK99の構成図を示す。
図１４は、染色体cbh2遺伝子をargB遺伝子と交換した構成図を示す。
図１５は、プラスミドpAJK99の構築を示す。
図１６は、プラスミドｐＰＬＥ３の構成図を示す。
図１７は、VTT-D-79125(UV)のtrpC−突然変異株である△cbh1△cbh2菌株の構
築を示す。
図１８は、T.reesei VTT-D-79125(UV)の高セルロース分解変異株及びそのセロ
ビオース加水分解酵素欠損株の遺伝子操作された派生株の酵素特性を示す。
図１９は、遺伝工学T.reesei株#1，#2及び#3の修飾された酵素特性を示す。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
ここでの説明においては、組替えDNA(rDNA)技術で使われる数多くの用語が広
く使用されている。その様な用語の範囲を含めて、明細及び請求を明白に且つ一
貫して理解するために、以下に示す定義を提供する。
セルラーゼ：セルラーゼは不溶性のセルロースを可溶性の炭水化物に分解する
反応を触媒する酵素を包括する包括的用語である。この用語”セルラーゼ”はこ
の様な一群の酵素を指すとしてこの分野で公知である。セルロースをグルコース
に効率的に加水分解するためには、少なくとも三つのセルラーゼ酵素（三つの型
のセルラーゼ酵素活性）が必要である。一つは、通常では置換可溶基質は攻撃す
るが結晶性セルロースには何の活性も示さない任意切断性エンドグルカナーゼ(1
,4−β-D−グルカン グルカン加水分解酵素、EC 3.2.1.4)で、他の二つは結晶
性セルロースを分解し得るが派生化セルロースには何の活性も示さないセロビオ
ース加水分解酵素(1,4−β−D-グルカン セルビオース加水分解酵素、EC 3.2.1
.91)及びセロビオースとセロー小糖類を分解してグルコースを作るβ−グルコシ
ダーゼ（β-D−グルコシド 糖加水分解酵素、EC 3.2.1.21)である。上に列挙し
たこれら三つの型の酵素の各々は複合形で存在する。例えば、二つの免疫学的に
異なったセロビオース加水分解酵素のCBH ＩとCBH IIが知られている。その他に
も、5-8個の電気泳動的に異なったエンドグルカナーゼが知られている。幾らか
のこれらの酵素の間に相乗作用があることが実証されている。セルラーゼ活性は
セルロース分解活性と同義である。
セルラーゼの生合成はセルロース、セロビオース、ソホロースとラクトースに
より惹起されまたは誘発され、且つグルコースや他の汎用性炭素源によって抑制
される。
一つ以上のセルラーゼ酵素の合成が”実質的に出来ない”Trichoderma宿主と
は、野生型（未形質転換の）Trichodermaに比べて、一つ以上のセルラーゼ酵素
の活性が抑制され、欠損し又は不在であるようなTrichoderma宿主を意味する。
ヘミセルロース分解酵素（ヘミセルラーゼ）：ヘミセルロースの酵素的分解と
修飾には、どれも”ヘミセルラーゼ”と呼ばれる幾つかの異なる酵素が必要であ
る。ヘミセルロースのバックボーンを解重合する二つの主なグリカナーゼはエン
ド−1,4−β-D−キシラナーゼとエンド−1,4 −β-D−マンナナーゼである。小
さ
い小糖類は1,4−β-D−キシロシダーゼ、1,4−β-D−マンノシダーゼと1,4−β-
D−グルコシダーゼによって更に加水分解される。側鎖基はα−Ｌ−アラビノシ
ダーゼ、α-D-グルクロニダーゼとα-D-ガラクトシダーゼで切断される。エステ
ル化された側鎖基は種々のエステラーゼで遊離される。
ヘミセルロース加水分解酵素の定義はViikari等，”ヘミセルラーゼの工業的
応用”，森林及び農業廃棄物の生物転化(Bioconversion of Forest and Agricul
tural Wastes)(1992)から引用している。
酵素製剤：”酵素製剤”とは、真菌又はその真菌の増殖に用いられる培地から
抽出された（部分的にか完全にかどちらかで精製された）酵素を含む組成物を意
味する。従って、この用語”酵素製剤”は、そんな真菌を培養する為に前もって
用いられた培地及びその真菌が培養中に培地中に分泌した全ての酵素から成る組
成物を含むことを意味する。
培地：培地とは、真菌を前もって培養するのに用いられる培地（”使用済み”
培地）を意味し、そこにはその真菌が培養中に培地中に分泌した酵素を含んでい
る。その様な培地は、そのままか部分的又は完全に精製し、濃縮し、乾燥し又は
固定化して、用いることが出来る。望まれれば、発現したエンドグルカナーゼタ
ンパク質は、抽出、沈でん、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、電気泳動などの従来の条件に従って、更に精製してもよい。
生物−漂白：”生物−漂白”とは、リグニン分解酵素と共に又は無しでヘミセ
ルロース分解酵素を作用させた後、セルロースパルプからリグニンを抽出する事
を意味する。リグニンの除去は、物理的にか（蒸煮の間に繊維表面上に再沈でん
する事で）又は化学的にか（リグニンー炭水化物複合体により）のどちらかでヘ
ミセルロースにより制限されるであろう。ヘミセルラーゼの活動でヘミセルロー
スを部分的に分解すると、従来の漂白用化学薬品（塩素、二酸化塩素、過酸化物
など）によるリグニンの抽出性が高められる(Viikari等，”酵素漂白(Bleaching
with Enzymes)，”パルプ及び製紙工業における生物工学(Biotechnology in Pul
p and Paper Industry)，第三回国際会議論文集，ストックホルム，67-69頁(198
6年）； Viikari等，”漂白における酵素の応用”，第四回国際木材及びパルプ
会議論文集，(4th Int.Symp.Wood and Pulping Chemistryl)，パリ，第１巻，15
1-154頁（1987年））；(Kantelinen等，”ヘミセルラーゼ及び漂白におけるその
潜在的役割(Hemicellulases and Their Potential Role in Bleaching)”，国際
パルプ漂白会議(Int.Pulp Bleaching Conference),Tappi論文集1-9頁（1988年）
。この改良された漂白能力の有益性は漂白用化学薬品のより少ない消費とより少
ない環境上の負荷又はより高い最終白度値である。ヘミセルロース分解酵素は、
従来の漂白用化学薬品を用いるリグニン除去をより容易にする事により漂白能力
を改良する。
遺伝子：RNAポリメラーゼ用の鋳型を含むDNA配列。タンパク質をコードするRN
AはメッセンジャーRNA(mRNA)と名付けられていて、真核生物では、RNAポリメラ
ーゼIIによって転写される。しかしながら、RNAポリメラゼII鋳型を含む遺伝子
を構築することも知られており、ここでは、特定のmRNAの配列に相補的な配列を
有するが普通には翻訳されないようなRNA配列が転写される。この様な遺伝子構
築体はここでは”アンチセンスＲＮＡ遺伝子”と呼ばれ、そして、その様なRNA
転写体は”アンチセンスＲＮＡ”と呼ばれている。アンチセンスRNAは、アンチ
センスRNA配列中に翻訳停止コドンが存在する為に翻訳され得ない。
”相補的DNA”即ち”cRNA”遺伝子は、mRNAの逆転写によって合成され、且つ
、そこから介在配列（イントロン）が取り除かれている様な組替え遺伝子を含ん
でいる。
本発明のTrichoderma宿主と相同の酵素とは、同一種の未転換Trichodermaが宿
主種としては若干量の天然型タンパク質を自然に生産する事を意味する。本発明
のTrichoderma宿主に相同の遺伝子とは、同一種の未転換Trichodermaを宿主種と
して持つゲノム中に見出される遺伝子を意味する。
本発明のTrichoderma宿主と非相同の酵素とは、同一種の未転換Trichodermaが
宿主種としては若干量の天然型タンパク質を自然に生産しない事を意味する。本
発明のTrichoderma宿主に非相同の遺伝子とは、同一種の未転換Trichodermaを宿
主種として持つゲノム中に見出されない遺伝子を意味する。
ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）とは
、
全てのTrichodermaキシラナーゼ遺伝子がT.reesei pI 5.5キシラナーゼのアミ
ノ酸配列をコード化している核酸配列に又はT.reesei pI 9キシラナーゼのアミ
ノ酸配列をコード化している核酸配列にハイブリッドする様な条件を意味する。
この様な条件は、好ましくは6xSSC+0.1%SDSの存在下に60-68℃でハイブリッドを
形成し且つ6xSSC+0.1%SDSの存在下に60-68℃で洗い込む事を特徴とする。
クローン化媒体：問題とする遺伝子を宿主細胞に伝達する為の適切な核酸環境
を提供する様なプラスミドかファージDNA又は他のDNA配列（線状DNAの様な）。
本発明のクローン化媒体は原核生物と真核生物の宿主に自律的に複製する様に設
計してもよい．Trichodermaでは、このクローン化媒体は一般的には自律的に複
製しないが、その代わりに、Trichodermaゲノムに引き続き挿入する為に問題の
遺伝子を移送する媒体を単に提供する。このクローン化媒体は、更に、一つ又は
少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とするが、ここでは、その様なDNA配
列は媒体の本質的な生物機能を失わずに決定的様式で切断されてもよいし、且つ
、DNAはその様なDNAの複製とクローン化をもたらす為にスプライス（接合）して
もよい。このクローン化媒体は、更に、クローン化媒体で形質転換された細胞を
認識するのに適した標識を含んでもよい。標識は、例えば、テトラサイクリン抵
抗性又はアンピシリン抵抗性因子である。”ベクター”という語が”クローン化
媒体”に変えて時々使用される。一方、その様な標識は、問題の遺伝子を供給す
るものとは別のクローン化媒体に提供してもよい。
発現媒体：クローン化媒体に似ているが、望ましい宿主に形質変換後、クロー
ン化されている問題の遺伝子を発現させ得る様な媒体又はベクター。好ましい態
様では、その様な発現媒体は、望ましい宿主に形質変換後クローン化されている
問題の遺伝子を高く発現させる。
好ましい態様では、クローン化又は発現媒体の部分として真菌宿主に提供され
る問題の遺伝子は真菌染色体中に組込まれる。クローン化媒体又は発現媒体から
派生する配列は、又、組込み過程で問題の遺伝子と組込まれてもよい。
好ましくは、問題の遺伝子は、ベクター（問題の遺伝子と組込まれた）により
提供されるプロモーター配列の如きある種の制御配列の制御下に（例えば、操作
的に連鎖して）置いてもよい。望むなれば、その様な制御配列は、挿入座の為に
真菌の染色体により提供されてもよい。
発現ベクター上の発現制御配列は、原核又は真核宿主中にある種の遺伝子を発
現する様にベクターがなっているかどうか（例えば、シャトルベクターは細菌宿
主に選択遺伝子を提供してもよい）によって変わるだろうし、且つ、エンハンサ
ー要素、終止配列、そして／又翻訳の開始と停止部位の如き転写要素を追加して
含んでもよい。
II．Trichoderma宿主の遺伝子操作
本発明での宿主を遺伝子操作する過程は、望ましい酵素活性をコード化し得る
遺伝子配列のクローン化によっても、その様な遺伝子配列の発現によっても促進
される。ここで使われる限り、”遺伝子配列”という語は核酸分子（好ましくは
DNA)を意味するものとする。望ましい酵素をコード化し得る遺伝子配列はいろい
ろな資源由来のものであってよい。これらの資源はゲノムDNA、 cDNA、合成DNA及
びそれらの組合わせを含む。
中温性不完全真菌Trichoderma reesei （以前はT.viride）はFungi imperfec
tiのメンバーとして分類されている。Fungi imperfetiは、最も典型的なAspergi
llusの様に、有性生殖性又は有性生殖属との明白な親和性を全く持たない多対応
範鴫の真菌である。Trichodermaは、完全子嚢菌属Hypocreaの不完全状態である
曖昧な性的期（sexual stage）を有すると報告されているが、明らかにAspergil
lusとTrichoderma属は分類学的には全く異なると考えられる。
本発明に基づく改良酵素製剤は、組み替えDNA技術で修飾されている真菌Trich
odermaにより生産される。この発明のTrichoderma宿主は、高水準の酵素、好ま
しくはヘミセルラーゼ、を産生できる様に修飾されている。加えて、これらの宿
主は、少なくとも一つのセルラーゼ酵素（その活性はパルプと製紙加工のあいだ
望ましくない）を全く欠損している様に修飾されてもよい。斯くして、残存する
セルラーゼ活性は変わらないが、本発明のTrichoderma宿主は、セルロースをグ
ルコースにまで十分に分解し、その結果、そんな分解は大きく低下するか完全に
阻害される様な必要補体酵素を部分的か完全に欠損している。
IIa.Trichodermaの新しい遺伝子構築体による形質転換
態様の一つとして、少なくとも一つのセルラーゼ活性を部分的又は完全に欠損
する本発明のTrichoderma宿主は、Trichodermaに相同である所の望ましいパルプ
と製紙加工酵素の少なくとも一つを発現し得る遺伝子構築体で形質変換されて，
Ｔrichoderma中のこの酵素の量を増加させる。望ましいパルプと製紙加工相同酵
素の例として、例えば、 ヘミセルラーゼ及びペクチンー分解酵素が挙げられる
。Trichodermaは生来、エンドキシラナーゼ、マンナナーゼ、β−キシロシダー
ゼ、α−アラビノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ及びアセチルエステラーゼを
含む異種のヘミセルラーゼを産生できるが、その中のどの活性体も本発明の酵素
製剤での望ましい酵素であってもよい。又、天然のTrichodermaは、本発明での
酵素製剤での望ましい酵素と分類されてもよいポリガラクツロナーゼの様なペク
チン分解酵素の微量を産生する。更に、セルロースを酸化するどんな他のTricho
derma酵素は本発明の酵素製剤で用いられてもよいし望ましい酵素であってもよ
い。
Trichoderma reesei QM 9414,Aspergillus awamori VTT-D-75029,Fusariumoxy
sporum VIT-D-80134,Bacillus sutilis ATCC 12711及びStreptomyces olivochro
mogenes ATCC 21713により産生されるキシラン分解酵素の比較によって、最高の
キシラナーゼ活性体はT.reeseiで産生される事が示された。従って、キシラナー
ゼ活性を保持するのが望ましい条件下では、T.reeseiは有利な宿主である。(Pou
tanen,K.,”キシラン分解酵素の潜在的応用のための特徴付け(Characterization
of Xylanolytic Enzymes for Potential Applications)”，工科博士論文集、
フィンランド工業研究センター，出版47）。
更に、異なる微生物源からの上述の製剤は、β−キシロシダーゼ活性と側鎖切
断活性に関して異なったが、T.reesei培養液濾液は全ての検定した側鎖切断活性
体（アセチルエステラーゼ、α−グロクロニダーゼ及びα−アラビノシダーゼ）
を含む一方、F.oxysporumとS.olivochromogenes由来の製剤はエステラーゼしか
含んでいなかった。このように、Trichodermaは宿主としても有利である；何故
なら、それは広いスペクトラムのキシラン分解酵素を自然に産出し、その比
率は異なった応用に対する遺伝子操作によって調整し個々の目的の注文に合わせ
た酵素製剤を提供し得るからである。
本発明によれば、パルプと製紙加工の目的には望ましい相同酵素をコード化す
る遺伝子構築体はTrichodermaのゲノムに導入してもよく、chh1の様な強力なプ
ロモーター及び、望まれれば、例えば、エンハンサー配列のような追加又は修飾
された調節領域を用いる事によって、より強い発現もまた達成され得る。その様
な調節配列はTrichodermaに相同であるのが好ましい。調節領域、特にプロモー
ターは、発現に必要なこれらの配列要素のみを含むように、且つ／又、高い発現
水準の基である領域を保持するように修飾してもよい。エンハンサー配列は、別
のDNA因子としての問題の遺伝子と同時に導入してもよいが、問題の遺伝子を（
例えば、５’か３’不翻訳配列又はイントロンで）供給するものと共線形である
DNA配列のような問題の遺伝子に操作可能的（機能的）に連鎖している。
きわめて好ましい態様では、Trichodermaのゲノムに導入された相同遺伝子は
相同ヘミセルラーゼ、好ましくはキシラナーゼをコード化する遺伝子である。T.
reeseiにより産生した二つの主キシラナーゼが精製されている(Tenkanen,M.,Enz
yme Micro.Technol.14:566-574(1992)）。これらの酵素は5.5(XYLI)と9.0(XYLII
)の等電点を有し、分子量は、それぞれ、19と20kDaである。
Trichoderma reesei由来のキシラナーゼＩ酵素は、より酸性のｐＨ域で最適活
性を示すが、一方、キシラナーゼIIは中性付近のｐＨ域でｐＨ最適性を示す。二
つのキシラナーゼの異なる性質の為に、これらの酵素は単独又は混合で異なった
応用に用い得る(W092/03541及びViikari等，”パルプ及び製紙工業に使用するキ
シナーゼの重要な性質(Important Properties of Xylanazes for Use in Pulp a
nd Paper Industry)，”パルプ及び製紙工業における生物工学(Biotechnology i
n Pulp and Paper Industry),Kuwahara,M.and Shimada,M.編集、第五回”パルプ
及び製紙工業における生物工学”国際会議論文集，ユニ(Uni)出版株式会社，東
京，1992年，101-106頁）。
本発明によれば、遺伝子操作法を使う事により、望ましいキシラン分解酵素活
性体を培地中に強化してその培地を目的の応用に使用することが可能である。例
えば、ある漂白過程と漂白条件においてはキシラナーゼＩ（より酸性のｐＨ域で
）を使用するのが有利であっても、ある他の漂白過程と漂白条件においてはキシ
ラナーゼIIが好ましいかもしれない（アルカリ性又は中性に近いｐＨ域では）。
ある応用においては、一つのセルロース分解酵素は除去、減少、不活性化又は
抑制されてもよいが、異なったセルロース分解酵素をコード化する遺伝子を宿主
に導入して、ある特定のセルロース分解酵素活性を高める様にする事が望ましい
。例えば飼料工業においては、ヘミセルロース分解活性に加えて、相当量のエン
ドグルカナーゼから成る酵素製剤を用いてもよい。斯くして、その様な加水分解
が望まれる様な調整剤においては、キシラナーゼ又は他のヘミセルラーゼに加え
て、高レベルのエンドグルカナーゼを発現する宿主を使用してもよい。
もう一つの態様においては、既に相同形の酵素を発現するTrichoderma宿主は
、非相同形の同一酵素をコード化する遺伝子構築体と形質転換される。更にもう
一つの態様においては、ある種の酵素を発現しないTrichoderma宿主は、Trichod
ermaに非相同の酵素をコード化する一つ以上の遺伝子構築体と形質変換される。
本発明によれば、パルプ及び製紙加工目的に望ましい活性を持つ相同酵素の量
は、その様な望ましい非相同酵素を産生する遺伝子を特定の座に導入するか、且
つ／又、上述のTrichodermaゲノム中にこの遺伝子をマルチコピーで(in multico
pies)導入することによって、うまく増加させられる。
好ましい態様においては、望ましい酵素をコード化する遺伝子は、強力なcbh1
プロモーターに操作可能的に連鎖するようにcbh1座に挿入される。下記の如く、
cbh1の様な強力なプロモーター使用すれば、高い生産が達成される。たとえ非相
同遺伝子がcbh1座に挿入されないでも、望ましい非相同酵素の量は、Trichoderm
aのセルラーゼ産生能が一般に低下すると、またうまく増加させられる。
相同又は非相同であれ、ヘミセルロース加水分解酵素のような望ましい酵素を
コード化する遺伝子は、特許申請EP 244,234に記載されているpAMH110のような
普遍的発現ベクター中に遺伝子を挿入することで、Trichodermaゲノム中に組込
まれ得る。pAMH110はPUC19由来の(Yannish-Perron等，Gene 33:103-119(1985)、
そして、cbh1遺伝子のプロモーターとターミネーター及びSac IIとNde
Ｉによる消化で除去し得るところのプロモーターとターミネーター配列間のスタ
ッファー(stuffer）断片を含んでいる。両端を平滑にした後、DNA、cDNA又は染色
体DNAのどれでもプロモーターとターミネーターとの間に挿入できる。望ましい
遺伝子は、cbh1プロモーターとターミネーターとの間に、プラスミドpAMH110のc
bh1発現カセットへ挿入され得る。
他の遺伝子の転写調節要素は、cbh1要素を使いたくない場合に使用してもよい
。例えば、３−ホスホグリセラーテ(phosphoglycerate)キナーゼ遺伝子(pgk)転
写調節領域から成るベクター構築体を使用してもよいが、この時には、３−ホス
ホグリセラーテ キナーゼ、解糖によってATPを発生する重要酵素、はグルコー
スは存在するがセルラーゼの合成は抑制されているような条件下で発現する。
本発明者等は、どの特定の理論によっても束縛されるつもりはないが、望まし
い遺伝子の発現の効率は、望ましい遺伝子がTrichodermaゲノムに組込まれるコ
ピーの数、及びに、遺伝子をゲノムに組込む位置の両方に左右されるように思わ
れる。好ましい態様においては、望ましい遺伝子の組込みは特定の座に指示され
る。線状DNAの使用は、組込みを相同座に指示するのを助ける。高度に好ましい
態様においては、望ましい遺伝子の組込みはTrichoderma cbh1座に向けられる。
本発明により作られるDNA構築体は、どのTrichoderma株でも形質変換させる為
に使用し得る。その様な菌株としては、例えば、T.reesei株QM9414(ATCC 26921
），RUT-C-30(ATCC 56765)およびQM9414の子孫であるVTT-D-79125の様な高度生
産性変異株が挙げられる(Nevalainen 1985年，フィンランド工業研究センター出
版26，(1985年），エスポー，フィンランド）。Trichodermaの形質変換はこの分
野で知られたどの技術によっても、特にEP 244,234に教示している技術によって
も、実施してもよい。
Trichoderma宿主細胞は培養してもよく、更に、望ましい酵素を発現させるよ
うな条件下で望ましい性質を持つ宿主菌株を培養する事により、望ましい酵素を
作成してもよい。例えば、望ましい性質を持つTrichoderma宿主菌株は、例えば
、6％Solka Flocセルロース，3％蒸留酒用麦芽かす(distiller's spent grain),
0.5％KH2PO4，0.5%(NH4)2S04及び0.1%ストルクトール(Struktol)より成る液
体栽培培地中で培養してもよい。Trichoderma株によるセルラーゼ産生はグルコ
ース抑制に敏感であり、例えば、セルロース、ラクトース及びソホロースのよう
な誘導物質を必要とする（Allen等，Biotechnology and Bioengineering 33:650
−656(1989)）。Trichoderma培養でのpHはリン酸又はアンモニアの添加約pH５に
保たねばならないし、温度は培養の間は３０℃に保たれてもよい。然しながら、
温度は菌株によっても、生産される酵素製剤によっても調節しなければならない
(Merivuori等，Biotechnology Lett.12:117-120(1990)）。
IIb．ＤＮＡクローン化
本発明の酵素製剤を生産するためのTrichoderma宿主を産生する方法では、ベ
クター様式を用いてもよい。その様なベクター構築により提供される一つのエレ
メントは、その遺伝子活性を除去、減少、不活性化、消去又は抑制する事が望ま
しい少なくとも一つの相同（ホモローガス）遺伝子の配列をコードしていること
である。その様なベクター構築体（ａ）は、別のベクター構築体（ｂ）を更に供
給するだろうが、それはTrichodermaゲノムに組み込まれる遺伝子の少なくとも
一つ及び（ａ）か（ｂ）と結合した選択的マーカー（ｃ）をコード化する。代わ
りに、別個のベクターを使用してもよい。
本発明の宿主内で用いられるクローン化ＤＮＡは天然に産出するイントロンを
含んでも含まなくてもよい。更に、その様なゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ遺伝子配列
の天然5'プロモータ領域と、及び／又は、3'転写停止領域と対合して、そんな配
列がTrichoderma中で機能し得るとして、調整してもよい。更に、その様なゲノ
ムDNAは、mRNAの5'非翻訳領域をクローン化する遺伝子配列と、及び／又は、非
翻訳領域をクローン化する遺伝子配列と、対合して調製してもよい。Trichoderm
a宿主細胞が認識できる範囲において、mRNAの発現に関連する転写の、及び／又
は、翻訳の調節シグナル並びにタンパク質、それに、天然遺伝子の5'及び／又は
3'非転写領域、及び／又は、mRNAの5'及び又は3'非翻訳領域は、保持して転写と
翻訳の調節に用いられてもよい。ゲノムDNAはこの分野でよく知られた手段で抽
出され得る（例えば、分子クローン化技術へのガイド(Guide to Molecular Clon
ing Techniques),S.L.Berger等編集，Academic Press社（1987年）参照）。代わ
りに、mRNAは、望ましいタンパク質を産生するか発現するどんな細胞から分離し
て、この分野で知られた手段でcDNAを調製するのに使用する事が出来る（例えば
、分子クローン化技術へのガイド(Guide to Molecular Cloning Techniques),S.
L.Berger等編集，Academic Press社(1987年）参照）。好ましくは、ここで使用
するmRNA剤は、望ましいタンパク質のためのmRNAクローン化で強化されるだろう
が、この方法としては、自然には、多量のタンパク質を生産する細胞から分離す
るか、試験管内では、ショ糖グラジエント遠心分離などの、特定の配列をmRNAに
強化するのに一般的に使用される技法によるか、それら両方がある。
ベクター中にクローン化する為には、その様な適するDNA剤（ゲノムDNAかcDNA
のどちらか）は、それぞれ、ランダムに剪断されるか酵素的に切断され、そして
、適切なベクター中に配位させて組換え遺伝子（ゲノムかcDNA）ライブラリーを
形成させる。
望ましいタンパク質をコード化するDNA配列は、従来の技法によりDNAベクター
中に挿入してもよいが、これには、連結反応末端の平滑端化又は付着端化、適切
な末端を提供する為の制限酵素消化、望ましくない接合を避ける適切なアルカリ
性ホスファターゼ処理としての付着端充填、及び、適切なリガーゼとの連結反応
を含んでいる。この様な操作技法は、Maniatis,T．等、上記、により開示され、
且つ、この分野でよく知られている。
望ましいタンパク質をコード化するクローンを含むライブラリーはふるい分け
し、そして、望ましいタンパク質へのクローンを同定してもよいが、その手段に
よって、例えば、ａ）このタンパク質のDNAに特異な配列を含む適切な核酸プロ
ーブとのハイブリダイゼーション、又は、ｂ）問題のクローンにハイブリダイズ
する天然形mRNAが試験管内で翻訳されそしてその翻訳産物が更に特徴づけられる
ようなハイブリダイゼーションー選択翻訳分析により、又は、ｃ）もしクローン
化された遺伝子配列が自身でmRNAを発現できるならば、クローンを含む宿主によ
り生産された翻訳化タンパク質産物の免疫沈降などにより、当タンパク質を特定
して選択する。
本発明で望ましいタンパク質に特異でそんなタンパク質へのクローンを同定す
るのに使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、タンパク質のアミノ酸配列の
知識から設計され得る。
遺伝子コードには同義性があるので、一つ以上のコドンが特定のアミノ酸をコ
ード化するために使用されてもよい(Watson,J.D.，遺伝子の分子生物学(Molecul
ar Biology of the Gene)，第三版， W.A.Benjamin社，メンロパーク，カリフォ
ルニア，（1977年），356-357頁）。ペプチド断片を分析し、最低度の同義性を
持つオリゴヌクレオチドでコード化され得るようなアミノ酸配列を決める。この
事は、ただ１個のコドンでコード化されるアミノ酸を含む配列を選ぶことにより
達成するのが好ましい。
時にはアミノ酸配列はただ１個のオリゴヌクレオチド配列でコード化されるだ
ろうが、屡々、このアミノ酸配列は一組の類似オリゴヌクレオチドのどれか一つ
でコード化されてもよい。重要な事として、この組の全メンバーは同じペプチド
断片をコード化し、それ故に、同じオリゴヌクレオチド配列を、ペプチド断片を
コード化する遺伝子として潜在的に含むが、一方では、その組の一つのメンバー
だけが遺伝子のエキソンコード化配列と同一であるヌクレオチド配列を含んでい
る。このメンバーはその組中に存在し、そして、組の他のメンバーの存在下でも
DNAにハイブリッドし得るので、不分画組のオリゴヌクレオチドを同じ様に用い
て、そこで、単一のオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質をコード化する遺
伝子をクローン化する事が可能になる。
遺伝子コードを用いて(Watson,J.D.，遺伝子の分子生物学(Molecular Biology
of the Gene），第三版，W.A.Benjamin社，メンロパーク，カリフォルニア，（
1977年））、一つ以上の異なったオリゴヌクレオチドがアミノ酸配列から同定さ
れ得るが、そのどれもタンパク質をコード化する能力がある。特定のオリゴヌク
レオチドが、実際に、現行タンパク質の配列を構築する可能性は、異常塩基対合
類縁(base paring relationships)、及び、真核細胞で（特定のアミノ酸をコード
化するために）現実に用いられるような頻度を考慮することにより評価し得る。
その様な”コドン使用則”はLathe,R.等，J.Molec.Biol.183:1-12（1985）によ
り公開されている。このLatheの”コドン使用則”を用いて、タンパク質の配列
をコード化し得る理論的で”最も可能性のある”ヌクレオチド配列を含む様な単
一のオリゴヌクレオチド、又は、一組のオリゴヌクレオチド配列が同定されてい
る。
タンパク質遺伝子の断片をコード化する適切なオリゴヌクレオチド又は一組の
オリゴヌクレオチド（又は、その様なオリゴヌクレオチド又は一組のオリゴヌク
レオチドに相補的であるもの）を、この分野で知られた手段で合成し（例えば、
DNAとRNAの合成と応用(Synthesis and Application of DNA and RNA),S.A.Naran
g編集，1987年，Academic Press社，サンディエゴ，カリフォルニア，参照）、
そして、この分野で知られた技法により、望ましいクローン化遺伝子を同定し単
離するプローブとして使用することができる。核酸ハイブリダイゼーション及び
クローン同定の技法はManiatis,T.等（分子クローン化，実験室マニュアル（Mol
ecular Cloning，A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor研究所，Cold Spr
ing Harbor，ニューヨーク（1982年））、及びHames,B.D．等，核酸ハイブリダ
イゼーション，実用的入門(Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approac
h,IRL Press社，ワシントンDC(1985年)）により開示されている。
オリゴヌクレオチドとPCRを用いるクローン化技法も又この分野でよく知られ
ている（”PCRプロトコール(PCR Protocols)”方法と応用への手引き(A Guide t
o Methods and Application),Innis等編集，Academic Press社，サンディエゴ（
1990年）。この様なハイブリダイゼーションが可能であると判明している上述の
遺伝子ライブラリーのこれ等のメンバーを、分析し、それらが含有する望ましい
ゲノムコード化配列の区域と本質を決定する。
望ましいDNAコード化配列の検出を容易にするために、上述のDNAプローブは検
出可能群で標識化される。その様な検出可能群は、検出可能な物理的又は化学的
性質を有するどんな物質でもよい。その様な物質は、核酸のハイブリダイゼーシ
ョンの分野でよく開発されてきており、一般的には、そんな方法で有用な各標識
の大部分は本発明に応用され得る。特に有用なのは、ジゴキシゲニン−核酸(dUT
P)の様な非放射性標識、又は、３２P，３H，１４C，３５S，１２５I、等の如き
放射性標識である。適切なシグナルを提供し十分な半減期を持つどんな放射性標
識も使用し得る。オリゴヌクレオチドは、この分野で知られた幾つかの方法で、
放射性又は非放射性に標識化してもよい、そして、この目的に合ったキットが市
販されている。
代わりに、ポリヌクレオチドも又、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素又は蛍光
体などの非放射性マーカーで標識すると、核酸ハイブリダイゼーションプローブ
として有用である。例えば、Leary,J.J．等，Proc.Nat1.Acas.Sci.USA 80:4045(
1983); Renz,M.等，Nuc1.Acids Res.12:3435(1984)及びRenz,M.,EMBO J.6:817(1
983)を参照。
要約すると、斯くしてタンパク質の配列（又はタンパク質の部分配列）を実際
に同定する事で、そんなペプチドをコード化し得る理論的な”最も可能性のある
”DNA配列、又は、一組のその様な配列の同定が可能になる。この理論的配列に
相補的なオリゴヌクレオチドを構築する事により（又は、一組の”最も可能性の
ある”オリゴヌクレオチドに相補的な一組のオリゴヌクレオチドを構築する事に
より）、同定のためのプローブとして機能し、タンパク質の遺伝子を含むクロー
ンの単離を可能にするDNA分子（又は一組のDNA分子）が得られる。
遺伝子をクローン化する代替法では、ライブラリーを調製するのに、発現ベク
ターを使って、DNA、又は更に好ましくは、望ましいタンパク質を発現し得る細
胞から調製したcDNAを、発現ベクター中にクローン化する。次いでタンパク質を
発現するメンバーを、例えば、そのタンパク質に対する抗体でライブラリーをス
クリーニングすることにより、スクリーニングする。
従って、上で論じた方法では、望ましいタンパク質又はそのタンパク質のフラ
グメントをコード化し得る遺伝子配列を同定する事が出来る。その様な遺伝子配
列を更に特性化し、そして、組換えタンパク質を作成する為には、それらの配列
がコード化するタンパク質を発現させる事が望ましい。その様な発現により、望
ましいタンパク質の特性を有するタンパク質を発現するところのクローンを同定
できる。その様な特性としては、そのタンパク質に対する抗体と特異的に結合す
る能力、そのタンパク質を結合し得る抗体の産生を引き出す能力、及び、受容細
胞にタンパク質特異的機能を付与する能力が含まれよう。
上述の方法により得られた、好ましくは、二重鎖形で得られたクローン化され
たタンパク質コード化配列は、発現ベクター中で転写発現を制御する配列に操作
可能的（機能的）に連結し、そして、Trichoderma宿主細胞中に導入し、組換え
タンパク質又はその機能的誘導体を産生する事が出来る。タンパク質コード化配
列のどの鎖を転写発現制御配列に操作可能的に連結するかによって、アンチセン
スRNAまたはその官能誘導体を発現することも又可能である。
DNAの様な核酸分子は、転写調節情報を含む発現制御配列を含有し、そして、
その配列がポリペプチドをコード化する核酸配列に”操作可能的に連結”してい
る場合は、ポリペプチドを発現することができるといわれている。
操作可能な連結とは、ある配列が、調節配列の影響下、又は制御下でその配列
が発現する様に、その調節配列と結ばれるような連結をいう。二つのDNA配列（
例えばタンパク質コード化配列とコード化配列の5'末端に連結したプロモーター
領域配列）が操作可能的に連鎖していると言われるのは、プロモーター機能の誘
導がタンパク質コード化配列mRNAの転写に到る場合、及び、一つのDNA配列間の
連結本質が、（１）フレームシフト型変異の導入に到らない、（２）mRNA、アン
チセンスRNA又はタンパク質の発現を指示する発現調節配列の能力を邪魔しない
、或いは、（３）プロモーター領域配列により転写されるべき鋳型の能力を邪魔
しない場合である。この様にして、もし仮にプロモーターが或DNA配列の転写を
もたらす能力があるとすると、そのプロモーター領域はそんなDNAに操作可能的
に連結しているとされるだろう。
遺伝子発現に必要である調節領域の正確な特性は種間又は細胞間で変わるかも
知れないが、一般的には、それぞれ転写と翻訳の開始に関与する５’非−転写配
列と5'非−翻訳（非−コード化）配列を含むであろう。
Trichoderma宿主中でのタンパク質発現はそんな宿主中で機能出来る調節領域
の使用を必要とする。一般的にTrichodermaは、例えば、他のフィラメント状真
菌の様な真核性宿主の転写制御体を認識するので、広く様々な転写化及び翻訳化
調節配列が使用され得る。転写が翻訳に連関していない真核生物では、その様な
制御領域はイニシェーターメチオニン(AUG)コドンを提供しても又はしていなく
てもよいが、それは、クローン化配列がその様なメチオニンを含むかどうかに係
っている。その様な領域は、一般的に、宿主でRNA合成の開始を指示するのに十
分なプロモーター領域を含む。
広く知られているように、真核性mRNAの翻訳は最初のメチオニンをコード化す
るコドンのところで開始される。この理由から、真核性プロモーターとタンパク
質又はその官能誘導体をコード化するDNA配列の間の連結は、メチオニンをコー
ド化し得る様な介在コドンを含んでいない事を確認するのが好ましい。その様な
コドンの存在は、融合タンパク質の形成か（もし、AUGコドンがタンパク質コー
ド化DNA配列として同じ読み枠にあれば）、又は、フレームシフト型変異（もし
、AUGコドンがタンパク質コード化DNA配列として同じ読み枠に無ければ）のどち
らかに到る。
IIc．調節領域
好ましい態様において、所望のタンパク質は、相同性（ホモローガス）Tricho
derma分泌シグナル配列が存在するために周りの培地中に分泌される。もし、望
ましいタンパク質がそれ自身のシグナル配列を持たないか、又は、その様なシグ
ナル配列がTrichoderma中でうまく機能しないとすると、そのタンパク質のコー
ド化配列を、Trichodermaに相同的か非相同的なシグナル配列に操作可能的に連
結してもよい。所望のコード化配列は、Trichoderma宿主からタンパク質を分泌
させるであろうどれかのシグナル配列、例えば、Trichodermaセルビオース分解
酵素Ｉタンパク質のシグナル配列と連結する。その様なシグナル配列は、シグナ
ルタンパク質配列がすぐ後の除去を受け易いように、特異的なプロテアーゼ部位
を持つ様に設計してもよい。
操作可能的に連結した遺伝子の発現が調節され得るように、抑制又は活性化を
させる転写開始調節シグナルを選択する事が出来る。興味深いことに、温度に敏
感な調節シグナルは、温度を変えることにより、発現が抑制又は開始されたり、
若しくは、例えば、基質か代謝物調節の如き化学調節を受けるようになる。又興
味深いことに、（ａ）望ましいタンパク質のmRNA及び（ｂ）セルラーゼ酵素を指
向するアンチセンスRNAの両方が転写可能型で提供されている構築体では、望ま
しいタンパク質のmRNAの発現は、宿主のセルラーゼ酵素の一つの発現に対してア
ンチセンスRNA抑制を伴うようになる。
アンチセンスRNA配列の発現が望ましいときには、翻訳シグナルは必要ではな
い。
所望により、タンパク質をコードしている配列の３’側の転写されない、そし
て／又は翻訳されない領域は、上述のクローン化方法で得られる。この3'−非転
写領域は其の転写停止調節配列要素のために保持されてもよく、３−非転写領域
は其の転写停止調節配列要素のために、又は、真核細胞中でポリアデニル化を指
示する要素のために保持されてもよい。
本発明のベクターは、エンハンサー配列の様な操作可能的に連結した調節要素
を更に含んでいてもよい。
IId.Trichodermaの安定形質転換体の検出
好ましい態様においては、Trichodermaの遺伝的に安定な形質変換体が構築さ
れ、タンパク質のDNAが宿主の染色体に組込まれる。望ましいタンパク質に対す
るコード化配列はどんなソースから取ってもよい。その様な組込みは、細胞内で
新規に起こってもよいし、或いは、最も好ましい態様においては、染色体中でDN
A配列の取込みを促進するDNA要素の如く、宿主染色体中にそれ自身で機能的に挿
入するベクターとの形質転換によって支援されてもよい。
導入されたDNAを染色体中に安定に取込んでいる細胞は、又、発現ベクターを
染色対中に含む宿主を選択させるような一つ以上のマーカーを導入することによ
り選択されるが、例えば、其のマーカーは抗生物質耐性の様なビオシド(biocide
）耐性、又は、銅のような重金属、等である。選択し得るマーカー遺伝子は、発
現されるべきDNA遺伝子配列に直接に連鎖されるか、又は、コトランスフェクシ
ョンにより同じ細胞中に導入される。
特定のプラスミドやウィルスベクターを選択するのに重要な因子は次のものを
含む：ベクターを含む受容細胞を認識しそしてベクターを含まない受容細胞から
選択する容易性；特定の宿主に望ましいベクターのコピー数；及び、異種の宿主
間でベクターを”シャトル”させるのに望ましいかどうか。
構築体（等）を含むベクター又はDNA配列が発現用として調製されると、このD
NA構築体（等）は、上述の形質転換を含む種々の適した手段のどれかで適切な宿
主中に導入される。ベクターの導入後、受容細胞が、形質変換細胞の成長を選び
出す選択的培地で増殖される。クローン化された遺伝子の配列（等）の発現は、
望ましいタンパク質の産生、又は、このタンパク質の断片の産生をもたらす。こ
の発現は形質変換細胞中で連続して、又は、制御下で行われる。
上述の方法で得られるDNAコード化配列は、定義では、望ましいタンパク質を
コード化し、そして、次いで望ましいタンパク質のアンチセンスRNA遺伝子配列
を得るのに使用され得るところの配列を提供するが、このアンチセンスRNA遺伝
子は、タンパク質核のmRNAを転写する鎖の反対鎖上に見出されるあの配列である
だろう。アンチセンスRNA鎖は、又、発現ベクターでプロモーターと操作可能的
に連鎖して、このベクターとの形質変換が、アンチセンスRNAの発現を形質変換
細胞内可能とする宿主に到るようになる。アンチセンスRNAとその発現は、内在
性DNAかRNAと交流して、高度特異的に遺伝子の転写又は形質変換を阻止又は抑制
する様に使用されてもよい。アンチセンスRNAを遺伝子発現の阻害に使用する
事はLichtenstein,C.,Nature 333:802(1988)で論じられている。
Trichodermaは、以下の理由から本発明の酵素製剤の合成に特に有用で実用的
な宿主である：Trichodermaは、例えば、40 g/L培養液の様な高い濃度が報告さ
れているように、大量にタンパク質を分泌する；相同性のTrichoderma cbh1プ
ロモーターは、Trichoderma宿主から分泌されるタンパク質の60%もの合成を標準
的に指示する強力な単一コピーなので、問題の遺伝子の発現に対して非常に強力
なプロモーターを提供する；この形質転換系は高度に多用性であり、問題の遺伝
子のどれにも適用し得る；このTrichoderma宿主は”動物細胞型”高級マンノー
ス糖鎖形成パターンを提供する；及び、Trichodermaの培養は、工業的規模の発
酵技法での以前からある幅広い経験で支えられている。
III．少なくとも一つのセルラーゼ酵素を欠損するTrichoderma宿主
本発明によれば、Trichoderma宿主を強化して、酵素に、少なくとも一つのセ
ルラーゼ酵素を不活性化するか除去することでパルプ及び製紙加工に望ましい活
性を持たせる事もまた可能である。一つの態様においては、cbh1遺伝子は単に変
異させられている。Trichodermaから分泌されるタンパク質の大多数は、cbh1遺
伝子が不活性形に変異されたTrichoderma宿主を構築する事により、遺伝子cbh1
、（セルビオース加水分解酵素，CBHI，タンパク質）、でコード化されたセルラ
ーゼ活性体であるので、Trichodermaにより培地に分泌される残存タンパク質の
相対パーセントを増加させてもよい。もう一つの態様においては、望ましい遺伝
子は好ましくはcbh1 座に挿入されて、望ましい遺伝子の発現が強力なcbh1プロ
モーターに操作可能的に連鎖する様にしている。高度に好ましい態様においては
、相同性cbh1プロモーターに既に操作可能的に連鎖した望ましい遺伝子から成る
ところのカセットがcbh1座に挿入される。本発明の宿主においては、どの一つの
、幾らかの、又は全てのセルロース分解酵素は、宿主がセルロースをグルコース
に分解する能力を部分的又は完全に無くするように、この分野で知られた方法に
より除去、減少、不活性化又は抑制されてもよい。幾つかの方法により、例えば
、その酵素をコード化する遺伝子（等）を不活性化することにより（例えば、フ
レームシフト変異を遺伝子に導入することにより）、完全に全部の遺伝子又は遺
伝子の大きい分節を消去することにより、遺伝子を相同的組替えを経て他
の遺伝子と置き換えることにより、遺伝子領域の補償により、追加の組込みによ
り、二重乗換えにより、及び、遺伝子をコード化する配列に対して指示するアン
チセンスRNAを発現し得る遺伝子構築体と宿主細胞を形質変換することにより、
等により、望ましくないセルロース分解酵素活性は、除去、減少、不活性化又は
抑制され得る。
例えば、セルロース分解酵素活性をコード化する遺伝子の不活性化は、欧州特
許申請EP137,280及びEP 244,234に記述されている様に実施してもよい。
Trichoderma真菌は、種々の変異処置に優れた材料を構築するところの理想的
で、単相支配的な単一核性分生子を、大量に産生する。如かしながら、単相変異
核でも、変異がＤＮＡ二重らせんの二つの鎖だけに初期に固定している場合には
（モザイク現象）、異核共存体性コロニー（菌糸体）を産生する亭が出来る。モ
ザイク変異株の量は、用いた変異原と投与量により決まる。真菌を形成する単相
単一核性分生子においては、異核共存体性菌糸体の問題は、分生子化をさせる事
により、そして、単一な別の分生子に由来するコロニーの再単離により解決し得
る。このサイクルは数回繰り返し得る。
本発明のTrichoderma宿主に突然変異を起こす(mutengenizing)のに有用な化学
変異原は、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エ
チルメタンスルホネート(EMS)及びジエチルスルフェイト(DES)のようなアルキル
化剤である。ヒドロキシルアミン、及び亜硝酸のようなDNA塩基を脱アミノ化す
る化学薬品もまた有用である。電離放射線（γ一及びＸ−線）並びに紫外線照射
(UV)は、Trichoderma株突然変異誘発で有用な物理的誘発原である。
固体培地の使用は、突然変異分生子から発生する数千のコロニーから特異的酵
素の存在と不在を素早くスクリーニングさせ、そして、産生した酵素量の定量的
評価を可能にする。例えば、細胞外アミロース分解酵素、ペクチナーゼ、プロテ
アーゼ、キチナーゼ、β−ガラクトシダーゼとセルラーゼ、リパーゼ、ウレアー
ゼ、RNA分解酵素及びDNA分解酵素などの酵素を検出する数個の型の固体培地がこ
の分野で知られている。
固体培地上で増殖させたときには、多くの真菌は大きい分散型コロニーを形成
する。コロニー増殖に制限的な化学薬品の添加は、それ故に、一つの平板あたり
一つ以上（100以下）のコロニーを発生させるのに望ましいであろう。多くの薬
剤の中でこの目的に使用されるものは、ローズベンガル、オキシガルとホスホン
D(oxgall and phosphon D）、トライトンX-100及びサポニンである。幾らかの真
菌については、細菌で開発されたものに相似のレプリカ平板技法が、ある場合に
は用いられ、異なった増殖培地上の真菌コロニーの性質を試験する。平板上での
スクリーニングの後には、一般的には、酵素活性の測定の為に、液体生産培地を
入れた振とうフラスコ中で、選択したコロニーを培養する。振とうフラスコ規模
で高い酵素活性を示す最良の分離株は、望ましければ、第二段の変異原処理にか
けてもよい。
本発明により不活性化又は消去するのが望まれる相同遺伝子としては、例えば
、セルラーゼ遺伝子，cbh1,cbh2,eg11,eg12（以前はeg13;Saloheimo等，Gene63:
11-21(1988)） （タンパク質、セルビオース加水分解酵素Ｉ、セルビオース加
水分解酵素II、エンドグルカナーゼＩ及びエンドグルカナーゼIIをコード化する
）、或いは、これらの遺伝子の組み合わせが挙げられる。これらの酵素のうちの
何れかの活性を除去すると、セルロースをグルコースに分解する能力を部分的に
又は完全に欠損する宿主が得られる。セルロース分解活性のそんな除去は、遺伝
子を除去するか又はそれを発現不能形に修飾するかにより、ゲノムレベルで達成
し得る。その様な除去は、ハイブリッドRNAの翻訳を阻止する程度にタンパク質
をアンチセンスRNAにコード化するようなmRNAをハイブリッド化する事によって
、翻訳レベルでも達成し得る。
好ましい態様においては、幾らかの然し全部ではないセルラーゼ成分が不活性
化される様に、セルラーゼ活性が選択的に不活性化される。例えば、β−グルカ
ンを加水分解する宿主の能力を保持するのが望ましいならば、エンドグルカナー
ゼ遺伝子は不活性化されることは無い。
例えば一つのセルラーゼ遺伝子の不活性化は、特許申請EP 244,234に記述され
ているように、欠損遺伝子を運ぶプラスミドとのTrichoderma reeseiの形質変換
に基づく事が出来る。染色体セルラーゼ遺伝子座におけるプラスミドの相同組替
えは、内在性T.reeseiセルラーゼ遺伝子の挿入不活性化を引き起こす。形質変換
に使用されるプラスミドはセルラーゼコード化領域の部分のみを含み、不
活性なタンパク質を産生する。5'フランキング配列はどれも含まれない。フレー
ムシフト変異はまた切断したコード化領域に導入し得る。選択マーカー、（例え
ば、amdS（アセタミダーゼ）かargB（オルニチン カルバモイル転移酵素）），
又は、スクリーニング用マーカー（例えば、1acZ）は、形質変換に用いられたプ
ラスミドに連関させ得るし、又は、この形質変換を共形質変換としても成し得る
が、これは選択可能マーカーと欠損遺伝子が異なったプラスミドに在る事を意味
する（EP 244,234)。遺伝子の相同組換えによる不活性化は環状DNAでも成し得る
が、これは、Trichoderma染色体DNA中に共線的に組込んでいる。
望ましくない遺伝子の欠失は、原理を図１に説明している戦術を用いて成し得
る。受容株は線状DNA断片で形質変換されるが、これには選択可能マーカー遺伝
子(trpC,argB又はamdSのような）、及びに／又は、欠失さるべき遺伝子の5'と3'
フランキング領域によりフランクされた発現さるべき望ましい異質の問題遺伝
子が含まれる。A座における相同組換えは、斯くして、A遺伝子が選択マーカー、
及び／又は、望ましい遺伝子Bで置換される事に繋がる。もしも形質変換断片に
おける5'領域がプロモーター区域から上流に取られるとすると、プロモーターも
又、できた置換株で除去されるであろう。遺伝子AはどのTrichoderma遺伝子でも
よく、そのフランキング領域はクローン化／分離され得る。さらに、線状DNA断
片は連結されて環状プラスミドを形成する事が出来るし、又それに加えて、その
環状形は細菌で（例えば、E.coliで）複製に必要なDNAを含んでもよい。望まし
くない遺伝子の欠失に用いた線状DNA断片は、例えばpUC19から構築され得る(Yan
nish-Perron等，Gene 33:103-119(1985)）。
この方法はさらに詳しく例1Bにおいて説明されているが、ここでは、本方法に
よりTrichodermaのゲノムからのcbh2遺伝子の欠失が述べられている。
セルラーゼタンパク質のクローンが記載されているが、これを、本発明の宿主
において相同配列の不活性化の為の変異配列を設計するのに使用してもよい。タ
ンパク質活性の不活性化をもたらす変異配列のどれを使用してもよい。例えば、
天然のセルビオース加水分解酵素CBHI配列のための遺伝子は、Shoemaker等（Sho
emaker,S.等,Bio/Technologyl:691-696(1983))とTeeri等（Teeri,T.等，Bio/Tec
hnology 1:696-699(1983)）によりクローン化されていて、そし
て、遺伝子の全体のヌクレオチド配列が知られている（Shoemaker,S.等，Bio/Te
chnology1:691-696(1983))。T.reesiからは、主エンドグルカナーゼ（EGI）のた
めの遺伝子がクローン化され特徴付けされている（Penttila,M.等，Gene 45:253
-263(1986); EP 137,280; Van Arstel,J.N.V．等，Bio/Technology 5：60-64）
。他の分離されたセルラーゼ遺伝子は、cbh2（特許申請WO 85/04672; Chen,C.M
．等，Bio/Technology 5:274-278(1987)）及びeg12（元はeg13(Saloheimo,M.等,
Gene 63: 11-21 (1988))である。
IV．酵素製剤
本発明によって、パルプ及び製紙加工に望ましい高水準のタンパク質、好まし
くはヘミセルラーゼ、を生産する方法が提供されている。又、セルロース分解活
性を部分的に又は完全に欠損し（即ち、セルロースをグルコースに完全に分解す
る能力において）、且つ、パルプ及び製紙加工に望ましいタンパク質、好ましく
は、ヘミセルラーゼが強化された酵素製剤を生産する方法が提供されている。”
セルロース分解能力を欠損した”とは、セルロースをグルコースに分解する生産
能力が減少、低下、下落、又は、抑制している事を意味する。この様な製剤は本
発明の宿主から直接に得てもよい。さらに、もしも望ましい活性体が一つ以上の
組換え宿主に存在すれば、その様な製剤は適切な宿主から単離されて、本発明で
の使用前に組合わされる。
予見するに、特異的な酵素活性が強化された、又は、部分的か完全に欠損した
酵素製剤は、パルプや製紙工業における、並びに、飼料製造における種々の応用
においては特異的な使用要求を満足させるように提供されるだろう。酵素活性体
を上述のように添加又は削除して、望ましい活性を提供または除去または低下さ
せてもよい。例えば、もし意図する応用がパルプのメカニカルマス(mechanicalm
ass）強度の改善であるならば、本発明の酵素製剤は、セルロース繊維を結びつ
ける能力を高め又は助長する酵素を提供するだろう。同様に、パルプ縮充の応用
では、本発明の酵素製剤はそんな膨潤を高め又は助長する酵素を提供するだろう
。
本発明の酵素製剤を得るためには、望ましい性質を持つ上述の組換え宿主（即
ち、一つ以上のセルラーゼ酵素を発現するのが実質的に不能な、そして、望まし
い酵素を発現できる）が適切条件下に培養され、望ましい酵素はTrichoderma宿
主から培地に分泌され、そして、この分野で知られた方法により培地から酵素製
剤が回収される。
この酵素製剤は、Trichoderma株を望ましい性質を有する発酵槽中で培養する
事により生産され得るが、用いる液体培地例は、例えば、6%Solka Flocセルロー
ス(BW40,James Riverコーポレーション，ハッケンサック，ニュージャージー）
，3%蒸留酒用の麦芽かす，0.5%KH2 P04，0.5%(NH4）2S04、及び、泡止め剤とし
て０．１％スクルトール（スクルトール SB2023,Schill&Seilacher社，ハンブ
ルグ，ドイツ連邦共和国）である。Trichoderma株のセルラーゼ産生はグルコー
ス抑制に敏感であり誘導物質を必要とする（セルロース、ラクトース又はソホロ
ース）（Allen等，Biotechnology and Bioenginerring 33:650-656(1989)）。ｐ
Ｈは、好ましくは、リン酸又はアンモニアの添加により約ｐＨ５に保ち、温度は
培養中には３０℃に保つ。しかしながら、温度は株によって又生産される酵素製
剤によって調製してもよい（Ｍerivouri等，Biotechnology Letters 12(2)：117
-120(1990））。
酵素製剤は、培地からこの分野でよく知られた方法を使用して回収される。し
かしながら、本発明の宿主は部分的又は完全にセルラーゼ活性を欠損しているの
で、本発明の酵素製剤はさらに精製しないで直接に使用してもよく、本発明の一
つの利点である。望ましければ、その様な製剤を凍結乾燥してもよく、又は、さ
もなくばこの活性を濃縮し、及び／又は、保管のために安定化してもよい。本発
明の酵素製剤は非常に経済的に供給され使用されるが、その理由は、（１）酵素
は粗製の形で使用してもよい；特定の酵素を培地液から単離する必要が無い、及
び、（２）酵素製剤は培地に分泌されるので、培地だけを回収すると望ましい酵
素製剤が得られる； Trichoderma宿主から酵素を抽出する必要はない、である。
望ましければ、発現したタンパク質は従来の条件に従って精製してもよいが、
その方法としては、抽出、沈でん化、クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、電気泳動、等がある。
本発明のTrichoderma及び酵素製剤は飼料製造においてさらに応用される。例
えば、本発明の酵素製剤で処理した飼料は、消化され易いため、飼育動物に多大
の食糧利点をもたらすであろう。
本発明は以下の実施例でさらに詳しく説明されるが、これらの実施例は本発明
の少数の具体的応用を示すにすぎない。幾らかの同様な応用を創造する事は、こ
の分野での熟練者にとって自明のことである。従って、この実施例は、本発明の
範囲を狭めるために理解されるべきではなく、単に本発明の用途を明らかにする
にすぎない。
実施例
材料および方法
Ｔ．レエセイの形質転換
Ｔ．レエセイの形質転換およびＡｍｄＳ+およびＡｍｄＳ-形質転換細胞の選択
はペンティーラら、ジーン第６１巻第１５５−１６４頁（１９８７年）に記載と
同様に行った。フィレオマイシン抵抗性形質転換細胞はデュランドら、イン：バ
イオケミストリー・アンド・ジェネティックス・オブ・セルロース・ディグラデ
ーションｐｐ．１３５−１５１（１９８７年）、ジェイーピー・オウバート、ピ
ー，ビグインおよびジェイ，ミレット（編）、アカデミック・プレス、ニューヨ
ークに記載と同様にしてスクリーニングした。
ｐ３ＳＲ２およびｐＡＭＨ１１１の同時形質転換はプラスミドＤＮＡ（５−１
０μｇ）と等量を用いた。フィレオマイシン抵抗性を確認する形質転換において
、用いたプラスミドＤＮＡの相対量はｐＡＭＨ１１１およびｐＡＮ８−１につき
それぞれ１：１または２：１であった。同時形質転換をｐ３ＳＲ２およびｐＭＳ
４を用いて行うとき、プラスミドｐＭＳ４を３−４倍モル過剰に添加した。形質
転換細胞は分生子によって精製した；すなわち、分生子懸濁液をすべてのコロニ
ーが１個の分生子から出発するように選択培地上に再び置いた。
鎖状ＤＮＡによる形質転換においては、ＤＮＡの使用量は２から５μｇの範囲
である。選択マーカー（ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ））またはａｒｇＢ（オル
ニチンカルバモイル・トランスフェラーゼ、ＯＴＣａｓｅ，．Ｅ．Ｃ．２．１．
３．３）またはｔｒｐＣ（トリプトファン）は形質転換フラグメント内に存在す
る。
ＤＮＡの分離および分析
Ｅ．コリからのプラスミドＤＮＡは標準法を用いて分離した（マニアチスら（
１９８２年）、モルキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク）。染色体ＤＮＡはレイダーおよびブロダ、Lett.Appl.Micr
obiol．第１巻第１７−２０頁（１９８５年）の方法を用いてＴ．レエセイから
分離した。サザンおよびノーザーンハイブリダイズは標準的技術（マニアチスら
、
上掲、１９８２年）により行った。ウエスタン・ブロッティングはマニアチス（
マニアチスら、上掲、１９８２年）により行った。
トリコデルマのための液体培養培地および条件
すべてのトリコデルマ液体培養はベイリーおよびネバレイネン、エンザイム・
アンド・マイクロビアル・テクノロジー第３巻第１５３ー１５７頁（１９８１年
）に記載と同様にポテトデキストロース寒天上で生長させた分生子柄から出発さ
せた。振盪フラスコ中液体培養は、フィンフロクをソルカ・フロク・セルロース
に置換した以外はベイリーおよびネバレイネン、エンザイム・アンド・マイクロ
ビアル・テクノロジー第３巻第１５３−１５７頁（１９８１年）に従って行った
。発酵容器培養に用いた培地は６％ソルカ・フロク・セルロース、３％蒸留器使
用ずみ穀物（distiller's spent grain)、０．５％ＫＨ2ＰＯ4、０．５％（ＮＨ4
）2ＳＯ4および０．１％ストルクトルを含む。ｐＨはりん酸またはアンモニア
の添加により４．０および４．８間に保った。発酵は３０℃にて行った。酵素の
最大収率は実験室発酵において５日、１００リットル発酵容器規模では４日で得
られた。
酵素検定
すべての酵素活性の検定は２０分３０００ｒｐｍにての遠心分離により菌糸体
除去後の培養上清画分で行った。基質（ＨＥＣ、ミッテルフィスケス、フルカＡ
Ｇ５４２９０、工業用）としてヒドロキシエチルセルロースを用いるエンドグル
カナーゼ活性はベイリーおよびネバレイネン、エンザイム・アンド・マイクロビ
アル・テクノロジー第３巻第１５３−１５７頁（１９８１年）およびコミッショ
ン・オン・バイオテクノロジー，インターナショナル・ユニオン・オブ・ピュア
・アンド・アプライド・ケミストリー；メジャーメント・オブ・セルロース・ア
クティビティズ，バイオケミカル・エンジニアリング・リサーチ・セントル，イ
ンディアン・インスティトュート・オブ・テクノロジー、ニューデリー１００１
６、デリー（１９８４年）に記載と同様にして測定し、基質としてかばのキシラ
ン（ロス番号７５００）を用いるキシラナーゼ活性はベイリーら、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー第２３巻第２５７−２７０頁（１９９２年）に記載と同
様にして測定した。ＴＣＡ沈降蛋白質は、標準としてうし血清アルブミンを用い
るロウ
リーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第１９３巻第２６５
−２７５頁（１９５１年）の方法により検定した。フィルター・ペーパーに対す
るセロビオヒドロラーゼ活性(filter paper unit、 FPU)はコミッション・オン・
バイオテクノロジー，インターナショナル・ユニオン・オブ・ピュア・アンド・
アプライド・ケミストリー；メジャーメント・オブ・セルロース・アクティビテ
ィズ，バイオケミカル・エンジニアリング・リサーチ・セントル，インディアン
・インスティトュート・オブ・テクノロジー、ニューデリー１００１６、デリー
（１９８４年）に記載と同様にして測定した。
エンドグルカナーゼＩのＥＬＩＳＡ検定
培養上清画分中のエンドグルカナーゼＩ蛋白質の濃度は２抗体サンドイッチＥ
ＬＩＳＡによって測定した。検定は３７℃にて（特に断らないかぎり）９６−ウ
エル平底マイクロタイタープレート中で行った。０．０５％ツイーン２０および
０．０２％アジ化ナトリウム（ＰＢＳ／ツイーン）を含むりん酸緩衝食塩水にて
３回洗浄して終了させた。
エンドグルカナーゼＩに対するマウスモノクローナル抗体（抗−ＥＧＩ抗体Ｅ
Ｉ−２）にて一夜４℃にて平板を被覆した。プラスチック表面の非被覆部位をＰ
ＢＳ／ツイーン中１％ＢＳＡにて１時間かけてブロックした。適当に希釈した培
養上清画分および精製エンドグルカナーゼＩを添加し、２時間インキュベートし
た後、エンドグルカナーゼに対する兎ポリクローナル抗体で２時間インキュベー
トした。結合した兎抗体をアルカリホスファターゼ（オリオン・ディアグノステ
ィカ、エスプー、フィンランド）に結合させた兎ＩｇＧに対する豚ポリクローナ
ル抗体とインキュベートすることにより検出した。最終段階で、ｐ−ニトロフェ
ニルホスファート（１mg/ml）を添加し、２ＮＮａＯＨを用いて室温にて３０分
後反応を終了させた。発色させた黄色を４０５ｎｍにて吸光光度測定した。培養
上清画分のエンドグルカナーゼ濃度はそれらのＯＤ405値と精製エンドグルカナ
ーゼＩを用いて同時に同平板上で行って作製した標準希釈曲線と比較して算出し
た。
等電点クロマトグラフィーによる培養上清の分画
クロマトグラフシステムは等電点クロマトグラフィーのためのモノＰ ＨＲ５
／２０カラムを備えたファルマシアＦＰＬＣ装置からなる。樹脂は２５ｍＭビス
トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．５にて安定させた。振盪フラスコ中Ｔ．レエセ
イにより産生させた粗酵素混合物を同じ緩衝液にて１mg/mlの蛋白質含有になる
ように希釈した。５００μ１酵素試料をカラムに注入し、ファルマライト／ポリ
バッファ（ファルマシア、全１００ml中１mlファルマライト（商品名）２．５−
５および５mlポリバッファ（商品名）ＰＢ７４、ＨＣ１にてｐＨ３．０に調整）
にて、６．５から３．０のｐＨ勾配を形成させて溶出させた。流速は３０ml／時
であった。カラム溶出液は６００μｌずつ分画し、ｐＨおよびＥＧＩ活性を測定
した。
実施例１
トリコデルマ・レエセイ・エンドキシラナーゼII（ｐＩ９）遺伝子、ｘｌｎ２の
クローニング、配列決定および増強発現
この実施例に示された結果において、ｐＩ９．０エンドキシラナーゼをコード
しているトリコデルマ・レエセイ・ｘｌｎ２遺伝子を野生型株ＱＭ６ａから分離
した。この遺伝子は１０８個のヌクレオチドのイントロンを含み、推定２個のＮ
−グリコシル化標的部位が見られる２２３個のアミノ酸の蛋白質をコードしてい
る。３個の異なるＴ．レエセイ株がｘｌｎ２遺伝子とそのためのプロモーターで
構成された構築物を内因性ｃｂｈ１座を標的として形質転換された。キシラナー
ゼの最高最終収率濃度は、宿主として遺伝子工学株であるＴ．レエセイＡＬＫＯ
２７２１を用いたときに得られた。ｃｂｈ１座中への組込みはｘｌｎ２プロモー
ターのもとでの増強発現のために必要ではない。
材料および操作
菌、プラスミドおよび生育条件
プラスミドはエシェリキア・コリ株ＸＬ１−ブルー（ブロック，ダブリュー・
オーら、バイオ／テクニク第５巻第３７６−３７８頁（１９８７年））またはＥ
．コリＩＮＶＩαＦ’（インビトロジェン、アメリカ合衆国カリフォルニア州サ
ンディエゴ）中で増殖させた。ｘｌｎ２遺伝子の受容菌は高セルラーゼ産生変異
体
であるＴ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５（ベイリーおよびネバレイネン、エ
ンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第３巻第１５３ー１５７頁（
１９８１年））、ＡＬＫＯ２７２１およびＡＬＫＯ２２２１であった。Ｔ．レエ
セイＡＬＫＯ２２２１は、ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５株の低プロテアーゼ突然変異
体である。Ｔ．レエセイＡＬＫＯ２７２１は、ｃｂｈ２座がアスペルギルス・ニ
デュランスのｔｒｐＣ遺伝子で置換されたＶＴＴ−Ｄ−７９１２５のｔｒｐＣマ
イナス（ｔｒｐＣ-）ＵＶ突然変異体である（イエルトン，エム・エムら、プロ
スィーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスィズＵＳ
Ａ第８１巻第１４７０−１４７４頁（１９８４年））。この株はまたｔｒｐＣ遺
伝子の数個の他の組込みコピーをもっている。
今回の研究で用いられたプラスミドはｐブルースクリプト（ストラタジーン、
アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）、ｐＣＲ１０００（インビトロ
ジェン）およびｐＵＣ１９（ヤニッシューぺロン，シーら、ジーン第３３巻第１
０３−１１９頁（１９８５年））である。選択可能なマーカーである、ａｍｄＳ
は、ハイネス博士の好意により供与されたプラスミドｐ３ＳＲ２（ケリーおよび
ハイネス、ヨーロピアン・モルキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・
ジャーナル第４巻第４７５−４７９頁（１９８５年））に由来するものである。
ｃｂｈ１フランキング領域は、プラスミドレスキューを用いてＴ．レエセイ株Ａ
ＬＫＯ２４６６（ハルッキ，エイら、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テ
クノロジー第１３巻第２２７−２３３頁（１９９１年））から分離された。
Ｅ．コリ培養物は、必要ならばアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したＬ
ーブロス（マニアティス，ティら、モルキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド
・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年））中で３７℃にて一夜生
長させた。ＰＤ（ポテト・デキストロース・ブロス、アメリカ合衆国デトロイト
，ディフコ）寒天斜面をトリコデルマ株の生育に用いた。キシラナーゼ産生のた
めに、Ｔ．レエセイ株を、４％乳漿、１．５％複合窒素源、１．５％ＫＨ2ＰＯ4
および０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ3を含むセルラーゼーおよびキシラナーゼ誘導培
地（ｐ
Ｈ５．５）の振盪フラスコ（３０℃、２５０ｒｐｍ）中で７日間生長させた。
ぺプチド消化およびアミノ酸配列決定
Ｔ．レエセイ（ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５）からの精製キシラナーゼII（テンカ
ネン，エムら、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第１４巻第
５６６−５７４頁（１９９２年））は、１％（w/v）炭酸水素アンモニウム中２
％（w/w）トリプシン（ＴＰＣＫ−処理済、アメリカ合衆国ミズーり州セントル
イス、シグマ・ケミカル・カンパニー社製）で３７℃、２．５時間消化させた。
３％（w/w）トリプシンを添加後インキュベーションを一夜（１３時間）継続
させた。ペプチドはレックスクロム・プレプ−５／３００−０ＤＳ逆相カラムの
高性能液体クロマトグラフィーを用いて分離させた。６０分２４℃にて０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有５％(v/v)アセトニトリル（ΛＣＮ）から０．
０６％(w/w)ＴＦＡ含有６０％(v/v)ＡＣＮへの直線溶媒勾配にて１ｍｌ／分の速
度で溶出させた。２１８ｎｍにおける吸収を測定した。アミノ−末端配列決定の
前に、１０μのキシラナーゼIIを、ＥＤＴＡ１０ｍＭおよびＤＴＴ５ｍＭを含む
１００ｍＭりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１Ｕのピログルタメート
アミノペプチダーゼ（ベーリンガー・マンハイム、ドイツ，マンハイム）で３７
℃にて一夜処理した。蛋白質およびペプチドのアミノ−末端は、気体−パルス−
液体−相シークエンサー（カルキネンおよびティルグマン，ジェイ、プロテイン
・ケミストリー第７巻第２４２−２４３頁（１９８８年））中でそれらを分解さ
せて配列決定した。遊離したＰＴＨ−アミノ酸は小内径逆相ＨＰＬＣを用いてオ
ンライン分析した。
ＤＮＡ操作および形質転換
マニアティス，ティら、モルキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年）記載の標準ＤＮＡ操作をＤＮＡ構
築に用いた。プラスミドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡは製造者の指示書に従って
キアガンカラム（ダイアゲン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハ
フツング、ドイツ，デュッセルドルフ）を用いて分離した。
Ｅ．コリはハナハン，ディ、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー
第１６６巻第５５７−５８０頁（１９８３年）に従って形質転換され、Ｔ．レエ
セイ株は下記のような修正を加えてペンティーラ，エムら、ジーン第６１巻１５
５−１６４頁（１９８７年）記載の方法により形質転換された：プロトプラスト
を、形質転換前に熱ショック処理し（バージェスおよびバロー、ジャーナル・オ
ブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー第１３５巻第６０１−６０４頁（１９８
９年））、２５％ＰＥＧ6000を６０％ＰＥＧ4000に置換し、形質転換は氷上温度
ではなく室温で行った。形質転換細胞はＰＤ斜面に移す前に、選択的アセトアミ
ド−ＣｓＣ１板上の分生胞子（ペンティーラ，エムら、ジーン第６１巻１５５ー
１６４頁（１９８７年））によって精製した。
ＲＮＡ分離、Ｔ．レエセイ
ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５キシラナーゼ誘導培地の発酵容器中で３日間培養させ
た。菌糸体を回収・凍結し、液体窒素下微粉末に粉砕した。バーテルズおよびト
ンプソン、ヌクレイック・アシド・リサーチ第１１巻第２９６１−２９７８頁（
１９８３年）に記載と同様にしてプロテイナーゼＫ消化、フェノール抽出および
オリゴｄＴ−セルローズ精製を用いて、総ＲＮＡ、ついでｍＲＮＡを分離した。
得られたｍＲＮＡはＤＭＳＯ−スクロース勾配遠心分離を用いて、サイズ分画し
た（ボードカー，エイチら、バイオケミストリー第１５巻第４７６５−４７７０
頁（１９７６年））。
キシラナーゼＩＩｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡの第１鎖はｃＤＮＡ合成キットを用いて（ベーリンガー・マンハイム
）、オリゴｄＴ−プライマーをハイブリットｄＴ17−アダプター・プライマー（
５’ＧＡＣ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＡＴＴ−ＣＡＴ−ＣＧＡ−ｄＴ17３’）［配列番
号５］に置換して、ｍＲＮＡ１μｇを用いて調製した。このｃＤＮＡは、ペプチ
ド配列から推定される遺伝子特異的プライマー（センス５’ＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ）
−ＴＧＧ−ＣＡ（Ａ／Ｇ）−ＣＣＮ−ＧＧＮ−ＡＣＮ−ＡＡ ３’）［配列番号
６］およびそのアダプタープライマー（５’ＧＡＣ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＡＴＴ−
ＣＡＴ−ＣＧＡ３’）［配列番号７］を目的とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）
増幅（フロウマン，エム・エイ、「レース：ラピド・アプリケイション・オブ・
ｃＤＮＡ・エンズ・イン・ＰＣＲ・プロトコル」、イニス，エム・エイら編、ア
カデミック・プレス・インコーポレイテッド社製、カリフォルニア州サンディエ
ゴｐｐ．２８−３８（１９９０年））の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応混合物は
１：２５希釈ｃＤＮＡ５μ１、各プライマー１００ピコモル、ｄＮＴＰ５μＭ、
１×ＰＣＲ緩衝液およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム
）１．５単位を含む。プログラム可能な熱コントローラー（Ｍ．Ｊ．リサーチＩ
ｎｃ．）中での増幅は、９５℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の３０
サイクルからなる。最後のサイクル後伸長期間を１０分間延長した。得られたＰ
ＣＲフラグメントは製造者の指示書に従ってＴＡクローニングキット（インビト
ロジェン）を用いてクローニングし、配列決定によって確認した。
ｘｌｎ２遺伝子の分離
Ｔ．レエセイＱＭ６ａ（マンデルスおよびリース、ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー第７３巻第２６９−２７８頁（１９５７年））のゲノムコスミドライ
ブラリー（スオミネンら、ＭＧＧ，インプレス）を販売者（ドイツ，ベーリンガ
ー・マンハイム社）の指示書に従って、キシラナーゼIIＰＣＲプローブとハイブ
リダイズさせることによってスクリーニングした。
ヌクレオチド配列決定
ヌクレオチド配列決定のための鋳型を、ｐブルースクリプトＥｘｏ／Ｍｕｎｇ
ＤＮＡ配列決定機（ストラタジーン）の製造者の指示書に従って一定方向の削除
によって製造した。ＤＮＡは、販売者の指示書に従って、蛍光標識Ｔ７およびＴ
３プライマーおよびＴａｑサイクル配列決定法に基づくＡＢＩ（応用バイオシス
テムズ、アメリカ合衆国フォスター・シティ）キットによって両方向に配列決定
した。配列決定反応はＡＢＩ３７３Ａ配列決定機により分析した。
酵素およひ蛋白質検定
酵素は菌糸体を除いた後の培養上清から検定した。基質としてカバのキシラン
（ロス７５００）を用い、ベイリー，エム・ジェイら、ジャーナル・オブ・バイ
オテクノロジー第２３巻第２５７−２７０頁（１９９２年）に記載の方法によっ
て、キシラナーゼ活性を測定した。セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）蛋白の
産生はＣＢＨＩ特異的モノクローナル抗体ＣＩ−８９およびＣＩ−２６１（エイ
ホ，エスら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー第２００巻
第６４３−６４９頁（１９９１年））を用いてウエスタンブロットまたはドット
ブロットによって検出した。
結果
精製キシラナーゼIIから数個のトリプシンのペプチドが得られ、直接配列決定
した（ペプチド配列の図３参照）。しかしながら、本来の蛋白質のアミノ末端配
列は検出されず、それが保護されていることを示唆するものである。ピログルタ
メートアミノペプチドで処理した後、（Ｑ）Ｘ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ［配列番号８］が得られた。ピログルタメ
ートアミノペプチド処理試料の最初のアミノ酸（Ｘ）はＨＰＬＣのクロマトグラ
ムのピークが重なっており不明確なために決定できなかった。
Ｔ．レエセイｘｌｎ２ｃＤＮＡのクローニング
Ｔ．レエセイ培養物中のキシラナーゼII特異的ｍＲＮＡの蓄積は、プローブと
してペプチド（図３中二重下線で示した）から推定されるヌクレオチドオリゴマ
ーを用いてノーザーンハイブダイゼーションによって決定した。結果は３日間生
長させた菌糸体中キシラナーゼIIｍＲＮＡがもっとも豊富であり、キシラナーゼ
II特異的ｍＲＮＡの大きさは約０．７ｋｂであった（データは示さず）。
キシラナーゼII特異的オリゴマー（上記参照）プライマーおよび非特異的ｄＴ
−アダプタープライマーをｃＤＮＡの第１鎖からキシラナーゼ配列の増幅に用い
た。ＰＣＲ反応で合成されたフラグメントの最も長いものを含む、サブクローン
ｐＡＬＫ５６４のヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は直接配列決定
によって得られた数個のキシラナーゼIIペプチド配列を含む。これはＰＣＲクロ
ーンがキシラナーゼIIをコードしていることを確認するものである。
Ｔ．レエセイのｘｌｎ２遺伝子の分離およびヌクレオチド配列
ｐＡＬＫ５６４のインサート（インサート＝ＰＣＲ合成ｘｌｎ２ｃＤＮＡ）と
のハイブリダイズによりＴ．レエセイのゲノムコスミドライブラリーから４種の
クローンを分離した。サブクローン、ｐＡＬＫ４７５は、ｐＵＣ１９ベクター中
のコスミドクローンからの、ハイブリダイズしている５．７ｋｂＫｐｎＩを含み
、制限酵素切断地図によって分析した（図２）。ｐＡＬＫ４７５からのハイブリ
ダイズしている２．３ｋｂＨｉｎｄIII、１．５ｋｂＨｉｎｄIII／ＸｈｏＩおよ
び１ｋｂＸｈｏＩをサブクローンし、部分的に配列決定し、ｘｌｎ２遺伝子を明
らかにした。
ｘｌｎ２遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図３に示す。ＴＡＴ
Ａボックスに類似する配列がＤＮＡのＡＴＧから−１４０ヌクレオチドの距離に
見られた（図３）。最初の翻訳開始部位（ＡＴＧ）は、糸状菌および他の真核生
物中に見られる非常に良く保存され一致する配列５’ＣＡＣ／ＡＡ／ＣＡＴＧ３
’（バランス，ジェイ・ディ、モルキュラー・インダストリアル・ミコロジー中
、「糸状菌のための形質転換システムおよび真菌類遺伝子構造の概要」：糸状菌
のためのシステムおよび応用、レオンおよびバーカ編、マーセル・デッカー・イ
ンコーポレイテッド、ニューヨークｐｐ．１−２９（１９９１年））に隣接して
おり、キシラナーゼIIの決定されたＮ−末端アミノ酸のコドンの上流９９個のと
ころにある。このｘｌｎ２遺伝子は２２３個のアミノ酸の蛋白質をコードしてい
る。この蛋白質ではＮ−末端は直接ペプチド配列決定によって得られ、３３個の
アミノ酸の後に存在する。このプレプロ配列はＡｌａ１９およびＡｌａ２０の間
に推定シグナルペプチダーゼ開裂部位を含む（フォン・ハイネ・ジー、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ第１４巻第４６８３−４６９０頁（１９８６年））。
このゲノム配列とｃＤＮＡ配列との比較によって１０８個のヌクレオチドのイン
トロンが明らかになった。これは成熟キシラナーゼII蛋白質は１９０個のアミノ
酸からなり、２０．８ｋＤａの理論分子量を有することを示すものである。これ
は精製キシラナーゼIIから得られた２０ｋＤａと良く一致するものである（テン
カネン，エムら、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第１４巻
第５６６−５７４頁（１９９２年））。配列の分析はまたＮ−グコシル化（成熟
蛋白質のＡｓｎ３８およびＡｓｎ６１）のための２個の推定的標的（Ａｓｎ−Ｘ
−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ （式中、ＸはＰｒｏでない）：ガベルおよびフォン・ハイネ
、
プロテイン・エンジニアリング第３巻第４３３−４４２頁（１９９０年））をも
明らかにした。
ｐＡＬＫ４７６の構築
プラスミドｐＡＬＫ４７６の構築を図４に示す。このプラスミドはｃｂｈ１部
位にｘｌｎ２遺伝子を標的するのに有効である。ｘｌｎ２遺伝子の発現はその本
来のプロモーターの制御下にある。ｐＡＬＫ４７５からの５．０ｋｂＳｍａＩフ
ラグメントはｘｌｎ２およびプロモーターを含み（遺伝子の上流領域２．３ｋｂ
）、プラスミドｐＡＬＫ４２５のＳｐｅＩ部位（クレノウで加入）に結合してい
る。
Ｔ．レエセイにおけるｘｌｎ２の増強発現
Ｔ．レエセイにおけるキシラナーゼ発現を増強するために、産生酵素種が異な
る３種の株、ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５、ＡＬＫＯ２２２１およびＡＬＫ００２７
２１をプラスミドｐＡＬＫ４７６（図４）からのＥｃｏＲＩフラグメントで形質
転換した。それ自体のプロモーターを伴うｘｌｎ２遺伝子を含む発現カセット（
図５）は、ｃｂｈ１フランキング領域を用いてｃｂｈ１部位を標的とした。
Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５形質転換からの５７、ＡＬＫＯ２２２１
形質転換からの４２およびＡＬＫＯ２７２１形質転換からの５３の形質転換細胞
を精製し、キシラナーゼ誘導条件で振盪フラスコ培養で生長させた。キシラナー
ゼ産生は培養上清中のかばのキシラン分解活性として測定した。ｃｂｈ１座に対
する標的頻度の測定およびｘｌｎ２発現カセットがｃｂｈ１座にある形質転換細
胞とどこか他の部位にある形質転換細胞を区別するために、形質転換細胞のＣＢ
ＨＩ蛋白質生産について検討した。ｃｂｈ１座のｘｌｎ２発現カセットによる置
換は、ＣＢＨＩ特異的モノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットおよびド
ットブロットで検出されたＣＢＨＩ陰性（ＣＢＨＩ-）表現型を生じさせる。Ｃ
ＢＨＩ−表現型として検出されるｃｂｈ１座に対する標的頻度は、形質転換細胞
ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５、ＡＬＫＯ２２２１およびＡＬＫＯ２７２１の各場合に
おいて：６７％、６２％および５８％と非常に高い。
図６は、そのＣＢＨＩ+/-表現型によって分類された形質転換細胞の相対的キ
シラナーゼ活性を示すものである。ｘ１ｎ２コピー数の増加は、各株のＣＢＨＩ-
およびＣＢＨＩ+の両方の形質転換細胞におけるキシラナーゼ活性の産生の増大
をもたらす。最良の形質転換細胞は、各宿主株と比較すると約２倍（Ｔ．レエセ
イＡＬＫＯ２２２１およびＡＬＫＯ２７２１）から４．５倍（Ｔ．レエセイＶＴ
Ｔ−Ｄ−７９１２５）のキシラナーゼ活性を産生する。
最大活性は(nkat/ml)は宿主としてＴ．レエセイＡＬＫＯ２７２１用いたとき
得られた。Ｔ．レエセイＡＬＫＯ２２２１の最良の形質転換細胞は他の２種の株
の最良の形質転換細胞で得られた活性の２分の１以下の活性を産生した。Ｔ．レ
エセイＡＬＫＯ２２２１とＡＬＫＯ２７２１の形質転換細胞におけるＣＢＨＩ+
およびＣＢＨＩ‐表現型間でキシラナーゼ活性にわずかな違いが存在する（図６
）。 Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５形質転換細胞のうち、ＣＢＨＩ+表
現型を有するものは平均的にキシラナーゼの良い生産体である。
３種の宿主におけるｘｌｎ２遺伝子の発現の遺伝的バックグラウンドの効果を
評価するために、ＣＢＨＩ-形質転換細胞のキシラナーゼ活性の相対的増加を測
定した。ＣＢＨＩ-形質転換細胞は遺伝子発現における組込み部位の違いによる
効果を除くために用いられた。各宿主株のうち、多くのＣＢＨＩ-形質転換細胞
（４２−８６％、表１）はキシラナーゼ活性について同程度の増大を示した。こ
の比較から除外された多くの形質転換細胞はより高いキシラナーゼ活性を示した
。このことから、表１に示された形質転換細胞は本来のｘｌｎ２に加えて、もう
１つ余分のｘｌｎ２コピーをｃｂｈ１座に有するらしいという結論に達した。こ
れらの形質転換細胞の平均キシラナーゼ活性と宿主株と比較した平均的増加を表
１に示した。平均的増加は宿主株によって変化し、約６００nkat/ml（ＡＬＫＯ
２２２１）から約２７００nkat/ml（ＡＬＫＯ２７２１）にわたる。
考察
細菌性キシラナーゼの分子クローニングに関するいくつかの報告がある（例え
ば、ガンガス，ジーエスら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第１７１巻第
２９６３−２９６９頁（１９８９年）；リンおよびトムソン、モルキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス第２２８巻第５５−６１頁（１９９１年）
；シャレック，エフら、ジーン第１０７巻第７５−８２頁（１９９１年）；ホワ
イトヘッドおよびりー、カレント・マイクロバイオロジー第２３巻第１５−１９
頁（１９９１年））。最近も糸状菌のキシラナーゼのクローニングに関する報告
がなされ、アスペルギルス・ツビゲンシス（ファン・デン・ブレック，エヌら、
「真菌類起源のキシラナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現」ヨーロッパ特許
出願０４６３７０６Ａ１号（１９９２年））、Ａ．ニゲルｖａｒ．アワモリ（マ
ート，ジェイら、キシランおよびキシラナーゼにおける「かばにおけるキシラナ
ーゼおよびそれらの適用」、ビサール，ジェイら編、エルセビエール・サイエン
ス、アムステルダムｐｐ．３４９−３６０（１９９２年））、Ａ．カワチイ（イ
トウ，ケイら、Biosci.Biotechnol.Biochem．第５６巻第９０６−９１２頁（１
９９２年））、およびＴ．レエセイ（スオミネン，ピーら、パルプおける紙産業
の生物工学における「パルプおよび紙産業における適用のための適当な酵素の組
合せを調製するためのトリコデルマ・レエセイの遺伝子工学」、クワハラおよび
シマダ編、ユニ・パブリッシャーズ・カンパニー・リミテッド、ジャパン、トウ
キョウｐｐ．４３９−４４５（１９９２年）；テールレネン，エイら、バイオ／
テクノロジー第１０巻第１４６１−１４６５頁（１９９２年））などが含まれる
。本発明者らによ野生型株ＱＭ６ａ（ｐＩ９）（スオミネン，ピーら、パルプお
ける紙産業における生物工学における「パルプおよび紙産業における適用のため
の適当な酵素の組合せを調製するためのトリコデルマ・レエセイの遺伝子工学」
、クワハラおよびシマダ編、ユニ・パブリッシャーズ・カンパニー・リミテッド
、ジャパン、トウキョウｐｐ．４３９−４４５（１９９２年）も参照）とテール
レネン，エイら、バイオ／テクノロジー第１０巻第１４６１−１４６５頁（１９
９２年）による変異株ＲｕｔＣ−３０のクローンされたＴ．レエセイのキシラナ
ーゼII（ｐＩ９）の遺伝子は完全には一致していない。主な違いはプレプロペプ
チドの配列にあり、シグナルプロセシングにおける違いを示唆している。
この結果によれば、Ｔ．レエセイのｘｌｎ２遺伝子は１０８ｂｐの１個の長い
イントロンを含んでいる。糸状菌のイントロンは通常は小さく、約５０ｂｐの長
さであるが、Ｔ．レエセイの３−ホスホグリセラ−ト・キナーゼについてバンハ
ネンら、カレント・ジェネティックス第１２巻第１８１−１８６頁（１９８９年
）に示されるように、これらはかなり長いこともあり得る。ｘｌｎ２遺伝子のか
なり長いプレプロ配列（３３個のアミノ酸）は１個のシグナルペプチダーゼの最
初の開裂部位を含んでいる。このことは１９個のアミノ酸のシグナル配列の後に
１４個のアミノ酸のプロペプチドがあることと矛盾せず、これらは翻訳後に成熟
蛋白質から分離され得る。テールレネン，エイら、バイオ／テクノロジー第１０
巻第１４６１−１４６５頁（１９９２年）はＴ．レエセイ・ＲｕｔＣ−３０のキ
シラナーゼII（ｐＩ９）シグナルプレープロペプチドは３２個のアミノ酸からな
り、翻訳開始部位に非常に近いところに２個の推定シグナルペプチダーゼ開裂部
位（各５および１１のアミノ酸）をもっていると示唆している。これはどちらか
といえ
ば短いシグナル配列である。２段階蛋白質プロセシングは、キシラナーゼIIにつ
いてここで提案されていると同様に、Ａ．ニゲル・グルコアミラーゼ（イニス，
エム・エイら、サイエンス第２２８巻第２１−２６頁（１９８５年））で生じて
いることが示され、Ｔ．レエセイ・セロビオヒドロラーゼII（ティリ，ティら、
ジーン第５１巻第４３−５２頁（１９８７年））で生じていることが示唆されて
いる。Ｔ．レエセイ・ｘ１ｎ２と同様の全体構造はＡ．ニゲル・キシラナーゼ遺
伝子で知られている（ファン・デン・ブレク，エヌら、「真菌類起源のキシラナ
ーゼ遺伝子のクローニングおよび発現」ヨーロッパ特許出願０４６３７０６Ａ１
号（１９９２年））が、例えば、Ａ．カワチイ・キシラナーゼ遺伝子では明らか
でなく、これは９個のイントロンを含み、より長い（３２．７ｋＤａ）蛋白質を
コードしている（イトウ，ケイら、Biosci.Biotechnol.Biochem．第５６巻第９
０６−９１２頁（１９９２年））。
キシラナーゼの産生は３種のＴ．レエセイ株においてｘｌｎ２遺伝子のコピー
数の増加によって増加させることができる。これらの株のうち、Ｔ．レエセイ・
ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５は高セルラーゼ−産生突然変異体であり、ＡＬＫＯ２７
２１は先在の高キシラナーゼ産生のために宿主として用いられた。本発明者らは
また低プロテアーゼＴ．レエセイＡＬＫＯ２２２１において、キシラナーゼを産
生させ、低プロテアーゼバックグラウンドを有するキシラナーゼ産生および培養
培地中のキシラナーゼの相対量の増加を追及した。
キシラナーゼ活性の増加は高く各宿主株と比較すると約２倍から４倍以上にわ
たった。低−プロテアーゼ株ＡＬＫＯ２２２１の形質転換細胞および遺伝子工学
による宿主ＡＬＫＯ２７２１のキシラナーゼ活性はｘｌｎ２遺伝子がｃｂｈ１座
に組み込まれたか、またはゲノム（ＣＢＨＩ+/-表現型）中の別のところに組み
込まれたかとは関係がない。Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５形質転換細胞
については、別のところに組み込まれたｘｌｎ２遺伝子（ＣＢＨＩ+表現型）は
ｃｂｈ１座に組み込まれたものよりも高い酵素産生をもたらした。これらの結果
はハルッキ，エイら、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第１
３巻第２２７−２３３頁（１９９１年）の結果とは少し矛盾し、ハルッキらは
最適発現のために、発現カセットがｃｂｈ１座中に組み込まれることが必要であ
ると報告している。しかしながら、この発明において、ハルッキ，エイら、エン
ザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第１３巻第２２７−２３３頁（
１９９１年）によってｅｇ１１ｃＤＮＡを用いて行われたときのｃｂｈ１プロモ
ーターの代わりに、ｘｌｎ２プロモーターが発現のために用いられたことに注目
すべきである。これはｃｂｈｌ座はｘｌｎ２プロモーターのもとでの発現のため
には良い環境でないかもしれないことを示している。
Ｔ．レエセイ・ＡＬＫＯ２２２１およびＡＬＫＯ２７２１株がＶＴＴ−Ｄ−７
９１２５に由来する事実にもかかわらず、遺伝的バックグラウンドがｘ１ｎ２発
現に顕著な影響力を有すると思われる。キシラナーゼ産生の増加は、最も高いキ
シラナーゼ活性を示すＴ．レエセイ・ＡＬＫＯ２７２１の形質転換細胞で最も高
い（２７００ｎｋａｔ／ｍｌ）。ｘｌｎ２のもう１つの余分のコピーの発現が宿
主によっては４倍以上に変わる。
実施例２
ＸＹＬIIの産生増強：ｃｂｈ１プロモーターと融合させたｘｌｎ２遺伝子ｐＡ
ＬＫ１７４の構築および３種のトリコデルマ・レエセイ株の形質転換ｐＡＬＫ１
７４の構築を図７に示す。最初にｘｌｎ２シグナル配列のｃｂｈ１プロモーター
への正確な融合（および内部ＸｈｏＩ部位へのｘｌｎ２遺伝子）を含む６７４ｂ
ｐＰＣＲフラグメントを鋳型としてプラスミドｐＡＬＫ４７５（図２）を用いて
合成した。用いられたオリゴヌクレオチドを下記に示す：５’−プライマーはｃ
ｂｈ１プロモーターの末端および推定的ｘｌｎ２シグナル配列の初端の配列を含
み、３’−プライマーは遺伝子の内部ＸｈｏＩ部位を含むｘｌｎ２遺伝子からの
配列を含む（ｐＡＬＫ４７６地図、図５またはｘｌｎ２配列参照）。
１００μｌＰＣＲ反応はＰＣＲ緩衝液（トリスｐＨ８．３ １０ｍＭＮ ＫＣ
ｌ５０ｍｌ、ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ、ゼラチン ０．０１％w/v）中に、各プラ
イマー５０ピコモル、鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、０．２ｍＭｄＮＴＰおよびＴａｑ−
ポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）２Ｕを含む。反応条件は下記の通り
である：変性９５℃にて１分、アニーリング６０℃にて１分、伸長３０サイクル
につき７２℃にて２分、最終的な伸長は９分であった。
ＰＣＲフラグメントはマーメイド（商品名）キット（バイオ１０１Ｉｎｃ.,ラ
ジョラ、カリホルニア、アメリカ合衆国）を用いて精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理した後、ｃｂｈ１プロモーターへの融合のためにＳａｃIIで切断し
た。
プラスミドｐＡＭＨ１１０は、ｃｂｈ１プロモーターを含み、ＮｄｅＩ （クレ
ノウで加入）およびＳａｃIIで切断した。上記のＰＣＲフラグメントを消化ｐＡ
ＭＨ１１０（ｐＡＬＫ１７４Ｘ）に結合した。融合およびＰＣＲにより合成され
た配列は配列決定によって確認された。プラスミドｐＡＬＫ１７４はｐＡＬＫ４
７６におけるｘｌｎ２プロモーターをｃｂｈ１プロモーターに置換して構築した
：プラスミドｐＡＬＫ１７４Ｘからの２．９ｋｂＫｐｎＩ−ＸｈｏＩフラグメン
トは、ｘｌｎ２遺伝子に融合されたｃｂｈ１プロモーターおよび内部ＸｈｏＩへ
のｘｌｎ２配列を含み、ｐＡＬＫ４７６のＫｐｎＩおよびＸｈｏＩによる切断後
のｐＡＬＫ４７６ののフラグメントを含有する分離ベクターに結合させる。
プラスミドｐＡＬＫ１７４はｐＡＬＫ４７６（図４）のａｍｄＳおよびｃｂｈ
１３’−領域に加えて、ｃｂｈ１プロモーターに融合させたｘｌｎ２遺伝子およ
びｘｌｎ２遺伝子の１．９ｋｂターミネーター（３’−領域）を含む。
９．７ｋｂＥｃｏＲＩフラグメント（ベクター配列を含まない発現カセット）
が過去に３種のトリコデルマ株、ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５、ＡＬＫＯ２２２１お
よびＡＬＫＯ２７２１に形質転換された。株、形質転換方法および形質転換細胞
の精製、分析、生長方法は実施例６に記載した。
２．２ ｐＡＬＫ１７４形質転換細胞によるキシラナーゼの産生
ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５、ＡＬＫＯ２２２１およびＡＬＫＯ２７２１形質転換
細胞、３９、４１および５１を各々精製し、生長させ、産生したキシラナーゼ活
性を測定した。ドット・ブロット法およびＣＢＨＩ特異的モノクローナル抗体を
用いて（実施例４におけると同様に）、ｃｂｈ１座への標的頻度を測定し、それ
ぞれ８２％、４６％および８４％であった。ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５によって産
生された活性と比較した相対活性で示す、ＣＢＨＩ＋およびＣＢＨＩ−形質転換
細胞のキシラナーゼ活性の産生を図８に示す。縦軸は各宿主株の形質転換細胞の
産生程度の平均値および範囲を示す。各形質転換細胞の１個のフラスコを生長さ
せた。キシラナーゼ活性は実施例３（ｘｌｎ１のクローニング）に記載と同様に
培養上清から測定した。
キシラナーゼのすべての３種のトリコデルマ株の形質転換細胞においてキシラ
ナーゼの高い産生が得られた。最良のＶＴＴ−Ｄ−７９１２５およびＡＬＫＯ２
２２１形質転換細胞はそれらの宿主株と比較して約１０倍量のキシラナーゼ活性
を産生した。最良のＡＬＫＯ２７２１形質転換細胞は最良のＶＴＴ−Ｄ−７９１
２５およびＡＬＫＯ２２２１形質転換細胞とほぼ同程度のキシラナーゼ活性を産
生し、宿主と比較して３倍以上の増加であった。平均して、ＣＢＨＩ−形質転換
細胞はＣＢＨＩ＋表現型を有する形質転換細胞より産生が良い。当然、ＣＢＨＩ
−形質転換細胞においては、繊維素分解活性はｃｂｈ１遺伝子が削除されるため
減少した。
ｐＡＬＫ１７４構築物が用いられるとき、ｐＡＬＫ４７６（それ自体のプロモ
ーターの制御のもとのｘｌｎ２、実施例１参照）を用いて得られたものに比較し
てキシラナーゼ産生度はより高かった。
実施例３
エンドキシラナーゼＩ、ｘｌｎ１、トリコデルマ・レエセイの遺伝子の構造
この実施例では、低ｐ１（５．５）エンドキシラナーゼＩをコードするＴ．レ
エセイ遺伝子ｘｌｎ１のクローニングを示す。
材料および方法
この実施例で用いられたプラスミドはｐブルースクリプト（ストラタジーン、
サンジエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびｐＣＲ１０００（インビトロン、サンジエゴ
、ＣＡ、ＵＳＡ）である。プラスミドはエシェリキア・コリ株ＸＬＩ−ブルー（
ブラック，ダブリュー・オーら、バイオ／テクニクス第５巻第３７６−３７８頁
（１９８７年））またはＥ．コリ・ＩＮＶＩαＦ’（インビトロジェン）中で増
殖させた。Ｅ．コリ培養物は必要ならばアンピシリン（５０μg/ml）を補足し、
３７℃にて一夜Ｌ−ブロス中で生長させた（マニアティス，ティら、モルキュラ
ー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）（１
９８２年））。
ペプチド消化およびアミノ酸配列決定
Ｔ．レエセイ（ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５；ベイリーおよびネバレイネン，ケイ
・
エイチ・エム、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第３巻第１
５３−１５７頁（１９８１年））からの精製キシラナーゼＩ（テンカネン，エム
ら、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第１４巻第５６６−５
７４頁（１９９２年））は１％（w/w）炭酸水素アンモニウム中２％（w/w）トリ
プシン（ＴＰＣＫ−処理済、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス、シグマ・
ケミカル・カンパニー社製）を用いて３７℃にて２．５時間消化させた。試料に
３％（w/w）トリプシンを添加後、インキュベーションを一夜継続させた（１３
ｈ）。ペプチドはレックスクロム・プレプ−５／３００・ＯＤＳ逆相カラムの高
性能液体クロマトグラフィーを用いて分離させた。６０分２４℃にて０．１％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有５％（v/v）アセトニトリル（ＡＣＮ）から０．
０６％（w/w）ＴＦＡ含有６０％（v/v）ＡＣＮへの直線溶媒勾配にて１ｍｌ／分
の速度で溶出させた。２１８ｎｍにおける吸収を測定した。蛋白質およびペプチ
ドのアミノ−末端は気体−パルス−液相シークエンサー（カルキネンおよびティ
ルグマン，ジェイ、プロテイン・ケミストリー第７巻第２４２−２４３頁（１９
８８年））中でそれらを分解させて配列決定した。遊離したＰＴＨ−アミノ酸は
小内径逆相ＨＰＬＣを用いてオンライン分析した。
ＤＮＡ操作および形質転換
マニアティス，ティら（モルキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニ
ュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク（１９８２年））記載の標準ＤＮＡ操作をＤＮＡ構
築に用いた。プラスミドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡは製造者の指示書に従って
キアガンカラム（ディアゲン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハ
フツング、ドイツ，デュッセルドルフ）を用いて分離した。Ｅ．コリはハナハン
（ハナハン，ディ、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー第１６６巻
第５５７−５８０頁（１９８３年））に従って形質転換された。
ＲＮＡ分離
ＲＮＡ分離のために、Ｔ．レエセイ（ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５）をキシラナー
ゼ誘導培地の発酵容器中で３０℃にて３日間培養させた（ｘｌｎ２遺伝子の分離
についての記載と同様に）。菌糸体を液体窒素下微粉末に粉砕した。総ＲＮＡお
よびｍＲＮＡはバーテルおよびトンプソン（バーテルズおよびトンプソン、ヌク
レイック・アシド・リサーチ第１１巻第２９６１−２９７８頁（１９８３年））
に記載と同様にして分離し、ＤＭＳＯ−スクロース勾配遠心分離を用いて、サイ
ズ分画した（ボードカー，エイチら、バイオケミストリー第１５巻第４７６５−
４７７０頁（１９７６年））。
キシラナーゼＩ ｃＤＮＡのクローニング
ｃＤＮＡの第１鎖の合成およびその後のＰＣＲ増幅は、遺伝子−特異的プライ
マーとして、キシラナーゼＩ蛋白質のＮ−末端配列から帰結されるオリゴマー（
５’ＡＡ（Ｔ／Ｃ）−ＴＡ（Ｔ／Ｃ）−ＧＡ（Ｔ／Ｃ）−ＣＡ（Ｇ／Ａ）−ＡＡ
（Ｔ／Ｃ）−ＴＡ（Ｔ／Ｃ）−ＧＡ ３’）［配列番号９］を用いる以外はｘｌ
ｎ２についてこの明細書に記載したと同様にして行った。得られたＰＣＲフラグ
メントはｐＣＲ１０００ベクター中にサブクローンし配列決定した。
ｘｌｎ１遺伝子の分離
Ｔ．レエセイ（ＱＭ６ａ、マンデルスおよびリース、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー第７３巻第２６９−２７８頁（１９５７年））のゲノムコスミドラ
イブラリーを、販売者の指示書（ベーリンガー・マンハイム）に従って、キシラ
ナーゼＩ ｃＤＮＡ（実施例１参照）のディゴキシゲニン−標識ＰＣＲフラグメ
ントを用いてスクリーニングした。コスミドのｘｌｎ１領域の制限地図を作成し
、２．３ｋｂＥ．コリ フラグメントを配列決定のためにｐフルースクリプト（
ｐＡＬＫ５７２）中にサブクローンした。
ヌクレオチド配列決定
ヌクレオチド配列決定のための鋳型を、ｐブルースクリプトＥｘｏ／Ｍｕｎｇ
ＤＮＡ配列決定機（ストラタジーン）の製造者の指示書に従って一定方向の削除
によって製造した。ＤＮＡは、販売者の指示書に従って、蛍光−標識Ｔ７および
Ｔ３プライマーおよびＴａｑサイクル配列決定法に基づくＡＢＩ（アプライド・
バイオシステムズ、フォスター・シティ，ＵＳＡ）キットを用いて両方向に配列
決定した。配列決定反応はＡＢＩ３７３Ａ配列決定機により分析した。
結果
Ｔ．レエセイｘｌｎ２ｃＤＮＡのクローニング
精製キシラナーゼＩのアミノ−末端配列はＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−
Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｓｅｒ）−Ｐｒｏ−（Ｓｅｒ）−Ａｓｎ−
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ［配列番１０］であることが判明した。５個の
トリプシンのペプチドも得られ、直接配列決定された（ペプチド配列につき図１
０参照）。プローブとしてキシラナーゼＩＮ−末端ペプチド配列（上記参照）か
ら推定されるオリゴマーを用いたノーザーンハイブリダイズはキシラナーゼＩｍ
ＲＮＡが約０．７ｋｂの大きさであることを示した。
ｃＤＮＡの第１鎖のＰＣＲ増幅の結果は０．７ｋｂであった。蛋白質に翻訳さ
れた場合のＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｎ−末端を含むすべてのキシラナーゼ
Ｉペプチド配列を含んでいた（図１０参照）。
Ｔ．レエセイのｘｌｎ１遺伝子の分離およびヌクレオチド配列
Ｔ．レエセイのゲノム・コスミドライブラリーから１個の陽性クローンが分離
された。キシラナーゼＩの遺伝子（ｘｌｎ１）はコスミドの２．３ｋｂＥ．コリ
フラグメント中にあった（図９）。
ｘｌｎ１のヌクレオチド配列を決定し、推定アミノ酸配列とともに図１０中に
示した。１個のＴＡＴＡボックスが推定翻訳開始部位の約９０ｎｔ上流に見られ
た。成熟蛋白質のＮ−末端より前の３個の推定翻訳開始部位のうち、１個のみが
糸状菌の翻訳開始部位のための非常に良く保存され一致している配列５’ＣＡ
Ｃ／Ａ Ａ／ＣＡＴＧ３’と似た環境にある（バランス，ジェイ・ディ、レオン
，エス・エイ、バーカ，アール・エム編、モルキュラー・インダストリアル・ミ
コロジー中、糸状菌のためのシステムおよび応用（マーセル・デッカー・インコ
ーポレイテッド、ニューヨーク）ｐｐ．１−２９（１９９１年））。すなわち、
この遺伝子は２２９個のアミノ酸の蛋白質をコードしている。この蛋白質におい
て、Ｎ−末端（直接のペプチド配列決定によって得られた）は、アミノ酸Ａｌａ
１９とＭｅｔ２０の間の最初のシグナル配列開裂部位（フォン・ハイネ、ヌクレ
イッ
ク・アシッズ・リサーチ第１４巻第４６８３−４６９０頁（１９８６年））を含
む５１個のアミノ酸の長いシグナルプロペプチドの後にある（図１０）。ゲノム
配列とｃＤＮＡ配列との比較では、１個の６２ｂｐのイントロンが明らかになっ
た。これらのデータに基づいて、成熟キシラナーゼＩは計算分子量１９．１ｋＤ
ａを有する１７８個のアミノ酸であると結論され得る。これはＴ．レエセイから
得られた精製キシラナーゼＩ（テンカネン，エムら、エンザイム・アンド・マイ
クロビアル・テクノロジー第１４巻第５６６−５７４頁（１９９２年））からの
１９ｋＤａと良く一致する。キシラナーゼIIの遺伝子とちがって、Ｎ−グリコシ
ル化のための配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、ＸはＰｒｏでない）；
ガベル，ワイ、フォン・ハイネ・ジー、プロテイン・エンジニアリング第３巻第
４３３−４４２頁（１９９０年））はなかった。
Ｔ．レエセイ・キシラナーゼＩと他のキシラナーゼとの比較
提案されているキシラナーゼの触媒的グルタミン酸（カツベ，ワイら、Proc.2
nd Int. Conference Protein Engineering（ジャパン・サイエンティフィック・
ソサイエティズ・プレス、トウキョウ）ｐｐ．９１−９６（１９９０年）；ワカ
ルチュク，ダブリューら、ビセール，ジェイら編、キシレンおよびキシラナーゼ
（エルセビエール・サイエンス、アムステルダム）ｐｐ．４３９−４４２（１９
９１年））の両方とも配列平行整列によってキシラナーゼＩ中にあり、成熟酵素
のＧｌｕ７５およびＧｌｕ６４に該当する（図１０）。
表２は異なるキシラナーゼ間の相同パーセントを示す配列平行整列比較を示す
。
マトリックスの上右半分は完全成熟配列の平行整列の結果を示し、下左半分はキ
シラナーゼの提案されている活性部位グルタミン酸間の配列の平行整列の結果を
示す。
表２
異なるキシラナーゼ間の平行整列の配列の相同％をマトリックスとして示した
。
上右半分：成熟酵素配列平行整列、下左半分：２個の提案されている活性部位グ
ルタミン酸間の配列の平行整列。
ＴＩ：Ｔ．レエセイ・キシラナーゼ；ＴＶ：Ｔ．ヴィリデ（ヤグチ，エムら、
ビセール，ジェイら編、キシレンおよびキシラナーゼ中、（エルセビエール・サ
イエンス、アムステルダム）ｐｐ．１４９−１５４頁（１９９２ａ年））；ＴＨ
：Ｔ．ハルジアヌム（ヤグチ，エムら、ビセール，ジェイら編、キシレンおよび
キシラナーゼ（エルセビエール・サイエンス、アムステルダム）ｐｐ．４３５−
４３８（１９９２ｂ年））；ＡＴ：Ａ．ツビゲンシス（ファン・デン・ブレク，
エイチら、「真菌類起源のキシラナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現」ヨー
ロッパ特許出願０４６３７０６Ａ１号（１９９２年））；ＳＣ：シゾフィラム・
コミュネ（オク，ティら、Canadian Fed. Biol. Soc. Annu. Meet.(Quebec City
), Abst. 第６７６頁（１９８８年））；ＡＫ：Ａ．カワチイ（イトー，ケイら
、Biosci. Biotec. Biochem. 第５６巻第９０６−９１２（１９９２年）、最初
の１９個のアミノ酸を平行整列させた。）；ＢＣ：バチルス・シルキュランス（
ヤン，アール・シー・エイら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第１６巻第７
１８７頁（１９８８年））；ＢＰ：Ｐ．プミルス（フカサキ，イーら、エフイー
ビーエス・レターズ第１７１巻第１９７−２０１頁（１９８４年））；ＢＳ：Ｂ
．ズブチルス（ペイス，エム・ジーら、アーチーブズ・オブ・マイクロバイオロ
ジー第１４４巻第２０１−２０６頁（１９８６年））；ＣＡ：クロストリジウム
・アセトバチリクム（ザップ，エイチら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第
１８巻第２１７９頁（１９９０年））；ＳＳ：ストレプトミセス・エスピー・３
６ａ（ナガシマ，エムら、Trends Actinomycetologia第９１−９６頁（１９８９
年））
Ｔ．キシラナーゼII（ｐＩ９．０）はＴ．ヴィリデおよびＴ．ハルジアヌムの
小さくかつ高活性のｐＩキシラナーゼとほぼ一致している（ヤグチ，エムら、ビ
セール，ジェイら編、キシレンおよびキシラナーゼ（エルセビエール・サイエン
ス、アムステルダム）ｐｐ．１４９−１５４頁（１９９２年）；ヤグチ，エムら
、ビセール，ジェイら編、キシレンおよびキシラナーゼ（エルセビエール・サイ
エンス、アムステルダム）ｐｐ．４３５−４３８頁（１９９２年））。２個の活
性部位グルタミン酸間の領域の平行整列では多くの場合、完全成熟配列の平行配
列させた場合より多くの場合高い相同性を示した。
考察
Ｔ．レエセイは少なくとも２種の異なるキシラナーゼを産生し、ｐＩ５．５の
キシラナーゼＩとｐＩ９のキシラナーゼIIであり、これらはそれぞれ１９ｋＤａ
および２０ｋＤａの小さい蛋白質である（テンカネン，エムら、エンザイム・ア
ンド・マイクロビアル・テクノロジー第１４巻第５６６−５７４頁（１９９２年
））。対応する遺伝子ｘｌｎ１およびｘｌｎ２は既にクローン化され、この明細
書
に記載ずみである。全体構造において、ｘｌｎ１およびｘｌｎ２遺伝子は非常に
似ている。それらはほぼ同じ大きさであり、両方とも１個のイントロンと長いプ
レ−プロペプチドを含んでいる。しかしながら、これらの２種のキシラナーゼは
ＤＮＡレベルでは５４％、アミノ酸レベルでは５２％の相同性しか示さない。す
なわち、これらは明らかに１次構造において異なるのみならず、種々のｐＨ値ま
たは温度に対する耐性およびテンカネンら（テンカネン，エムら、エンザイム・
アンド・マイクロビアル・テクノロジー第１４巻第５６６−５７４頁（１９９２
年））により示される動力学的パラメーターなどの酵素的特徴においてもまた異
なる。
疎水性菌株群分析に基づいて、キシラナーゼは２つの亜科ＦおよびＧに分類さ
れた（ヘンリサート，ビーら、ジーン第８１巻第８３−９５頁）。亜科Ｆは高−
ＭＷキシラナーゼを含み、一方低−ＭＷキシラナーゼは亜科Ｇに属する。ヘンリ
サート（ヘンリサート，ビー、ビサール，ジェイら編、キシレンおよびキシラナ
ーゼ、Proc. Int. Symp. Wageningen（エルセビエール、アムステルダム）ｐｐ
．９７−１１０（１９９１年））はこれら２種の亜科のキシラナーゼが異なる起
皺を示すことを示唆している。Ａ．カワチイ・キシラナーゼＡを除く比較した他
のすべてのキシラナーゼに対するＴ．レエセイ・キシラナーゼＩおよびIIの高い
相同性は、それらがまたもう一方の低ＭＷ−キシラナーゼと同様に亜科Ｇに属す
ることを示唆している。Ａ．カワチイ・キシラナーゼ（イトー，ケイら、Biosci
. Biotec. Biochem. 第５６巻第９０６−９１２（１９９２年））の場合は、Ｔ
．レエセイ・キシラナーゼと約２０％のみの相同性であった。このキシラナーゼ
は３２．７ｋＤａの高ＭＷを有し、亜科Ｆに属すると報告されている（イトー，
ケイら、Biosci. Biotec. Biochem. 第５６巻第９０６−９１２（１９９２年）
）。
実施例４
ｃｂｈ１プロモーターと融合したｘｌｎ１遺伝子を含む構築物（ｐＡＬＫ８０７
）で形質転換されたトリコデルマによるＸＹＬＩの増強発現
プラスミドｐＡＬＫ８０７の構築およびトリコデルマ株ＡＬＫＯ２２２１の形質
転換
プラスミドｐＡＬＫ８０７はｐＡＬＫ１７４におけると同様のストラテジーを
用いて構築した（図１１）。ｃｂｈ１プロモーターの推定ｘｌｎ１シグナル配列
への融合およびｘｌｎ１配列の内部ＸｈｏＩ部位への融合（図２のｐＡＬＫ５７
２地図またはｘｌｎ１配列参照）を含む９８ｂｐＰＣＲフラグメントは下記のオ
リゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって作製された。
ｘｌｎ１遺伝子を含有するプロモーターｐＡＬＫ５７２はＰＣＲ反応の鋳型に
用いられた。生成物の反応および精製はｐＡＬＫ１７４の構築におけると同様に
行った。ｐＡＬＫ８０５を得るために、精製されＳａｃII−ＸｈｏＩ消化された
ＰＣＲフラグメントを、ｃｂｈ１プロモーターを含むＳａｃII−ＸｈｏＩ切断プ
ラスミドｐＡＬＫ４８６に結合させた。ｐＡＬＫ８０６を構築するために、Ｘｈ
ｏＩ部位より下流のｘｌｎ１配列がＰｓｔＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで加入）
−ＸｈｏＩ消化によるプラスミドｐＡＬＫ５７２から分離され、このフラグメン
トをＢａｍＨＩ（クレノウで加入）−ＸｈｏＩ消化ｐＡＬＫ８０５に結合させた
。ｐＡＬＫ８０５は、ａｍｄＳ遺伝子およびｃｂｈ１３’−フランキング領域（
ｐＡＬＫ１７４と同様に）を含むｐＡＬＫ４２４からのＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ（
クレノウで加入）を、ＥｃｏＲＶ切断ｐＡＬＫ８０６に結合させることによって
得られた。
Ｔ．レエセイ株ＡＬＫＯ２２２１はプラスミドｐＡＬＫ８０７からの８．２ｋ
ｂＮｏｔＩフラグメントを用いて形質転換させた。
ｐＡＬＫ８０７形質転換細胞によるキシラナーゼの産生
５１個の全ての形質転換細胞を、実施例２と同様に精製・分析および生長させ
た。ｃｂｈ１座への標的頻度は３５％であった。キシラナーゼ活性は実施例２と
同様にして測定したが、ＸＹＬＩ活性のための最適ｐＨ範囲はｐＨ４．３であっ
た（テンカネン，エムら、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー
第１４巻第５６６−５７４頁（１９９２年））。宿主株ＡＬＫＯ２２２１のキシ
ラナーゼ活性と比較した生成キシラナーゼ活性の増加として結果を表３に示す。
得られた３０の最も良いキシラナーゼ産生体が含まれている。各形質転換細胞の
１個のボトルを生長させた。
最良の形質転換細胞は親株と比較して１０倍以上のキシラナーゼ活性量を産生
した。ＸＹＬII（ｐＡＬＫ１７４）と異なり、最良のキシラナーゼ産生体はＣＨ
ＢＩ+のものであった。
実施例５
主要セルラーゼｃｂｈ１遺伝子の不活性化
Ｔ．レエセイ中の主要セルラーゼをコードするｃｂｈ１遺伝子を、フレーム・
シフト突然変異を生じたｃｂｈ１ｃＤＮＡの０．８ｋｂ内部フラグメントを含む
プラスミドｐＭＳ４との相同的組換えによって不活性化した。ｐＭＳ４プラスミ
ドは下記の方法によって作製された：プラスミドｐＴＴｃ０１（ティーリら、ア
ナリティカル・バイオケミストリー第１６４巻第６０−６７頁（１９８７年）；
ペンティーラら、ジーン第６３巻第１０３−１１２頁（１９８８年））は、ｐＵ
Ｃ８ベクター中にｃｂｈ１の完全な長さのｃＤＮＡクローンを含み（ビエイラお
よびメッシング、ジーン第１９巻第２５９−２６８頁（１９８２年））、シグナ
ル配列において切断するＢｇｌＩ（シューメイカーら、バイオ／テクノロジー第
１巻第６９１−６９６頁（１９８３年））およびＢｇｌIIを用いて消化した。ｃ
ｂｈ１ ｃＤＮＡの５’領域を有する得られた０．８ｋｂＤＮＡフラグメントは
Ｓ1ヌクレアーゼで平滑末端化し、ＥｃｏＲＩ切断平滑末端化ｐＵＣ８ベクター
（ヤニッシ−ペローンら、ジーン第３３巻第１０３−１１９頁（１９８５年））
に結合させた。得られたクローンはＥｃｏＲＩにより中程度のｃｂｈ１フラグメ
ントに切断した。ＥｃｏＲＩが生成させた末端が加入されそして戻し結合された
。このようにして得られたプラスミドｐＭＳ４は先端を欠いたｃｂｈ１ ｃＤＮ
Ａフラグメントの中程にフレーム・シフト突然変異を含んでいる。
Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５（ベイリーおよびネバレイネン、エンザ
イム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第３巻第１５３−１５７頁（１９
８１年））はｐＭＳ４およびｐ３ＳＲ２により同時形質転換された。ｐ３ＳＲ２
は、ｐＢＲ３３２（ケリーおよびハイネス、ヨーロピアン・モルキュラー・バイ
オロジー・オーガニゼーション・ジャーナル第４巻第４７５−４７９頁（１９８
５年））中にクローン化されたＡ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子を含有する５ｋ
ｂＤＮＡフラグメントをもっている。形質転換細胞はＡＭｄＳ+表現型の点から
選択され、その後分生子から精製された。ついで２００個の独立形質転換細胞か
ら約６００個のクローンをマイクロタイタープレート上に生長させ、それら
のセルラーゼ表現型を、無希釈成長培地およびＣＢＨＩ特異的ひつじ抗血清を用
いてオーチターロニー免疫拡散法により試験した（オーチターロニー、Progr. A
llergy第５巻第１−７８頁（１９５８年））。多数の株からＣＢＨＩは検出され
なかった。これらの株の１種であるＶＴＴ−Ｄ−８７３１２のＣＢＨＩ陰性の特
徴が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦＰＬＣにおける成長培地の分析によって確認さ
れた。ＣＢＨＩに該当するピークが見られなかった（図１２と図１２Ａを比較）
。ＣＢＨＩ陰性株の分泌蛋白質の総量は、Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５
により分泌された総蛋白質量の約半分であった。株ＶＴＴ−Ｄ−８７３１２の培
養上清部に検出された濾紙分解（filter paper degrading）活性、ＦＰＵ（マン
デルスら、Biotechnol. Bioeng. Symp.第６巻第２１−３３頁「糖化セルロース
の測定」、ガデン，イー・エル、マンデルス・エム・エイチ、リース，イー・テ
ィおよびスペイノ，エル・エイ編、ジョン，ウィリーおよびサンズ、ニューヨー
ク、１９７６年）活性は著しく減少しており、通常の約２０％であった。通常総
分泌蛋白質の約６０％存在する主要セロビオヒドロラーゼの欠如はこの株の成長
特質を著しく変えなかった。
Ｂ．プロモーターを有するｃｂｈ２遺伝子の削除
トリコデルマのｃｂｈ２遺伝子は下記に示すようにアスペルギルス・ａｒｇＢ
遺伝子で置換した。プラスミドｐＡＬＫ９９は形質転換フラグメントの原料とし
て構築された（図１３）。プラスミドｐＡＬＫ９９は下記の方法で構築された。
プラスミドｐＵＣ１９のＰｖｕIIフラグメント（マルチリンカーを含む）を、下
記の制限酵素：ＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ−ＳｍａＩ−ＸｂａＩ−ＰｖｕII−ＳａII−
ＸｈｏＩの認識部位を含む新規合成マルチリンカーフラグメントで置換した。新
規のプラスミドをｐＡＬＫ９６という。このプラスミドをＸｂａＩおよびＰｖｕ
IIで切断し、ｃｂｈ２遺伝子の３’領域からの２．１ｋｂＸｂａＩ−ＰｖｕIIフ
ラグメントをその中に結合させた。得られたプラスミドはＰｖｕIIおよびＨｉｎ
ｃIIで切断し、ｃｂｈ２−遺伝子の５’領域から３．４ｋｂＰｖｕII−フラグメ
ントと結合させた（図１４参照）。３’および５’の両方のフラグメントは本来
λクローンｃｂｈ２ ｌａｍｂｄａ１に由来するものである（ティーリら、ジー
ン第５１巻第４３−５２頁（１９８７年））。得られたプラスミドをｐＡＬＫ９
８という。ついで、アスペルギルス・ニデュランスａｒｇＢ遺伝子（２．６ｋｂ
ＳａｌＩ）をｃｂｈ２の３’および５’領域間のプラスミドｐＡＬＫ９８の特徴
的ＰｖｕII部位中に結合させた。得られたプラスミドをｐＡＬＫ９９という。す
なわち、ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＡＬＫ９９から分離された形質転換フラ
グメントは、ｃｂｈ２の５’フランキング領域の３．４ｋｂ（ＰｖｕII−Ｐｖｕ
IIフランキング）および３’フランキング領域の２．１ｋｂ（ＰｖｕII−Ｘｂａ
Ｉフランキング）の間に２．６ｋｂＳａｌＩフラグメントとしてアスペルギルス
ａｒｇＢ遺伝子を含む（バースら、ジーン第２５巻第１０９−１１７頁（１９８
３年））（図１４参照）。Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−８７３０５ＡｒｇＢ-変異
株（ペンティーラら、ジーン第６１巻第１５５−１６４頁（１９８７年））をア
ルギニン原栄養性による選択を用いてこのフラグメントで形質転換させた。つい
で、ＡｒｇＢ+形質転換細胞はＣＢＨIIに対するモノクローナル抗体を用いるウ
エスタンブロッティングによってＣＢＨII-表現型についてスクリーニングした
。ついで、ＣＢＨII−形質転換細胞中の形質転換フラグメントによるｃｂｈ２座
の置換をサザーンブロツにより確認した。ＡＬＫＯ２５６４株はこの種の「置換
」株の例であり、従って、もはやｃｂｈ２遺伝子を含まない。
上記の方法により、トリコデルマのｃｂｈ２遺伝子はアスペルギルｔｒｐＣ遺
伝子で置換された。
アスペルギルス・ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子（クレノウ酵素で平滑末端化４
．２ｋｂＸｈｏＩフラグメント）を、ｃｂｈ２遺伝子の３’および５’領域間の
プラスミドｐＡＬＫ９８の特徴的ＰｖｕII部位に結合させた。得られたプラスミ
ドをｐＡＬＫ４０２という。ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＡＬＫ４０２から分
離された形質転換フラグメントは、ｃｂｈ２遺伝子の５’フランキング領域の３
．４ｋｂと３’フランキング領域の２．１ｋｂの間に４．２ｋｂＸｈｏＩフラグ
メントとしてＡ．ニデュランスｔｒｐＣ遺伝子を含む（イエルトンら、プロスィ
ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスィズ第９１巻
第１４７０−１４７４頁（１９８４年））。Ｔ．レエセイＡＬＫＯ２３１９ｔｒ
ｐＣ-
変異株はトリプトファン栄養原性による選択を用いてこのフラグメントで形質転
換させた。ＴｒｐＣ+形質転換細胞はＣＢＨIIに対するモノクローナル抗体を用
いるウエスタンブロッティングによってＣＢＨII-表現型についてスクリーニン
グした。ついで、ＣＢＨII−形質転換細胞中の形質転換フラグメントによるｃｂ
ｈ２座の置換をサザーンブロツにより確認した。ＡＬＫＯ２７２１株はこの種の
「置換」株の例であり、従って、もはやｃｂｈ２遺伝子を含まない。
実施例６
多量のＥＧＩを産生するＣＢＨＩ陰性トリコデルマ株の構築
実施例５Ａに記載のＣＢＨＩ陰性株ＶＴＴ−Ｄ−８７３１２をプラスミドｐＡ
ＭＨ１１１で形質転換させ、ＣＢＨＩ陰性バックグラウンド中にＥＧＩ発現を増
強させた。プラスミドｐＡＭＨ１１１は一般的な発現ベクターｐＡＭＨ１１０を
用いて構築した（これらのプラスミドはいずれもＥＰ２４４２３４に記載されて
いる）。ｐＡＭＨ１１０はｐＵＣ１９から構築された（ヤニッシュ・ペローンら
、ジーン第３３巻第１０３−１１９頁（１９８５年））。最初に、クレノウポメ
ラーゼで凹端をふさぐことにより唯一のｐＵＣ１９のＮｄｅＩ部位を破壊し、つ
いでプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、ついでｃｂｈ１プロモー
ターおよびターミネーターフラグメントに結合させて発現カセットを作製した。
プロモーターフラグメントはプラスミドｐＡＭＨ１０２からの２．６ｋｂＥｃｏ
ＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントである（ハルッキら、バイオ／テクノロジー第７巻
第５９６−６０３頁（１９８９年））。ターミネーターは、すべての３つの解読
枠内にＴＡＡ終止コドンをもったアダプターも含むＰｓｔＩフラグメント内に含
まれる０．７５ｋｂＡｖａIIフラグメントであった。ついで、ｐＡＭＨ１１０を
ＳａｃIIおよびＮｄｅＩで消化し、ｃｂｈ１プロモーターとターミネーター間の
ＤＮＡ片を除去し、消化末端をＳ1ヌクレアーゼおよびクレノウポリメラーゼに
より平滑末端化した。発現すべきｅｇｌ１ｃＤＮＡをプラスミドｐＴＴｃ１１（
ティーリら、アナリティカリー・バイオケミストリー第１６４巻第６０−６７頁
（１９８７年）；ペンティーラら、イースト第３巻第１７５−１８５頁（１９８
７年））から、１．６ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして取り出し
、クレ
ノウポリメラーゼで平滑末端化し、発現カセットに結合させ、プラスミドｐＡＭ
Ｈ１１１を得る。形質転換はｐＡＭＨ１１１およびＡ．ニデュランスｇｐｄプロ
モーターのもとでステプトアロテイクス・ヒンダスタヌスのフレオマイシン抵抗
性遺伝子を有するプラスミドｐＡＮ８−１（マターンら、「トランスフォーメイ
ションズ・オブ・アスペルギルス・オリザエ」イン：アブストラクツ・オブ・ザ
・ナインティーンス・ラントレン・レクチャーズ・オブ・モルキュラー・ジェネ
ティクス・オブ・イースツ・アンド・フィラメンタス・フンギ・アンド・イッツ
・インパクト・オン・バイオテクノロジー、ラントレン、オランダ、ｐ．３４（
１９８７））を同時形質転換させた。もし必要ならば他のマーカーも使用しなけ
ればならない。この例では株ＶＴＴ−Ｄ−８７３１２が既にＡｍｄＳ+である。
形質転換細胞は精製され、振盪フラスコ中でエンドグルカナーゼ産生について試
験した。形質転換細胞の約２０％において、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥ
Ｃ）加水分解活性の濃度は受容菌株におけるよりも高かった。振盪培養上清中の
ＥＧＩ蛋白質（表４）を高ＨＥＣ活性を示す３種の形質転換細胞について分析し
た。これらの形質転換細胞のサザーン・ブロット分析は最良のエンドグルカナー
ゼ産生クローン（ＡＬＫＯ２４６６）において、ｃｂｈ１プロモーターとターミ
ネーター配列間のｅｇｌ１ｃＤＮＡを含む発現カセットが、インサート上のター
ミネーター配列によって染色体のｃｂｈ１座中に組み込まれていた。この形質転
換株（ＡＬＫＯ２４６６）の分泌ＥＧＩ蛋白質の量は対照のそれよりも約４倍以
上に増加した（表４）。
実施例７
ｃｂｈ１遺伝子の同時不活性化およびｅｇｌ１コピー数の増殖
Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５のｃｂｈ１遺伝子をトリコデルマｅｇｌ
１ｃＤＮＡおよびａｍｄＳ遺伝子で置換した。ｅｇｌ１ｃＤＮＡをｃｂｈ１遺伝
子のプロモーターとターミネーター間に結合させた。プラスミドｐＡＬＫ４１２
は形質転換フラグメントの材料として構築された。プラスミドｐＡＬＫ４１２は
図１５に示す通り作製された。ｐＢＲ３２２（ケリーおよびハイネス、ヨーロピ
アン・モルキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル第４巻第
４７５−４７９頁（１９８５年））中にクローニングされたアスペルギルス・ニ
デュランスａｍｄＳ遺伝子を含むプラスミドｐ３ＳＲ２をＳｐｈＩおよびＸｂａ
Ｉで消化した。得られた全ａｍｄＳ遺伝子を有する３．２ｋｂＤＮＡフラグメン
トをＳｐｈＩおよびＸｂａＩ切断ｐＵＣ１９に結合させた（ヤニッシュ−ペロー
ンら、ジーン第３３巻第１０３−１１９頁（１９８５年））。得られたプラスミ
ドをｐＡＬＫ４１０という。
コード領域にＳｃａＩから開始するｃｂｈ１遺伝子の３’領域の１．６５ｋｂ
を含むＤＮＡをＳｃａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして分離し、クレノナウ−
酵素で平滑末端化した。このフラグメントをプラスミドｐＡＬＫ４１０の（クレ
ノウ−酵素で平滑末端化）ＸｂａＩ部位に結合させた。この場合は３’フラグメ
ントをプラスミドｐＴＴ１１から分離した。
プラスミドｐＴＴ１１（ティーリら、バイオ／テクノロジー第１巻第６９６−
６９９頁（１９８３年））は、コード領域中にｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に
クローニングされた１．８ｋｂフラグメントｃｂｈ１領域、ＢａｍＨＩ部位から
の３’を含む。この遺伝子はまた他の材料から、例えば、λクローン４４Ａ（テ
ィーリら、バイオ／テクノロジー第１巻第６９６−６９９頁（１９８３年））か
らも分離され得る。
得られたプラスミドがｐＡＬＫ４１１である。これをＳｃａＩおよびＳｐｈＩ
で消化した。この５．８ｋｂフラグメントを、ｐＵＣ１８中にクローニングされ
たｃｂｈＩ遺伝子のプロモーターとターミネーター領域間にｅｇｌ１ｃＤＮＡを
含むＳｃａＩ−ＳｐｈＩ切断プラスミドｐＰＬＥ３（ネバレイネンら、イン：モ
ルキュラー・インダストリアル・ミコロジー：システムズ・アンド・アプリケイ
ションズ・フォー・フィラメンタス・フンギ、レオンら編ｐｐ．１２９−１４８
（１９９０年））に結合させた（図１６）。プロモーターとターミネーター領域
は発現ベクターｐＡＭＨ１１０（ネバレイネンら、モルキュラー・インダストリ
アル・ミコロジー中：システムズ・アンド・アプリケイションズ・フォー・フィ
ラメンタス・フンギ、レオンら編ｐｐ．１２９−１４８（１９９０年））に由来
するものである。
得られたプラスミドｐＡＬＫ４１２をＥｃｏＲＩで切断し、細菌性ＤＮＡを除
去した。９．３ｋｂｐＡＬＫ４１２Ｆフラグメントはまた戻し結合させ、プラス
ミドｐＡＬＫ４１２Ｌを得た。Ｔ．レエセイＶＴＴ−Ｄ−７９１２５（ベイリー
およびネバレイネン、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第３
巻第１５３−１５７頁（１９８１年））を、プラスミドｐＡＬＫ４１２で、ｐＡ
ＬＫ４１２Ｆ鎖状フラグメントで、戻し結合したｐＡＬＫ４１２ＬおよびｐＡＬ
Ｋ４１２ＦおよびｐＡＬＫ４１２Ｌで、同時に５：１のモル比で、それぞれ形質
転換させた。形質転換細胞をａｍｄＳ+の点から選択し、単一窒素源としてアセ
トアミドを含有する選択培地上の分生子から精製した。
精製形質転換細胞をミクロタイタープレート上で生長させ、ＣＢＨＩ蛋白質に
対するポリクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロッティングによりＣＢＨＩ-
表現型を選択した。ｐＡＬＫ４１２Ｆ形質転換細胞の約３分の１は検出可能な
ＣＢＨＩを産生しなかった。プラスミドｐＡＬＫ４１２で形質転換された４０株
のうちＣＢＨＩ-形質転換細胞が１種あった。
ＣＢＨＩ-形質転換細胞は振盪フラスコ培養中でエンドグルカナーゼ産生を試
験した。これらのこれらすべての形質転換細胞において、ヒドロキシエチルセル
ロース（ＨＥＣ）加水分解活性の程度は受容菌株におけるより高かった。最良の
形質転換細胞は４−５倍の受容菌株のエンドグルカナーゼ活性を分泌した。ＣＢ
ＨＩ-形質転換細胞のサザンブロト分析はそれらのｃｂｈ１座がベクターフラグ
メントで置換されていることを示した。形質転換細胞の染色体ＤＮＡをＸｈｏＩ
で消化し、ｃｂｈ１コード領域プローブの０．５ｋｂフラグメントとハイブリダ
イズさせた。
最良のエンドグルカナーゼ産生株は、トリコデルマゲノム中に挿入された当該
遺伝子をもつベクターフラグメントのコピーを１個以上もっていた。
実施例８
セロビオヒドロラーゼ陰性Ｔ．レエセイ株の構築
高セルロース分解変異体ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５（ベイリー，エム・ジェイら
、エンザイム・アンド・マイクロビアル・テクノロジー第３巻第１５３−１５７
頁（１９８２年））は優秀なセルラーゼ産生菌であり、また非常に優れた生活能
力を有し、それを産生する変異誘発プログラムの結果として分泌蛋白質を産生す
る能力が増大している。すなわち、本発明者らは、パルプ漂白に使用し得る、セ
ルビオヒドロラーゼ無含有キシラナーゼを産生するこの変異体の高蛋白質産生能
力を利用することを考えた。
ＵＶ−誘発トリプトファン栄養要求変異種であるＶＴＴ−Ｄ−７９１２５を、
ｃｂｈ２フランキング領域がｃｂｈ２座への形質転換フラグメントを標的化のた
めに使用されているＤＮＡ（図１７）の鎖状フラグメントで形質転換した。精製
ＴｒｐＣ+形質転換細胞はマイクロタイタープレート上で生長させ、ＣＢＨIIに
対するモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによってＣＢＨII-
表現型につきスクリーニングした。形質転換フラグメントによるｃｂｈ２座の
置換はサザンブロッティングにより確認した。このｃｂｈ２陰性形質転換細胞を
第２のＤＮＡで形質転換させた。このときのｃｂｈ１フランキング領域は野生型
ｃｂｈ１をアセトアミドのためのａｍｄＳマーカーで置換するために使用した。
精製ａｍｄＳ+形質転換細胞はマイクロタイタープレート上で生長させ、ＣＢＨ
Ｉに対するモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによってＣＢ
ＨＩ-表現型につきスクリーニングした。置換はサザンブロッティングでも確認
した。得られた株はｃｂｈ１およびｃｂｈ２遺伝子のいずれももたなかった。す
なわち、いかなる条件においてもセルビオヒドロラーゼを産生し得ない。
図１８は高セルロース分解株の酵素産生像およびセルビオヒドロラーゼ陰性誘
導体を示すものである。エンドグルカナーゼの産生は当分野で公知の適切な発酵
条件を選択することにより低下する。新規株ではキシラナーゼは宿主細胞から分
泌される酵素混合物として産生され得る。この酵素混合物はセルビオヒドロラー
ゼを含まず、結晶性セルロースに対する活性を欠くものである。微量のエンドグ
ルカナーゼ活性がなお存在するが、この種の漂白製剤が酵素強化パルプ漂白に用
いられる場合はパルプ特性になんら悪影響をもたらさない。
実施例９
種々の組合せのセルラーゼを産生する株の構築
前記の株の構築に用いたと同様の遺伝子置換ストラテジーを用いて、種々の組
合せのセルラーゼを産生するＴ．レエセイ株のセットを構築した（図１７）（表
５）。第１セットの株Ａ−Ｄでは、１個のセルラーゼが１度に除去されている。
株Ａ−Ｄは、ＣＢＨＩ（株Ａ）、ＣＢＨII（株Ｂ）、ＥＧＩ（株Ｃ）またはＥＧ
II（株Ｄ）以外は親株が産生するものをすべて産生する。第２セットの株Ｅ−Ｊ
は、４種のセルラーゼのすべての組合せを欠く変異体である。株ＥはＣＢＨＩお
よびＣＢＨIIを欠く。株ＦはＣＢＨＩおよびＥＧＩを欠く。株ＧはＣＢＨＩおよ
びＥＧIIを欠く。株ＨはＣＢＨIIおよびＥＧＩを欠く。株ＩはＣＢＨIIおよびＥ
ＧIIを欠く。株ＪはＥＧＩおよびＥＧIIを欠く。
ＥＧＩおよびＥＧIIの両方の遺伝子が削除されたとき（表５株Ｊ）、ヒドロキ
シエチルセルロースに対する活性は親の高セルロース分解株であるＶＴＴ−Ｄ−
７９１２５によって産生される活性の１０％以下に落ちる。ＣＢＨＩまたはＣＢ
ＨII蛋白質の欠損（株Ｅ、表５）は当業者に公知である濾紙に対する活性を試験
することによって検定することができる。ＣＢＨＩおよびＣＢＨIIの両方が削除
されたとき、測定可能な活性を産生しない。当業者には３個またはそれ以上の活
性を除去するなどのさらなる修飾を同様のストラテジーによって構築し得ること
が理解されるであろう。
図１９は本発明の組成物を産生するための遺伝子工学の効果を示すものである
。遺伝子工学はこれまで種々のセルラーゼ−キシラナーゼ混合物を産生するため
の高セルロース分解変異体の誘導体を構築するために成功裡に用いられて来た。
株３では、ｃｂｈ１遺伝子コード配列がｅｇｌ１遺伝子コード配列で置換され、
株３ではｃｂｈ１プロモーターのもとで発現する。すなわち、これらの宿主によ
って産生され分泌されるエンドグルカナーゼの比率は増大する。株１は主な活性
としてはキシラナーゼを産生し、種々の産生条件において当業者に公知であるよ
うに、セロビオヒドロラーゼを伴わないエンドグルカナーゼを産生し得る。株３
によって産生された酵素混合物ではエンドグルカナーゼの比率は増大し、株２は
主としてエンドグルカナーゼを含まないセロビオヒドロラーゼを産生する。
実施例１０
生化学的漂白における酵素製剤の使用
酸素−脱リグニン軟材クラフトミルパルプ（カッパ１６．１、白色度３５．４
％ＩＳＯ）を用いた。パルプｐＨは硫酸を用いて６に調整した。乾燥物２５０ｇ
のパルプ試料を、キシラナーゼ使用量が１００nkat/gパルプ乾燥物である酵素Ａ
３２７３（「酵素Ａ」）またはＡ２７９９（「酵素Ｂ」）にて、ｐＨ６、５５℃
２時間処理し、洗浄した。ついで、漂白工程Ｄ0（ＥＯ）ＤＥＤを用いて漂白し
た。対照パルプは酵素処理せずに漂白した。
下記の標準方法を用いた：白色度（ＩＳＯ２４７０）、カッパ数（ＩＳＯ３０
２）、粘度（ＩＳＯ５３５１／１）およびｐｃ（着色後）数（ＴＡＰＰＩ２６０
pm−８１）。パルプをＰＦＩミル（ＩＳＯ５３５１／１）で粉砕し、ＩＳＯ５２
６９／１による手漉シートを作製し、強度特性の試験をした（ＩＳＯ５２７０）
。
酵素処理パルプは対照パルプよりも第１漂白段階で２５％少ないＣｌＯ2使用
量を用いて漂白した。酵素前処理パルプは合計約１５％少ないａＣｌにより完全
な白色度が得られた（表６）。これはＯ2−脱リグニン処理および塩素元素を含
む漂白工程なしの通常の処理パルプ（カッパ数３１−３２）を用いた初期の実験
におけるとほぼ同じである（ラウティネン，ティら、イン：バイオテクノロジー
・
イン・パルプ・アンド・ペーパー・インダストリー、クワハラ，エム、シマダ，
エム編、ユニ・パブリッシャーズ・カンパニー・リミテッド、ジャパン、トウキ
ョウｐｐ．１２９−１３７（１９９２年））。
強度特性（粘度および引裂強度）はセルロース分解２次（side）活性と関連す
る：低２次（low side）活性（酵素Ａ）では対照と同様の強度が得られた。光学
特性はまた対照に匹敵し、酵素処理パルプでも良いｐｃ−数（白色度の逆の尺度
）を除いて、光学特性もまた対照と匹敵し得る。
本発明を詳細に記載したが、本発明の範囲は条件、パラメーターなどの広範つ
均等の範囲で本発明の趣旨および範囲またはそれらの具体例に影響を与えること
なく実施され得ることが当業者に理解されるであろう。ここに挙げられた全ての
文献ここには引用することによってこの明細書の記載とする。
配列表
(1)一般的情報；
(i)特許出願人：
(a)名宛人：アルコ・リミテッドら
(B)通り：サルミサーレンランタ ７ホー番
(c)市：ヘルシンキ
(D)国：フィンランド
(E) 郵便番号：00180
(ii)発明の名称：新規な酵素製剤及びその製造方法
(iii)配列の数：14
(V)コンピュター解読書式：
(A)媒体型：フロッピーディスク
(B)コンピュター:IBM PC適合
(c)オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウエア：Patene In Release#1.0 Version 1.25#
(vi)本出願のデータ：
(A)出願番号：PCT/FI93/00221
(B)出願日：1993年5月24日
(C)分類：
(vii)優先権主調出願のデータ：
(A)出願番号：US 07/524,308
(B)出願日：1990年5月16日
(1)配列番号１の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：1015塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：join（176..448,557..952）
(xi)配列：配列番号１：
(1)配列番号２の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：223アミノ酸
(B)型：アミノ核
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号２：
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：941塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：CDS
(B)存在位置：join（102..392，455..）
(xi)配列：配列番号３：
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：229アミノ酸
(B)型：アミノ核
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号４：
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特徴：
(A)長さ：18塩基対
(B)型：核核
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号５：
(2)配列番号６の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：20塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号６：
(2)配列番号７の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：18塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号７：
(2)配列番号８の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：10塩基対
(B)型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列の特徴：
(A)特徴を表す記号：ペプチド
(B)存在位置：１
(D)その他の情報：/ラベル=ペプチド
／注=Xaaで表示された第２のアミド酸は不明
(xi)配列：配列番号８：
(2)配列番号９の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：20塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号９：
(2)配列番号１０の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：25塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号１０：
(2)配列番号１１の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号１１：
(2)配列番号１２の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：26塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号１２：
(2)配列番号１３の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：39塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号１３：
(2)配列番号１４の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(A)長さ：30塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：１本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ix)配列：配列番号１４：
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｓ 3/08 8931−4Ｂ
Ｄ２１Ｃ 3/22 7199−3Ｂ
9/10 Ｚ 7199−3Ｂ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:885）
(Ｃ１２Ｎ 9/24
Ｃ１２Ｒ 1:885）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，
ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ
Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ
，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，
ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ
(72)発明者 サーレライネン、リトヴァ
フィンランド00200ヘルシンキ、ミッリカ
ッリオンティエ２ベー17番
(72)発明者 パロヘイモ、マルヤ
フィンランド00260ヘルシンキ、トーロン
カトゥ32ベーアー７番
(72)発明者 ラハティネン、タルヤ
フィンランド01620ヴァンター、ラーヤニ
ーティンティエ12エー63番
(72)発明者 ファーゲルストレム、リシャルド
フィンランド02260エスポー、キエロティ
エ18アー番