FI120097B - Uudet entsyymivalmisteet ja niiden valmistusmenetelmät - Google Patents

Description

Uudet entsyymivalmisteet ja niiden valmistusmenetelmät

Esillä oleva keksintö koskee eristettyjä nukleiinihappomolekyylejä, yhdistelmävektoreita, 5 yhdistelmäisäntiä sekä menetelmää sellaisen entsyymiaktiivisuuden tuottamiseksi, jossa on rikastettu entsyymiaktiivisuus, viljelyalustaa ja tuotetta. Lisäksi keksintö koskee tuotteiden käyttöä massa -, paperi-ja rehuteollisuudessa. Keksinnössä julkistetaan myös tällaisten entsyymivalmisteiden tuottaminen Trichoderma-lajien jäsenillä, joita on käsitelty geenitekniikalla. Nämä valmisteet sisältävät runsaasti ksylanaasientsyymejä.

10

Selluloosa on lineaarinen polysakkaridi, jonka muodostavat glukoosiyksiköt, joita β-1,4-sidokset yhdistävät. Luonnossa selluloosa on yhdistetty tavallisesti ligniiniin yhdessä hemiselluloosien kuten esimerkiksi ksylaanien ja glukomannaanien kanssa. Massa-ja paperiteollisuudessa pääosa ligniinistä uutetaan puun kemiallisen massan valmistuksessa 15 (keitossa), niin että saadaan hyväksyttävä sellumassatuote. Saatu massa on kuitenkin pääasiallisesti ruskeaa, koska keiton jälkeen vielä pieni osa ligniiniä jää massaan. Tämä jäännösligniini poistetaan perinteisesti monivaiheisessa valkaisumenettelyssä, jossa tyypillisesti käytetään kloorikemikaalien ja uuttamisvaiheiden yhdistelmää. Silloin kun halutaan vähentää kloorikemikaalien käyttöä tai välttää niitä kokonaan, käytetään myös 20 peroksidia, happea ja otsonia.

• · · • · · • · · · • · m • · · * l Hemisellulaaseja voidaan käyttää myös massojen entsyymiavusteisessa valkaisussa, jotta • · · .*’* kemikaaliannosta voidaan vähentää myöhemmässä valkaisussa tai lisätä massan • · · • · · "V siniheijastuslukua (Kantelinen et ai., International Pulp Bleaching Conference, Tappi 25 Proceedings, 1 - 5 (1988); Viikari et ai., Paper and Timber 7:384 - 389 (1991); ja • · ·

Kantelinen et ai., "Enzymes in bleaching of kraft pulp," Dissertation for the Degree of . : . Doctor of Technology, Technical Research Centre of Finland, VTT Publications 114, • · · .···. Espoo, 1992). Kim hemisellulaasia käytetään tällä tavalla, siinä ei luonnollisesti saisi olla • · • ·· .* . sellulaaseja, jotka vahingoittaisivat sellukuituja.

• · · • ·· 3o • ·

Hemiselluloossa hydrolysoivien entsyymien käyttö erilaisissa valkaisusaqoissa tunnetaan • · · WO 89/08738:n, EP 383 999, WO 91/02791 :n, EP 395 792:n, EP 386 888:n ja WO ’· ’· 91/05908:n perusteella.

2

Hemiselluloosaa hajottavien entsyymien muihin teollisiin sovellutuksiin kuuluu termo-hierremassojen valmistus, jossa hemiselluloosaa hajottavien entsyymien käyttötarkoitus on vähentää energian kulutusta. Hemiselluloosaa hajottavia entsyymejä voidaan käyttää uusiomassan kuivattamisen parantamiseen tai liukosellujen valmistukseen (Viikari et ai.. 5 "Hemicellulases for Industrial Applications," julkaisussa Bioconversion of Forest and

Agricultural Wastes, Saddler, J., julkaisija, CAB International, USA (1993)).

Hemisellulolyyttisten entsyymien käyttö parannettuun veden poistoon mekaanisesta massasta tunnetaan EP 262 040:n, EP 334 739:n ja EP 351 655:n ja DE 4 000 558:n 10 perusteella.

Kun tarkastellaan biomassan hydrolyysiä nestemäisiksi polttoaineiksi tai kemikaaleiksi, sekä selluloosan että hemiselluloosan muuttaminen on välttämätöntä, jotta saadaan suuria saantoja (Viikari et ai.. "Hemicellulases for Industrial Applications", julkaisussa 15 Bioconversion of Forest and Agricultural Wastes, Saddler, J., julkaisija, CAB Interna tional, USA (1993)).

Myös rehuteollisuudessa on tarvetta käyttää entsyymiaktiisuuksien sopivaa yhdistelmää selllaisen subtraatin pilkkomiseksi, joka sisältää β-glukaania ja hemiselluloosaa.

• · · 20: • · · : .* Jotta hemisellulolyyttisten entsyymien käyttö tehdään taloudellisesti järkeväksi mahdolli-• · · *·:·* suudeksi, entsyymien tuotantokustannuksia täytyy alentaa. Tämä tarkoittaa, että tuotan-• · · ··*/ tomäärien täytyy olla suuria, eikä valmistus voi sisältää mitään kalliita puhdistusvaihei-• · · ta. Taloudellisin tapa olisi valita tuotantokannat ja -olosuhteet sillä tavalla, että viljel- • · · • · · 25 mäsupematantissa olisi runsaasti tarvittavia aktiivisuuksia ja sivuaktiivisuuksia olisi vain . vähäisiä komponentteja.

• · · · ♦ · ♦ • · · • · · • # Niin muodoin selvästi tarvitaan entsyymivalmisteita, jotka sisältävät ainutlaatuisia ’ entsyymiprofiileita ja ovat räätälöityjä, toisin sanoen ne on spesifisesti suunniteltu • · 30 sellaisen teollisuuden tarpeisiin, jossa niitä on tarkoitus käyttää, ja joita voidaan saada • · · *.· * edullisin kustannuksin, kuten esimerkiksi suoraan sellaisen mikro-organismin viljely-• · · alustasta, joka on muunnettu, siten että se tuottaa haluttua entsyymiä, mutta se ei tuota tuntuvia määriä sellaisia entsyymejä, joita ei toivota.

3

Ksylaanit ovat monimutkaisia heteropolymeerejä, jotka pääasiallisesti koostuvat ksyloo-sista ja arabinoosista. Ksylaanit ovat muodostuneet B-l,4-kytketyista ksylopyranoosiyk-siköistä, jotka voivat olla asetyyli- sekä arabinoosi- ja metyyliglukuronihappotähteillä substituoituja (Timell, T. E., et ai.. Wood Sei. Technol. 1:45-70 (1967). Ksylaanit ovat 5 selluloosan jälkeen toiseksi runsain kasvibiomassan hiilihydraattijae. Ksylaanin täydelli seen hydrolyysiin tarvitaan joukko entsyymejä, joista tärkein kuuluu endo-B-glukanaasi-en ryhmään (Biely, P., Trends Biotechnol 3:286-260 (1985); Dekker, R. F. H., julkaisussa Hignehi, T. (julkaisija), Biosynthesis and biodegradation of wood components (Academic Press Inc., Orlando), ss. 505-533 (1985); Woodward, J., Top Enzyme Fer-10 ment. Biotechnol. 8:9-30 (1984)).

Erilaiset mikro-organismit pystyvät pilkkomaan ksylaaneja, ja ksylanaaseja on löydetty sekä prokaryooteista että aitotumaisista (Dekker, R. F. H., Richards, G.N., Adv.

Carbohydrate Chem. Biochem. 32:277-352 (1976)). Ksylaania pilkkovat mikro-organis- 15 mit tuottavat usein monia ksylaanaaseja, jotta ne voivat pilkkoa ksylaanimolekyylien erilaisia sidoksia. Viimeaikaisessa selonteossa Bastawde (Bastawde, K. B., World J.

Microbiol. Biotechnol. 8:353-368 (1992)) esitti nykyisen tiedon kompilaation mikrobi- peräisten endoksylaasien ominaisuuksista ja toimintamalleista. On olemassa useita selostuksia, jotka koskevat näiden entsyymien molekyylikloonausta bakteereista (esimer- ilÖi kiksi Ghangas, G.S. et ai.. J. Bacteriol. 171:2963-2969 (1989); Lin, L.-L., Thomson, ·· · • ‘f J.A., Mol. Gen. Genet. 228:55-61 (1991); Shareck, F. et ai., Gene 107:75-82 (1991), • · · /•f Scheirlinck. T. et ai., Appi. Microbiol Biotechnol. 33:534-541 (1990); Whitehead, • · · :*V T.R., Lee, D.A., Curr. Microbiol. 23:15-19 (1991)) mutta harvoja sienistä (Boucher, • · · '"I F. et ai.. Nucleic Acids res. 16:9874 (1988); Ito, K. et ai., toimittajat, Xylans and • · · • · · 25 Xylanases (Elsevier Science, Amsterdam), ss. 349-360 (1992); van den Broeck, H. et

.:. aJL "Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin," EP 463 706 AI

(1992)).

. Trichoderma reesei on tehokas sellulolyyttisten ja ksylanolyyttisten entsyymien tuottaja 30 (Suominen, P. et ai., julkaisussa Kuwahara, M., Shimada, M. (toimittajat), Biotech- • · · • · · ’·' * nology in Pulp and Paper Industry (Uni Publishers Co., Ltd., Tokyo), ss. 439-445 • · '· (1992); Tenkanen, M. et ai.. Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 (1992)).

4

Trichoderma reesei tuottaa myös kaikkia entsyymejä, joita tarvitaan natiivien, substitu-oitujen ksylaanien täydelliseen hydrolyysiin (Poutanen, K., et ai.. J. Biotechnol. 6:49-60 (1987)). Multippeleita endo-β-1,4-ksylanaaseja on puhdistettu Trichoderman viljelmien suodoksista (Baker, C.J.,, et ai.. Phytopathology 67:1250-1258 (1977)); Hromo-5 va, M., et ai.. Arch. Microbiol. 144:307-311 (1986); John ja Schmidt, Methods Enzy- mol. 160A:662-671 (1988); Lappalainen, A., Biotechnol. Appi. Biochem. 8:437-448 (1986); Sinner ja Dietrichs, Holzforschung 29:207-214 (1975); Tan, L.U.L. et ai.. Enzyme Microb. Technol. 7:425-430 (1985); Wood ja McCrae, Carbohydr. Res. 148: 321-330 (1986)). T. reesein kaksi sellaista spesifistä endoksylanaasia on karakterisoitu, 10 joiden isoelektriset pisteet ovat vastaavasti pH 5,5:ssä (endoksylanaasi I) ja pH 9,0:ssa (endoksylanaasi II) (Tenkanen, M., et ai.. Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 (1992)).

Tarvitaan tehokkaita mirobiperäisen ja erityisesti sieniperäisen ksylanaasin tuottajia, 15 esimerkiksi entsyymiseosten tuottajia massan entsyymiavusteista valkaisua varten (Kan- telinen, A., et ai.. "Hemicellulases and Their Potential Role in Bleaching" Int. Pulp

Bleaching Confrence, Tappi Proceedings 1-9 (1988); Lahtinen, T., et al.. "Using

Selective Trichoderma Enzyme Preparations in Kraft Pulp Bleaching", julkaisussa

Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Kuwahara ja Shimada, toimittajat, Uni 20 1· Publishers Co., Ltd., Tokio, Japani, ss. 129-137 (1992); Viikari, L., et al.. "Bleaching ·· · • · · : ·1 with Enzymes", Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Proc. 3rd Int. Conf., • · · /··1 Tukholma, ss. 67-69 (1986); Viikari, L., et al.. Proc. 4th Int. Symp. Wood and Pulp-• · · :1V ing Chemistry, Pariisi 1:151-154 (1987).

• · · • · · · • · · • · · • · « 25 Keksijät ovat oivaltaneet, että on tärkeää tuottaa suuria määriä hemisellulaaseja ta- loudellisesti ja ihanteellisena yhdistelmänä muiden sellaisten entsyymien kanssa, jotka .···. pilkkovat puu- tai kasvimateriaalia, ja he ovat näin ollen tutkineet yhdistelmä-DNA-• · · • . tekniikan käyttöä sellaisten isäntien konstruoinnissa, jotka olisivat käyttökelpoisia yhdis- • · . telmä-DNA-tekniikalla suuressa mittakaavassa tuotettujen sellaisten ensyymien lähteenä, • · 30 jotka ovat edullisia hemisellulolyyttisten entsyymien käytöille.

• · · • · · • · · · • · · • · · • · 5 Nämä tutkimukset ovat johtaneet sellaiseen kehitystyöhön, jonka tuloksena on saatu sieni-isäntiä, jotka ilmentävät suuria määriä haluttuja entsyymejä ja mieluummin suuria määriä hemisellulolyyttisiä entsyymejä.

5 Nämä tutkimukset ovat johtaneet myös sellaisten sieni-isäntien kehittämiseen, jotka eivät ainoastaan ilmennä suuria määriä haluttuja entsyymejä, mieluummin hemisellulolyyttisiä entsyymejä, vaan joilta puuttuu sellulaasihajotusjäijestelmän ainakin yksi komponentti.

Keksinnön kohteena on aikaansaada sieni-isäntiä, jotka kuuluvat Trichoderma-sukuun ia 10 jotka pystyvät ilmentämään suuria määriä ksylanaasiaktiivisuutta, tai sieni-isäntiä, joilta lisäksi puuttuu osittain tai täydellisesti sellulaasiaktiivisuus. Keksinnön lisäkohteena on aikaansaada sieni-isäntiä, jotka tuottavat ksylanolyyttisten ja tiettyjen sellulolyyyttisten, mieluummin endoglukaanaasien, suuria määriä, mutta joilta lisäksi osittain tai täydellisesti puuttuu jokin muu sellulaasiaktiivisuus ja mieluummin sellobiohydrolaasi. Tämän 15 keksinnön lisäkohteena on aikaansaada uusia isäntiä (kasvi-, hiiva-, sieni- ja bakteeri-isäntiä), jotka sisältävät ja ilmentävät tällaisia ksylanaaseja. Tarkemmin sanottuna keksinnön kohteelle on tunnusomaista se, mitä on sanottu patenttivaatimusten 1,5,6, 9, 11,14 ja 15 tunnusmerkkiosassa.

. . 20 Lisäksi keksinnön mukaiselle menetelmälle entsyymivalmisteen tuottamiseksi on • · · • · · j'V tunnusomaista se, mitä on sanottu patenttivaatimuksen 18 tunnusmerkkiosassa. Keksinnön • · \ mukaiselle viljelyalustalle tai tuotteelle on tunnusomaista se, mitä on sanottu vastaavien • · · patenttivaatimusten 24 ja 25 tunnusmerkkiosassa. Lisäksi keksinnön mukaisen • · · • · · · viljelyalustan tai tuotteen käytölle on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimusten • · · · . ·: ·. 25 26 ja 27 tunnusmerkkiosassa.

• · · ; * j *. Tämän keksinnön lisäkohteena on eristää j a kloonata ksylanaasigeenej ä Trichodermasta.

• · · • · • · • · a .·! ; Kuvio 1 esittää geenideleetion yleistä periaatetta.

• · · 3o • ·

• M

Kuvio 2 esittää restriktiokarttaa, joka on laadittu pALK475:n 5,7 kb:n (kiloemäksen) • · • · l”. suuruiselle insertille (Kpnl). Geenin xln2 sijainti merkitään nuolella. Erilliset viivat t t · esittävät inserttejä alaklooneissa pALK573, pALK574, pALK570 ja pALK476. Smal-kohta fragmentin 5'-päässä on peräisin polylinkkeristä pUC19.

6

Kuvio 3 esittää T. reesein xln2-geenin nukleotidisekvenssiä [sekvenssin identifioin-tinumero 1]. Koodittavat alueet ilmaistaan ylemmillä isoilla kiijaimilla [sekvenssin identifiointinumero 2]. Puhdistetusta proteiinista saadut peptidisekvenssit ilmaistaan alleviivauksella; kaksinkertaisella alleviivauksella ilmaistua sekvenssiä käytettiin PCR-5 alukkeen valmistukseen. TATA-boksi ilmaistaan pisteillä. Oletettu 58 signaalipilkkoutu- miskohta merkitään nuolella (t) ja oletetut N-glykosylointikohdat kolmiolla (▼). Kypsän proteiinin N-pääte esitetään nuolella (). Ne kaksi glutamiinihappoa on kehystetty, joiden on ehdotettu kuuluvan aktiiviseen kohtaan.

10 Kuvio 4 esittää plasmidia pALK476, jota käytetään xln2-geenin kohdistamiseksi cbhl- lokukseen. Geeni xln2 on oman promoottorinsa kontrollin alla.

Kuvio 5 esittää pALK476-fragmenttia, jota käytetään transformaatioihin. 1,9 kb:n suuruinen cbhl:n 5’:a reunustava alue (Scal-EcoRI) on 2,2 kb:tä cbhl:htä koodittavan 15 alueen yläpuolella, 1,8 kb:n suuruinen 3’-alue (BamHI-EcoRI) on 1,4 kb:tä cbhl:htä koodittavan alueen pään alapuolella. Geeni amdS oli p3SR2:sta (3,1 kb:n suuruinen Spel-Xbal-fragmentti), ja xln2-geeni oli pALK475:stä (5,0 kb:n suuruinen Smal-frag-mentti, katso kuva 2). Geenin xln2 promoottorialue on fragmentissa kooltaan 2,3 kb.

• · · j2Ö: Kuvio 6 esittää kuvion 5 transformanttien suhteellisia ksylanaasin tuottotasoja, jotka on • · · • · * ; laskettu T. reesei VTT-D-79125:n tuottotasojen suhteen. Pylväät osoittavat keskimää- • · · • · .**! räisiä arvoja ja tuottotasojen aluetta kunkin isäntäkannan transformanttien joukossa.

• « I

“V Kasvatettiin yksi pullollinen kutakin transformanttia. Tutkittujen transformanttien luku- määrät olivat seuraavat (CBHI+/ ): T. reesei VTT-D-79125 19/38, ALK02221 16/26 ja • · · 25 ALK02721 22/31.

• · · • · · ·

Kuvio 7 esittää pALK174:n konstruktiota (xln2-geeni on sulautettu cbhl-promoottorim).

’ . Vain asiaankuuluvat restriktiokohdat esitetään.

• · 30 Kuvio 8 esittää ksylanaasiaktiivisuuden tuottamisen suhteellista lisäystä pALK174- • · · f ’ transformanteilla.

• · « • ·«

Kuvio 9 esittää pALK572:n 2,3 kb:n suuruisen EcoRI-insertin restriktiokarttaa. Geenin xlnl sijainti on merkitty nuolella.

7

Kuvio 10 esittää T.reesein xlnl-geenin nukleotidisekvenssiä [sekvenssin identifioin-5 tinumero 3]. Koodittavat alueet ilmaistaa ylemmillä isoilla kirjaimilla [sekvenssin identi- fiointinumero 4]. Puhdistetusta proteiinista saadut peptidisekvenssit ovat alleviivatut.; kaksi kertaa alleviivattua sekvenssiä käytettiin PCR-alukkeen valmistukseen. TATA-boksi ilmaistaan pisteillä. Oletettu signaalipilkkoutumiskohta merkitään nuolella (t). Kypsän proteiinin N-pääte esitetään nuolella (). Ne kaksi glutamiinihappoa on kehystet-10 ty, joiden oletetaan sisältyvän aktiiviseen kohtaan.

Kuvio 11 esittää plasmidin pALK807 rakennetta (xlnl-geeni on sulautettu yhteen cbhl-promoottorin kanssa). Esitetään ainoastaan asiaankuuluvat restriktiokohdat.

15 Kuvio 12 esittää CBHI-negatiivisen transformantin VTT-D-87312:n FPLC-analyysiä.

Kuvio 12A esittää sen vertailua transformoimattomaan isäntään.

Kuvio 13 esittää plasmidin pALK99 kaaviota.

:2*): ·· · • · · • · * 1 Kuvio 14 esittää kromosomiperäisen cbh2-geenin korvaamista aergB-geenillä.

• « · • · • · · « · • · · • · · **V Kuvio 15 esittää plasmidi pALK412:n rakennetta.

·· ·· • ♦ · • · « • · · * 25 Kuvio 16 esittää plasmidin pPLE3 kaaviota.

··« «

Kuvio 17 esittää Acbhl-Acbh2-kannan konstruktiota; VTT-D-79125:n (UV) trpC-mu-tanttia.

• · • · 30 Kuvio 18 esittää T. reesei VTT-D-79125:n (UV) hypersellulolyyttisen mutanttikannan « ♦ » ; . entsyymiprofiilia ja tämän kannan geenitekniikan avulla valmistettua muunnosta, jolta • · · • · · ’ ‘ sellobiohydrolaasi puuttuu.

8

Kuvio 19 esittää geenitekniikan avulla konstruoitujen T. reesein kantojen #1, #2 ja #3 muunnettuja entsyymiprofiileita.

Seuraavassa selityksessä käytetään lukuisia termejä, jotka ovat laajalti tunnettuja yhdis-5 telmä-DNA(rDNA)-tekniikassa. Jotta selitys sekä vaatimukset ja tällaisin termein esitet ty keksinnön piiri tulevat ymmärretyiksi, annetaan käyttöön seuraavat määritelmät.

Sellulaasi. Sellulaasi on yhteisnimitys entsyymeille, jotka katalysoivat sellaisia reaktioita, jotka osallistuvat liukenemattoman selluloosan pilkkomiseen liukoiseksi hiilihydraa-10 tiksi. Tekniikan tason mukaisesti tunnetaan termi "sellulaasi", joka tarkoittaa mainittuja entsyymeitä. Jotta selluloosa pilkotaan tehokkaasti glukoosiksi, tarvitaan ainakin kolmea sellulaasia (sellulaasientsyymiaktiivisuuden kolmea tyyppiä): satunnaisesti pilkkovia endoglukanaaseja (1,4-B-D-glukaaniglukanohydrolaasia, EC 3.2.1.4), jotka tavallisesti ovat aktiivisia substituoituja, liukoisia substraatteja kohtaan ja joilla ei ole aktiivisuutta 15 kiteistä selluloosaa kohtaan, sellobiohydrolaasia (l,4-B-D-glukaanisellobiohydrolaasi, EC 3.2.1.91), joka pystyy hajottamaan kiteistä selluloosaa mutta jolla ei ole aktiivisuutta selluloosajohdannaisia kohtaan, ja B-glukosidaasia (β-D-glukosidiglykohydrolaasi, EC 3.2.1.21), joka hajottaa sellobioosia ja sello-oligosakkarideja, jotta tuotetaan glukoosia. Kukin entsyymien kolmesta päätyypistä esiintyy multippelimuodoissa. Esimerkiksi tun- • · · *2Q* netaan kaksi immunologisesti selvästi erotettavaa sellobiohydrolaasia, CBHI ja CBHII.

• * · • · ’ ! Lisäksi tunnetaan viidestä kahdeksaan erillistä endoglukanaasia, jotka elektroforeettisesti • 4 « • · eroavat toisistaan. On havainnollistettu synergististä toimintaa joidenkin näiden ent- • · · V syymien välillä. Sellulaasiaktiivisuus on sellulolyyttisen aktiivisuuden synonyymi.

*··« • ·· • · · * ♦ · 25 Selluloosa, sellobioosi, soforoosi ja laktoosi kiihottavat tai indusoivat sellulaasien bio- synteesiä, ja glukoosi tai muut helposti käytettävät hiilen lähteet ehkäisevät sitä.

« · ·« • · · • · · • · ·

Trichoderma-isännällä. joka on "suurin piirtein kykenemätön" syntetisoimaan yhtä tai * · useampaa sellulaasientsyymiä, tarkoitetaan Trichoderma-isäntää. jossa yksi tai useampi • · 3Q sellulaasientsyymi on depressoitu, puutteellinen tai puuttuu luonnonmukaiseen (transfor- • · · • · · i . moimattomaan) Trichoderma-tyyppiin verrattuna.

« · · • · · • · 9

Hemisellulolvvttiset entsyymit ChemisellulaasitV Hemiselluloosien entsymaattista pilkkomista ja muuntamista varten tarvitaan useita erilaisia entsyymeitä, joista kutakin nimitetään "hemisellulaasiksi". Kaksi pääasiallista glykanaasia, jotka depolymerisoivat hemiselluloosarunkoa, ovat endo-l,4-B-ksy lanaasi ja endo-l,4-B-D-mannanaasi. Pieniä 5 oligosakkarideja hydrolysoi lisäksi 1,4-B-D-ksylosidaasi, l,4-B-D-mannosidaasi ja 1,4- β-D-glukosidaasi. Sivuryhmiä poistavat a-L-arabinosidaasi, α-D-glukuronidaasi ja a-D-galaktosidaasi. Esteröityjä sivuryhmiä tuottavat erilaiset esteraasit.

Hemisellulolyyttisten entsyymien määritelmä on otettu artikkelista Viikari et aL, "He-10 micellulases for Industrial Applications, joka on ilmestynyt julkaisussa Bioconversion of

Forest and Agricultural Wastes (1992).

Entsvvmivalmiste. "Entsyymivalmisteella" tarkoitetaan koostumusta, joka sisältää entsyymejä, jotka on uutettu (joko osittain tai täydellisesti puhdistettu) sienistä tai 15 viljelyalustasta, jota on käytetty tällaisten sienten kasvattamiseen. Sentähden termillä "entsyymivalmiste" tarkoitetaan koostumusta, joka sisältää alustan, jota aiemmin on käytetty mainittujen sienten viljelyyn ja kaikkia entsyymeitä, joita sienet ovat erittäneet alustaan viljelyn aikana.

» « i t

• · I

1201 Vilielvalusta. Viljelyalustalla tarkoitetaan koostumusta, jota aiemmin on käytetty sienten • 1 « ] t-# viljelyyn ("käytetty" viljelyalusta), sellaista viljelyalustaa, joka sisältää sienten viljelyn • · • .·, aikana alustaan erittämiä entsyymeitä. Viljalyalusta on käyttökelpoinen sellaisenaan tai • · · • 1 » · osittain tai täydellisesti puhdistettuna, väkevöitynä, kuivattuna tai immobilisoituna eli liikkumattomaksi tehtynä. Jos halutaan, ilmennettyä endoglukanaasiproteiinia voidaan 25 puhdistaa edelleen tavanomaisten olosuhteiden mukaan, kuten esimerkiksi uuttamalla, ··· saostamalla, kromatografialla, affiniteettikromatokrafialla, elektroforeesilla yms..

• · · · • · · » · · • i ·

Biologinen valkaisu. "Biologisella valkaisulla" tarkoitetaan ligniinin uuttamista sellu- • · massasta, sen jälkeen kun massaa on käsitelty hemiselluloosaa hajottavilla entsyymeillä .30 ligniiniä hajottavien entsyymien kanssa tai ilman niitä. Hemiselluloosat voivat rajoittaa • · · . ligniinin poistamista, joka suoritetaan joko fysikaalisesti (saostumalla uudelleen kuidun * ** pinnalle keiton aikana) tai kemiallisesti (ligniini-hiilihydraattikompleksien kautta). Hemisellulaasiaktiivisuus hajottaa hemiselluloosaa osittain, mikä lisää ligniinien uutetta- 10 vuutta tavanomaisilla valkaisukemikaaleilla (kuten kloorilla, klooridioksidilla, peroksi-dilla jne.) (Viikari et aL, "Bleaching with Enzymes" julkaisussa Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Proc. 3rd Int. Conf., Tukholma, ss. 67-69 (1986); Viikari et aL. "Applications of Enzymes in Bleaching" julkaisussa Proc. 4th Int. Symp. Wood 5 and Pulping Chemistry, Pariisi, osa 1, ss. 151-154 (1987); Kantelinen et al.. "Hemisel- lulases and their Potential Role in Bleaching" julkaisussa International Pulp Bleaching Conference, Tappi Proceedings, ss. 1-9 (1988)). Tämän parannetun valkaistavuuden etuina ovat valkaisukemikaalien vähäisempi kulutus ja pienemmät ympäristökuormitukset tai suuremmat lopulliset hajasiniheijastusarvot. Hemisellulolyyttiset entsyymit paran-10 tavat valkaistavatta, siten että ne helpottavat ligniinin poistoa, joka suoritetaan ta vanomaisilla valkaisukemikaaleilla.

Geeni. Geeni on DNA-sekvenssi, joka sisältää templaatin RNA-polymeraasia varten. Sellaista RNA:ta, joka koodittaa proteiinia, nimitetään lähetti RNA:ksi (mRNA), ja 15 eukaryooteilla RNA-polymeraasi II transkripoi sitä. Kuitenkin on myös tunnettua konst ruoida sellainen geeni, joka sisältää RNA-polymeraasi II:n templaatin, jossa transkriboidaan RNA-sekvenssi, jolla on komplementaarinen sekvenssi spesifiselle mRNA:lle, mutta jolle normaalisti ei tapahdu translaatiota. Sellaista geenikonstruktiota tässä yh-. teydessä nimitetään "antisense-RNA-geeniksi" ja sellaista RNA-transkriptia nimitetään i i · • · · V.2iJ "antisense-RNA":ksi. Antisense-RNA:ille ei normaalisti voi tapahtua translaatiota, mikä * · '1' johtuu siitä, että antisense-RNA-sekvenssissä on translaation pysäytyskodoneja.

• · * · · 1 « • · · • « t * · · · "Komplementaarinen DNA" eli "cDNA"-geeni sisältää yhdistelmägeenejä, jotka on ♦» · « syntetisoitu mRNA:n käänteistranskriptiolla ja joista välissä olevat sekvenssit (intronit) » 25 on poistettu.

• « · • · ·«

Sellaisella entsyymillä, joka on homologinen keksinnön Trichoderma-isännän kanssa, tarkoitetaan, että isäntälajien transformoimaton Trichoderma tuottaa luonnostaan saman • · määrän luonnonmukaista proteiinia; keksinnön Trichoderma-isännälle homologisella ,3D geenillä tarkoitetaan geeniä, joka esiintyy sellaisen transformoimattoman Trichoderman I t f ^"""" • · » ^ . genomissa, joka on samaa lajia kuin isäntälajit.

* »i » · 11

Keksinnön Trichoderma-isännälle heterologisella entsyymillä tarkoitetaan, että sellainen transformoimaton Trichoderma. joka on samaa lajia kuin isäntälajit, ei tuota samaa määrää luonnonmukaista entsyymiä; keksinnön Trichoderma-isännälle heterologisella geenillä tarkoitetaan geeniä, joka ei esiinny sellaisen transformoimattoman Trichoder-5 man genomissa, joka on samaa lajia kuin isäntälajit.

Hybridisaatio. Hybridisaatiolla tarkoitetaan olosuhteita, joissa kaikki Trichoderman ksylanaasigeenit hybridisoituvat nukleiinihapposekvenssiin, joka koodittaa T. reesein ksylanaasin pl 5,5 aminohapposekvenssiä, tai nukleiinihapposekvenssiä, joka koodittaa 10 T. reesein ksylanaasin pl 9 aminohapposekvenssiä. Näille olosuhteille on ominaista, että hybridisoidaan mieluummin 60-68 °C:ssa ja niin että läsnä on 6 x SSC + 0,1 prosenttia SDS:ää, ja pestään 68 °C:ssa, jolloin on läsnä 6 x SSC +0,1 prosenttia SDS:ää.

Kloonausvehikkeli. Kloonausvehikkelillä tarkoitetaan plasmidia tai faagi-DNA:ta tai 15 muuta DNA-sekvenssiä (kuten esimerkiksi lineaarista DNA), joka antaa käyttöön sopi van nukleiinihappoympäristön, jotta kiinnostava geeni voidaan siirtää isäntäsoluun. Keksinnön kloonausvehikkelit voidaan rakentaa, siten että ne replikoituvat autonomisesti prokaryootti- tai eukaryootti-isännissä. Kloonausvehikkelit eivät yleensä replikoidu . autonomisesti Trichodermassa. ja sen sijaan ne yksinomaan antavat käyttöön kuljetti- » S · j.M men, jolla kiinnostava geeni voidaan siirtää Trichoderma-isäntään myöhempää insertiota t · ] .·, varten Trichoderma-genomiin. Kloonausvehikkeliä voidaan lisäksi luonnehtia yhdellä • endonukleaasin tunnistamiskohdalla tai pienellä lukumäärällä tällaisia tunnistamiskohtia, 4 * · «· · ,i, joissa näitä DNA-sekvenssejä voidaan leikata määrätyllä tavalla, ilman että vehikkelin ·««» varsinainen biologinen toiminta häviää, ja joihin DNA voidaan silmukoida, jotta aikaan-25 saadaan tällaisen DNA:n replikaatio ja kloonaus. Kloonausvehikkeli voi sisältää lisäksi ··« markkerin, joka soveltuu siihen, että identifioidaan soluja, jotka on transformoitu kloo- 4 Γ·· s’:*: nausvehikkelillä. Markkerit ovat esimerkiksi tetrasykliiniresistenssi tai ampisil- liiniresistenssi. Sanaa "vektori" käytetään joskus "kloonausvehikkelistä". Vaihtoehtoi-sesti sellaisia markkereita voidaan aikaansaada kloonausvehikkelillä, joka on erillään ,30 siitä vehikkelistä, jolla kiinnostava geeni hankitaan.

• » i * · • « · • ··

Ilmentvmisvehikkeli. Ilmentymisvehikkeli on sellainen vehikkeli tai vektori, joka on samanlainen kuin kloonausvehikkeli mutta joka pystyy ilmentämään kiinnostavaa gee 12 niä, joka siihen on kloonattu, sen jälkeen kun se on transformoitu haluttuun isäntään. Edullisessa sovellutusmuodossa tällainen ilmentymisvehikkeli aikaansaa, sen jälkeen kun haluttu isäntä on sillä transformoitu, sellaisen kiinnostavan geenin lisätyn ilmentymisen, joka on siihen kloonattu.

5

Kiinnostava geeni, joka sieni-isännälle annetaan käyttöön kloonaus- tai ilmentymisve-hikkelin osana, integroidaan edullisessa sovellutusmuodossa sienen kromosomiin. Sellaisia sekvenssejä, jotka ovat peräisin kloonausvehikkelistä tai ilmentymisvehikkelistä, voidaan myös integroida kiinnostavan geenin kanssa integraatiotapahtuman aikana.

10

Kiinnostava geeni voidaan mieluummin asettaa sellaisten tiettyjen kontrollisekvenssien (se on toiminnallisesti kytkettyjen), kuten esimerkiksi promoottorisekvenssien, kontrollin alle, jotka vektori (joka integroituu kiinnostavan geenin kanssa) antaa käyttöön. Jos halutaan, sieni-isännän kromosomi voi antaa käyttöön tällaisia kontrollisekvenssejä, 15 mikä on tulos insertion paikasta.

Ilmentymisen kontrollisekvenssit ilmentymisvektorilla vaihtelevat sen mukaan, onko vektori konstruoitu ilmentämään tiettyä geeniä prokaryootti- tai eukaryootti-isännässä (esimerkiksi sukkulavektori voi antaa käyttöön geenin bakteeri-isäntien valintaa varten), 20 ja vektori voi lisäksi sisältää transkriptioelementtejä, kuten esimerkiksi voimistaja-elem- : nettejä, päätesekvenssejä ja (tai) translaation aloitus- ja päättämiskohtia.

• · · • · 1 • · • · • · · ”·' Trichoderma-isäntien geneettinen konstruointi • · · • · · • · · · • · · *35 Keksinnön isäntien geneettinen konstruointimenetelmä on tehty helpoksi, siten että on • · · • · « kloonattu geenisekvenssejä, jotka pystyvät koodittamaan haluttua entsyymiaktiivisuutta, . sekä ilmentämällä tällaisia geenisekvenssejä. Tässä yhteydessä käytettynä termin "gee- *·;·. nisekvenssit" on tarkoitus viitata nukleiinihappomolekyyliin (mieluummin DNA:han).

• · · • # Sellaiset geenisekvenssit, jotka pystyvät koodittamaan haluttua entsyymiä, ovat peräisin $0. erilaisista lähteistä. Näihin lähteisiin sisältyvät genominen DNA, cDNA, synteettinen • · . DNA sekä niiden yhdistelmät.

• · · • · · • · · · • » · • · · * · 13

Mesofiilinen imperfect fungus Trichoderma reesei (ennen T. viridae) luokitellaan Fungi imperfectin jäseneksi. Fungi imperfecti on kaikenlaisten sellaisten sienten kategoria, jotka eivät lisäänny suvullisesti tai joilla ei ole ilmeistä sukulaisuutta suvullisesti lisääntyvien sukujen, kuten esimerkiksi erittäin luonteenomaisen Aspergilluksen kanssa.

5 Vaikka Trichodermalla on raportoitu huonosti määritelty suvullinen aste, joka on per fect ascomycete -lajien Hypocrean imperfect-aste, Aspergillus- ja Trichoderma-sukuia on taksonomisesti selvästi pidetty hyvin erilaisina.

Tämän keksinnön mukaisia parannettuja entsyymivalmisteita tuotetaan Trichoderma-10 sienellä, jota on muunnettu yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Keksinnön mukaiset Tricho- derma-isännät on muunnettu siten, että ne pystyvät tuottamaan entsyymien, mieluummin hemisellulaasien suuria määriä. Tämän lisäksi nämä isännät on muunnettu siten, että niiltä puuttuu kokonaan ainakin yksi sellulaasientsyymi (jonka aktiivisuus ei ole toivottavaa massan ja paperin valmistuksessa). Vaikka täten jäljelle jäävät sellulaasiaktiivisuu-15 det voivat olla koskemattomia, keksinnön mukaisilta Trichoderma-isänniltä puuttuu osittain tai täydellisesti entsyymien välttämätön sellainen täysi määrä, joka pilkkoo selluloosan täydellisesti glukoosiksi, ja sen tähden tällainen selluloosan hajoaminen on suuresti vähentynyt tai täydellisesti estynyt.

20 Trichoderman transformaatio uudella geenikonstruktiolla • · · • · · • · · · • · · • · · : ·’ Eräässä suoritusmuodossa on transformoitu esillä olevan keksinnön Trichoderma-isän- • · · /•f tiä, joista puuttuu osittain tai täydellisesti ainakin yksi sellulaasiaktiivisuus, sellaisella • · · • · · **·.* geenikonstruktiolla, joka pystyy ilmentämään ainakin yhtä haluttua massan- ja paperin- • · · '125 valmistuksen entsyymiä, joka on Trichodermalle homologinen, niin että aikaansaadaan • · · • · · tämän entsyymin lisääntyneitä määriä Trichoderma-isännässä. Sellaisten homologisten entsyymien esimerkkeihin, joita halutaan massan- ja paperinvalmistukseen, sisältyy esimerkiksi hemisellulaaseja ja pektiiniä hajottavia entsyymeitä. Trichoderma pystyy • · · * . luonnostaan tuottamaan erilaisia hemisellulaaseja, joihin sisältyy endoksylanaaseja, • · 30. mannanaaseja, β-ksylosidaaseja, a-arabinosidaasia, α-glukuronidaasia sekä asetyylieste-« · . raasi, joista kukin voi olla entsyymi, joka halutaan keksinnön mukaisiin valmisteisiin.

• · · • · · *·* Myös luonnonmukainen Trichoderma tuottaa vähäisiä määriä pektiiniä hajottavia ent- • · · *· ’· syymeitä, kuten esimerkiksi polygalakturonidaasia, joka voidaan luokitella entsyymiksi, 14 joka halutaan keksinnön mukaisiin entsyymivalmisteisiin. Lisäksi mitä tahansa muuta Trichoderma-entsvvmiä. joka hapettaa selluloosaa, voidaan käyttää hyväksi keksinnön mukaisissa entsyymivalmisteissa, ja se voi olla haluttu entsyymi.

5 Trichoderma reesei QM 9414: n, Aspergillus awamori VTT-D-75028:n, Fusarium oxvsporum VTT-D-80134:n, Bacillus subtilis ATCC 1271 l:n ja Streptomvces olivocho-romogenes ATCC 21713:n tuottamien ksylanolyyttisten entsyymien vertailu on osoittanut, että T. reesei tuotti suurimmat ksylanaasiaktiivisuudet. Sen tähden sellaisissa olosuhteissa, joissa ksylanolyyttinen aktiivisuus halutaan säilyttää, T. reesei on edulli-10 nen isäntä. (Poutanen, K., "Characterization of Xylanolytic Enzymes for Potential

Applications" julkaisussa Dissertation for degree of Doctor of Technology, Technical Research Center of Finland, julkaisut 47).

Vaikka yllä mainitut valmisteet, jotka olivat peräisin erilaisista mikrobilähteistä, erosi- 15 vat β-ksylosidaasiaktiivisuuden sekä sivuketjuja pilkkovan aktiivisuuden suhteen, T\ reesein viljelyalusta sisälsi tämän lisäksi kaikkia määritettyjä, sivuketjuja pilkkovia

aktiivisuuksia (asetyyliesteraasia, α-glukuronidaasia ja α-arabinosidaasia), kun taas R

oxvspommin ja S. olivochromogenesin viljelyalustat sisälsivät vain esteraasia. Tricho- derma on täten edullinen isäntä, koska se tuottaa luonnostaa laajan spektrin ksylano- 20 lyyttisiä entsyymeitä, joiden osuuksia voidaan manipuloida geenitekniikan avulla erilai- • · · siä sovellutuksia varten, jotta aikaansaadaan entsyymivalmisteita, jotka on räätälöity • · · • · * 1 näitä tarkoituksia varten.

• · · • · • · · • · • · · • · · **V Tämän keksinnön mukaan sellaisia geenirakenteita, jotka koodittavat homologisia ent- • ·· · __ .*£5 syymeitä, joita halutaan massan- ja paperinvalmistustarkoituksiin, voidaan viedä Tricho- • · m derman genomiin ja myös voimistettu ilmentyminen voidaan saavuttaa, siten että käyte-tään voimakkaita promoottoreita, kuten esimerkiksi cbhl:htä. ja jos halutaan, uusia ja • · · · muunnettuja säätelyalueita, kuten esimerkiksi voimistajasekvenssejä. Tällaiset säätely-alueet mieluummin ovat Trichodermalle homologisia. Säätelyaluetta ja erityisesti pro- • · . 3Q; moottoria voidaan muuntaa, jotta se sisältää ainoastaan niitä sekvenssielementtejä, joita • · tarvitaan ilmentymiseen ja (tai) siihen, että säilytetään alue, joka vastaa suurista ilmen- • · · • · « I . tymistasoista. Voimistajasekvenssejä voidaan viedä sisään kiinnostavan geenin kanssa • · · • «· samanaikaisesti, siten että ne ovat erillisenä DNA-elementtinä mutta toiminnallisesti 15 kiinnostavaan geeniin kytkettyinä, esimerkiksi DNA-sekvenssinä, joka on kolineaarinen sekvenssin kanssa, joka antaa käyttöön kiinnostavan geenin (esimerkiksi 5’- tai 3’-ei-translaatiosekvenssissä tai intronissa).

5 Erityisen edullisessa sovellutusmuodossa Trichoderman genomiin viety homologinen geeni on geeni, joka koodittaa homologista hemisellulaasia, mieluummin ksylanaasia.

On puhdistettu kaksi pääksylanaasia, joita T. reesei tuottaa (Tenkanen, M., Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 (1992)). Entsyymien isoelektriset pisteet ovat 5,5 (XYLI) ja 9,0 (HYLII), ja niiden molekyylimassat ovat vastaavasti 19 ja 20 kDa.

10

Trichoderma Teeseiltä saadun ksylanaasi I -entsyymin optimiaktiivisuus on happamemmalla pH-alueella, kun taas ksylanaasi Π:η pH-optimi on lähellä neutraalia pH-aluetta. Kahden ksylanaasin erilaisten ominaisuuksien vuoksi yhtä näistä entsyymeistä tai niiden seosta voidaan käyttää erilaisissa sovellutuksissa (WO 92/03541 ja Viikari et ai.. "Im-15 portant Properties of Xylanases for Use in Pulp and Paper Industry" julkaisussa Bio technology in Pulp and Paper Industry, Kuwahara, M. ja Shimada, M. toimittajat,

Proc. 5th Int. Conf. Biotechnology in Pulp and Industry, Uni Publishers Co., Ltd., Tokio, 1992, ss. 101-106).

20 Keksinnön mukaan on mahdollista käyttää geenitekniikan menetelmiä, jotta haluttu • · · ”·/ ksylanolyyttinen aktiivisuus rikastuu viljelyalustaan, ja tätä viljelyalustaa on mahdollista • · · : *.* käyttää halutussa sovellutuksessa. Esimerkiksi joissakin valkaisuvaiheissa ja -olosuhteis- • · · • · sa voi olla edullista käyttää ksylanaasi I:tä (happamempi alue), joissakin muissa vai- • · · • · · '**.* kaisusekvensseissä ja -olosuhteissa ksylanaasi II voi olla edullinen (alkalinen tai neut- *‘25 raali pH-alue).

• · ·

Joissakin sovellutuksissa, vaikka yksi sellulolyyttinen aktiivisuus voi olla poistettu, • · · · vähennetty, inaktivoitu tai repressoitu, voidaan haluta viedä isäntäsoluihin geeni, joka * . koodittaa erilaista sellulolyyttistä entsyymiä, niin että yksi spesifinen sellulolyyttinen • · 30. aktiivisuus voimistuu. Esimerkiksi rehuteollisuudessa hemisellulolyyttisen aktiivisuuden • · lisäksi voidaan käyttää entsyymivalmistetta, joka sisältää endoglukanaasin lisääntyneitä • · · f . määriä. Täten sellaisissa valmisteissa, joissa halutaan tällaista hydrolyysiä, voidaan • · · • · · • · ksylanaasien ja muiden hemisellulaasien lisäksi käyttää endoglukanaasien lisättyjä mää riä.

16

Toisessa sovellutusmuodossa transformoidaan Trichoderma-isäntä. joka jo ilmentää 5 entsyymin homologista muotoa, sellaisella geenikonstruktiolla, joka koodittaa saman entsyymin heterologista muotoa. Lisäsovellutusmuodossa transformoidaan Trichoderma-isäntä, joka ei ilmennä tiettyä entsyymiä, yhdellä tai useammalla sellaisella geenikonstruktiolla, joka koodittaa entsyymiä (entsyymejä), jotka ovat Trichodermalle hetero-gisia.

10 Tämän keksinnön mukaan saadaan lisääntyneet määrät heterologista entsyymiä, jonka aktiivisuutta halutaan massan- ja paperin valmistustarkoituksiin, siten että viedään spesifiseen lokukseen geeni, joka tuottaa tällaista heterologista, haluttua entsyymiä, tai geeni viedään Trichoderman genomiin monina kopioina, kuten edellä kuvattiin.

15

Haluttua entsyymiä koodittava geeni insertoidaan edullisessa sovellutusmuodossa cbhl- lokukseen, siten että se on toiminnallisesti kytketty voimakkaaseen cbhl -promoottoriin.

Kuten myöhemmin kuvataan, voimistettu tuotto aikaansaadaan, siten että käytetään voimakkaita promoottoreita, kuten esimerkiksi cbhlrhtä. Kuten myöhemmin kuvataan, 20 heterologisen entsyymin lisääntyneet määrät voidaan myös saavuttaa, kun Trichoderman « · · : sellulaasia tuottava kapasiteetti on yleensä alentunut, vieläpä jos heterologista geeniä ei • « · : ** ole insertoitu cbhl-lokukseen.

• ~ » • · · • · • · · • · • · · • · · “Y Haluttua entsyymiä koodittava geeni, joko homologinen tai heterologinen, kuten esimer- *125 kiksi hemiselluloosaa hydrolysoiva entsyymi, voidaan integroida Trichoderman geno- • · · miin, siten että geeni insertoidaan yleiseen ekspressiovektoriin, esimerkiksi pAMHllO:-een, jota kuvataan patenttihakemuksessa EP 244 234. pAMHllO on peräisin pUC19:stä • · · · (Yanish-Perron et ai.. Gene 33:103-119 (1985), ja se sisältää cbhl-geenin promootto- • · · ' , rin ja lopetuskodonin sekä sullojafragmentin, joka sijaitsee promoottori- ja lopetusko- • · 30. donisekvenssien välissä ja voidaan poistaa, siten että pilkotaan SacII:lla ja Ndel:llä. Sen • · • jäi- keen kun päät on typistetty, mikä tahansa DNA, cDNA tai kromosomiperäinen • · * *·* * DNA voidaan insertoida promoottorin ja lopetuskodonin väliin. Haluttu geeni voidaan • · · • · · • · insertoida cbhl-ilmentvmiskasettiin. joka on plasmidissa pAMHllO, cbhl-promoottorin ja lopetuskodonin väliin.

17

Muiden geenien transkription säätelyelementtejä voidaan käyttää siellä, missä ei haluta 5 käyttää cbhl-elementteiä. Esimerkiksi sellaista vektorikonstruktiota, joka sisältää 3- fosfoglyseraattikinaasigeenin (pgk) transkription säätelyalueita ja jota voidaan käyttää 3-fosfoglyseraattikinaasina, joka on avainentsyymi glykolyysissä tapahtuvaa ATP:n tuottoa varten, ilmennetään glukoosin puuttuessa, missä olosuhteissa sellulaasien synteesi on tukahtunut.

10

Vaikka keksijöiden tarkoituksena ei ole sitoutua mihinkään tiettyyn teoriaan, Trichoder-man genomiin integroidun halutun geenin kopioiden lukumäärä sekä geenin integraation paikka genomissa näyttävät vaikuttavan halutun geenin ilmentymisen tehokkuuteen. Edullisessa sovellutusmuodossa suunnataan halutun geenin integraatio spesifiseen lokuk-15 seen. Lineaarisen DNA:n käyttö auttaa tällaisessa integraation suuntaamisessa. Erittäin edullisessa sovellutusmuodossa suunnataan halutun geenin integraatio Trichoderman cbhl-lokukseen.

Tämän keksinnön mukaisia DNA-konstruktioita voidaan käyttää Trichoderma-kannan 20 transformointiin. Sellaisiin kantoihin sisältyvät esimerkiksi T. reesein kannat QM9414 • a · (ATCC 26921), RUT-C-30 (ATCC 56765) sekä erittäin hyvätuottoiset mutantit, kuten • · · * ; esimerkiksi VTT-D-79125, joka on QM91414:n jälkeläinen (Nevalainen 1985, Techni- * · · « · cal Research Centre of Finland Publications 26, (1985), Espoo, Suomi). Trichoderma λ · · • · · "V voidaan transformoida millä tahansa tekniikan tasoisella menetelmällä ja erityisesti ‘*35 sellaisella tekniikalla, joka esitetään EP 244 234:ssä.

• · ·

Trichoderma-isäntäsoluia voidaan viljellä ja haluttuja entsyymejä tuottaa, siten että « ··· viljellään isäntäkantaa, jolla on halutut ominaisuudet, missä tahansa olosuhteissa, jotka ' . tekevät mahdolliseksi ilmentää haluttuja entsyymejä. Esimerkiksi sellaista Trichoderma- • · ^30; isäntäkantaa, jolla on haluttuja ominaisuuksia, voidaan viljellä nestemäisessä viljelyalue-• « ;t tässä, joka voi sisältää esimerkiksi 6 prosenttia Solka Floc -selluloosaa, 3 prosenttia * « « . käytettyä, 0,5 prosenttia KH2P04:ää, 0,5 prosenttia (NH4)2S04:a, 0,1 prosenttia strukto- * · · • * · ’ * lia. Glukoosi tukahduttaa herkästi Trichoderma-kantoien sellulaasin tuottamisen, ja se 18 edellyttää induktoria, kuten esimerkiksi selluloosaa, laktoosia tai soforoosia (Allen et ai., Biotechnology and Bioengineering 33:650-656 (1989). Trichoderman viljelyssä pH tulisi pitää noin 5:ssä, siten että lisätään fosforihappoa tai ammoniakkia ja lämpötila pidetään 30 °C:ssa viljelyn aikana. Kuitenkin lämpötila tulisi säätää kannan ja sen 5 entsyymipreparaatin mukaan, jota tuotetaan (Merivuori et ai.. Biotechnology Lett.

12:117-120 (1990)).

DNA:n kloonaus 10 Vektorijäqestelmiä voidaan käyttää menetelmässä, jossa valmistetaan Trichoderma- isäntiä keksinnön mukaisten entsyymien tuottamista varten. Yksi elementti, jonka tällainen vektorikonstruktio antaa käyttöön, voi koodittaa ainakin yhden homologisen geenin sekvenssiä, jonka aktiivisuus halutaan jättää pois, jota halutaan vähentää, inaktivoida, deletoida tai tukahduttaa. Tällainen vektorikonstruktio (a) voi antaa lisäksi käyttöön 15 erillisen vektorikonstruktion (b), joka koodittaa ainakin yhtä haluttua geeniä, joka on integroitava Trichoderman genomiin, sekä (c) valittavissa olevan markke-rin, joka on kytketty (a):han tai (b):hen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää erillistä vektoria.

£0 Sellainen kloonattu DNA, jota käytetään keksinnön mukaisissa isännissä, voi sisältää t · t • ψ · 'CV introneita, jotka esiintyvät luonnonmukaisesti, tai se voi olla ilman niitä. Ennen kaikkea 4 » f f · ‘ *.t tällainen genominen DNA voidaan saada, siten että se on yhdistetty DNA-geenisek- .*/, venssin luonnonmukaisen 5’-promoottorialueen ja (tai) transkription 3’-päättymisalueen • t « *·. kanssa, jos sellaiset sekvenssit pystyvät toimimaan Trichodermassa. Tämän lisäksi *·!· /25 tällainen genominen DNA voidaan saada yhdistettynä geenisekvensseihin, jotka kooda tavat mRNA:n 5’-aluetta, jolle ei tapahdu translaatiota, ja (tai) yhdistettynä geenisek-vensseihin, jotka koodittavat 3’-aluetta, jolle ei tapahdu translaatiota. Siinä laajuudessa, * - · * jossa Trichoderma-isäntäsolu voi tunnistaa transkription ja (tai) translaation säätelysig-naalit, jotka liittyvät mRNA:n ja proteiinin ilmentymiseen, luonnonmukaisen geenin 5’- * · „3ft ja (tai) 3’-alueet, joille ei tapahdu transkriptiota, ja (tai) mRNA:n 5’- ja (tai) 3’-alueet, • · joille ei tapahdu translaatiota, voidaan säilyttää ja käyttää transkription ja translaation i « i * · · \ . säätelyyn. Genominen DNA voidaan säilyttää keksinnön tason tunnettujen menetelmien « · · • *» mukaan (katso esimerkiksi Guide to Molecular Cloning Techniques, S.L. Berger et ai..

19 toimittajat, Academic press 81987). Käytetyn mRNA-valmisteen tulee mieluummin olla rikastettu mRNA:n suhteen, joka koodittaa haluttua proteiinia, joko luonnostaan, tai siten että se eristetään soluista, jotka tuottavat suuria määriä proteiinia, tai mRNA:a rikastetaan in vitro sellaisilla menetelmillä, joita yleisesti käytetään mRNA-valmisteiden 5 rikastamiseen spesifisten sekvenssien suhteen, kuten esimerkiksi sakkaroosigradient- tisentrifugoinilla, tai mRNA on rikastettu sekä luonnostaan että in vitro.

Kun kloonataan vektoriin, tähän tarkoitukseen sopivat DNA-valmisteet (joko genominen DNA tai cDNA) leikataan satunnaisesti tai pilkotaan vastaavasti entsymaattisesti ja sidoit) taan sopiviin vektoreihin, jotta yhdistelmägeenikirjasto (joko genominen tai cDNA) muodostuu.

Sellainen DNA, joka koodittaa haluttua proteiinia, voidaan insertoida DNA-vektoriin tavanomaisin tekniikoin, joihin kuuluvat tylppä- tai vuorottaispäiset päätteet, ko-15 heesiopäiden sopiva täyttäminen, käsittely alkalisella fosfataasilla, jotta vältetään sellai nen yhteenliittäminen, jota ei toivota, sekä sitominen sopivilla ligaaseilla. Tällaiset manipulaatiotekniikat, joita Maniatis, T., et ai., supra, julkistavat, ovat tekniikkan tason mukaan tunnettuja.

# ^20 Voidaan seuloa sellaisia kirjastoja, jotka sisältävät haluttua proteiinia koodittavia kloo- i · t {•V neja, jotka on identifioitu millä tahansa selektiivisillä, mainitun proteiinin DNA:n f · , /·. valitsevilla keinoilla, kuten esimerkiksi, siten että a) hybridisoidaan sopivan nukle- • » * t · j .·. iinihappokoettimen (sopivien nukleiinihappokoettimien) kanssa, jotka sisältävät tälle IM · proteiinille spesifisen sekvenssin, tai (b) käytetään hybridisaation perusteella valittua

»IM

·*·2£ translaatioanalyysiä, jossa luonnonmukaiselle mRNA:lle, joka hybridisoituu kyseessä olevann klooniin, suoritetaan translaatio in vitro ja translaatiotuotteet karakterisoidaan ·:* edelleen, tai c) jos kloonamt geenisekvenssit itse pystyvät ilmentämään mRNA:ta, im- i’i : munologisesti seostetaan proteiinituote, joka translaatiossa on saatu isännän avulla, joka 9 sisältää kloonin.

• *

-M

#···, Sellaisia oligonukleotidikoettimia, jotka ovat spesifisiä halutuille proteiineille, voidaan * t* 9 ,·. j käyttää silloin, kun identifioidaan tällaisia proteiineja vastaavia klooneja, joita voi- * M • * daan konstruoida proteiinin aminohapposekvenssiä koskevan tiedon perusteella.

20

Koska geneettinen koodi on degeneroitunut, tiettyä aminohappoa koodittamaan voidaan käyttää useampaa kuin yhtä koodia (Watson, J.D., julkaisussa Molecular Biology of the Gene, kolmas painos, julkaisija W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), ss. 356-357). Peptidifragmentit analysoidaan, jotta voidaan identifioida sellaiset aminohap-5 pojen sekvenssit, joita koodittavat oligonukleotidit, joiden degeneraatioaste on pienin.

Tämä suoritetaan mieluummin, siten että identifioidaan sekvenssit, jotka sisältävät aminohappoja, joita yksi ainoa kodoni koodittaa.

Vaikka yksi ainoa oligonukleotidisekvenssi voi koodittaa aminohapposekvenssiä, sitä 10 voi koodittaa usein mikä tahansa samanlaisten oligonukleotidien sarja. Tärkeää on, että kun tämän sarjan kaikki jäsenet sisältävät oligonukleotidisekvenssejä, jotka pystyvät koodittamaan samaa peptidifragmenttia ja täten mahdollisesti sisältävät saman nukleoti-disekvenssin kuin geeni, joka koodittaa peptidifragmenttia, ainoastaan yksi saijan jäsen sisältää nukleotidisekvenssin, joka on identtinen eksonille, joka koodittaa geenisekvens-15 siä. Koska tämä jäsen on sarjan sisällä ja se pystyy hybridisoitumaan DNA:hän vieläpä silloin, kun sarjan muut jäsenet puuttuvat, on mahdollista käyttää oligonukleotidien fraktioimatonta sarjaa samalla tavalla, kuin jos käytettäisiin yhtä ainoaa oligonuldeotidiä sellaisen geenin kloonaamiseen, joka koodittaa peptidiä.

20 Geneettistä koodia käyttämällä (Watson, J.D. julkaisussa Molecular Biology of the • · · :·: · Gene, kolmas painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977) voidaan amino- • · · • · · : ·’ happosekvenssistä identifioida yksi tai useampia oligonukleotidejä, joista kukin pystyisi • · · *··; koodittamaan proteiinia. Todennäköisyyttä, että tietty oligonukleotidi oikeastaan muo- • · « dostaa varsinaisen proteiinin sekvenssin, voidaan arvioida ottamalla huomioon epänor- • · · '25 maalit emäspariutumissuhteet ja taajuus, jolla tiettyä kodonia varsinaisesti käytetään • · · (tietyn aminohapon koodittamiseen) eukaryoottisoluissa. Lathe, R., et ai. julkaisivat tällaiset "kodonin käyttösäännöt" julkaisussa J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Lathen • · · · "kodonin käyttösääntöjen" avulla identifioidaan yksi ainoa oligonukleotidisekvenssi tai • · · • . oligonukleotidien sarja, joka tai jotka sisältävät teoreettisen, "todennäköisimmän" nukle- • · 30. otidisekvenssin, joka pystyy koodittamaan identifioitua proteiinisekvenssiä.

• · 21 dille tai oligonukleotidien sarjalle) voidaan syntetisoida tekniikan tason mukaisin, hyvin tunnetuin menetelmin (katso esimerkiksi, Synthesis and Application of DNA and RNA, S. A. Narang, toimittaja, 1987, Academic Press, San Diego, CA) ja sitä voidaan käyttää koettimena halutun, kloonatun geenin identifiointiin, kun käytetään mainitunlaatuisia,

5 hyvin tunnettuja menetelmiä. Maniatis, T. et ai., (julkaisussa Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, Cold Sring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)) ja Hames, B.D., et ai. (julkaisussa Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) ovat julkaisseet nukleiiinihappohybridisaatio- ja kloonin identifiointitekniikoita.

10

Tekniikan tason mukaisesti hyvin tunnettuja ovat kloonaustekniikat, joissa käytetään oligonukleotidejä ja PCR:ää ("PCR Protocols" julkaisussa A Guide to Methods and Application, Innis et ai., julkaisijat, Academis Press, San Diego (1990)). Yllä kuvatun geenikirjaston ne jäsenet, joiden on havaittu pystyvän sellaiseen hybridisaatioon, on 15 sitten analysoitu, jotta on määritetty niiden sisältämien, haluttujen, genomisten kooditta- vien sekvenssien laajuus sekä luonne.

Halutun, DNA:ta koodittavan sekvenssin ilmaisemisen helpottamiseksi, edellä kuvattu DNA-koetin on leimattu ryhmällä, joka ilmaistaan. Tällainen ilmaistava ryhmä voi olla 20 mitä tahansa materiaalia, jolla on ilmaistava fysikaalinen tai kemiallinen ominaisuus.

• · · “·/ Nukleiinihappohybridisaation alueella ilmaisu- materiaalit ovat hyvin kehitettyjä, ja • · · * I esillä olevassa keksinnössä yleensä voidaan käyttää useimpia niistä leimoista, jotka ovat • · · • · · .**! näissä menetelmissä käyttökelpoisia. Erityisen käyttökelpoisia ovat ei-radioaktiiviset • · · • · · **Y leimat, kuten esimerkiksi digoksigeniininukleotidit (dUTP) tai radioaktiiviset leimat, 'Ϊ5. kuten esimerkiksi 32P, 3H, 14C, 35S, 125J tai yms.. Voidaan käyttää mitä tahansa radioak-• · · tiivistä leimaa, joka antaa käyttöön riittävän signaalin ja jolla on riittävä puoliintumisai-ka. Oligonukleotidi voidaan leimata radioaktiivisesti tai ei-radioaktiivisesti useilla mene- • ··· telmillä, jotka tunnetaan tekniikan tason mukaan, ja näitä tarkoituksia varten on saata- * . vissa kaupallisia reagenssipakkauksia.

jp/: • · • Vaihtoehtoisesti polynukleotidit ovat myös käyttökelpoisia nukleiinihappohybridisaation • · · f 1 koettimina, kun ne leimataan ei-radioaktiivisella markkerilla, kuten esimerkiksi bio- • · · • · ♦ 1 fiinillä, digoksigeniinillä, entsyymillä tai fluoroivalla ryhmällä, katso esimerkiksi Leary, 22 J.J., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4045 (1983); Renz, M., et ai., Nucl. Acids Res. 12: 3435 (1984); sekä Renz, M., EMBO J. 6:817 (1983).

Täten yhteenvetona voidaan sanoa, että proteiinin sekvenssin (tai proteiinin osittaisen 5 sekvenssin) varsinainen identifiointi tekee mahdolliseksi identifioida teoreettisesti "to dennäköisin" DNA-sekvenssi tai sellaisten sekvenssien sarja, joka pystyy koodittamaan kyseistä peptidiä. Konstruoimalla sellainen oligonukleotidi, joka on komplementaarinen tälle teoreettiselle sekvenssille (tai konstruoimalla sarja oligonukleotidejä, jotka ovat komplementaarisia oligonukleotidien "todennäköisimmälle sarjalle") saadaan DNA-10 molekyyli (tai sarja DNA-molekyyejä), joka pystyy (jotka pystyvät) toimimaan koetti mena (koettimina), kun identifioidaan ja eristetään klooneja, jotka sisältävät proteiinin geenin.

Geenin kloonauksen vaihtoehtoisessa tavassa valmistetaan kirjasto, siten että käytetään 15 ilmentymisvektoria, johon kloonataan DNA tai mieluummin cDNA, joka on valmistettu solusta, joka pystyy ilmentämään haluttua proteiinia. Sitten kiijasto seulotaan niiden jäsenten suhteen, jotka ilmentävät proteiinia, esimerkiksi siten että kiijasto seulotaan proteiinin vasta-aineilla.

20 Edellä esitetyillä menetelmillä voidaan sen tähden identifioida geenisekvenssejä, jotka • · · • · · _ pystyvät koodittamaan haluttua proteiinia tai tämän proteiinin fragmentteja. Tällaisten • · · • · * I geenisekvenssien lisäkarakterisointia varten ja yhdistelmäproteiinin tuottamiseksi on • · · • · · .“I toivottavaa ilmentää proteiineja, joita nämä sekvenssit koodittavat. Tällainen ilmentymi- • · · nen identifioi ne kloonit, jotka ilmentävät proteiineja, joilla on halutun proteiinin omi- • · · · .2£. naisuuksia. Näihin ominaisuuksiin muun muassa sisältyy kyky sitoa spesifisesti vasta-• · · aineita, jotka on suunnattu proteiinia vastaan, saada esiin sellaisten vasta-aineiden tuotto, jotka pystyvät sitomaan proteiinia, sekä kyky aikaansaada vastaanottajasolulle • · · · funktio, joka on proteiinille spesifinen.

• · .39.: Kloonattua proteiinia koodittavat sekvenssit, jotka on saatu edellä kuvatuilla menetelmil- • · lä ja mieluummin kaksisäikeisessä muodossa, voidaan sitoa toiminnallisesti sekvenssei- • · · • · · I . hin, jotka kontrolloivat transkriptioperäistä ekspressiota ekpressiovektorissa, ja viedä • · · • · ·

Trichoderma-isäntäsoluun. jotta tuotetaan yhdistelmäproteiinia tai sen toiminnallista 23 johdannaista. Sen mukaan, mikä proteiinia koodittavan sekvenssin säie kytketään toiminnallisesti sekvensseihin, jotka kontrolloivat transskriptioperäistä ekstressiota, on mahdollista ilmentää antisense-RNA:ta tai sen funktionaalista johdannaista.

5 Nukleiinihappomolekyylin, kuten esimerkiksi DNA: n, sanotaan "pystyvän ilmentä mään" polypeptidiä, jos se sisältää ilmentymistä kontrolloivia sekvenssejä, jotka sisältävät transskriptiota koskevaa säätelyinformaatiota, ja jos sellaiset sekvenssit on "toiminnallisesti sidottu" nukleiinihapposekvenssiin, joka koodittaa polypeptidiä.

10 Toiminnallinen sidos on sidos, jolla sekvenssi on yhdistetty säätelysekvenssiin (tai sekvensseihin) sillä tavalla, että sekvenssin ilmentyminen asetetaan säätelysekvenssin vaikutuksen tai kontrollin alle. Kahden DNA-sekvenssin (kuten proteiinia koodittavan sekvenssin ja promoottorialueen, joka on yhdistetty koodittavan sekvenssin 5’-päähän) sanotaan oleva toiminnallisesti sidottuja, jos (1) promoottorin toiminnan induktion 15 seurauksena ei aikaansaada lukuvaiheistuksen mutaatiota, (2) jos ei häiritä ilmentymisen säätelysekvenssien kykyä ohjata mRNA:n, antisense-RNA:n tai proteiinin ilmentymistä, tai (3) jos ei häiritä promoottorin säätelyalueen kykyä transkriboida templaattia. Täten promoottori olisi toiminnallisesti kytketty DNA-sekvenssiin, jos promoottori pystyisi aikaansaamaan tuon DNA-sekvenssin transkription.

20 • · » • · · I".' Sellaisten säätelyalueiden tarkka luonne, joita tarvitaan geenin ilmentymiseen, voi • · · • · '. vaihdella lajien ja solutyyppien mukaan, mutta yleensä niiden tulee sisältää välttämättä • · 5’- sekvenssejä, joille ei tapahdu transkriptiota eikä translaatiota (ei-koodittavia sek- • · ·

• ·· I

venssejä) ja jotka liittyvät vastaavasti transkription ja translaation aloittamiseen.

• · · t .25.

• · ·

Proteiinin ilmentyminen Trichoderma-isännissä edellyttää sellaisten säätelyalueiden .·· käyttöä, jotka toimivat tällaisissa isännissä. Voidaan käyttää monia erilaisia transkripti-• · · · on ja translaation säätelysekvenssejä, koska Trichoderma tunnistaa yleensä eukaryootti- >>t>; isännältä peräisin olevat transkription kontrollit, kuten esimerkiksi ne kontrollisekvens-• · .30.: sit, jotka ovat peräisin sieniltä, joilla on filamentteja. Sellaisilla eukaryooteilla, joilla • · transkriptio ei ole kytketty translaatioon, tällaiset kontrollialueet voivat antaa käyttöön • · · • · · . aloitusmetioniininkodonin (AUG), tai se puuttuu niiltä sen mukaan, sisältääkö kloonattu • · · • · · • · 24 sekvenssi kyseistä metioniinia. Nämä alueet yleensä sisältävät promoottorialueen, joka on riittävä ohjaamaan RNA-synteesin aloittamista isäntäsolussa.

Kuten laajalti tunnetaan, eukaryoottiperäisen mRNA:n translaatio alkaa kodonissa, joka 5 koodittaa ensimmäistä metioniinia. Tästä syystä on parempi varmistaa, että sidos euka ryoottiperäisen promoottorin ja proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin tai sen funktionaalisen DNA-sekvenssin välillä ei sisällä mitään väliin tulevia kodoneja, jotka pystyvät koodittamaan metioniinia. Sellaisten kodonien läsnäolo johtaa joko fuusioproteiinin muodostumiseen (jos AUG-kodoni on samassa lukuvaiheistuksessa kuin proteiinia 10 koodittava DNA-sekvenssi) tai lukuvaiheistuksen mutaatioon (jos AUG-kodoni ei ole samassa lukuvaiheistuksessa kuin proteiinia koodittava sekvenssi).

Säätelyalueet 15 Edullisessa sovellutusmuodossa haluttu proteiini eritetään ympäröivään viljelyalustaan, mikä johtuu Trichoderman homologisen erityssignaalisekvenssin läsnäolosta. Jos halutulla proteiinilla ei ole omaa signaalisekvenssiä, tai jos sellainen signaalisekvenssi ei toimi hyvin Trichodermassa. silloin proteiinia koodittava sekvenssi voidaan yhdistää toiminnallisesti signaalisekvenssiin, joka on homologinen tai heterologinen Trichoder- 20 inalle. Haluttu koodittava sekvenssi voidaan yhdistää mihin tahansa signaalisekvenssiin, • ♦ ♦ ♦ · · 1IV joka sallii, että proteiini erittyy Trichoderma-isännästä, kuten esimerkiksi Trichoder- • · ! .·. man sellobiohydrolaasi I -proteiinin signaalisekvenssiin. Tällaiset signaalisekvenssit • · • · · : .·. voidaan konstruoida spesifisten proteaasikohtien kanssa tai ilman niitä, siten että signaa-• · · • ·· · lisekvenssi on vastuussa myöhemmästä poistosta.

··*· .25-• · ·

Voidaan valita transkription aloituksen säätelysignaalit, jotka sallivat repression tai ··· aktivaation, niin että toiminnallisesti yhdistettyjen geenien ilmentymistä voidaan mu- t »·· :T: kauttaa. Kiinnostavia ovat säätelysignaalit, jotka ovat herkkiä lämpötilalle, niin että lämpötilaa vaihtelemalla ilmentymistä voidaan repressoida tai se voidaan aloittaa, tai .30: ilmentyminen voidaan kohdistaa kemiallisen säätelyn, esimerkiksi substraatin tai meta- .1. boliitin aikaansaaman säätelynm, alaiseksi. Kiinnostavia ovat myös rakenteet, joissa • · · '· ; sekä (a) halutun proteiinin mRNA ja (b) antisense-RNA, joka kohdistuu sellulaasient-• · · syymiin, annetaan käyttöön sellaisissa muodoissa, jotka voidaan transkriboida, kuten 25 esimerkiksi sellaisessa muodossa, että halutun proteiinin mRNA:n ilmentymistä täydentää isännän yhden sellulaasientsyymin ilmentymisen repressio antisense-RNA:lla.

Translaation signaalit eivät ole välttämättömiä, kun halutaan ilmentää antisense-RNA-5 sekvenssejä.

Jos halutaan, sellaiselle sekvenssille, joka koodittaa proteiinia, voidaan saada edellä kuvatuilla menetelmillä 3’-alueita, joille ei tapahdu transkriptiota ja (tai) translaatiota. Sellainen 3’-alue, jolle transkriptiota ei tapahdu, voi säilyttää säätelysekvenssirakenne-10 osansa, jotka koskevat transkription päättymistä, tai ne rakenneosat, jotka koskevat translaation päättymistä, tai ne rakenneosat, jotka ohjaavat polyadenylaatiota.

Keksinnön mukaiset vektorit voivat lisäksi sisältää muita toiminnallisesti yhdistettyjä säätelyrakenneosia, kuten esimerkiksi voimistajasekvenssejä.

15

Trichoderman stabiilien transformanttien ilmaisu

Geneettisesti stabiilit Trichoderman transformantit konstruoidaan edullisessa sovellutus- muodossa, siten että halutun proteiinin DNA yhdistetään isäntäkromosomiin. Haluttua ' 20a proteiinia koodittava sekvenssi voi olla mistä tahansa lähteestä. DNA voidaan yhdistää • · · ’•V de novo solun sisällä tai edullisimmassa sovellutusmuodossa transformaation avulla • · · 1 • · . .·, vektorin kanssa, joka toiminnallisesti insertoituu isäntäkromosomiin, esimerkiksi DNA- • · • « · : rakenneosiin, jotka edistävät DNA-sekvenssien yhdistymistä kromosomeihin.

• ·· · • · · ·· ·· x35: Valitaan sellaiset solut, jotka pysyvästi ovat integroineet sisään viedyn DNA:n kro- mosomeihinsa, siten että viedään sisään myös yksi tai useampia markkereita, jotka *:1 mahdollistavat sellaisten isäntäsolujen valitsemisen, jotka kromosomissa sisältävät : ekspressiovektorin, esimerkiksi markkeri voi aikaansaada resistenssin biosidiä kohtaan, esimerkiksi antibioottiresistenssin tai vastustuskyvyn raskasmetalleja, kuten kuparia •£0· yms. kohtaan. Valittava markkerigeeni sidotaan joko suoraan DNA-geenisekvensseihin, '•j>. jotka on ilmennettävä, tai se viedään samaan soluun kotransfektion avulla.

• » · · • · · • ·· • · 26

Tietyn plasmidin tai virusperäisen vektorin valinnassa tärkeät tekijät ovat seuraavat: sellaiset vastaanottajasolut, jotka sisältävät vektorin, tulee tunnistaa ja valita helposti niiden vastaanottajasolujen joukosta, jotka eivät sisällä vektoria; halutun vektorin kopioiden lukumäärä, joka halutaan tiettyyn isäntään; ja halutaanko pystyä "kuljettamaan 5 vektoria edestakaisin" eri lajien isäntäsolujen välillä.

Kun kerran valmistetaan vektori tai DNA-sekvenssi, joka sisältää konstruktion (konstruktioita) ilmentymistä varten, DNA-konstruktio(t) viedään sopivaan isäntäsoluun jollain monista sopivista keinoista, joihin kuuluu edellä esitetty transformaatio. Vektorin si-10 säänviennin jälkeen vastaanottajasoluja kasvatetaan valikoivassa väliaineessa, joka valitsee transformoitujen solujen kasvun suhteen. Kloonatun (kloonattujen) geenisekvenssin (geenisekvenssien) ilmentyminen antaa tulokseksi halutun proteiinin tai tämän proteiinin fragmentin tuotannon. Tämä proteiini ilmentyy transformoiduissa soluissa jatkuvasti tai säädellyllä tavalla.

15

Koodittavat DNA-sekvenssit, jotka on saatu edellä esitetyillä menetelmillä, antavat käyttöön sekvenssejä, jotka määritelmän mukaan koodittavat haluttua proteiinia ja joita sitten voidaan käyttää, jotta saadaan halutun proteiinin antisense-RNA-geenisekvenssejä, koska antisense-RNA-sekvenssi on sekvenssi, joka sijaitsee sen säikeen vastakkaisella # 20 säikeellä, jossa peptidiytimen mRNA:n transkriptio tapahtuu. Antisense-DNA-säie » · · ••V voidaan myös toiminnallisesti yhdistää promoottoriin ekspressiovektorissa, siten että • · . transformaatio tällä vektorilla antaa isännän, joka pystyy ilmentämään antisense-RNA:ta « ♦ * · ♦ : transformoidussa solussa. Antisense-RNA:ta ja sen ilmentymistä voidaan käyttää, jotta • ·♦ » aikaansaadaan vuorovaikutus endogeenisen DNA:n tai RNA:n kanssa tavalla, joka ·««« j*35; inhiboi geenin transkription tai translaation tai aiheuttaa niistä jomman kumman tai mo- lempien repression. Antisense-RNA-koettimien käyttöä geenin ekspression estämiseen ;!· on käsitelty julkaisussa Lichtenstein, C., Nature 333:801-802 (1988).

• · ♦ ♦ · ·

Trichoderma on erityisen käyttökelpoinen ja käytännöllinen isäntä keksinnön entsyymi- .30; valmisteiden synteesiin, koska Trichoderma pystyy erittämään proteiinia suuria määriä, .’;.t esimerkiksi on raportoitu saadun konsentraatioita, jotka ovat 40 g/1 viljelynestettä; « · · .·. ; homologinen Trichoderman cbhl-promoottori on erittäin sopiva promoottori kiinnosta-« ·· • · van geenin ilmentymistä varten, koska se on voimakas, yksi ainoa kopiopromoottori, 27 joka ohjaa normaalisti Trichoderma-isännästä eritetyn proteiinin synteesiä aina 60 prosenttiin saakka; transformaatiojärjestelmä on monikäyttöinen, ja se voidaan soveltaa jokaiseen kiinnostavaan geeniin. Trichoderma-isäntä antaa käyttöön "eläinsolutyypin", joka glykosyloi mannoosia voimakkaasti; ja Trichoderman viljelyä tukee aiempi, laaja 5 käymistekniikoiden kokemus teollisessa mittakaavassa.

Trichoderma-isännät, joilta ainakin yksi sellulaasientsyymi puuttuu Tämän keksinnön mukaan on mahdollista rikastaa Trichoderma-isäntiä entsyymin suh- 10 teen, jonka aktiivisuutta halutaan massan ja paperinvalmistustarkoituksiin, siten että ainakin yksi sellulaasientsyymi inaktivoidaan tai poistetaan. Yhdessä sovellutusmuodos- sa ainoastaan cbhl-geeni on mutatoitu. Koska Trichoderman eritettämien proteiinien pääosa voi olla sellulaasiaktiivisuutta, jota cbhl-geeni koodittaa (sellobiohydrolaasi, CBHI, proteiini), niin konstruoimalla sellaisia Tri- choderma-isäntiä, joissa cbhl-geeni 15 on mutatoitu inaktiiviseen muotoon, voidaan lisätä niiden jäljelle jäävien proteiinien suhteellista prosenttia, joita Trichoderma erittää viljelyalustaan. Toisessa sovellutus- muodossa haluttu geeni insertoidaan mieluummin cbhl-lokukseen. siten että halutun geenin ilmentyminen on toiminnallisesti liitetty voimakkaaseen cbhl-promoottoriin.

Erittäin edullisessa sovellutusmuodossa cbhl-lokukseen insertoidaan kasetti, joka sisäl- 2.0 tää halutun geenin, joka jo on toiminnallisesti liitetty homologiseen cbhl-promoottoriin.

• « · ♦ · · • · · · •« · * · « • · ‘ ^ Keksinnön mukaisissa isännissä mikä tahansa yksi sellulolyyttinen entsyymi, joitakin • · ;*]·. mainittuja entsyymeitä tai niistä kaikki voidaan poistaa tai inaktivoida, niitä voidaan • · · • ·· · vähentää tai repressoida tekniikan tason mukaisin tunnetuin menetelmin, niin että ai- * « · · .*25. kaansaadaan isäntiä, jotka osittain tai kokonaan ovat kykenemättömiä pilkkomaan sellu- * · · loosaa glukoosiksi. Sellaisia sellulolyyttisiä entsyymiaktiivisuuksia, joita ei haluta, ··· voidaan poistaa, vähentää, inaktivoida tai repressoida useilla menetelmillä, esimerkiksi r ··· siten että inaktivoidaan geeni (geenejä), jotka koodittavat sellaista enstyymiä (esimerkik-si, siten että geeniin viedään lukuvaiheistusmutaatio), deletoidaan täydellinen, kokonai- • · .Λ0: nen geeni tai sen suuria fragmentteja, siten että geeni korvataan toisella DNA: 11a homo- • · logisen rekombinaation kautta, geenialueen kompensoinnilla, lisäintegraatiolla, kaksin- • · · • · * . keltaisella crossing-overilla ja transformoimalla isäntäsolu geenikonstruktiolla, joka « *» • » 28 pystyy ilmentämään antisense-RNA:ta, joka on suunnattu tuon geenin koodittavaa sekvenssiä kohtaan, jne.

Esimerkiksi sellulolyyttisiä aktiivisuuksi koodittavat geenit voidaan inaktivoida, kuten 5 esitetään eurooppalaisissa patenttihakemuksissa EP 137 280 EP 244 234.

Trichoderma-sienet tuottavat suuria määriä identtisiä, valtaosaltaan haploidisia, yksitumaisia konidioita, jotka muodostavat erinomaisen materiaalin erilaisia mutageenikäsitte-lyjä varten. Kuitenkin vieläpä haploidi, mutatoitu tuma voi tuottaa heterokaryoottisen 10 kolonian (sienirihmaston), jos mutaatio aluksi tulee kiinnitetyksi ainoastaan yhteen DNA-kaksoisheliksin säikeistä (mosaikismi). Mosaiikkimutanttien määräään vaikuttavat sekä mutageeni että käytetty annos. Haploidisia, yksitumaisia konidioita muodostavilla sienillä heterokaryoottisen sienirihmaston ongelmaa voidaan käsitellä siten, että sallitaan konidioiden muodostuminen ja eristetään uudelleen koloniat, jotka ovat peräisin yhdestä 15 ainoasta erillisestä konidiasta. Tämä sykli voidaan toistaa useita kertoja.

Esimerkkeihin kemiallisista mutageeneistä, jotka ovat käyttökelpoisia keksinnön Tricho-derma-isäntiä mutagenisoitaessa, kuuluu alkyloivia aineita, kuten esimerkiksi N-metyy-li-N’-nitro-N-nitrosoguanidiini (NTG), etyylimetaanisulfonaatti (EMS) ja dietyylisulfaat-, £0 ti (DES). Käyttökelpoisia ovat hydroksyyliamiini ja kemikaalit, jotka poistavat amido- • v · ;v. ryhmiä DNA-emäksistä, kuten esimerkiksi typpihapoke. Ionisoiva säteily (r- ja X- « · • · . säteet) sekä ultraviolettisäteily (UV) ovat esimerkkejä fysikaalisista mutageeneista, jotka «ti j .·. ovat käyttökelpoisia Trichoderma-kannan mutageneesissa.

«1· · t·· »M» }‘£>. Kiinteitä viljelyalustoja käyttämällä on mahdollista seuloa nopeasti sellaisia kolonioita, * jotka ovat peräisin mutage- nisoiduista kolonioista, siten että ne seulotaan spesifisten *!' entsyymien läsnäolon ja puuttumisen suhteen, ja mainittujen alustojen avulla voidaan t»1 ϊ,ί : tuotettu entsyymi määrittää kvantitatiivisesti. Tekniikan tason mukaan tunnetaan useita ·:1·: tyyppejä kiinteitä viljelyalustoja, jotka soveltuvat entsyymien, kuten esimerkiksi ekst- *•30; rasellulaaristen amylolyyttisten entsyymien, pektinaasin, proteaasin, kitinaasin, B-galak- /··. tosidaasin ja sellulaasin, ureaasin, RNA:aasin sekä DNA:aasin ilmaisuun.

• · 1 · « · > « · p I · 29

Monet sienet muodostavat suuria, hajanaisia kolonioita, kun ne kasvavat kiinteällä viljelyalustalla. Kolonian kasvua rajoittavien kemiallisten aineiden lisäystä voidaan sen tähden toivoa, jotta useamman kuin yhden (aina sataan saakka) pesäkkeen kehittyminen on mahdollista yhtä levyä kohti. Tähän tarkoitukseen käytettävien aineiden joukossa on 5 rose bengal, härän sappi ja fosforiin D, Triton X-100 sekä saponiini. Joillekin sienille voidaan käyttää bakteereille kehitettyä replikointitekniikkaa, kun sienipesäkkeiden ominaisuuksia tutkitaan erilaisilla viljelyalustoilla.

Levyjen seulonnan jälkeen valittuja kolonioita tavallisesti viljellään ravistelupulloissa, 10 nestemäisessä tuotantoalustassa, entsyymiaktiivisuuden mittausta varten. Parhaat eristyk set, jotka ilmaisevat voimistettua entsyymin tuottoa ravistelupullojen mittakaavassa, voidaan käsitellä mutageenilla toisen kerran, jos niin halutaan.

Sellaisiin homologisiin geeneihin, jotka keksinnön mukaan on toivottavaa inaktivoida tai 15 deletoida, kuuluvat esimerkiksi sellulaasigeenit cbhl. cbh2. egll. eg!2. (aiemmin egl3;

Saloheimo et ai.. Gene 63:11-21 (1988)) (jotka koodittavat proteiineja sellobiohydrolaa-si I, sellobiohydrolaasi II, endoglukanaasi I ja endoglukanaasi II) tai näiden geenien yhdistelmät. Minkä tahansa näiden geenien aktiivisuuden poistaminen tuottaa isännän, jolta osittain tai kokonaan puuttuu sen kyky hajottaa selluloosaa glukoosiksi. Sellulo-. 20 lyyttinen aktiivisuus voidaan täten poistaa genomisella tasolla, siten että poistetaan geeni * * i t tai muunnetaan se muotoon, joka ei voi ekpressoitua. Aktiivisuus voidaan poistaa myös « » * ·'· translaation tasolla, siten että proteiinia koodittava mRNA hybridisoidaan antisense- ·»· j RNA:han siinä määrin, että hybridisoidun RNA:n translaatio estetään.

··· * · · * : Edullisessa sovellutusmuodossa inaktivoidaan selektiivisesti sellulaasiaktiivisuus, niin että jotkut sellulaasikomponentit inaktivoituvat mutta kaikki eivät inaktivoitu. Esimer-kiksi jos halutaan pitää yllä isännän kykyä hydrolysoida β-glukaania, silloin endoglu- • · ♦

Vs kanaasigeenit inaktivoitaisiin.

ψ 9 * ♦··♦ • ♦ ‘öd Yhden tai useamman sellulaasigeenin inaktivaatio voi perustua Trichoderma reesein /;*. transformaatioon plasmidilla, jossa on puutteellinen geeni, kuten kuvataan patenttihake- muksessa EP 244 234. Plasmidin homologinen yhdistäminen kromosomiperäisen sellu- laasigeenilokuksen kanssa aiheuttaa T. reesein endogeenisen sellulaasigeenin insertio- • 9 30 naalisen inaktivoitumisen. Transformaatioon käytetty plasmidi sisältää vain osan sellu-laasia koodittavasta alueesta, ja se tuottaa inaktiivista proteiinia. Siilien ei sisälly 5’-reunustavia sekvenssejä. Lukuvaiheistusmutaatio voidaan aikaansaada myös typistettyyn koodittavaan alueeseen. Valintamarkkeri (esimerkiksi amdS (asetamidaasi) tai argB 5 (omitiinikarbamoyylitransferaasi) tai seulontamarkkeri (esimerkiksi IacZ) voidaan kytkeä plasmidiin, jota käytetään transformaatioon, tai transformaatio voidaan suorittaa kotransformaationa, joka tarkoittaa, että valittava markkeri ja puutteellinen geeni ovat eri plasmideissa (EP 244 234). Geeni voidaan inaktivoida homologisen rekombinaation avulla, siten että käytetään rengasmaista DNA:ta, joka yhdistyy kolineaarisesti Tricho-10 derman kromosomiperäiseen DNA:han.

Sellainen geeni, jota ei haluta, voidaan deletoida, siten että käytetään kuviossa 1 kuvattua toimintaperiaatetta. Vastaanottajakanta transformoidaan lineaarisella DNA-fragmen-tilla, joka sisältää valittavan markkerigeenin (kuten trpC. argB tai amdSl ja (tai) kiin-15 nostavan, halutun, vieraan geenin, joka on ekspressoitava ja jota reunustavat deletoita- van geenin 5’- ja 3’-reunustavat alueet. Homologinen yhdistäminen A-lokuksessa johtaa täten A-geenin syrjäytymiseen valintamarkkerilla ja (tai) halutulla geenillä B. Jos 5’-alue transformoivassa fragmentissa otetaan ylävirtaan promoottorialueesta, saadussa täydennyskannassa promoottori on myös poistettu. Geeni A voi olla mikä tahansa . 20 Trichoderma-geeni. mieluummin sellulaasigeeni, jonka reunustavat alueet voidaan • · · ··· · kloonata (eristää). Ennen kaikkea lineaarinen DNA-ffagmentti voidaan sitoa, niin että • · . se muodostaa rengasmaisen plasmidin, tai sen lisäksi rengasmainen muoto voi sisältää • · · • DNA:n, jota bakteerissa (esimerkiksi E. colissa) tarvitaan replikaatioon. Lineaariset • ·· · *:* fragmentit, joita käytetään niiden geenien deleetioon, joita ei haluta, voidaan konstru- :*i5c oida esimerkiksi plasmideista pUC19 (Yanish-Perron et ai.. Gene 33:103-119 (1985)).

..*·* Tätä menetelmää kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkissä IB, joka kuvaa cbh2- • · · * geenin sellaista deleetiota Trichoderman genomista, jossa käytetään mainittua menetel- ♦:··: mää.

•30: .·:*. On kuvattu sellulaasientsyymien klooneja, joita voidaan käyttää mutanttisekvenssien ;’· · konstruoimiseksi, kun halutaan inaktivoida homologisia sekvenssejä keksinnön mukai-• · sessa isännässä. Voidaan käyttää mitä tahansa mutanttisekvenssiä, jonka vuoksi entsyy- 31 min aktiivisuus inhiboituu. Esimerkiksi Shoemaker, S., et ai.. Bio/Technology 1:691-696 (1983)) ja Teeri et ai.. (Teeri, T., et ai.. Bio/Technology 1:696-699 (1983)) 5 ovat kloonanneet geenin sellobiohydrolaasin luonnonmukaista CBHI-sekvenssiä varten, ja geenin koko nukleotidisekvenssi on tunnettu (Shoemaker, S., et ai.. Bio/Technology 1:691-696 81983)). Pääendoglukanaasin (EG I) geeni T. reeseistä on myös kloonattu ja karakterisoitu (Penttilä, M., et ai.. Gene 45: 253-263 (1986); EP 137 280; Van Arstel, J.N.V., et ai.. Bio/Technology 5:274-278 81987) samoinkuin ee!2 (alunperin eg!3 10 (Saloheimo, M., et ai.. Gene 63:11-21 81988)).

Entsyymivalmiste

Keksinnön mukaan aikaansaadaan menetelmä, jolla tuotetaan suuria tasoja entsyymeitä, 15 mieluummin hemisellulaaseja, joita halutaan massan- ja paperinjalostuksessa. Käyttöön annetaan myös sellaisen entsyymin valmistusmenetelmä, josta osittain tai kokonaan puuttuu sellulolyyttinen aktiivisuus (se on, kyky hajottaa selluloosaa täydellisesti glukoosiksi) ja joka on rikastettu entsyymeillä, joita halutaan massan- ja paperinjalostuksessa ja jotka mieluummin ovat hemisellulaaseja. "Puutteellisella sellulolyyttisellä . j20 aktiivisuudella" tarkoitetaan vähentynyttä, alentunutta, heikennettyä tai tukahdutettua • · · · kapasiteettia hajottaa selluloosaa glukoosiksi. Tällaisia valmisteita voidaan saada suo- • · • ·/: raan keksinnön mukaisesta isännästä. Jos haluttuja aktiivisuuksia on tämän lisäksi • · · : useammassa kuin yhdessä yhdistelmäisännässä, tällaisia valmisteita voidaan eristää ·»· ♦ *:* sopivista isännistä ja ne voidaan yhdistää, ennenkuin niitä käytetään keksinnön mukai- : 25 sessa menetelmässä.

Kuvitellaan, että aikaansaadaan entsyymivalmiste, jossa spesifisiä entsyymiaktiivisuuk-* siä on rikastettuina tai josta ne puuttuvat joko osittain tai täydellisesti, niin että tyydyte- ·:··: tään spesifisen käytön vaatimukset massa- ja paperiteollisuudessa ja rehuntuotannossa.

*30: Entsyymiaktiivisuuksia voidaan lisätä tai poistaa, kuten edellä kuvattiin, jotta aikaansaa- .*:*. daan, poistetaan tai säilytetään haluttu aktiivisuus tai sitä vähennetään. Jos esimerkiksi valmistetta aiotaan käyttää mekaanisen massan lujuuden parantamiseen, silloin keksin- • · nön mukainen entsyymivalmiste voi antaa käyttöön entsyymeitä, jotka voimistavat tai 32 helpottavat selluloosakuitujen yhteensitoutumista. Samalla tavalla keksinnön entsyymi-valmiste voi antaa massanvalmistuskäyttöön myös entsyymeitä, jotka voimistavat tai helpottavat tällaista turvottamista.

5 Keksinnön entsyymivalmisteiden saamiseksi edellä kuvattuja yhdistelmäisäntiä, joilla on haluttuja ominaisuuksia (se on, sellaisia isäntiä, jotka oleellisesti pystyvät ilmentämään yhtä tai useampaa sellulaasia ja jotka pystyvät ilmentämään haluttuja entsyymeitä), viljellään sopivissa olosuhteissa, tällöin haluttu entsyymi erittyy Trichoderma-isännistä viljelyalustaan ja entsyymivalmiste otetaan talteen mainitusta viljelyalustasta menetel-10 min, jotka ovat tekniikan tason mukaisia, hyvin tunnettuja.

Entsyymivalmistetta voidaan tuottaa, siten että Trichoderma-kantaa viljellään käymisas- tiassa, jossaa on halutut olosuhteet, esimerkiksi nestemäisessä viljelyalustassa, joka sisältää esimerkiksi kuusi prosenttia Solka Floc -selluloosaa (BW40, James River Cor- 15 poration, Hackensack, NJ), kolme prosenttia rankkia, 0,5 prosenttia KH2P04:a, 0,5

prosenttia (NH4)2S04:a sekä 0,1 prosenttia struktolia vaahdonestoaineena (struktol SB

2023, Schill & Seilacher, Hamburg, FRG). Trichoderma-kantoien sellulaasin tuoton glukoosi repressoi herkästi, ja tuotto edellyttää induktoria (selluloosaa, laktoosia tai

soforoosia) (Allen et ai.. Biotechnology and Bioengineering 33:650-656 (1989). pH

. .20 tulisi mieluummin pitää noin viidessä, siten että lisätään fosforihappoa tai ammoniakkia • · · · ja lämpötila pidetään 30 °C:ssa viljelyn aikana. Lämpötila voidaan kuitenkin säätää • · ·. kannan sekä tuotettavan entsyymivalmisteen mukaan (Merivuori et ai.. Biotechnology • · ·

Letters 12(2):117-120 (1990)).

• · · · • · · • · · · • · · :.25 Entsyymivalmiste otetaan talteen viljelyalustasta tunnetuilla, tekniikan tason mukaisilla menetelmillä. Koska keksinnön isänniltä sellulaasiaktiivisuus voi puuttua osittain tai kokonaan, keksinnön etuna on, että keksinnön mukaista entsyymivalmistetta voidaan • · · : käyttää suoraan viljelyalustasta ilman lisäpuhdistusta. Tällaisia valmisteita voidaan *:·*: haluttaessa lyofilisoida tai entsyymiaktiivisuutta voidaan muuten väkevöidä ja (tai) •SO*. stabiloida varastointia varten. Keksinnön mukaiset entsyymivalmisteet ovat erittäin taloudellisesti aikaansaatavissa ja käytettävissä, koska (1) entsyymejä voidaan käyttää ;·,· raa’assa muodossa; spesifisen entsyymin eristäminen vijelyalustasta ei ole välttämätöntä, • · ja (2) koska entsyymit erittyvät viljelyalustaan, tarvitsee ottaa talteen vain viljelyalusta, 33 jotta saadaan haluttu entsyymivalmiste; entsyymiä ei tarvitse uuttaa Trichoderma-isän-nistä.

Jos halutaan, ilmennetty proteiini voidaan vielä puhdistaa tavanomaisten olosuhteiden 5 mukaan, kuten esimerkiksi uuttamalla, saostamalla, kromatografialla, affiniteettikroma- tografialla, elektroforeesilla yms.

Keksinnön Trichoderma- ja entsyymivalmisteilla on lisäsovellutuksia rehun valmistuksessa. Esimerkiksi rehulla, jota on käsitelty keksinnön entsyymivalmisteilla, olisi suuri 10 ravintoarvo kotitalouseläimille, koska tällaista rehua ne voivat sulattaa helpommin.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä. Nämä esimerkit esittävät ainoastaan keksinnön muutamia konkreettisia sovellutuksia. On itsestään selvää, että ammattimies luo useita samankaltaisia sovellutuksia. Tästä syystä ei tulisi 15 tulkita, että esimerkit rajoittavat keksintöä, vaan että ne selventävät sitä.

ESIMERKIT

Materiaalit ja menetelmät . .20 • · » • · · · '.*·'· T. reesein transformaatio • · • · • · · • · • · · : T. reesei transformoitiin ja AmdS+- sekä ArgB+-transformantit valittiin, kuten Penttilä et ai. kuvaavat julkaisussa Gene 61:155-164 (1987).

• · · :.25

Fleomysiinille resistentit transformantit seulottiin tavalla, jota Durand et ai. kuvaavat julkaisussa Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, sivuilla 135-151, • · · * 1987, J.-P. Aubert, P. Beguin ja J. Millet (toimittajat) Academic Press, New York.

• · *30: Sellaisessa kotransformaatiossa, joka suoritettiin p3SR2:lla ja pAMHlll:llä, käytettiin ekvimoolimääriä plasmidi-DNA:ta (5-10 μg). Niissä transformaatioissa, jotka antoivat :*·.· fleomysiiniresistenssin, käytettiin plasmidi-DNA:n suhteellisia määriä, jotka pAMH-• · 111:lie ja pAN8-l:lle olivat vastaavasti 1:1 tai 2:1. Kun kotransformaatiossa käytettiin 34 p3SR2:hta ja pMS4:ää, plasmidi pMS4 lisättiin 3-4-kertaisena molaarisena ylimääränä. Transformantit puhdistettiin konidioiden kautta, tämä on, että konidiosuspensio siirros-tettiin jälleen levyille, joilla oli selektiivistä viljelyalustaa, niin että jokainen kolonia sai alkunsa yhdestä ainoasta konidiosta.

5

Lineaarisella DNA-fragmentilla suoritetuissa transformaatioissa DNA:n määrä, jota käytettiin, vaihteli kahdesta viiteen mikrogrammaan. Selektiomarkkeri (amdS (asetami-daasi) tai areB (omitiinikarbamoyylitransferaasi, OTC:aasi, E.C. 2.1.3.3) tai trpC (tryptofaani) oli transformoivan fragmentin sisällä.

10 DNA:n eristäminen ja analyysi E. colista plasmidi-DNA eristettiin standardi menetelmien avulla (Maniatis et ai.. 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 15 Spring Harbor, N.Y.). Kromosomiperäinen DNA eristettiin T. Teeseistä, siten että käytettiin Raederin ja Brodan menetelmää, Lett. Appi. Microbiol. 1:17-20 (1985)). Southern- ja Northem-hybridisaatiot suoritettiin standardi tekniikoin (Maniatis et ai.. supra. 1982). Westem-(blottaus)tekniikka oli Maniatis et al.:n mukainen, supra. 1982).

: :20 Nestemäiset viljalyalustat ja olosuhteet Trichodermalle • · · · • · · • · · • · • ·

Trichoderman kaikki nestemäiset viljelmät aloitettiin konidiosporeilla, joita kasvatettiin • · ·.: : perunan dekstroosiagarilla, kuten Bailey ja Nevalainen kuvaavat julkaisussa Enzym.

Microb. Technol. 3:153-157 (1981)). Nestemäiset viljelyt ravistelupulloissa suoritettiin • · · :.25 Baileyn ja Nevalaisen mukaan, Enzyme Microb. Technol. 3:153-157 (1981), paitsi että

Finnfloc korvattiin Solca Floc -selluloosalla. Fermentteriviljelmissä käytetty alusta • · · ···· sisälsi kuusi prosenttia Solka Floc -selluloosaa, 3 prosenttia rankkia, 0,5 prosenttia • · · * KH2P04:a, 0,5 prosenttia (NH4)2S04:a sekä 0,1 prosenttia struktolia. PH pidettiin 4,0:n ja 4,8:n välisellä alueella, siten että lisättiin fosforihappoa tai ammoniakkia. Fermentoi-*:3Ö? tiin 30 °C:ssa. Entsyymien maksimisaanto saatiin viidessä vuorokaudessa laboratorio-fermentaatioissa ja neljässä päivässä, kun käytettiin 100 litran vetoista käymisastiaa.

• · · • ·« • · 35

Entsyymimääritykset

Kaikki entsyymiaktiivisuudet määritettiin viljelmäsupematantin jakeista, sen jälkeen kun rihmastot oli poistettu sentrifugoimalla 20 minuutin ajan nopeudella 3000 kierrosta 5 minuutissa. Endoglukanaasiaktiivisuus mitattiin, siten että käytettiin hydroksietyylisellu- loosaa substraattina (HEC, mittelviskös, Fluka AG 54290, pract. grade) ja meneteltiin, kuten Bailey ja Nevalainen kuvaavat julkaisuissa Enzyme Microbiol. Technol. 3:153-157 (1981) ja Comission on Biotechnology, International Union of Pure and Applied Chemistry; Measurement of Cellulase Activities, Biochemical Engineering Research 10 Centre, Indian Institute of Technology, Delhi, New Delhi - 10016 (1984)), ja ksy- lanaasiaktiivisuus mitattiin koivun ksylanaasi (Roth nro 7500) substraattina ja menetelmällä, jota Bailey et ai. kuvaavat julkaisussa J. Bact. 23:257-270 (1992). TCA:lla saostetut proteiinit määritettiin Lowry et al.:n menetelmällä, joka esitetään julkaisussa J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951), ja härän seerumin albumiini oli substraattina.

15 Sellobiohydrolaasiaktiivisuus suodatinpaperia kohtaan (suodatinpaperiyksikkö), FPU) mitattiin, niin kuin määritystä kuvaa Comission on Biotechnology, International Union of Pure and Applied Chemistry julkaisussa Measurement of Cellulase Activities, Biochemical Engineering Research Centre, Indian Institute of Technology, Delhi, New Delhi - 10016 (1984)).

: :*20 • · · · :**: Endoglukanaasi I:n määrittäminen ELISA-menetelmällä • · · • · • · · • · : Endoglukkanaasi I -proteiinin konsentraatio viljelmäsupematanttijakeissa määritettiin kerros-ELISAlla, jossa käytettiin kaksoisvasta-ainetta. Määritykset suoritettiin 96-kam- * · · V25 mioisilla, litteäpohjaisilla mikrotiitterilevyillä 37 °C:ssa (ellei muuten mainittu). Jokai nen vaihe päätettiin kolminkertaisella pesulla, johon käytettiin fosfaatilla puskuroitua «·· •••j keittosuolaliuosta pH 7,2, joka sisälsi 0,05 prosenttia Tween 20:nNtä ja 0,02 prosenttia • · · '·. natriumatsidia (PBS/Tween).

• · *30 Levyt päällystettiin yön ajaksi 4 °C:ssa hiiren monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka oli :T: suunnattu endoglukanaasi I:htä vastaan (anti-EGI-vasta-aine-EI2). Muovipinnan käyttä- • · _ ' mättömiin kohtiin pantiin yhdeksi tunniksi 1-prosenttista BSA:a, joka oli PBS/Tweenis- sä. Sitten lisättiin sopivat laimennukset viljelmäsupematantin jakeita ja inkuboitiin 36 kahden tunnin ajan, minkä jälkeen inkuboitiin kahden tunnin ajan kaniinin sellaisten polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka oli muodostettu endoglukanaas I:htä vastaan. Sidotut kaniinin vasta-aineet ilmaistiin, siten että inkuboitiin kahden tunnin ajan sian polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka oli kehitetty kaniinin IgG:tä vastaan ja 5 konjugoitu alkaliseen fosfataasiin (Orion Diagnostica, Espoo, Finland). Loppuvaiheessa lisättiin p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml) ja reaktio pysäytettiin 30 minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa 2-normaalisella NaOH:lla. Kehittynyt keltainen väri mitattiin fotometrillä 405 nm:ssä. Endoglukanaasi I:n konsentraatio viljelmäsupematanttijakeissa laskettiin sitten, siten että verrattiin jakeiden OD^-arvoja sellaiseen standardin lai-10 mennuskäyrään, joka oli laadittu puhdistetun endoglukanaasi I:n avulla ja samanaikai sesti samoilla levyillä.

Viljelmäsupernatanttijakeen fraktiointi kromatofokusoinnilla 15 Kromatofokusointiin käytettiin kromatografiajäjjestelmää, joka koostui Pharmacia FPLC-laitteesta, joka oli varustettu Mono P HR 5/20 -pylväällä. Hartsi stabiloitiin 25 mmolaarisessa bitris-HCl-puskurissa, pH 6,5. Raaka entsyymiseos, jonka T. reesei tuotti ravistelupulloissa, laimennettiin samalla puskurilla proteiinipitoisuuteen 1 mg/ml.

500 /xl:n suuruisia entsyyminäytteitä ruiskutettiin pylvääseen ja niitä eluoitiin Pharmaly-

; :¾) te/Polybufferilla (Pharmacia, 1 ml PharmalyteR 2,5 - 5:ttä ja 5 ml Polybuffer™ PB

• « · · :*·*: 54:ää kaikkiaan 100 ml:ssa, pH säädetty 3,0:aan HCl:lla), siten että muodostettiin pH- • · gradientti 6,5:stä 3,0:aan. Virtausnopeus oli 30 ml/h. Pylvään effluentit koottiin 600 • · ·,· : μ1:η jakeina ja pH sekä EGI-aktiivisuus määritettiin.

I·» • · · * • ·· v2$ Esimerkki 1

Trichoderma reesein endoksylanaasi Π (pl 9) -geenin xln2:n kloonaus, sekvensointi • · · ···*· ja voimistettu ilmentyminen ·»· ♦ ♦ * • · · Tämän esimerkin tuloksena eristettiin luonnonmukaisesta kannasta QM6 Trichoderma *:5’ö reesein xln2-geeni, joka koodittaa endoksylanaasia pl 9,0. Geeni sisältää yhden intro- « nin, jossa on 108 nukleotidiä, ja se koodittaa 223 aminohapon suuruista proteiinia, josta löydettiin kaksi oletettua N-glykosyloinnin tavoitekohtaa. Transformoitiin kolme erilaista T. reesein kantaa, siten että tavoitteena oli saada endogeeniseen cbnl-lokukseen 37 konstruktio, joka koostui xln2-geenistä sekä sen omasta promoottorista. Ksylanaasin suurimmat tuottotasot saavutettiin, siten että isäntänä käytettiin T. reesein kantaa AL-K02721, joka on geenitekniikan avulla konstruoitu kanta. Ei tarvinnut integroida cbhl-lokukseen, jotta xln2-promoottorin alla saavutettiin voimistunut ilmentyminen.

5

Materiaalit ja menetelmät

Organismit, plasmidit ja kasvuolosuhteet. Plasmideja lisättiin Escherichia colin kannassa XLl-Blue (Bullock, W.O. et ai.. Bio/Techniques 5:376-378 (1987)) tai kannassa INV-10 laF’ (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Vastaanottajaorganismit xln2-geenille olivat T. reesein mutantit, jotka olivat hyviä sellulaasin tuottajia, nimittäin kannat VTT-D-79125 (Bailey ja Nevalainen, Enzyme Microb. Technol. 3:153-157 (1981)), ALKO-2721 ja ALK02221. T. reesei ALK02221 on kannan VTT-D-79125 mutantti, joka tuottaa vähäisen määrän proteaasia. T. reesei ALKO 2721 on kannan VTT-D-79125 15 mutantti trpC-miinus (trpC). joka on aikaansaatu UV-valokäsittelyllä ja jossa cbh2- lokus on korvattu Aspergillus nidulansin geenillä trpC (Yelton, M.M., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1470-1474 (1984)). Kannassa on myös useita muita trpC-geenin integroituja kopioita.

: :*20 Tässä tutkimuksessa käytettyihin plasmideihin kuuluvat pBluescript (Stratagene, San :***: Diego, CA, USA), pCRIOOO (Invitrogen) ja pUC19 (Yanish-Perron, C., et ai.. Gene *,·/ 33: 103-119 (1985)). Valintamarkkeri amdS tuli plasmidista p3SR2 (Kelly ja Hynes, : EMBO J. 4:475-479 (1985)), jonka tohtori M. Hynes ystävällisesti lahjoitti. cbhl:htä ..!! reunustavat alueet eristettiin T. reesein kannasta ALK02466 (Harkki, A., et ai.. Enzy- }.:25 me Microb. Technol. 13:227-233 (1991)), siten että käytettiin plasmidivapautusta.

·»· •••j E. colin viljelmiä kasvatettiin L-liemessä, jota tarvittaessa oli täydennetty ampisilliinillä ♦ ♦ * *\ * (50 μg/ml), 37 °C:ssa yön ajan (Maniatis, T., et ai. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Trichoderma-kantoien kasvatukseen käytet- *:*30 tiin PD- (Potato Dexstrose Broth, Difco, Detroit, USA) agarvinopintoja. Ksylnaasin « :T: tuottamista varten T. reesein kantoja kasvatettiin seitsemän päivän ajan ravistelupullois- • · ί ’.· sa (30 °C, 250 kierrosta minuutissa) sellaisessa väliaineessa (pH 5,5) joka indusoi 38 sellulaasia ja ksylanaasia ja sisälsi 4 prosenttia heraa, 1,5 prosenttia eri komponenteista muodostunutta typpilähdettä, 1,5 prosenttia KH2P04:a sekä 0,5 prosenttia (NH4)2S03:a.

Peptidin pilkkominen ia aminohapposekvensointi. Puhdistettua ksylanaasi II:hta (Tenka-5 nen, M., et ai.. Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 (1992), joka oli T. Teeseistä (VTT-D-79125), pilkottiin kaksiprosenttisella (paino/paino) trypsiinillä (TPCK-käsitelty, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA), joka oli yksiprosenttisessa am-moniumbikarbonaatissa, 37 °C:ssa, kahden ja puolen tunnin ajan. Kolmeprosenttisen (paino/paino) trypsiinin lisäyksen jälkeen inkubointia jatkettiin yön ajan (13 h). Peptidit 10 erotettiin nestekromatografialla, jolla on suuri erotuskyky (HPLC), siten että käytettiin

Rexchrom Prep-5/300 ODS-käänteisfaasipylvästä. Pylvästä eluoitiin nopeudella, joka oli yksi ml/minuutti, lineaarisessa liuotingradientissa, siten että 60 minuutissa, 24 °C:n lämpötilassa, ajettiin 5-prosenttisesta (tilavuus/tilavuus) asetonitriilistä (ACN), joka sisälsi 0,1 prosenttia trifluorietikkahappoa (TFA) 60-prosenttiseen (tilavuus/tilavuus) 15 ACN:ään, joka sisälsi 0,06 prosenttia TFA:ta. Absorbanssi mitattiin 218 nm:ssä. Ennen aminopäätteen sekvensointia 10 ^g ksylanaasi II:hta käsiteltiin 1 U:lla pyroglutamaat-tiaminopeptidaasia (Boehringer Mannheim, Mannheim, Sakasa) 37 °C:ssa, yön ajan, 100-mmolaarisessa kaliumfosfaattipuskurissa, pH 8,0, joka sisälsi 10 mmoolia EDTA:ta ja 5 mmoolia DTT:tä. Proteiinien ja peptidien aminopäätteet sekvensoitiin, siten että ne : : 20 hajotettiin kaasu-nestepulssi-sekvenaattorissa (Kalkkinen ja Tilgmann, J. Protein Chem.

\ ' · 7:242-243 (1988)). Vapautuneet PTH-aminohapot analysoitiin sekvenaattoriin kytketyl- lä, ohutkolonnisella käänteisfaasi-HPLC:llä.

• · # * · • · * ·*» * DNA:n käsittelyt ia transformaatiot. DNA-konstruktioihin käytettiin standardi metelmiä, • »·

I f I

*‘*25 joita Maniatis et ai. kuvaavat julkaisussa Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Plasmidi- ja kosmi- ··· di-DNA:t eristettiin Quiagen-pylväillä (Diagen GmbH, Diisseldorf, Saksa) valmistajan S · · \ ohjeiden mukaan.

.1*·· • · * ** 30 E. coli transformoitiin D. Hanahanin mukaan, J. Mol. Biol. 166:557-580 (1983), ja Ί\ I reesein kannat M. Penttilä et al.:n menetelmällä, Gene 61:155-164 (1987), siten että • ♦ ?/·· käytettiin seuraavia muunnoksia: ennen transformaatiota protoplasteja käsiteltiin läm- pösokilla (Berges ja Barreau, J. Gen. Microbiol. 135:601-504 (1987)), 25-prosenttinen 39 PEGgooo korvattiin 60-prosenttisella PEG4000 ja transformoitiin huoneenlämpötilassa sen sijaan, että olisi transformoitu jäiden päällä. Transformantit puhdistettiin konidioiden kautta valikoivilla asetamidi-CsCl-levyillä (Penttilä, M., et ai.. Gene 61:155-164 (1987), ennen kuin ne siirrettiin PD-vinopinnoille.

5 RNA:n eristäminen. T. reesei. VTT-D-79125:ttä viljeltiin fermenttorissa, ksylanaasia indusoivassa alustassa, kolmen päivän ajan. Rihmastot koottiin, jäädytettiin ja ne jauhettiin hienoksi jauheeksi nestemäisen typen alla. Kokonais-RNA ja myöhemmin mRNA eristettiin, siten että pilkottiin proteinaasi K: 11a, käytettiin fenoliuuttoja ja oligo-dT-10 selluloosapuhdistusta, kuten Bartels ja Thompson kuvaavat julkaisussa Nucleic Acid

Res. 11:2961-2978 (1983): Saatu mRNA fraktioitiin koon perusteella käyttämällä DMSO-sakkaroosigradienttisentrifugointia (Boedtker, H., et ai.. Biochemistry 15:4765-4770 (1976)).

15 Ksvlanaasi II:n cDNA:n kloonaus. Ensimmäinen säie cDNA:ta valmistettiin yhdestä /xg:sta mRNA:ta, siten että käytettiin cDNA:n synteesin reagenssipakkausta (Boehringer Mannheim), oligo-dT-aluke korvattiin hybridi-dT17-adapterialukkeella (5’-GAC-TCG-AGA-ATT-CAT-CGA-dT17 3’) [sekvenssin identifiointinumero 5]. Tätä cDNA:ta käytettiin templaattina polymeraasiketjureaktio(PCR)amplifikaatiolle (Frohman, M.A., • J ?0 "Race: Rapid Amplification of cDNA Ends," julkaisussa PCR Protocols, Innis, M.A., • t « : et ai., toimittajat, Academic Press Inc., San Diego, CA, ss. 28-38 (1990), jota ohjasi- ‘ .0 vat geenille spesifinen aluke (sense 5’ GG(A/C/G)-TGG-CA(A/G)-CCN-GGN-ACN- % « i.i : AA 3’) [sekvenssin identifiointinumero 6], joka oli päätelty peptidisekvenssistä, sekä '··· adapterialuke (5’ GAC-TCG-AGA-ATT-CAT-CGA 3’) [sekvenssin identifiointinumero '•*25 7]. 100 μ\ PCR-reaktioseosta sisälsi 5 μΐ cDNA:ta, joka oli laimennettu 1:25, 100 pmoolia kutakin aluketta, 5 ^moolia dNTP:a, 1 x PCR-puskuria ja 1,5 yksikköä Taq «·· *:*.** DNA -polymeraasia (Boehringer Mannheim). Amplifikaatio ohjelmoitavan lämpötilasää- • ψ · • · · *. timen avulla (M.J: Research Inc) käsitti 30 sykliä, siten että amplifikoitiin 95 °C:ssa • ··· * * yhden minuutin ajan, 55 °C:ssa yhden minuutin ajan sekä 72 °C:ssa kahden minuutin \3Ö ajan. Viimeisen jakson jälkeen jaksoa pidennettiin 10 minuutilla. Saadut PCR-frag- »•t V : mentit kloonattiin, siten että käytettiin TA-kloonausreagenssejä (Invitrogen) valmistajan • · *♦*·; ohjeiden mukaan ja sekvensointi varmistettiin.

40 xln2-geenin eristäminen. T. reesei QM6a:n (Mandels ja Reese, J. Bacteriol. 73:269-278 (1957)) genominen kosmidikirjasto seulottiin, siten että hybridisoitiin ksylanaasi II:n PCR-koettimella valmistajan ohjeiden mukaan (Boehringer Mannheim, saksa).

5 Nukleotidin sekvensointi. Templaatit nukleotidin sekvensointia varten tuotettiin yk sisuuntaisilla deleetioilla valmistajan ohjeiden mukaan, jotka on esitetty pBluescript Exo/Mung:in DNA:n sekvensointijärjestelmää varten (Stratagene). DNA sekvensoitiin molemmissa suunnissa, siten että toimittajan ohjeiden mukaan käytettiin ABI-reagensse-ja (Applied Biosystems, Foster City, USA), jotka perustuvat fluoresenssillä leimattuihin 10 T7- ja T3-alukkeisiin sekä Taq-sykliä käyttävään sekvensointimenetelmään. Sekvensoin- tireaktiot analysoitiin ABI 373A -sekvenaattorilla.

Entsyymi- ja proteiinimääritvkset. Entsyymit määritettiin viljelmäsupematanteista rihmaston poistamisen jälkeen. Mitattiin ksylanaasiaktiivisuus, siten että koivun ksylaani 15 (Roth 7500) oli substraattina ja käytettiin menetelmää, jonka Bailey, M.J. on esittänyt julkaisussa J. Biotechnol. 23:257-270 (1992). Sellobiohydrolaasi I:n (CBHI) tuottaminen ilmaistiin Wester blot- tai dot blot -menetelmillä, joissa käytettiin CBHLlle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita CI-89 tai CI-261 (Aho, S., et ai.. Eur. J. Biochem. 200:643-649 (1991)).

20 • : : Tulokset • · · · • · « • · · • » • ·

Peptidisekvenssit • · • · · • · · • ·· · • · · __ 25· Puhdistetusta endoksylanaasi II:sta saatiin useita tryptisiä peptidejä ja ne sekvensoitiin • ·« • · · *·* * suoraan (katso kuviota 3 peptidisekvenssien suhteen). Luonnonmukaiselle peptidille ei havaittu kuitenkaan yhtään aminoterminaalista sekvenssiä, mikä viittaa siihen, että se oli • ♦ · ·;;; estetty. Aminoterminaalinen sekvensssi (Q)-X-Ile-Gln-Pro-Gly-Thr-Gly-Tyr-Asn [sek- ♦ ♦ · • · · *. venssin identifiointinumero 8] saatiin sen jälkeen, kun oli käsitelty pyroglutamaat- 30 * tiaminopeptidaasilla. Pyroglutamaattiaminopeptidaasilla käsitellyn näytteen ensimmäistä aminohappoa (X) ei voitu määrittää selvästi sekaannusta aiheuttavien piikkien vuoksi, • · · _ v ; jotka saatiin HPLC-kromatogrammissa.

• · • · · • ·· 41 T. reesein xln2-cDNA:n kloonaus mRNA:lle spesifisen ksylanaasi II:n kerääntyminen T. reesein viljelmissä määritettiin Nothem-hybridisaatiolla, jossa koettimena käytettiin peptidisekvenssistä pääteltyä nukle-5 otidioligomeeriä (alleviivattu kaksi kertaa kuviossa 3). Tulokset ilmaisevat, että ksy lanaasi Π:η mRNA oli runsaimmillaan rihmastossa, jota kasvatettiin kolmen päivän ajan, ja että ksylanaasi II:lle spesifisen mRNA:n koko oli noin 0,7 kb (tuloksia ei esitetä).

10 Ksylanaasi II:lle spesifistä oligomeerialuketta (katso edellä) ja epäspesifistä dT-adapte- rialuketta käytettiin, kun suoritettiin ksylanaasisekvenssin amplifikaatio cDNA:n ensimmäisestä säikeestä. Sellainen aminohapposekvenssi, joka pääteltiin alakloonin pALK564 nukleotidisekvenssistä, joka sisältää PCR-reaktiossa syntetisoidun pisimmän fragmentin, sisälsi useita ksylanaasi II -peptidin sekvenssejä, jotka saatiin suoralla sekvensoinnilla.

15 Tämä varmisti sen, että PCD-klooni koodini ksylanaasi H:hta.

T. reesein xln2-geenin eristäminen ja nukleotidisekvenssi T. reesein genomisesta kosmidikirjastosta eristettiin neljä kloonia, siten että hybridisoi- 20 tiin pALK564:n insertin kanssa (insertti = PCR:llä syntetisoitu xln2-cDNAl. Alaklooni :.· · pALK- 475, joka sisälsi hybridisoituvan, 5,7 kb:n mittaisen Kpnl-fragmentin, joka oli ·· · : '.· peräisin kosmidikloonista ja oli pUC 19-vektorissa, analysoitiin restriktiokartoituksen avulla (kuvio 2). Hybridisoituvat fragmentit pALK475:stä, jotka olivat 2,3 kb:n mittai- • · ·'·: : nen HindlH. l,5:n mittainen Hindll/XhoI sekä 1 kb:n mittainen Xhol. alakloonattiin ja « · · 26: sekvensoitiin osit-tain, jotta geeni xln2 saatiin ilmi.

• · · • · · xln2-geenin nukleotidi- ja päätellyt aminohapposekvenssit esitetään kuviossa 3. DNA:sta ·· · ***I löydettiin sekvenssi, joka muistutti TATA-boksia ja joka oli -140 nukleotidin etäisyy-• · · • · · dellä ATG:stä (kuvio 3). Primaarinen translaation aloituskohta (ATG), jota reunustaa 30 * erittäin hyvin säilynyt konsensus-sekvenssi 5’ CA C/A A/C ATG 3’, joka esiintyy ♦ sienillä, joilla on filamenttejä, ja muilla eukaryooteilla (Ballance, J.D., "Transformation • · · systems for filamentous fungi and an overview of fungal gene strukture", julkaisussa • · \*·: Molecular Industrial Mycology: Systems and Applications for Filamentous Fungi, Leon 42 ja Berka, toimittajat, Marcel Dekker Inc., New York, ss. 1-29 (1991)), on 99 nukleotidiä ylävirtaan ksylanaasi II:n N-terminaaliselle aminohapolle määritetystä kodonista. xln2-geeni koodittaa 223 aminohapon mittaista proteiinia. Tässä proteiinissa 33 aminohappoa edeltää N-päätettä, joka on saatu suoralla peptidisekvensoinnilla. Tämä esi-5 prosekvenssi sisältää Alal9:n ja Ala20:n välissä oletetun signaalisekvenssin kohdan, joka pilkkotuu peptidaasilla (von Heijne, G., Nucl. Acid Res. 14:4683-4690 (1986). Genomisen sekvenssin vertailu cDNA-sekvenssien kanssa paljasti yhden intronin, jossa oli 108 nukleotidiä. Tämä ilmaisee, että kypsä ksylanaasi II -proteiini koostuu 190 aminohaposta ja sen laskettu molekyylipaino on 20,8 kDa. Tämä sopii hyvin yhteen 20 10 kDa:n kanssa, joka saatiin puhdistetulle ksylanaasi Ilille (Tenkanen, M., et ai.. Enzyme

Microb. Technol. 14:566-574 (1992)). Sekvenssianalyysi paljasti myös kaksi oletettua (Asn-X-Ser/Thr, jossa X ei ole Pro; Gavel ja von Heijne, Protein Engineering 3:433-442 (1990) glykosylaation kohdetta (kypsän proteiinin Asn38 ja Asn61).

15 pAlk476:n konstruktio

Plasmidin pALK476:n konstruktio esitetään kuviossa 4. Tämä plasmidi on käyttökelpoinen, kun xln2-geeni kohdistetaan cbhl-lokukseen. xln2-geeni ilmentyy luonnonmukaisen promoottorinsa kontrollin alla. 5,0 kb:n mittainen Smal-fraementti. joka on peräisin 20 plasmidista pALK475 (kuvio 2) ja sisältää xln2-geenin ja promoottorin (2,3 kb:tä gee- ; nin alueesta ylävirtaan), sidottiin plasmidin pALK425 Spel-kohtaan (täydennetty Kleno- • · · : willa).

• · · • · • # * • · • · · : xln2:n voimistettu ilmentyminen T. Teeseissä 25:” • ·· • · · ·* * Jotta ksylanaasin ilmentyminen tehostui T. Teeseillä, sen kolme kantaa VTT-D-79125, . ALK02221 ja ALK02721, jotka erosivat toisistaan entsyymin tuottoprofiilien suhteen, • · · transformoitiin EcoRI-fragmentilla, joka oli peräisin plasmidista pALK476 (kuvio 4).

• · ·

Sellainen ilmentymiskasetti, joka sisälsi xln2-geenin sekä sen oman promoottorin (kuvio 30 ‘ 5), kohdistettiin cbhl-lokukseen. siten että käytettiin cbhl:htä reunustavia alueita.

• · • · · · Transformantteja puhdistettiin, 57 T. reesein VTT-D-79125-kannan, 42 ALK02221:n • · *. *: ja 53 ALK02721:n transformaatioista, ja niitä kasvatettiin ravistelupulloissa, sellaisissa 43 viljelmissä, joissa olosuhteet indusoivat ksylanaasia. Ksylanaasin tuotto mitattiin koivun ksylaania hajottavan aktiivisuutena viljelmäsupematanteista. Transformantit testattiin CBHI-proteiinin tuoton suhteen, jotta määritettiin kohdistumisen taajuus cbhl-lokukseen ja erotettiin tranformantit, joissa xln2-ekspressiokasetti oli sijoitettu cbhl-lokukseen.

5 niistä transformanteista, joissa se oli yhdistetty muualle, cbhl-lokuksen korvaaminen xln2-ekspressiokasetilla tuottaa CBHI-negatiivisen (CBHI) fenotyypin, joka ilmaistiin Westem-bloteilla ja dot Moteilla, siten että käytettiin CBHI:lle spesifistä monoklonaalis-ta vasta-ainetta. Kohdistumisen tehokkuus cbhl-lokukseen. mikä määritettiin CBHI-fenotyyppinä, oli kussakin tapauksessa hyvä: 67, 62 ja 58 prosenttia vastavasti VTT-D-10 79125:n, ALK02221 :n ja ALK02721 :n transformanteissa.

Kuvio 6 esittää suhteellista ksylanaasiaktiivisuutta transformanteilla, jotka on ryhmitetty niiden CBHI+/"-fenotyypin mukaan. Lisäys xln2:n kopioiden lukumäärässä suurensi ksylanaasiaktiivisuuden tuottoa kunkin kannan sekä CBHI'- että CBHI+-transformanteis-15 sa. Parhaat transformantit tuottivat ksylanaasiaktiivisuuden, joka oli noin kaksinkertai sesta (T. reesei ALK02221 ja ALK02721) noin 4,5-kertaiseen (T. reesei VTT-D-79125) vastaaviin isäntäkantoihin verrattuina. Korkeimmat aktiivisuudet (nkat/ml) saatiin, kun isäntänä käytettiin T. reesei ALK02721:htä. T. reesei ALK02221:n parhaat transformantit tuottivat vähemmän kuin puolet aktiivisuudesta, joka saatiin kahden 20 muun kannan parhailla transformanteilla. Ksylanaasiaktiivisuudessa oli vähän eroa T\ : reesei ALK02221:n ja ALK02721:n transformanttien CBHI+- ja CBHI-fenotyyppien • · · • välillä (kuvio 6). T. reesei VTT-D-79125:n niiden transformanttien joukossa ne trans- *.:.·* formantit, joilla oli fenotyyppi CBHI+, olivat keskimäärin parempia ksylanaasin tuotta- • · • · · M : jia.

• · · 25* • ·· • · # *·* * Sen vaikutuksen arvioimiseksi, joka geneettisellä taustalla oli xln2-geenin ilmetymiseen kolmessa isännässä, laskettiin ksylanaasiaktiivisuuden suhteellinen lisääntyminen CBHI'- • # · \”j transformanteissa. CBHI -transformantteja käytettiin, jotta eliminoitiin kaikki vaikutuk- • · · • · · *. set, joita integraatiokohdan eroilla oli geenin ilmentymiseen. Kunkin isäntäkannan 30 * CBHI -transformanttien suurimmalla osalla (42 - 86 prosenttia, taulukko 1) ksylanaasi lisääntyi saman verran. Useimmat transformantit, jotka poistettiin tästä vertailusta, • · · ; tuottivat suurempia ksylanaasiaktiivisuuksia. Tästä voidaan päätellä, että taulukossa 1 • · esitetyillä transformanteilla on todennäköisesti yksi ylimääräinen xln2:n kopio cbhl- 44 fokuksessa luonnonmukaisen xln2:n lisäksi. Näiden transformanttien keskimääräinen ksylanaasiaktiivisuus ja sen keskimääräinen lisääntyminen isäntäkantaan verrattuna esitetään taulukossa 1. Kesksimääräinen lisäys, kannan mukaan, oli alueella, joka oli 600 nkat/ml (ALK02221) - 27000 nkat/ml (ALK02721).

5

Taulukko 1

Ksylanaasin tuoton suhteellinen nousu CBHr-transformanttien valitussa sarjassa

Kanta Keskim. aktiivisuus Aktiivisuuden keskim.

(nkat/ml) lisäys (nkat/ml) VTT-D-79125 3700 (+/-20 %) 1400 10 transformantit (50%) 5100 (+/-20 %) ALK02221 3800 (+/-10 %) 600 transformantit (85%) 4400 (+/-15 %) ALK02721 10200(+/-15 %) 2700 transformantit (42%) 12900(+/-10 %) 15 1 2 Suluissa esitetään sellaisten CBHr-transformanttien osuus (%), joilla ilmeisesti on xln2-geenin ylimääräinen kopio.

·.· I Tulosten tarkastelu • · · • · · • · • ·

On esitetty useita selontekoja, jotka koskevat bakteeriperäisten ksylanaasien molekyyli- • · ·1·: : kloonausta (esim. Ghangas, G.S. et ai.. J. Bacteriol. 171:2963-2969 (1989); Linja ···· Thomson, Mol. Gen. Genet. 228:55-61 (1991); Sharek, F., et ai.. Gene 107:75-82 * ·· • · · (1991); Whitehead ja Lee, Curr. Microbiol. 23:15-19 (1991)). Viimeaikoina on julkaistu myös raportteja, jotka koskevat filamenttisienten ksylanaasien kloonausta, mukaan • · · 25; luettuina selonteot, jotka koskevat Aspergillus tubieensistä (van den Broeck, N., et ai., • · · • · ·

"Cloning and Expression of Xylanase Genes from Fungal Origin," EP 0 463 706 AI

* 1 (1992)), A. nigerin var. awamorita (Maat, J., et ai.. "Xylanases and their Application

In Bakery" julkaisussa Xylans and Xylanases, Visser, J., et ai,, toimittajat, Elsevier 2

Science, Amsterdam, ss. 349-360 (1992)), A. kawachiita (Ito, K., et ai.. Biosci. Bio- • · :3t>: technol. Biochem. 56:906-912 (1992) sekä T. reeseitä (Suominen, P., et ai.. "Genetic 45

Engineering of Trichoderma reesei to Produce Suitable Enzyme Combinations for Applications in the Pulp and Paper Industry", julkaisussa Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Kuwahara ja Shimada, toimittajat, Uni Publishers Co., Ltd., Tokio, Japani, ss. 439-445 (1992); Törrönen, A., et ai.. Bio/Technology 10:1461-1465 5 (1992)). T. reesein luonnonmukaisen kannan QM6a ksylanaasi II:n geenit, jotka keksi jät ovat kloonanneet (katso myös Suominen, P., et ai.. "Genetic Engineering of Trichoderma reesei to Produce Suitable Enzyme Combinations For Applications in Pulp and Paper Industry", julkaisussa Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Kuwahara ja Shimada, toimittajat, Uni Publishers Co., Ltd., Tokio, Japani, ss. 439-445 (1992)) ja 10 RUTC-30-mutanttikannan ksylanaasi II:n geenit, jotka Törrönen et ai. olivat kloonan neet, Bio/Technology 10:1461-1465 (1992), eivät olleet täydellisesti identtisiä. Pääerot olivat esipropeptidien sekvenssien välillä, mikä antaa aiheen olettaa, että signaalin käsittelyssä oli eroja.

15 Keksijöiden tulosten mukaan T. reesein geeni xln2 sisältää yhden pitkän intronin, joka on suuruudeltaan 10S emäsparia. Filamenttisienten intronit ovat tavallisesti pienempiä, pituudeltaan noin 50 emäsparia, mutta ne voivat olla myös huomattavasti pitempiä, kuten Vanhanen et ai. ovat osoittaneet T. reesei:llä 3-fosfoglyseraattikinaasin suhteen, Curr. Genet. 12:181-186 (1989). xln2-geenin sopivan mittainen esiprosekvenssi (33 20 aminohappoa) sisältää yhden pääpilkkoutumiskohdan signaalipeptidaasia varten. Tämä • · · ··· : on sopusoinnussa signaalisekvenssin kanssa, joka sisältää 19 aminohappoa ja jota seuraa • · · • 14 aminohapon mittainen propeptidi, joka translaation jälkeen voidaan lohkoa kypsästä • · · proteiinista. Törrönen et ai.. Bio/Technology 10:1461-1465 (1992) ovat esittäneet, että • · · • · · **V T. reesein kannan RutC-30 ksylanaasi II:n (pl 9) signaaliesipropeptidi käsittää 32 amin-··· Ϊ3! ohappoa ja siinä on kaksi oletettua signaalipeptidaasin pilkkomiskohtaa, jotka ovat erit-• · · täin lähellä translaation aloituskohtaa (5 ja vast. 11 aminohappoa). Tämä antaisi tulok-seksi jokseenkin lyhyet signaalisekvenssit. Kaksivaiheisen proteiinin käsittelyn, saman- • ··· laisen kuin ksylanaasi II:lie tässä ehdotetun käsittelyn on osoitettu tapahtuvan A. nieerin • · · « • . glukoamylaasilla (Innis, M.A., et ai.. Science 228:21-26 (1985)), ja esitetään, että se 301. tapahtuu T. reesein sellobiohydrolaasi II:lla (Teeri, T., et ai.. Gene 51:43-52 (1987)).

• 1

Sellainen kokonaisrakenne, joka esiintyy T. reesein xn!2:lla. esiintyy myös A. nigerin • · ♦ ;1 ‘ ksylanaasigeenillä (van den Broek, N., et ai.. "Cloning and Expression of Xylanase • · · genes from Fungal origin", EP 0 463 706 AI (1992), mutta se ei esiinny esimerkiksi 46 A. kawachiin ksylanaasigeenillä, joka sisältää yhdeksän intronia ja koodittaa suurempaa proteiinia (32,7 kDa) (Ito, K., et ai.. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:906-912 (1992)).

Ksylanaasin tuottoa T. reesein kolmessa kannassa voitiin lisätä, siten että lisättiin xln2-5 geenin kopioiden lukumäärää. Näistä kannoista T. reesei VTT-D-79125 on sellulaasin suurtuottajamutantti, ja ALK02721:htä käytettiin isäntänä, koska se jo ennalta tuotti suuria ksylanaasimääriä. Ksylanaasia haluttiin tuottaa myös T. reesei ALK02221:llä, joka tuottaa vähän proteaasia, molempia siitä syystä, että aikaansaatiin alhainen ksylanaasin tuotto sekä samanaikaisesti alhainen proteaasitausta ja haluttiin lisätä ksylanaa- 10 sin suhteellista määrää viljelyalustassa.

Ksylanaasiaktiivisuuden suurin nousu oli noin kaksinkertaisesta noin nelinkertaiseen, kun verrattiin vastaavaan isäntäkantaan. Vähän proteaasia tuottavan ALK02221-kannan transformanttien ja geenitekniikan avulla konstruoidun isännän ALKO-2721 ksylanaasi-15 aktiivisuuksiin ei vaikuttanut se, oliko xln2-geeni integroitu cbhl-lokukseen tai muualle genomiin (CBHI+/' -fenotyyppi). T. reesein VTT-D-79125-transformanteilla xln2-geenin integraatio muualle (CBHI+-fenotyyppi) kuin cbhl-lokukseen näytti tuottavan suuremman entsyymisaannon. Nämä havainnot ovat jokseenkin ristiriitaisia Harkki et al.:n (Enzyme Microb. Technol. 13:227-233 (1991)) havaintojen kanssa, jotka viittaavat sii-20 hen, että ekspressiokasetin optimi ilmentyminen edellyttäisi, että se integroituisi cbhl- : lokukseen. Olisi kuitenkin huomattava, että esillä olevassa tutkimuksessa ilmentymiseen m « • · · • .1 käytettiin xln2-promoottoria cbhl-promoottorin sijaan, jota viimeksi mainittua Harkki et 9 ai., Enzyme Microb. Tecnol. 13:227-233 (1991), käyttivät egll cDNA:n kanssa. Tämä • 1 · **’/ ilmaisee, että cbhl-lokus ei voi olla paras ympäristö ilmentymiselle xln2-promoottorin alla.

• · · » « · . Geneettisellä taustalla näytti olevan merkittävä vaikutus xln2:n ilmentymiseen, siitä |1J’# huolimatta että T. reesein kannat ALK02221 ja ALK02721 ovat peräisin VTT-D- • t 9 79125:stä. Ksylanaasin tuotto lisääntyi eniten (2700 nkat/ml) T.reesein ALK02721 30 ] kannan transformanteissa, joilla oli myös suurin ksylanaasiaktiivisuus. xln2:n yhden . lisäkopion ilmentyminen vaihteli yli nelinkertaisesti isännän mukaan (taulukko 1).

11 · • · · • · · • · · • ·· • · 47

Esimerkki 2 XYL2:n lisääntynyt tuotto: cbhl-promoottoriin yhdistetty xln2-geeni pALK174:n konstruktio ja kolmen Trichoderma reesei-kannan transformaatio 5 pALK174:n konstruktio esitetään kuviossa 7. Syntetisoitiin ensimmäinen PCR-fragment-ti, joka sisälsi 674 emäsparia sekä cbhl-promoottorin tarkan yhdistämiskohdan xln2-signaalisekvenssiin (ja xln2-eeenin sisäiseen Xhol-kohtaan). siten että templaattina käytettiin plasmidia pALK475 (kuvio 2). Käytetyt oligonukleotidit olivat seuraavat: 5’-10 aluke, joka sisälsi cbhl -promoottorin pään ja oletetun xln2-signaalisekvenssin alkuosan, 3’-alukkeella oli sekvenssi, joka oli peräisin xln2-geenistä ja sisälsi geenin sisäisen Xhol-kohdan (katso pALK476:n karttaa, kuvio 5, tai x]n2-sekvenssiä).

5’-aluke (39-mer) (sekvenssin identifiointinumero 11]: 15 5’- C AACCGCGGA CTG CGC ATC ATG GTC TCC TTC ACC TCC CT Sac II oletetun xln2-sig-cbhl-promoot- naalisekvenssin alku torin loppu 20 m

» « I

3’-aluke (26-mer) [sekvenssin identifiointinumero 12]: • t « • · • » r

I * I

.'* 5’-GGG AGC CGC TCG AGC GGT GGT TGC GG

!··ν _Xhsi * ·· $$ xln2-sekvenssi » t « « 100 /xl PCR-reaktioseosta sisälsi PCR-puskurissa (10 mmoolia Tris pH 8,3, 50 mmoolia »«·« , KC1, 1,5 mmoolia MgCl2, 0,01 prosenttia gelatiinia, paino/tilavuus) 50 pmoolia kutakin e , aluketta, 10 ng templaatti-DNA:ta, 0,2 mmoolia dNTP:tä ja 2 U Taq-polymeraasia * · 30. (Boehringer Mannheim). Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: denaturointi yhden minuu-• · tin ajan 95 °C:ssa, alukkeiden kinnittyminen 60 °C:ssa, pidentäminen (DNA-jaksojen • · « ] kopionti) 72 °C:ssa 30 syklin ajan, ja lopullinen pidennys, 9 minuuttia.

et· ♦ ·· t · 48 PCR-fragmentti puhdistettiin Mermaid®in reagensseja ja välineitä käyttämällä (Bio 101 Inc., La Jolla, Kalifornia, Yhdysvallat). Sen jälkeen kun fragmenttia oli käsitelty T4 DNA -polymeraasilla, se leikattiin Sachlla. jotta se voitiin yhdistää cbhl-promoottoriin.

5 Plasmidi pAMHllO, joka sisälsi cbhl -promoottorin, leikattiin NdeLllä (täydennetty

Klenowlla) sekä SacILlla. Edellä kuvattu PCR-fragmentti sidottiin pilkottuun pAMH110:een (pALK174X). Fuusiot ja PCR:llä syntetisoitu sekvenssi varmistettiin sekvensoimalla.

10 Plasmidi pAKJ174 konstruoitiin, siten että xln2-promoottori. joka sijaitsi pALK476:ssa, korvattiin cbhl -promoottorilla: 2,9 emäsparin mittainen Kpnl-XhoI-fragmentti plasmi-dista pALK174X, joka sisälsi cbhl -promoottorin, joka oli yhdistetty xln2-geeniin. ja xln2-sekvenssi. joka oli yhdistetty sisäiseen XhoLhteen. sidottiin eristettyyn vektoriin, joka sisälsi pALK476:n fragmentin, sen jälken kun pALK476 oli leikattu KpnLllä ja 15 XhoI:llä.

Plasmidi pALK174 sisältää amdS:n ja cbhl:n 3’-alueiden lisäksi, kuten pAJLK476:ssa (kuvio 4), xln2-geenin. joka on yhdistetty cbhl-promoottoriin ja xln2-geenin 1,9 emäs-parin mittaiseen päätekodoniin (3’-alue).

20 «

III

;;·/ 9,7 kiloemäksen suuruista EcoRI-fragmenttia (ilmentymiskasetti, jossa ei ole vektorisek- r i · ‘ !1 venssejä) käytettiin Trichodenna-kantojen VTT-D-79125:n, ALK02221:n ja ALKO- • i « • · 2721 :n transformointiin. Kantoja, transformaatio- ja puhdistusmenetelmää, transfer-

i » S

**V mänttien analysointia ja kasvatusta kuvattiin edellä ja kuvataan esimerkissä 6.

·»<« i · · «

Ksylanaasin tuottaminen pALK174-transformanteilla ««· VTT-D-79125-, ALK02221- ja ALK02721-transformantteja, vastaavasti 39, 41 ja 50, puhdistettiin ja kasvatettiin tuotettujen ksylanaasiaktiivisuuksien mittaamiseksi. Ne taa- • · 30. juudet, jotka saavutettiin kohdistettaessa cbhl-lokukseen ja jotka mitattiin, siten että 9 9 käytettiin dot blot -menetelmää ja CBHLlle spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta • « · l \ (kuten esimerkissä 4), olivat 82, 46 ja vastaavasti 84 prosenttia. CBHI+- ja CBHL- < » · *· · · ’ transformanttien ksylanaasiaktiivisuuden tuotto, joka esitetään suhteellisena aktiivisuute- 49 na verrattuna VTT-D-79125:llä tuotettuun aktiivisuuteen, esitetään kuviossa 8. Pylväät esittävät tuotantotasojen keskiarvoja ja aluetta kunkin isäntäkannan transformanttien joukossa. Ksylanaasi-aktiivisuus määritettiin viljelmäsupematanteista, kuten kuvataan esimerkissä 3 (xln2:n kloonaus).

5

Kaikki Trichoderma-kantoien transformantit tuottivat ksylanaasia runsaasti. Parhaat VTT-D-79125- ja ALK02221-transformantit tuottivat noin 10 kertaisen ksylanaasiaktii-visuuden isäntäkantoihinsa verrattuina. Parhaat ALK02721-transformantit tuottivat suunnilleen saman määrän ksylanaasiaktiivisuutta kuin parhaat VTT-D-79125- ja 10 ALKO-2221-transformantit, ja aktiivisuuden lisäys oli kolminkertainen isäntään verrat tuna. CBHr-transformantit olivat keskimäärin parempia tuottajia kuin transformantit, joilla oli CBHI+-fenotyyppi. CBHT-transformanteissa selluloosaa hajottava aktiivisuus luonnollisesti väheni cbhl-geenin deleetion vuoksi.

15 Kun käytettiin pALK174-konstruktiota, ksylanaasin tuottotasot olivat suuremmat kuin tasot, jotka saatiin, jos käytettiin pALK476:tta (xln2 oman promoottorinsa kontrollin alla, katso esimerkkiä 1).

Esimerkki 3 « :2P: Endoksylanaasi I:n rakenne, xlnl. Trichoderma reesein geeni • · · • · · • · • · Tässä esimerkissä esitetään kloonaus T, reesein geenille xlnl. joka koodittaa endoksy- • · : lanaasi I:htä, jolla on alhainen pl (5,5).

• · · • · ·· • · · • · · *25 ’ Materiaalit ja menetelmät • · · *::: Bakteerikannat ja plasmidit • · · • · · * 1 Tässä tutkimuksessa käytetyt plasmidit olivat pBluescript (Stratagene, San diego, CA,- 30 ’ USA) sekä pCRIOOO (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Plasmideja lisättiin Esche- ; richia colin kannassa XLI-Blue (Bullock, W.O. et ai.. Bio/Techniques 5:376-378 (19- • · 87) tai E. coli INVlaF’:ssa (Invitrogen). E. colin viljelmiä kasvatettiin 37 °C:ssa yön ajan L-liemessä (Maniatis, T. et ai.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold 50

Sring Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, New York) (1982), jota tarvittaessa oli täydennetty ampisilliinilla (50 /^g/ml).

Peptidin pilkkominen ja aminohapposekvensointi 5

Puhdistettua ksylaasi I:htä (Tenkanen, M. et ai.. Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 81992), joka oli peräisin T. Teeseistä (VTT-D-79125; Baily. M.J., Nevalainen, K.H- .M., Enzyme Microb. Technol. 3:153-157 (1981)) pilkottiin 2-prosenttisella (paino/pai- no) trypsiinillä (TPCK-käsitelty, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; USA), 10 joka oli 1-prosenttisessa (pamo/tilavuus)ammoniumkarbonaatissa, 37 °C:ssa 2,5 tunnin ajan. Sen jälkeen kun näytteeseen oli lisätty 3-prosenttista trypsiiniä (paino/paino), inkubointia jatkettiin yön ajan (13 h). Peptidit erotettiin nestekromatokrafialla, jolla on suuri erotuskyky (HPLC) ja jossa oli Rexchrom Prep-5/300 ODS käänteisfaasipylväs.

Eluoitiin nopeudella 1 ml/ minuutti liuottimen lineaarisessa gradientissa, 5-prosentti- 15 sesta (tilavuus/tilavuus) asetonitriilistä (ACN), joka sisälsi 0,1 prosenttia trifluorietikka- happoa (TFA), 60-prosenttiseen (tilavuus/tilavuus) ACN:iin, joka sisälsi 0,06 prosenttia TFA:ta, 60 minuutissa, 24 °C:ssa. Mitattiin absorbanssi 218 nm:ssä. Proteiinien ja peptidien aminopäätteet sekvensoitiin, siten että ne pilkottiin kaasu-nestepulssi-sek- venaattorissa (Kalkkinen, N. ja Tilgmann, C., J. Prot. Chem. 7:242-243 (1988). Va- •2D · pautuneet PTH-aminohapot analysoitiin ohutkolonnisella käänteisfaasinestekromatogra-• · · i fialla, jolla oli suuri erotuskyky.

• · · • · · • · · • · • · · DNA-manipulaatiot ja -transformaatiot • · · • · · · • ·« • · · *25' DNA-konstruktioihin käytettiin standardi-DNA-menetelmiä, joita Maniatis et ai. kuvaa- . vat (Maniatis et ai.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor • · ·

Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) (1982)). Plasmidi- ja kosmidi-DNA:t • · · • · · eristettiin, siten että käytettiin Qiagen-pylväitä (Diagen GmbH, Diisseldorf, Saksa) * valmistajan ohjeiden mukaan. E. coli transformoitiin Hanahanin mukaan (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166:557-580 (1983)).

• · · • · · • · · 1 · · • · · • · 51 RNA:n eristäminen RNA:n eristämistä varten T. reeseitä (VTT-D-79125) kasvatettiin fermenttorissa, ksy-lanaasia indusoivassa väliaineessa; 30 °C:ssa kolmen päivän ajan (kuten tässä edellä 5 kuvattiin xln2-geenin eristämisen suhteen). Rihmastot jauhettiin hienoksi jauheeksi nestemäisen typen alla. Kokonais-RNA ja mRNA eristettiin, kuten Bartels ja Thompson kuvaavat (Bartels, D., ja Thompson, R.D., Nucleic Acid Res. 11:2961-2978 (1983)), ja ne fraktioitiin koon mukaan DMSO-sakkaroosigradienttia käyttämällä (Boedtker, H. et ai.. Biochemistry 15:4765-4770 (1976)).

10

Ksylanaasi I -cDNA:n kloonaus cDNA:n ensmmäinen säie syntetisoitiin ja myöhemmin se amplifikoitiin PCR:llä, kuten tässä yhteydessä kuvataan xln2:n suhteen, paitsi että geenispesifisenä alukkeena käytet-15 tiin oligomeeriä (5’ AA(T/C)-TA(T/C)-GA(T/C)-CA(G/A)-AA(T/C)-TA(T/C)-GA 3’) [sekvenssin identifiointinumero 9], joka pääteltiin ksylaansi I -proteiinin N-päätteen sekvenssistä. Saatu PCR-fragmentti, joka oli 0,6 kiloemäksen suuruinen, alakloonattiin pCRIOOO-vektoriin ja sekvensoitiin.

•201 xlnl-eeenin eristäminen • · · • · · • · • · T. reesein (QM6a, Mandels, M., Reese, E.T., J. Bacteriol. 73:269-280 (1957)) geno- • · : minen kosmidikirjasto seulottiin ksylanaasi I -cDNA:n PCR-fragmentilla, joka oli • · · ···: leimattu digoksigeniinillä (katso esimerkki 1), toimittajan ohjeiden mukaan (Boehringer • · · ♦ · · '25 ’ Mannheim, Mannheim, Saksa). Saatiin yksi positiivinen kosmidiklooni. Valmistettiin kosmidin xlnl-alueen res-triktiokartta, ja 2,3 kiloemäksen mittainen EcoRI- fragmentti j alakloonattiin pBluescriptiin (pALK572) sekvensointia varten.

• · · « ' * Nukleotidisekvensointi 30" • · * :.· - Templaatit nukleotidisekvensointia varten tuotettiin yksisuuntaisilla deleetioilla ohjeiden • · mukaan, jotka valmistaja on antanut pBluescript-Exo/Mung -DNA:n sekvensointijärjes-telmälle (Stratagene). DNA sekvensoitiin molemmissa suunnissa, siten että käytettiin 52 ABI-reagensseja (Applied Biosystems, Foster City, USA), jotka perustuivat fluoresenssilla leimattuihin T7- ja T3-alukkeisiin, ja Taq-syklisekvensointimenetelmällä toimittajan ohjeiden mukaan. Sekvensointireaktiot analysoitiin ABI 373A -sekvenaattorilla.

5 Tulokset T. reesein xlnl-cDNA:n kloonaus

Puhdistetun ksylanaasi I:n aminopään sekvenssiksi saatiin Ala-Ser-Ile-Asn-Tyr-Asp-Gln-10 Asn-Tyr-Gln-Thr-Gly-Gly-Gln-Val-Ser-Tyr-(Ser)-Pro-(Ser)-Asn-Thr-Gly-Phe-Ser [sek venssin identiflointinumero 10]. Saatiin myös viisi tryptistä peptidiä ja ne sekvensointiin suoraan (katso kuviota 10 peptidisekvenssien suhteen).

Sellainen Northem-hybridisaatio, jossa koettimena käytettiin oligomeeriä, joka oli 15 päätelty ksylanaasi I:n N-terminaalisesta peptidisekvenssistä (katso yllä), antoi ksy lanaasi I:n mRNA:n kooksi noin 0,7 kiloemästä.

cDNA:n ensimmäisen säikeen PCR-amplifikaatio motti fragmentin, jonka koko oli 0,7 kiloemästä. Tämän DNA:n nukleotidisekvensssin translaatiossa saatiin proteiini, joka :2P: sisälsi kaikki ksylanaasi I -peptidin sekvenssit, N-terminaalinen sekvenssi mukaan • · · : luettuna (katso kuvio 10).

• · · • · • · · • · » ·*·: : T. reesein xln2-geenin eristäminen ja nukleotidisekvenssi • · · ···· • · · ‘25 ’ T. reesein genomisesta kosmidikirjastosta eristettiin yksi positiivinen klooni. Ksylanaasi I:n geeni (xlnl) löydettiin kosmidin EcoRI-fragmentista. joka oli kooltaan 2,3 kiloemäs- • · « *::: tä (kuvio 9).

• · « • · · Määritettiin xlnl-geenin nukleotidisekvenssi ja se esitetään kuviossa 10 yhdessä päätel- 30 ’ lyn aminohapposekvenssin kanssa. TATA-boksi löydettiin noin 90 nukleotidiä ylävir-• · · ; taan oletetusta translaation aloituskohdasta. Translaation kolmesta erilaisesta päätellystä • · aloituskohdasta, jotka edeltävät kypsän proteiinin N-päätettä, vain yksi oli ympäristössä, joka muistutti hyvin säilynyttä konsensussekvenssiä 5’ CA-C/A-A/C-ATG 3’, joka 53 filamenttisienillä on translaation aloituskohtaa varten (Ballance, J.D., julkaisussa Leone, S. A., Berka, R.M., toimittajat, Molecular Industrial Mycology. System and application for filamentous fiingi (Marcel Dekker, Inc., New York), ss. 1-29 (1991)). Täten geeni koodittaa 229 aminohappoa. Tässä proteiinissa N-päätettä (saatu suoralla peptidi-sek- 5 vensoinnilla) edeltää 51 aminohapon mittainen signaalipropeptidi, joka sisältää signaa- lisekvenssin pääpilkkoutumiskohdan (von Heijne, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986), joka on aminohappojen Alal9 ja Met20 välissä (kuvio 10). Genomisen sekvenssin vertailu cDNA-sekvenssin kanssa paljasti yhden intronin, jossa oli 62 emäsparia. Näiden tulosten perusteella pääteltiin, että kypsän ksylanaasi I:n proteiinissa on 178 10 aminohappoa ja sen laskettu molekyylipaino on 19,1 kDa. Tämä sopii hyvin yhteen 19 kDa:n kanssa, joka on saatu T. reeseistä eristetylle, puhdistetulle ksylanaasi I:lle (Tenkanen, M. et ai.. Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 (1992)). Erona ksylanaasi II:n geeniin (katso tässä) nähden on se, että N-glykosylointia varten ei ole mitään sekvenssiä (Asn-X-Ser/Thr, jossa X ei ole Pro; Gavel, Y., von Heijne, G., Protein Engineering 15 3:433-442 (1990).

T. reesein ksylanaasi I:n vertailu muiden ksylanaasien kanssa

Ksylanaasien molemmat ehdotetut katalyyttiset glutamiinihapot (Katsube, Y. et ai..

:2P: Proc. 2nd Int. Conference Protein Engineering (Japan Scientific Societies Press, Tokio) • · · : ss. 91-96 (1990); Wakarchuk, W. et ai., julkaisussa Visser et ai., toimittajat, Xylans and Xylanases (Elsevier Science, Amsterdam), ss. 439-442 (1991), löydettiin ksylanaasi ;·ϊ : I:stä asettamalla sekvenssi suoraan riviin, ja ne vastasivat kypsän entsyymin • · ·

Glu75:ttä ja Glul64:ää. Taulukko 2 esittää suoraan riviin asetetun sekvenssin vertailua, ··· ** I i · 215’ joka osoittaa prosentuaalisen yhtäläisyyden erilaisten ksylanaasien välillä. Matriisin . ylempi oikea puolisko esittää täydellisten, kypsien sekvenssien suoraan riviin asettami- • · · sen tulokset, ja matriisin alempi vasen puoli esittää sekvenssien tulokset ksylanaasien • · · aktiivisen kohdan oletettujen glutamiinihappojen välillä.

• · # ·« • I · • · « · • · · • · · • · 54

Taulukko 2

Erilaisten ksylanaasien sekvenssien linjausten identiteetti-%:t matriisina esitettynä. Ylempi oikea puolisko: kypsän entsyymin sekvenssin linjaukset. Alempi vasen puolisko: sekvenssivertailu kahden ehdotetun aktiivisen kohdan glutamiinihapon väliltä TI, T. reesei ksylanaasi I; TII, T. reesei ksylanaasi II; TV, T. viride (Yaguchi, M. et ai., in Visser, J. et ai., eds., Xylans and Xylanases (Elsevier Science, Amsterdam), pp -154 (1992a)); ΤΗ, T. harzianum (Yaguchi, M. et ai., in Visser, J. et ai.. J., Xylans and Xylanases (Elsevier Science, Amsterdam), pp. 435438 (1992b)); AT, A. tubieensis (van den Broeck, H. et ai.. "Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin," EP 0 463 706 AI (1992)); SC, Schizophvllum commune (Oku, T. et ai.. Canadian Fed. Biol. Soc. Annu. Meet. (Quebec City), Abst. 676 (1988)); AK, A. kawachii (Ito, K. et ai.. Biosci. Biotec. Biochem. 56: 906-912 (1992), linjattiin ensimmäiset 190 aminohappoa); BC, Bacillus circulans (Yang, R.C.A. et ai.. Nucleic Acids Res. 16:7187 (1988)); BP, P. pumilus (Fukasaki, E. et ai.. FEBS Lett. 171:197-201 (1984)); BS, B. subtilis (Paice, M.G. et ai.. Arch. Microbiol 144: 201-206 (1986)); CA, Clostridium acetobutvlicum (Zappe H. et ai.. Nucleic Acids Res. 18:2179 (1990)); SS, Streptomvces sp. 36a (Nagashima, M. et ai.. Trends Actinomycetologia 91-96 (1989)).

_ π ΤΠ TV TH AT SC AK BC BP BS CA SS

Tl 10· S2 52 51 47 42 16 49 40 49 40 43 ΤΠ 60 100 98 94 43 34 17 52 48 52 46 52 TV «0 99 100 94 43 54 23 52 49 52 46 51

• · · mbb^B ^^^^MB MM MMM1· ^^^^B BBBB^M ^MMM

TH 57 98 97 100 43 56 19 52 48 52 44 51

• · · MM^M HMMBBM MM BBBBBBBI MM B^HBBB MMM· HMM BM^M· BBBM^B ^MM^M

AT 62 57 57 58 100 38 17 40 34 40 32 33 • · «BMMM ΜΜΜΜΜ M^B^MB BMB^M BMB MH· B^MBM BBBB B^MBM BBMMB MM^HM ^M· ;1V SC 52 51 51 52 SO 100 15 52 42 52 44 50

• · · BMi^^B MMM MH^MM MMMMI B^M^M MBB, BBBBBB Bi^^BM BBM B^MMBi BBBBBBa HMBBBB BBBB

·;;; AK 20 21 20 21 23 21 100 14 18 14 20 19

• · · BBBMB^B «B^MMB BBMBM MBM MBBBM ^^^BM MB^BB BBBB M^MBM BBB^B

BC 53 54 54 56 S3 54 16 100 48 100 45 58 BP 52 57 57 58 47 48 17 59 100 48 71 49 • · · HBMBM MMB MB^^B BBBBBM ^B^B· BBMBM BBB^^B ^^BBM ^BBBBB ^B^^^B ·1Β·ν^ BS 53 54 54 56 53 54 14 99 60 100 45 58

• · · MMMBBM MMiMB MM ^BBMM BBMBM BMBB^ BMBBB· ^^^MB BBMBB ΒΒΒϋ BBBB BMM^M

CA 52 51 52 52 42 47 19 57 73 58 100 46

MBB MMMMMi BB^^^B ^BBIBi BB^MB ^^MB BBM BBBBBB BMBBB BBBB B^^M^B ^M^BMB

SS 50 53 53 53 46 49 18 64 56 64 52 100 • · LbbJLbbbbJmbJLbbb-LbbbLbb^m^^^^^^^bb^imJbbbbJLbbb ··· • · • · • · · • ·· • · • · ··· · • · · • · · • · 55

Voidaan nähdä, että T. reesein ksylanaasi Π (pH 9,0) on melkein identtinen T. viriden ja T. harzianumin pienimolekyylisten ksylanaasien kanssa, joilla pl on korkea (Yaguchi, M. et ai., julkaisussa Visser, J. et ai., toimittajat, Xylans and Xylanases (Elsevier Science, Amsterdam), ss. 149-154 (1992); Yaguchi, M. et ai., julkaisussa Visser, J. et 5 aL, julkaisijat, Xylans and Xylanases (Elsevier Science, Amsterdam), ss. 435-438 (1992)). Kahden aktiivisen kohdan glutamiinihappojen välisen alueen asettaminen suoraan riviin antoi useimmissa tapauksissa suuremman yhtäläisyyden kuin antoivat täydelliset, kypsät sekvenssit, jotka oli asetettu suoraan riviin.

10 Tulosten tarkastelu T. reesei tuottaa ainakin kahta erilaista ksylanaasia, ksylanaasi I:htä, jonka pl on 5,5, sekä ksylanaasi II:hta, jonka pl on 9, jotka ovat pienikokoisia proteiineja, vastaavasti 19kDa ja 20 kDa (Tenkanen, M. et ai.. Enzyme Microb. technol. 14:566-574 (1992)). 15 Vastaavat geenit xlnl ja xln2 on kloonattu ja kuvattu tässä yhteydessä, xlnl- ja xln2- geenien kokonaisrakenteet olivat hyvin samanlaiset; ne olivat samankokoiset, ja molemmat sisälsivät vain yhden intronin ja pitkän esipropeptidin. Kuitenkin vain näillä kahdella ksylanaasilla on 54 prosenttia yhtäläisyyttä DNA-tasolla ja 52 prosenttia aminohappo-tasolla. Täten ainoastaan niiden primaarirakenteet eivät eroa toisistaan vaan myös niiden :2b! entsymaattiset ominaisuudet, kuten esimerkiksi erilaisten pH-arvojen tai lämpötilojen • · · • · · : sietokyky, sekä kineettiset parametrit, kuten Tenkanen et ai. esittävät (Tenkanen, M. et 9 9 9 m aL, Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 (1992)). Ksylanaasit on jaettu hydrofobisen • · · :·· ' ryhmäanalyysin perusteella kahteen alaluokkaan F ja G. Henrissat ehdottaa (Henrissat • · · B., julkaisussa Visser, J. et ai., toimittajat, Xylans and Xylanases, Proc. Int. Symp.

: : : 25 Wageningen (Elsvier, Amsterdam), ss. 97-110 (1991)), että näiden kahden alaluokan . ksylanaasit kertautuvat eri tavalla. T. reesein ksylanaasien I ja II suuri yhtäläisyys muihin ksylanaaseihin verrattuina (taulukko 2), A. kawachiin ksylanaasia A lukuunotta- • · · • # matta, viittaa siihen, että myös ne, kuten muut pienimolekyylipainoiset ksylanaasit, ] kuuluvat alaluokkaan G. A. kawachiin ksylanaasin tapauksessa (Ito, K. et ai.. Biosci.

30 Biotec. Biochem. 56:906-912 (1992)) havaittiin vain noin 20 prosentin yhtäläisyys T\ • · · *.* * reesein ksylanaasien kanssa. Ensiksi mainitulla ksylanaasilla on suurempi molekyylipai- • 9 9 9 9 '· no, joka on 32,7 kDa, ja sen on ehdotettu kuuluvan alaluokkaan F (Ito, K. et ai. Bios ci. Biotec. Biochem. 56:906-912 (1992)).

56

Esimerkki 4 XYLI:n lisääntynyt tuotto Trichodermalla. joka on transformoitu konstruktiolla, joka sisältää cbhl-promoottoriin (pALK807) yhdistetyn xlnl-geenin 5 Plasmidin pALK807 konstruktio ja Trichoderma-kannan ALK0221 transformointi

Plasmidi pALK807 kontruoitiin, siten että käytettiin samaa strategiaa kuin pALK174:n konstruoinnissa (kuvio 11). PCR:n avulla valmistettiin 98 emäsparin suuruinen fragmentti, joka sisälsi cbhl -promoottorin liittymän oletettuun xlnl -signaalisekvenssiin ja 10 xlnl-sekvenssin liittymän sisäiseen Xhol-kohtaan (katso pALK572:n karttaa kuviossa 2 tai xlnl-sekvenssiä), ja tällöin käytettiin seuraavia oligonukleotidejä: 5’-aluke (39-mer) [sekvenssin identifiointinumero 13]:

15 5 - C AAC CGC GGA CTG CGC ATC ATG GTT GCC TTT TCC AGC CT

Sac II oletetun xlnl-signaalisekvens- cbhl -promoottorin loppu sin alku 3’-aluke (30 mer) [sekvenssin identifiointinumero 14] :2b: ·« ·

i 5’-CAG GCT CGA GGC CTG TGG GCA TCG CCA GAG

•i-: XhoI

• · ♦ · · · xlnl-sekvenssi • · · • I···

• M

: : : 25 . PCR-reaktion templaattina käytettiin plasmidia pALK572, joka sisälsi xlnl-geenin.

• · · ’!!! Reaktion annettiin tapahtua ja mote puhdistettiin, kuten meneteltiin plasmidia pALK174 • · · konstruoitaessa. Plasmidin pALK805 saamiseksi puhdistettu ja SacII- XhoI:llä pilkottu [ PCR-fragmentti sidottiin plasmidiin pALK486, joka oli leikattu SacII-XhoI:llä ja joka 30 sisälsi cbhl-promoottorin. Jotta plasmidi pALK806 voitiin konstruoida, plasmidista • · · * pALK572 eristettiin xlnl-sekvenssi alavirtaan Xhol-kohdasta. siten että käsiteltiin • · ’· " PstKtävdennettv T4-DNA-polymeraasilla)-XhoI:llä, ja fragmentti yhdistettiin 57 pALK805:teen, jota oli käsitelty BamHKtäydennetty Klenowilla)- XhoI:llä. pALK805 saatiin, siten että EcoRI-Spel-fragmentti (täydennetty Klenowilla), joka oli saatu pALK174:stä ja joka sisälsi amdS-geenin ja cbhl 3’-reunustavan alueen (kuten pALK174:ssä), yhdistettiin EcoRV:llä leikattuun pALK806: teen.

5 T. reesein kanta ALK02221 transformoitiin 8,2 kiloemäksen mittaisella Notl-fraemen-tilla, joka oli peräisin plasmidista pALK807.

Ksylanaasin tuottaminen pALK807-transformanteilla 10

Kaikkiaan 51 pALK807-transformanttia puhdistettiin, analysoitiin ja kasvatettiin, kuten kuvataan esimerkissä 2. Kohdistumisen tehokkuus cbhl-lokukseen oli 35 prosenttia. Ksylanaasiaktiivisuus mitattiin kuten esimerkissä 2, mutta pH 4,3:ssa, joka on XYLI-aktiivisuuden optimialueella (Tenkanen et ai.. Enzyme Microb. Technol. 14:566-574 15 (1992)). Tulokset esitetään taulukossa 3 ksylanaasiaktiivisuuden lisääntymisenä verrattu na isäntäkantaan ALK02221:hteen. Mukana ovat kolmekymmentä parasta ksylanaasin tuottajaa, jotka oli saatu. Kutakin transformanttia kasvatettiin yksi pullolinen.

Parhaat transformantit tuottivat yli kymmenkertaisen määrän ksylanaasiaktiivisuutta :20: lähtökantaan varrattuna. Parhaat ksylanaasin tuottajat olivat CBHI+-fenotyyppiä, joten «i · ! ·1 ne erosivat XYLII(pALK174)-transformanteista.

f · · • · • · · • · • · · • · · • ·· t » · · • • II· • 9 a I I · » « • · · • ··· I··

• f I

• · « M··· • · • • im • % •

III

• · · • · · ft • · · • ·· • · 58

Taulukko 3

Transformanttien CBHI+/- (dot blot) X

lukumäärä verrattuna ALK02221 :hteen 5 (kontrolli) (+) ALK02221 20 (+) 11,8 5 (+) 11,7 18 (+) 10,4 10 4 (+) 9,8 33 (+) 9,5 32 (-) 9,2 21 (+) 8,9 3 (+) 8,9 15 46 (+) 8,8 40 (+) 8,2 1 (+) 8,2 43 (+) 8,0 10 (+) 8,0 20 19 (+) 8,0 8 (+) 7,9 51 (+) 7,8 39 (+) 7,6 '.:ί: 12 (_) 7)5 :2S. 7 (-) 7,2 36 (+) 6,9 41 (-) 6,8 *·** : 35 (+) 6,8 49 (-) 6,6 .30* 29 (-) 6,6 :T; 24 (+) 6,3 50 (-) 5,9 14 (-) 5’9 26 (+) 5,8 :3S: 15 (-) 5,8 52 (+) 5,1 • ·___ 59

Esimerkki 5 A. Pääsellulaasin cbhl-geenin inaktivointi 5 T. Teeseissä pääsellulaasia koodittava chhl-geeni inaktivoitiin homologisen rekombinaa- tion avulla plasmidin pMS4:n kanssa, joka sisältää cbhl:n cDNA:n sisäisen fragmentin, joka on 0,8 kiloemäksen suuruinen ja jossa on lukuvaiheistusmutaatio. Plasmidi pMS4 valmistettiin seuraavalla tavalla: plasmidia pTTcOl (Teeri et ai.. Anal. Biochem. 164:60-67 (1987); Penttilä et ai.. Gene 63:103-112 (1988)), joka sisältää cbhl-geenin 10 täysimittaisen cDNA-kloonin, joka on pUC8-vektorissa (Vieira ja Messing, Gene 19:259-268 (1982)), käsiteltiin BglLllä. joka leikkaa signaalisekvenssissä (Shoemaker et ai.. Bio/Technology 1:691-696 (1983), sekä BglII:lla. Saatu 0,8 kiloemäksen mittainen DNA-fragmentti, jossa on cbhl- cDNA:n 5’alue, tehtiin tylppäpäiseksi Srnukleaasilla ja yhdistettiin EcoRLllä leikattuun, tylppäiseksi tehtyyn pUC18-vektoriin (Yanish-15 Perron et ai.. Gene 33:103-119 (1985)). Saatu klooni leikattiin cbhl-fragmentin keskel tä EcoRLllä. Sitten EcoRLllä aikaansaatu pääte täydennettiin ja se sidottiin takaisin. Saatu plasmidi sisältää täten lukuvaiheistusmutaation, joka on typistetyn cbhl:n cDNA-fragmentin keskellä.

i2S0t T.reesei VTT-D-79125 (Bailey ja Nevalainen, Enzyme Microb. Technol. 3:153-157 ♦· * »ti * ·* (1981)) kotransformoitiin pMS4:llä ja p3SR2:lla. p3SR2:ssa on 5 kiloemäksen suurui- • · » ♦··* nen DNA-fragmentti, joka sisältää A. nidulansin amdS-geenin. joka on kloonattu • · · *·*/ pBR322:hteen (Kelly ja Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985)). Transformantit valittiin ··· « '"i amdS+-fenotyypin perusteella, minkä jälkeen ne puhdistettiin konidioista. Noin 600 • ♦ · • « · 25 kloonia 200 itsenäisestä transformantista kasvatettiin mikrotiitterilevyillä ja niiden sellulaasifenotyyppi tutkittiin Ouchterloney-immunodiffiiusiolla (Ouchterloney, Progr.

/♦·, Allergy 5:1-78 (1958)), jossa käytettiin laimentamatonta kasvualustaa ja CBHLlle • · · * ( spesifistä lampaan antiseerumia.

. ·♦ ·· ft » k) Monet kaimat eivät tuottaneet mitään havaittavaa CBHLhtä. Näistä VTT-D-87312- • ·· « ft · *·* * kannoista yhden CBHI-negatiivinen luonne varmistettiin, siten että analysoitiin kasvu-·*♦ · *· *· alusta SDS-PAGE:lla ja FPLC:llä, jossa ei havaittu mitään piikkiä, joka vastaisi CBHLhtä (vertaa kuviota 12 ja Kuviota 12A). Sellainen kokonaisproteiinimäärä, jonka 60 CBHI:n suhteen negatiivinen kanta eritti, oli noin puolet siitä määrästä, jonka T. reesei VTT-D-79125 eritti. Suodatinpaperia pilkkova aktiivisuus, FPU-aktiivisuus (Mandels, M.H., Reese, E.T. ja Spano, L.A. (toimittajat); John Wiley ja Sons, New York, 1976), joka havaittiin VTT-D-87312-kannan viljelmäsupematantissa, oli vähentynyt 5 huomattavasti, ja se oli noin 20 prosenttia normaaliaktiivisuudesta. Sellaisen pääsello- biohydrolaasin puuttuminen, joka normaalisti edustaa noin 60 prosenttia erittyneestä proteiinin kokonaismäärästä, ei muuttanut huomattavasti kannan kasvuominaisuuksia.

cbh2-geenin ja sen promoottorin deleetio 10

Trichoderman cbh2-geeni korvattiin Aspereilluksen argB-geenillä, kuten alla kuvataan. Plasmidi pALK99 konstruoitiin transformointifragmentin (kuviol3) lähteeksi. Plasmidi pALK99 muodostettiin seuraavalla tavalla. Plasmidin pUC19 fragmentti PvuII (joka sisältää mulltilihkkerin) korvattiin uudella synteettisellä multilinkkerifragmentilla, joka 15 sisältää tunnistamiskohdat seuraaville restriktioentsyymeille: Xhol-Stul-Smal-Xbal-

PvuII-Sall-XhoI. Uusi plasmidi nimitettiin pALK96:ksi. Tämä plasmidi leikattiin Xbal:-llä ja PvuII:11a ja 2,1 kiloemäkksen suuruinen Xbal-PvuII-fragmentti cbh2-geenin 3’alueesta (katso kuvio 14) sidottiin siihen. Saatu plasmidi leikattiin PvILlla ja Hindi:11a ja sidottiin 3,4 kiloemäksen suuruisen PvuII-fragmentin kanssa, joka oli peräisin cbh2- 20 . geenin 5’-alueesta (katso kuvio 14). Sekä 3’- että 5’-fragmentit olivat peräisin -kloonis-• · · ta cbh21ambdal (Teeri et ai., gene 51:43-52 (1987)). Syntyvä plasmidi nimitettiin • · . .·. pALK98:ksi. Aspergillus nidulansin geeni (2,6 kiloemäksen suuruinen Sali-fragmentti) • · · • · · : .·. sidottiin cbh2-geenin 3’- ja 5’-alueiden väliin, plasmidin pALK98 ainutlaatuiseen PvuII-• · · · kohtaan. Saatu plasmidi nimitettiin pALK99:ksi. Transformoiva fragmentti, joka eristet- • · ·· 23*; tiin pALK99:stä Xhol-fragmenttina, sisältää täten Aspergillus argB-geenin SaU-frag- menttina, joka on 2,6 kiloemäksen suuminen (Berse et ai.. Gene 25:109-117 (1983)) ja joka sijaitsee cbh2-geenin 3,4 kiloemäksen mittaisen (PvuII-PyuII-fragmentin) 5’:a :T: reunustavan alueen ja 2,1 kiloemäksen mittaisen (PyuII-Xball-fragmentin) 3’:a reunus- tavan alueen välissä (katso kuvio 14). T. reesei VTT-D-87305:n ArgB-mutanttikanta 30·: (Penttilä et ai.. 1987, Gene 61:155-164) transformoitiin tällä fragmentilla, siten että .···. käytettiin arginiiniprototyypin valintaa. ArgB+-transformantit seulottiin CBHIT-fenotyy-• · · : pin suhteen Western- (blottaus)tekniikalla, jossa käytettiin monoklonaalista vasta-ainet- • ·· • · ta, joka oli kohdistettu CBHII:hta vastaan. cbh2-lokuksen korvaaminen transformoivalla 61 fragmentilla CBHII-transformanteissa, varmistettiin sitten Southern bloteilla. Kanta ALKO 2564 on esimerkki tämänlaatuisesta "korvauskannasta", ja se ei sisällä enää cbh2-geeniä.

5 Edellä kuvatulla menetelmällä Trichoderman cbh2-geeni korvattiin Aspergilluksen trpC- geenillä.

Aspergillus nidulansin trpC-geeni (4,2 kiloemäksen suuruinen Xhol-fragmentti. joka on tehty tylppäpäiseksi Klenow-entsyymillä), sidottiin cbh2-geenin 3’-ja 5’-alueiden väliin 10 plasmidin pALK98:n ainutlaatuiseen PvuII-kohtaan. Muodostunut plasmidi nimitettiin pALK402:ksi. Transformoiva fragmentti, joka eristettiin pALK402:sta Xhol-ffagmentti- na, sisältää A. nidulansin trpC-geenin 4,2 kiloemäksen suurisena Xhol-fragmenttina (Yelton et ai.. PNAS, 91:1470-1474 (1984), joka sijaitsee cbh2-geenin 3,4 kiloemäksen mittaisen 5’:a reunustavan alueen ja 2,1 kiloemäksen mittaisen 3’:a reunustavan alueen 15 välissä. T. reesein ALK02319:n trpC-mutanttikanta transformoitiin tällä fragmentilla, siten että valintaan käytettiin tryptofaaniprototrofia. TrpC+ -transformantit seulottiin CBHIL-fenotyypin suhteen Western (blottaus)tekniikalla, jossa käytettiin monoklonaalis- ta vasta-ainetta CBHII:hta vastaan. cbh2-lokuksen korvautuminen CBHIT-fenotyypis- sä fragmentilla, jolla transformoitiin, varmistettiin Southem-bloteilla. Kanta AL- 20. K02721 on esimerkki tämänlaatuisesta "korvautumiskannasta", eikä se sisällä enää • « · ♦ · · ;.V cbh2-geeniä.

• · • · • · · • · · • · · : .·. Esimerkki 6 • · · • · · ·

Sellaisen CBHl:n suhteen negatiivisen kannan konstruointi, joka ei tuota EGI:n • · ·· £’5 1; lisääntyneitä määriä ··· CBHI:n suhteen negatiivinen kanta VTT-D-87312, jota kuvattiin esimerkissä 5A, trans-• · · · :T: formoitiin plasmidilla pAMH 111, jotta EGI:n ilmentymistä voimistettiin CBHIille negatiivisessa taustassa. Plasmidi pAMH 111 konstruoitiin, siten että käytettiin yleistä $9.: ilmentymisvektoria pAMH 110 (näitä molempia plasmideita kuvataan EP 244 234:ssä).

pAMH 110 rakennettiin pUC19:stä (Yanish Perron et ai.. Gene 33:103-119 (1985)).

• · · : pUC19:n yksi ainoa Ndel-kohta tuhottiin, siten että sen päät, joissa oli syvennys, täy- • ·· • · dennettiin Klenow-polymeraasin avulla, ja sitten plasmidia käsiteltiin EcoRI:llä ja 62

PstLllä ja se sidottiin cbhl-promoottori- ja päätekodonifragmentteihin, jotta aikaansaatiin ekspressiokasetti. Promoottorifragmentti oli 2,6 kiloemäksen suuniinen EcoRI-Pstl-fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pAMH 102 (Harkki et ai.. Bio/Technology 7:596-603 (1989)). Päätekodoni oli 0,75 kiloemäksen suuruinen AvaH-fragmentti, joka 5 sisältyi Pstl-fragmenttiin. joka sisälsi myös adaptorin sekä TAA-pysäytyskodonin kai kissa kolmessa lukuvaiheistuksessa. Sitten pAMH 110:ntä käsiteltiin SacILlla ja Ndel:-llä, jotta DNA poistettiin cbhl -promoottorin ja päätekodonin välistä, ja käsitellyt päät tehtiin tylppäpäisiksi Sj-nukleaasilla ja Klenow-polymeraasilla. Ilmennettävä egll-cDNA otettiin plasmidista pTTcll (Teeri et ai.. Anal. Biochem. 164:60-67 (1987); Penttilä et 10 ah, Yeast 3:175-185 (1987) 1,6 kiloemäksen suuruisena EcoRI-BamHI-fragmenttina, joka tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-polymeraasilla ja yhdistettiin ilmentymiskasettiin, jotta saatiin plasmidi pAMH 111. Transformaatio suoritettiin kotransformaationa pAMHlll:n ja plasmidin pAN8-l:n kanssa (Mattem et ai.. "Transformations of Aspergillus orvzae". julkaisussa Abstracts of the 19th Lunteren Lecmres of Molecular Gene-15 tics of Yeasts and Filamentous Fungi and its Impact on Biotechnology, Lunteren,

Alankomaat, s 34, (1987), joissa oli Steptoallotheicus hindustanuksen fleomysiiniresis-tenssigeeni A. nidulansin gpd-promoottorin alla. Täytyy käyttää jotain muuta markke-ria, jos VTT-D-87312-kanta oli jo AmdS+, kuten tässä esimerkissä. Transformantit puhdistettiin ja tutkittiin endoglukanaasin tuoton suhteen ravistelupulloviljelmissä. Noin 20. 20 prosentilla viljelmistä hydroksietyyliselluloosaa (HEC) hydrolysoiva aktiivisuus oli • · · |"V suurempi kuin vastaanottajakannassa. EGI-proteiinin määrä (taulukko 4) ravistelupullo-• · . viljelmän supematanttijakeessa tutkittiin kolmelta transformantilta, joilla HEC-aktiivi- • · · • · · : suus oli suuri. Näiden transformanttien Southern blot -analyysi osoitti, että parhaassa • ·· · endoglukanaasia tuottavassa kloonissa (ALKO 2466) ilmentymiskasetti, joka sisälsi *··· egll-cDNA:ta cbhl-promoottori- ja päätekodonisekvenssien välissä, oli integroitu kromosomaaliseen cbhl-lokukseen päätekodonisekvenssien kautta, jotka sijaitsivat *;· insertillä. Eritetyn proteiinin määrä lisääntyi tässä transformanttikannassa (ALKO 2466) : noin nelinkertaiseksi kontrolliin verrattuna (taulukko 4).

• · • · • · · • · · • · · 1 · • · · • ·· • · 63

Taulukko 4 EGI:n tuoton karakterisointi T. reesei VTT-D-87312:11a (CBHI:n suhteen negatiivinen VTT-D-79125:n transformantti) ja ALKO 2493:11a, ALKO 2466:11a sekä ALKO 2494-:llä, joka on peräisin VTT-D-87312:sta, joka on transformoitu plasmidilla pAMHlll.

5 TT-D-79125 on transformoimaton T. reesein mutanttikanta, joka tuottaa runsaasti sellulaasia. Kaikki kannat kasvatettiin ravistelupulloissa, kuten kuvataan kappaleessa Materiaalit ja menetelmät. EGI-proteiinin ja eritetyn proteiinin kokonaismäärä mitattiin seitsemän vuorokauden mittaisen viljelyn kuluttua, kuten kuvataan kappaleessa Materiaalit ja menetelmät.

10

EG 1-proteiini Erittynyt koko- % EGI

naisproteiini 15 % eritetys- (mg/ml) (mg/ml) tä kokonais- proteiinista VTT-D-87312 0,35 4^5 7/7 20 ALKO 2493 1,25 5,2 24,0 ALKO 2466 1,90 5,8 32,8 ALKO 2494 1,40 5,9 23,7 VTT-D-79125 0,75 10,6 7,1 25 • · · HY Esimerkki 7 • · · • · cbhl-geenin samanaikainen inaktivointi ja egll:n kopioluvun moninkertaistaminen • · • · · • · • · · 3Q:. T. reesei VTT-D-79125:n cbhl-geeni korvattiin Trichoderman egll:n cDNA:lla ja lit· amdS-geenillä. egll-cDNA sidottiin cbhl-geenin promoottorin ja päätekodonin väliin. Plasmidi pALK412 konstruoitiin, jotta se on transformoivan fragmentin lähde. Plasmidi ··· pALK412 valmistettiin, kuten kuvataan kuviossa 15.

IMI

• · · • · · • · · 35.: Plasmidi p3SR2, joka sisältää Aspergillus nidulansin amdS-geenin, kloonattiin pBR322- • · :hteen (Kelly ja Hynes, EMBO J. 4:475-479 (1985) ja sitä käsiteltiin SphLllä ja Xbal:-llä. Saatu 3,2 kiloemäksen suuruinen DNA-fragmentti, jossa oli koko amdS-geeni.

• · · • · · I . yhdistettiin Sphl:llä ja Xbal:llä leikattuun pUC19-vektoriin (Yanish-Perron et ai.. Gene • ·· 33:103-119 (1985)). Saatu plasmidi nimitettiin pALK410:ksi.

64

Sellainen DNA-fragmentti, joka sisälsi 1,65 kiloemäksen mittaisen cbhl-geenin 3’-alueen Scal-kohdasta. joka oli koodittavassa alueessa, eristettiin Scal-BamHI-fragmentti-na ja se tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-entsyymillä. Tämä fragmentti yhdistettiin plasmi-di pALK410:n Xbal-kohtaan (tehty tylppäpäseksi Klenow-entsyymillä). Tässä tapauk-5 sessa eristettiin 3’-fragmentti plasmidista pTTll.

Plasmidi pTTll (Teeri et ai.. Bio/Tech 1:696-699 (1983) sisältää 1,8 kiloemäksen suuruisen cbhl-alueen. 3’ BamHI-kohdasta koodittavassa alueessa, ja se kloonattiin pBR322:n BamHI-kohtaan. Geeni voidaan eristää myös muista lähteistä, esimerkiksi -10 kloonista 44A (Teeri et ai.. Bio/Tech 1:696-699).

Saatu plasmidi oli pALK411. Sitä käsiteltiin ScaLllä ja Sphl:llä. 5,8 kiloemäksen suuruinen fragmentti sidottiin Scal:llä ja SphLllä leikattuun plasmidiin pPLE3 (Nevalainen et ai. julkaisussa Molecular Industrial Mycology: Systems and Applications for 15 Filamentous Fungi, Leong et ai., toimittajat, ss. 129-148 (1990), joka sisältää egll- geenin cDNA.n, joka on pUC18:aan kloonatun cbhl-geenin promoottori- ja pääteko-donialueiden välissä (kuvio 16). Promoottori- ja päätekodonialueet ovat peräisin ekpres-siovektorista pAMHllO (Nevalainen et ai.. julkaisussa Molecular Industrial Mycology: Systems and Applications for Filamentous Fungi, Leong et ai., toimittajat, ss. 129-148 2Q\ (1990)).

• · · • · · · • · · • · · • · • · ; Saatu plasmidi pALK412 leikattiin EcoRLllä. jotta bakteeriperäinen DNA poistettiin.

• · · • 9,3 kiloemäksen mittainen pALK412F-fragmentti sidottiin myös takaisin, jotta muodos-·«· · ·:· tui plasmidi pALK412L.

25’: T. reesei VTT-D-79125 (Bailey ja Nevalainen, Enzyme Microb. Technol. 3:153-157 (1981) transformoitiin plasmidilla pALK412, lineaarisella pALK412F-fragmentilla, ta-· kaisinsidotulla pALK412:lla ja pALK412F:llä sekä pALK412L:llä samanaikaisesti, niin *:··· että viimeksimainittujen moolisuhde oli vastaavasti 5:1. Transformantit valittiin amdS+-•30*: fenotyypin perusteella ja ne puhdistettiin konidioista selektiivisellä alustalla, joka sisälsi asetamidia yksinomaisena typen lähteenä.

• · · • · · • ·

Puhdistettuja transformantteja kasvatettiin mikrotiitterilevyillä ja ne seulottiin CBHI - 65 fenotyypin suhteen Western- (blottaus)tekniikalla, siten että käytettiin polyklonaalista vasta-ainetta, joka oli muodostettu CBHI:htä vastaan. Noin yksi kolmannes pALK412F-transformantista ei tuottanut ollenkaan havaittavaa CBHLhtä. Neljänkymmenen kannan joukossa oli yksi CBHr-transformantti, joka oli transformoitu plasmidilla pALK412.

5 CBHr-transformantit tutkittiin endoglukanaasin tuoton suhteen ravistelupulloissa. Kaikissa näissä transformanteissa hydroksietyyliselluloosaa (HEC) hydrolysoiva aktiivisuus oli suurempi kuin vastaanottajakannassa. Parhaat transformantit erittivät endoglu-kanaasiaktiivisuutta 4-5 kertaa sen verran kuin vastaaottajakanta.

10

Southern blot -analyysi osoitti, että vektorifragmentti syrjäytti CBHI'-transformanttien cbhl-lokuksen. Transformanttien kromosomaalista DNA:ta käsiteltiin XhoI:llä ja se hybridisoitiin cbhl:htä koodittavan alueen koettimen kanssa, joka oli 0,5 kiloemäksen mittainen.

15

Parhailla endoglukanaasia tuottavilla kannoilla oli enemmän kuin yksi vektorifragmentin kopio, jossa oli kiinnostava geeni, joka oli insertoitu Trichoderman genomiin.

Esimerkki 8 2Q\ Sellobiohydrolaasiin suhteen negatiivisen T. reesein kannan konstruktio ··« · ·· · • · · • · • · • Hypersellulolyyttinen mutantti VTT-D-79125 (Bailey, M.J. et ai.. Enzyme Microb.

« · · • Technol. 3:153-157 (1982)) on hyvä sellulaasin tuottaja, sen elinkyky on myös parantu-·*· · ·;· nut, ja se pystyy paremmin tuottamaan eritettyä proteiinia, mikä johtuu mutageneesioh- 23 : jelmasta, jolla se luotiin. Täten haluttiin käyttää hyväksi tämän mutantin suurta proteii nin tuottokykyä, jotta massan valkaisua varten saatiin ksylanaaseja, joissa ei ollut sello-biohydrolaaseja.

• · · • · · • · · *:**: UV:llä aikaansaatu tryptofaanin suhteen auksotrofinen VTT-D-79125:n mutantti trans si formoitiin DNA:n lineaarisella fragmentilla (kuvio 17), jossa cbh2:hta reunustavia alueita käytettiin kohdistamaan transformoiva fragmentti cbh2-lokukseen. Puhdistettuja ;*·.· TrpC+-transformantteja kasvatettiin mikrotiitterilevyillä ja ne seulottiin CBHII -fenotyy-• · pin suhteen Westem-(blottaus)tekniikalla, jossa käytettiin monoklonaalista vasta-ainetta, 66 joka oli muodostettu CBHII:hta vastaan. Southem-(blottaus)tekniikalla varmistettiin, että cbh2-lokus korvaumi transformoivalla fragmentilla. Yksi sellainen cbh2-negatiivi-nen transformantti transformoitiin toisella DNA-fragmentilla. Tällä kertaa käytettiin cbhl:htä reunustavia alueita, jotta luonnonmukaisen tyypin cbhl-lokus korvattiin aseta-5 midaasin amdS-markkerilla. Puhdistettuja amdS+-transformantteja kasvatettiin mikrotiit- terilevyillä ja ne seulottiin CBHT-fenotyypin suhteen Westem-(blottaus)tekniikalla, jossa käytettiin polyklonaalista vasta-ainetta, joka oli kehitetty CBHI-proteiinia vastaan. Korvautuminen varmistettiin jälleen Southem-(blottaus)tekniikalla. Muodostuneella kannalla ei oe cbhl- eikä cbh2-geeniä, ja täten se ei pysty tuottamaan sellobiohydrolaasia 10 missään olosuhteissa.

Kuvio 18 valaiseen entsyymintuottoprofiileja, jotka on saatu hypersellulolyyttisella kannalla ja sen sellobiohydrolaasin suhteen negatiivisella johdannaisella. Endoglu-kanaasien tuotto alenee, kun valitaan sopivat fermentaatio-olosuhteet, jotka tekniikan 15 tason mukaan tunnetaan hyvin. Uudella kannalla voidaan tuottaa ksylanaasia isäntäsolun erittämänä entsyymikoostumuksena, eikä sellainen entsyymikoostumus sisällä sellobiohydrolaasia ja täten siltä puuttuu aktiivisuus kiteistä selluloosaa kohtaan. Hyvin pienellä endoglukanaasiaktiivisuuden määrällä, joka vielä on läsnä, ei ole haitallisia vaikutuksia massan ominaisuuksiin, kun tämänlaatuista valmistetta käytetään massan entsyymiavus-2Q\ teisessa valkaisussa.

i · » ··« · ·· · • · « • ♦ • » • ·*. Esimerkki 9 • m • · · : Sellaisten kantojen konstruointi, jotka tuottavat sellulaasien erilaisia yhdistelmiä «·* · • · · ·»·· dl*: Sellulaasien erilaisia yhdistelmiä tuottavia T. reesein kantoja konstruoitiin, siten että käytettiin samanlaista geeninsyrjäyttämisstrategiaa kuin aiemmissa konstruktioissa (kuvio 17). Ensimmäisessä sarjassa, joka koskee kantoja A-D, yksi sellulaasi eliminoi- • · · * daan kerrallaan. Kannat A-D syntetisoivat kaikkea kuten isäntäkanta, paitsi eivät ·:··: CBHI:htä (kanta A), CBHIEhta (kanta B), EGIihtä (kanta C) tai EGIEhta (kanta D).

•30: Toinen sarja, kannat E-J, antavat käyttöön mutantteja, joilta puuttuvat neljän sellulaasin kaikki parit. Kannalta E puuttuvat CBHI ja CBHII. Kannalta F puuttuvat CBHI ja EGI.

•

.·. : Kannalta G puuttuvat CBHI ja EGII. Kannalta H puuttuvat CBHII ja EGI. Kannalta I

• · puuttuvat CBHII ja EGII. Kannalta J puuttuvat EGI ja EGII.

67

Kun sekä EGI:n että EGII:n geenit (kanta J, taulukko 5) deletoidaan, aktiivisuus hyd-roksietyyliselluloosaa vastaan vähenee enemmän kuin 10 prosenttia siitä aktiivisuudesta, jota hypersellulolyyttinen isäntäkanta VTT-D-79125 tuotti. CBHI- tai CBHII-proteiinien puute (kanta E, taulukko 5) voidaan määrittää, siten että tutkitaan aktiivisuus suodatin-5 paperia vastaan sellaisella menetelmällä, joka tekniikan tason mukaan on tunnettu. Kun sekä CBHI että CBHII eliminoidaan, ei tuoteta mitään niitattavaa aktiivisuutta. Alan ammattimiehelle olisi selvää, että samalla strategialla voidaan konstruoida lisämuunnok-sia, kuten esimerkiksi poistaa kolme tai useampia aktiivisuuksia.

10

Taulukko 5

Geneettisesti konstruoidut kannat uusien sellulaasiseosten tuottamista varten

Kanta- CBHI CBHII EGI EGII 15 tyyppi A + + + B + - + + C + + - -ΙΟ + + + - 20 E - - + ΙΕ - + - + G - + + - . H + - - + • ♦ · _ ··· ' I + - + K1 j + + . K + - - l - + - * « · • · · «·» · t • · · ·»·» i»· 5^0 ·* Kuvio 19 kuvaa geenitekniikan tehokkuutta keksinnön mukaisia koostumuksia tuotettaessa. Geenitekniikkaa on käytetty menestyksellisesti hypersellulolyyttisen mutantin • · · johdannaisten tuottamiseksi, niin että on saatu erilaisia sellulaasi-ksylanaasiseoksia.

• · · • · · **) * Kannassa 3 syrjäytetään cbhl-geeniä koodittava sekvenssi egll-geeniä koodittavalla * * sekvenssillä, joka kannassa 3 ilmentyy cbhl -promoottorin alla. Täten lisääntyy endoglu- 3β * kanaasin osuus, jota nämä isännät tuottavat ja erittävät. Kanta 1 tuottaa ksylanaaseja • · · ·.· * pääaktiivisuutenaan ja eri tuotanto-olosuhteissa, kuten tekniikan tason mukaan on tun-• · « · · *· nettua, endoglukanaaseja voidaan tuottaa ilman yhtään sellobiohydrolaasia. Kannan 3 68 tuottamassa entsyymiseoksessa endoglukanaasien osuus nousee, ja kanta 2 tuottaa sello-biohydrolaaseja, joissa ei ole oleellisesti endoglukanaaseja.

Esimerkki 10 5 Entsyymivalmisteiden käyttö bioyalkaisussa Käytettiin havupuukraftmassaa, josta ligniini oli poistetti hapen avulla (kappa 16,1, isovaaleus 35,4 prosenttia). Massan pH säädettiin rikkihapolla 6:ksi. Entsyymillä A3273 ("entsyymi A") tai entsyymillä A2799 ("entsyymi B") käsiteltiin massanäytteitä, 10 joissa kuiva-ainetta oli 250 g, siten että ksylanaasiannos oli 100 nkat/g massan kuiva- ainetta, pH 6:ssa, 55 °C:ssa, kahden tunnin ajan, ja pestiin. Sitten massanäytteet valkaistiin käyttämällä valkaisujaksoa D„ (EO) DED. Vertailumassa valkaistiin ilman entsyymikäsittelyä.

15 Käytettiin seuraavia standardimenetelmiä: vaaleus (ISO 2470), kappaluku (ISO 302), viskositeetti (ISO 5351/1 sekä pc- kellertyminen) luku (TAPPI 260 pm-81). Massoja hienonnettiin PFI-myllyssä (ISO 5264/2), koearkit tehtiin käsin ISO 5269/1 :n mukaan ja lujuusominaisuudet tutkittiin (ISO 5270).

• « · • t · • 4 · « ·· » £ö.: Entsyymillä käsiteltyjä massoja valkaistiin, siten että ensimmäisessä valkaisuvaiheessa * • · t ·!·' käytettiin 25 prosenttia pienempiä C102-annoksia kuin vertailumassassa. Entsyymillä • · · f,*t* esikäsitelty massa saavutti täydellisen vaaleuden noin 15 prosenttia pienemmällä Cl:n

»M

kokonaismäärällä (taulukko 6). Tämä on suunnilleen sama tulos, joka saavutettiin aiem- * · · f · · missä kokeissa, joissa käytettiin tavanomaisesti keitettyjä massoja (kappaluku 31-32), 25c. joista ligniiniä ei oltu poistettu hapen avulla ja joita ei oltu käsitelty alkuaineklooria • «·! sisältävillä valkaisujaksoilla (Lahtinen, T., et ai.. Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Kuwahara, M. Shimada, M. (toimittajat) Uni Publishers Co., Tokio, Japani, ····: ss. 129-137 (1992)).

k·» « · ·

• · I

* -SO· Lujuusominaisuudet (viskositeetti ja repäisyindeksi) korreloivat selluloottisten sivuaktii- 9 9 visuuksien kanssa: kun sivuaktiivisuudet (entsyymit A) olivat vähäisiä, saatiin saman- 69 laiset lujuusominaisuudet kuin vertailunäytteellä. Optiset ominaisuudet olivat myös vertailumateriaalin kanssa vertailukelpoisia, poikkeuksena oli pc-luku (kellertymisen mitta), joka oli jopa parempi massoilla, jotka oli käsitelty entsyymillä.

• • 4 4 • I · • «f · «· · 9 9 4 9 4 C t • • m · • · » » · • ♦ * « · «Il »1· · 4 *·· *· ·· * · · • ♦ · 9 9 4 4 9 9 • 494 449 9 41 • · 4 4 9 4 • 9 4 i 4414 4 4 * 444 4 4 4 •49 * · « · · • ·· ♦ 1 70

Taulukko 6. ECF-valkaisukokeet

Entsyymit Vertailu

A B

Entsyymivaihe 5 Annos, nkat/g 100 100 Lämpötila °C 55 55 pH 6,0 6,0 aika, tunteja 2 2- DO-vaihe 10 CL02:n kulutus, akt. Cl 24,2 24,1 31,9 kg/t____ EO-vaihe

Vaaleus, % 62,5 62,5 63,1

Kappa 4,6 4,6 4,2 15 Dl-vaihe C102:n kulutus, akt. Cl kg/t 17 17 17

Vaaleus, % 82,9 82,5 83,5 D2-vaihe .20. CL02:n kulutus, ”V akt· Cl kg/t 6,5 6,3 6,0 • · · | Il ..... —— I ..... M·-^—— • · • Lopullinen

Vaaleus, % 90,2 89,5 89,7 : : : pc-luku 0,45 0,54 0,87 25. Viskositeetti 830 810 840 • • · · ·

Kokonais- • · · CL02:n kulutus, akt. Cl kg/t 47,7 47,4 54,9 ··· CL02:n kulutus, *3i>. akt. Cl kg/t, ISO 901:ssä *·] Vähennys 46,9 49,4 56,1 16 % 12 % • ·

Ml • · · • · · 1 · • · · • · · 71

Massan ominaisuudet puhdistuksen jälkeen (Vetoindeksillä 70 Nm/g) 5 PFI revs

Repäisy, nNm2/g 1123 945 871

Valonsirontakerroin m2/kg 13,8 12,2 14,2 V alonabsorptiokerroin 10 m2/kg 20,7 20,6 21,6 0,06__(^08__0,06

Kuidun pituus mm 2,00 1,99 1,97 < 0,20 mm, % 3,23 3,22 3,39 15 1: olettaen, että 4 kg Cl:a lisää vaaleutta yhden ISO-yksikön Valkaisuolosuhteet: 20

Vaihe DO (E0) Dl E D2 . Koostumus, % 3 10 9 9 9 • · · !:V Lämpötila, °C 55 75 70 70 70 • · ] .·, Aika, min. 60 60 180 60 180 I * · 2$. Loppu-pH 2,9-3,2 10,8 3,7-4,0 10,8 3,5-3,8 • · · • · · · C102-annos, kg/t • · · · ·*:*· aktiivista Cl:a 24,2 - 17-8 • · · 9 02:n paine, kPa - 200 - - - ··· NaOH-annos, kg/t - 17 2,5 9 • · · ·

Kun keksintö nyt on kuvattu täydellisesti, alan ammattimiehelle on selvää, että keksin-nön piiri voidaan aikaansaada laajalla ja yhtäläisen olosuhteiden, parametrien jne. alueella, ilman että vaikutetaan keksinnön henkeen tai piiriin tai johonkin sen sovellu- ^ ; tusmuotoon. Kaikki keksinnön yhteydessä mainitut viitteet sisällytetään tähän viitteinä.

• · · • · 72

SEKVENSSILISTAUS

(1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA: (A) NIMI: OY ALKO AB et ai.

(B) KATU: Salmisaarenranta 7 H

(C) KAUPUNKI: Helsinki (E) MAA: Suomi (F) POSTINUMERO: 00180 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Uudet entsyymivalmisteet ja niiden valmistusmenetelmät (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 14 (v) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, versio #1.25 (vi) TIEDOT NYKYISESTÄ HAKEMUKSESTA: (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/FI93/00221 (B) HAKEMISPÄIVÄ: toukokuu-24-1993 (C) LUOKITUS: (vii) ETUOIKEUSTIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: US 07/889,893 (B) HAKEMISPÄIVÄ: toukokuu-29-1992 (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1015 emäsparia . .·, (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · . (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS : CDS

: (B) SIJAINTI: väli (176..448, 557..952) * · * • · · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:l: • ·· * AAGCTTGATG AGGCCAAATT ATCCGTCAAC TGTCTTATAA AGGAGCCCAT GCCAAACCCC 60 CCCTAAAGAC TCAAGAAGCC AAACCTGAAC AACCCCAGCA CCTGAACAGT CATACAACCC 120 • · · CTCCAAGCCC AAAAGACACA ACAACTCCTA CTAGCTGAAG CAAGAAGACA TCAAC ATG 178

Met ·;··· GTC TCC TTC ACC TCC CTC CTC GCC GGC GTC GCC GCC ATC TCG GGC GTC 226 . Vai Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Gly Vai Ala Ala Ile Ser Gly Vai ·:*·: 5 ίο is TTG GCC GCT CCC GCC GCC GAG GTC GAA TCC GTG GCT GTG GAG AAG CGC 274 ' Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Vai Glu Ser Vai Ala Vai Glu Lys Arg : 20 25 30 • · · • · CAG ACG ATT CAG CCC GGC ACG GGC TAC AAC AAC GGC TAC TTC TAC TCG 322

Gin Thr Ile Gin Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser 35 40 45 73 TAC TGG AAC GAT GGC CAC GGC GGC GTG ACG TAC ACC AAT GGT CCC GGC 370

Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly 50 55 60 65 GGG CAG TTC TCC GTC AAC TGG TCC AAC TCG GGC AAC TTT GTC GGC GGC 418

Gly Gin Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly 70 75 80 AAG GGA TGG CAG CCC GGG ACC AAG AAC AAG TAAGACTACC TACTCTTACC 468

Lys Gly Trp Gin Pro Gly Thr Lys Asn Lys 85 90 CCCTTTGACC AACACAGCAC AACACAATAC AACACATGTG ACTACCAATC ATGGAATCGG 528 ATCTAACAGC TGTGTTTTAA AAAAAAGG GTC ATC AAC TTC TCG GGA AGC TAC 580

Val lie Asn Phe Ser Gly Ser Tyr 95 AAC CCC AAC GGC AAC AGC TAC CTC TCC GTG TAC GGC TGG TCC CGC AAC 628

Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser Arg Asn 100 105 110 115 CCC CTG ATC GAG TAC TAC ATC GTC GAG AAC TTT GGC ACC TAC AAC CCG 676

Pro Leu lie Glu Tyr Tyr lie Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr Asn Pro 120 125 130 TCC ACG GGC GCC ACC AAG CTG GGC GAG GTC ACC TCC GAC GGC AGC GTC 724

Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly Ser Val 135 140 145 TAC GAC ATT TAC CGC ACG CAG CGC GTC AAC CAG CCG TCC ATC ATC GGC 772

Tyr Asp lie Tyr Arg Thr Gin Arg Val Asn Gin Pro Ser lie lie Gly 150 155 160 ACC GCC ACC TTT TAC CAG TAC TGG TCC GTC CGC CGC AAC CAC CGC TCG 820

Thr Ala Thr Phe Tyr Gin Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His Arg Ser 165 170 175 :.: i AGC GGC TCC GTC AAC ACG GCG AAC CAC TTC AAC GCG TGG GCT CAG CAA 868

Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Gin Gin : .· 180 185 190 195 '·.*. GGC CTG ACG CTC GGG ACG ATG GAT TAC CAG ATT GTT GCC GTG GAG GGT 916 : .·. Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gin lie Val Ala Val Glu Gly ί.· : 200 205 210 • · · ...: TAC TTT AGC TCT GGC TCT GCT TCC ATC ACC GTC AGC TAAAGGGGGC 962 .*:*. Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser lie Thr Val Ser ’·* ’ 215 220 TCTTCTTTTG TGATGTGTGA AAAAAAAAAA AAGGATGGTG GATAAAAGGG GGT 1015 • · · ···· .*:*. (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: • · · *:**: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . (A) PITUUS: 223 aminohappoa *:**: (B) TYYPPI: aminohappo . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « · · • · · *.* * (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini *· *: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2:

Met Vai Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Gly Vai Ala Ala Ile Ser Gly 15 10 15 74

Vai Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Vai Glu Ser Vai Ala Vai Glu Lys 20 25 30

Arg Gin Thr Ile Gin Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr 35 40 45

Ser Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Vai Thr Tyr Thr Asn Gly Pro 50 55 60

Gly Gly Gin Phe Ser Vai Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Vai Gly 65 70 75 80

Gly Lys Gly Trp Gin Pro Gly Thr Lys Asn Lys Vai Ile Asn Phe Ser 85 90 95

Gly Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Vai Tyr Gly Trp 100 105 110

Ser Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Vai Glu Asn Phe Gly Thr 115 120 125

Tyr Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Vai Thr Ser Asp 130 135 140

Gly Ser Vai Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gin Arg Vai Asn Gin Pro Ser 145 150 155 160

Ile Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gin Tyr Trp Ser Vai Arg Arg Asn 165 170 175

His Arg Ser Ser Gly Ser Vai Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp 180 185 190

Ala Gin Gin Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gin Ile Vai Ala 195 200 205

Vai Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Vai Ser . 210 215 220 • · · • · · · • · ·

Iti • ·* (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: « * * • ♦ · • « ♦ : (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ··· ♦ (A) PITUUS: 941 emäsparia ... (B) TYYPPI: nukleiinihappo *·♦· (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • (ix) OMINAISPIIRRE:

(A) NIMI/SELITYS : CDS

(B) SIJAINTI: väli (102..392, 455..850) • · · • · · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3: ____. GAATTCTGCA TATATAAAGC CATGGAAGAA GACGTAAAAC TGAGACAGCA AGCTCAACTG 60 • · • CATAGTATCG ACTTCAAGGA AAACACGCAC AAATAATCAT C ATG GTT GCC TTT 113

Met Vai Ala Phe • m 4 • 1 « * » ·. *: TCC AGC CTC ATC TGC GOT CTC ACC AGC ATC GCC AGT ACT CTG GCG ATG 161

Ser Ser Leu Ile Cys Ala Leu Thr Ser Ile Ala Ser Thr Leu Ala Met 5 10 15 20 75 CCC ACA GGC CTC GAG CCT GAG AGC AGT GTC AAC GTC ACA GAG CGT GGC 209

Pro Thr Gly Leu Glu Pro Glu Ser Ser Vai Asn Vai Thr Glu Arg Gly 25 30 35 ATG TAC GAC TTT GTT CTT GGA GCT CAC AAT GAT CAT CGC CGT CGT GCT 257

Met Tyr Asp Phe Vai Leu Gly Ala His Asn Asp His Arg Arg Arg Ala 40 45 50 AGC ATC AAC TAC GAC CAA AAC TAC CAA ACT GGC GGA CAA GTC AGC TAT 305

Ser Ile Asn Tyr Asp Gin Asn Tyr Gin Thr Gly Gly Gin Vai Ser Tyr 55 60 65 TCG CCT TCC AAC ACT GGC TTC TCA GTG AAC TGG AAC ACT CAA GAT GAC 353

Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Vai Asn Trp Asn Thr Gin Asp Asp 70 75 80 TTT GTT GTG GGC GTT GGT TGG ACG ACT GGA TCT TCT GCG TCGGAGGATT 402

Phe Vai Vai Gly Vai Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Ala 85 90 95 CTCATCATTC TGCACTTTGA AAGCATCTTC TGACCAACAA GCTTCTCTTA GT CCC 457

Pro ATC AAC TTT GGC GGC TCT TTT AGT GTC AAC AGC GGA ACT GGC CTG CTT 505

Ile Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Vai Asn Ser Gly Thr Gly Leu Leu 100 105 110 TCC GTC TAT GGC TGG AGC ACC AAC CCA CTG GTT GAG TAC TAC ATC ATG 553

Ser Vai Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Vai Glu Tyr Tyr Ile Met 115 120 125 130 GAG GAC AAC CAC AAC TAC CCA GCA CAG GGT ACC GTC AAG GGA ACC GTC 601

Glu Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gin Gly Thr Vai Lys Gly Thr Vai 135 140 145 ACC AGC GAC GGA GCC ACT TAC ACC ATC TGG GAG AAT ACC CGT GTC AAC 649 . Thr Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg Vai Asn *··· · 150 155 160 • · · • · · • ·' GAG CCT TCC ATC CAG GGC ACA GCG ACC TTC AAC CAG TAC ATT TCC GTG 697 . Glu Pro Ser Ile Gin Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gin Tyr Ile Ser Vai 165 170 175 • · • · · : Cgg aac tcg ccc agg acc agc gga act gtt act gtg cag aac cac ttc 745 ··· Arg Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Vai Thr Vai Gin Asn His Phe ··· 180 185 190 • · t • · f ' AAT GCT TGG GCC TCG CTT GGC CTG CAC CTT GGG CAG ATG AAC TAC CAG 793

Asn Ala Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gin Met Asn Tyr Gin 195 200 205 210 • · · **·· GTT GTC GCT GTC GAA GGC TGG GGT GGT AGT GGT TCT GCC TCA CAG AGT 841 ·*·*; Vai Vai Ala Vai Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Gin Ser \ 215 220 225 GTC AGC AAC TAGGTTCTGT TGATGTTGAC TTGGAGTGGA TGAGGGGTTT 890 . Vai Ser Asn • · GAGCTGGTAT GTAGTATTGG GGTGGTTAGT GAGTTAACTT GACAGACTGC A 941 • » • ♦ · *· (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: 1 SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: 76 (A) PITUUS: 229 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4:

Met Vai Ala Phe Ser Ser Leu Ile Cys Ala Leu Thr Ser Ile Ala Ser 15 10 15

Thr Leu Ala Met Pro Thr Gly Leu Glu Pro Glu Ser Ser Vai Asn Vai 20 25 30

Thr Glu Arg Gly Met Tyr Asp Phe Vai Leu Gly Ala His Asn Asp His 35 40 45

Arg Arg Arg Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gin Asn Tyr Gin Thr Gly Gly 50 55 60

Gin Vai Ser Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Vai Asn Trp Asn 65 70 75 80

Thr Gin Asp Asp Phe Vai Vai Gly Vai Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser 85 90 95

Ala Pro Ile Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Vai Asn Ser Gly Thr Gly 100 105 110

Leu Leu Ser Vai Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Vai Glu Tyr Tyr 115 120 125

Ile Met Glu Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gin Gly Thr Vai Lys Gly 130 135 140

Thr Vai Thr Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg 145 150 155 160 • · · ··· · Vai Asn Glu Pro Ser Ile Gin Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gin Tyr Ile I’·*. 165 170 175 • · • · . Ser Vai Arg Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Vai Thr Vai Gin Asn *··· 180 185 190 • · • · · *·· * His Phe Asn Ala Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gin Met Asn ··· 195 200 205 • · ··

Tyr Gin Vai Vai Ala Vai Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser * 210 215 220

Gin Ser Vai Ser Asn ··· 225 ···· • · · • · » (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: 1 SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: • · (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ·*·*; (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste • (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · · • · · • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5: GACTCGAGAA TTCATCGA 18 77 (2) SEKVENSSIN ID NO :6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:6: GGVTGGCARC CNGGNACNAA 20 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 18 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7: GACTCGAGAA TTCATCGA 18 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 9 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMl/SELITYS: Peptidi . (B) SIJAINTI: 1 · (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= Peptidi /huom.= "Aminohappo, jonka sijainti on 2 ja joka on • ·* merkitty "Xaa", on tuntematon." • · · ···* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8: *·· · Xaa Ile Gin Pro Gly Thr Gly Tyr Asn l s ··*· • · · * · ♦ *·’ ’ (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: •j. (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ···· (A) PITUUS: 20 emäsparia ·*·*; (B) TYYPPI: nukleiinihappo • * (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:9: • · • AAYTAY GAY C ARAAYTAY GA 20 • · · • · · • · · : (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: • · · • · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 2 5 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 78 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10:

Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gin Asn Tyr Gin Thr Gly Gly Gin Vai Ser 15 10 15

Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser 20 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:11: CAACCGCGGA CTGCGCATCA TGGTCTCCTT CACCTCCCT 39 (2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:12: GGGAGCCGCT CGAGCGGTGG TTGCGG 26 9 • · · ['/ ' (2) SEKVENSSIN ID NO: 13 TIEDOT: • · 1 • · 9 9 • (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: .*** (A) PITUUS: 20 emäsparia : : : (B) TYYPPI: nukleiinihappo *·1.· (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste ·;1 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · · :T: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 13: GACTGGCATC ATGGCGCCCT 2 0 9 9 9 9 9 ”” (2) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: • · · • · · • (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen juoste (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · · * , (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:14: • · · « · · ’ CAGGCTCGAG GCCTGTGGGC ATCGCCAGAG 30

Claims (27)

1. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää nukleiini- happosekvenssin, joka koodittaa T. reesein ksylanaasin pl 5,5 aminohapposek- 5 venssiä (sekvenssin identifiointinumero 4), tai jokin muu nukleiinihappomolekyyli, joka koodittaa proteiinia, jolla on endo-β-1,4-ksylanaasiaktiivisuus ja jonka aminohapposekvenssi on yli 49 %:sti identtinen T. reesein ksylanaasin pl 5,5 kypsän osan kanssa.

2. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, t u n n e 11 u siitä, että se sisältää nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa proteiinia, jolla on endo-β-1,4-ksylanaasiaktiivisuus ja jonka aminohapposekvenssi on yli 62 %:sti identtinen T. reesein ksylanaasin pl 5,5 sellaisen osan kanssa, joka on aktiivisessa keskuksessa sekvenssin identifiointinumero 4:n asemissa 126 ja 215 olevien glutamiinihappojen 15 välillä mukaan lukien mainitut aminohapot.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa sekvenssin identifiointi-numero 4 aminohapposekvenssiä. 20

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että mainittu nukleiinihapposekvenssi on DNA:n nukleiinihapposekvenssi, : jolla on sekvenssin identifiointinumero 3. • · · • · · · • · · • ♦ · • # ] ! 25 5. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää nukleiini- • · · .*** happosekvenssin, joka koodittaa T. reesein ksylanaasin pl 9 aminohapposekvenssiä • · · ··· · (sekvenssin identifiointinumero 2) tai jokin muu nukleiinihappomolekyyli, joka • · · • · · ‘ koodittaa proteiinia, jolla on endo-β-1,4-ksylanaasiaktiivisuus ja jonka • · · V · aminohapposekvenssi on yli 94 %:sti identtinen T. reesein ksylanaasin pl 9 kypsän 30 osan kanssa. • · · • · · • · · 1 Eristetty nukleiinihappomolekyyli, t u n n e 11 u siitä, että se sisältää • · · .* . nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa proteiinia, jolla on endo-β-1,4- • · · ;.. * ksylanaasi-aktiivisuus ja jonka aminohapposekvenssi on yli 98 %:sti identtinen T. • · **;·' 35 reesein ksylanaasin pl 9 (sekvenssinumero 2) sellaisen osan kanssa, joka on :***: aktiivisessa keskuksessa sekvenssin identifiointinumero 2:n asemissa 119 ja 210 :*·.· olevien glutamiinihappojen välillä mukaan lukien mainitut aminohapot. • ·

7. Patenttivaatimuksen5tai6mukainennukleiinihappomolekyyli,tunnettu siitä, että se sisältää nukleiinihapposekvenssin, joka koodittaa sekvenssin identifiointinumeron 2 mukaista aminohapposekvenssiä.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että mainittu nukleiinihapposekvenssi on sekvenssin identifiointinumeron 1 mukainen sekvenssi.

9. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaati- 10 musten 1 - 8 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että mainittu vektori valitaan ryhmästä, joka käsittää plasmidin ja lineaarisen DNA:n.

11. Yhdistelmäisäntä, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukaisella yhdistelmävektorilla.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen yhdistelmäisäntä, tunnettu siitä, että mainittu isäntä on Trichoderma. 20

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen yhdistelmäisäntä, tunnettu siitä, että mainittu Trichoderma on T. reesei. • % • · · • 1 ♦

14. Yhdistelmävektori, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimusten 1-8 mukaisen • · ' 25 eristetyn nukleiinihappomolekyylin, t u n n e 11 u siitä, että nukleiinihappo- • · ♦ molekyyli on toiminnallisesti kytketty T. reesein promoottoriin, joka on valittu • · · "· · ryhmästä, johon kuuluvat xlnl-. xln2-. cbhl-, cbh2-, eell- ja egl2-promoottori. ··♦· • · · V 1 15. Yhdistelmäisäntä, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 14 mukaisella 30 yhdistelmävektorilla. ··· • · · • · · •

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen yhdistelmäisäntä, tunnettu siitä, että mainittu .1 . isäntä on Trichoderma. • · · “ ♦ · · • · «·· • · **;·" 35 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen yhdistelmäisäntä, tunnettu siitä, että mainittu • · · ϊ : Trichoderma on T. reesei. ··« — 1 · • · · • · · • ·

18. Menetelmä sellaisen entsyymivalmisteen tuottamiseksi, jossa on rikastettu entsyymiaktiivisuus,tunnettu siitä,että (1) isäntä transformoidaan jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukaisella 5 nukleiinihappomolekyylillä tai jonkin patenttivaatimuksen 9,10 tai 14 mukaisella yhdistelmävektorilla; (2) mainittua isäntäsolua viljellään olosuhteissa, joissa mainittu nukleiinihappomolekyyli tai yhdistelmävektori ilmenee mainitussa (1)- 10 vaiheen isäntäsolussa tuottaen ksylanaasia; (3) mainittu viljelyalusta otetaan talteen.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu IS isäntä on geneettisesti kykenemätön ilmentämään yhtä tai useampaa endogeenista sellulolyyttistä entsyymiä.

20. Patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu sellulolyyttinen entsyymi valitaan ryhmästä, joka koostuu CBHIrstä,

20 CBHII:sta, EGI:stä ja EGIIrsta.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu j .1· sellulolyyttinen entsyymi on CBHI. • · · · ·· · • · · • « \ s, 25 22. Jonkin patenttivaatimusten 18-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että • · · . 1 1 I mainittu isäntä on Trichoderma. • · · • · · ··· · • · ·

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu • · · *·’ 1 Trichoderma on T. reesei. 30 • · · ϊ.ϊ ·' 24. Sellainen viljelyalusta, joka on saatu jonkin patenttivaatimuksen 11 - 13 tai 15 -17 mukaisen isännän viljelyn jälkeen. • · • · · • · · !..1 25. Sellainen tuote, joka on saatu patenttivaatimuksen 24 mukaisesta viljelyalustasta, • · ·;·1 35 joka sisältää sienten viljelyn aikana alustaan erittämiä entsyymeitä, puhdistamalla, • · · •.. #' kuivaamalla, konsentroimalla tai immobilisoimalla mainittu viljelyalusta. • · • · · • · · • ·

26. Patenttivaatimuksen 24 mukaisen viljelyalustan, joka sisältää sienten viljelyn aikana alustaan erittämiä entsyymeitä, tai patenttivaatimuksen 25 mukaisen, viljelyalustasta johdetun tuotteen käyttö massa-ja paperiteollisuudessa.

27. Patenttivaatimuksen 24 mukaisen viljelyalustan, joka sisältää sienten viljelyn aikana alustaan erittämiä entsyymeitä, tai patenttivaatimuksen 25 mukaisen, viljelyalustasta johdetun tuotteen käyttö rehuteollisuudessa. • · • · · • · · ··· · ·· · • · ♦ • · • · • · « • · · • · · • · • · ♦ • · · ··· ♦ ··· ···· ··· ♦ · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • ·· • · • · · • · • · • · · • · · • i • · • · · 1 · • · · • ·· • ·