ES2346451T3 - Procedimiento y constructos de adn destinados a incrementar el nivel de produccion de enzimas degradantes de carbohidratos en hongos filamentosos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de ADN recombinante para la obtención en un huésped hongo filamentoso de un nivel de producción más alto de enzima termoestable degradante de xilano de Nonomureae flexuosa Nf xyn11A, que en su estado de longitud completa original presenta una estructura constituida por un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidratos (CMB) separado por una región conectora, caracterizado porque un constructo de ADN, que comprende unas secuencias reguladoras derivadas de hongos filamentosos y una secuencia de ADN acortada codificante de una forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A de longitud completa, cuya forma truncada es la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 12 y contiene la región catalíticamente activa de CAT, pero no presenta parte del CBM, se introduce en un huésped hongo filamentoso y se permite que se exprese y secrete dicho enzima Nf xyn11A truncado bajo el control de dichas secuencias reguladoras derivadas de hongo filamentoso, que incluyen una secuencia promotora, una secuencia de señal con o sin una secuencia portadora, y una secuencia de terminador derivada de un hongo filamentoso.

Description

Procedimiento y constructos de ADN destinados a incrementar el nivel de producción de enzimas degradantes de carbohidratos en hongos filamentosos.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a la biología molecular, y en particular a procedimientos y constructos de ADN destinados al incremento del nivel de producción en un huésped fúngico filamentoso al producir enzimas degradantes de carbohidratos (CD), que en su estado no modificado nativo presentan un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidrato (CBM) separado por una región conectora. Los enzimas degradantes de carbohidratos con la estructura definida anteriormente se encuentran entre hongos filamentosos y bacterias, tales como cepas de actinomicetes, incluyendo Nonomuraea flexuosa Xyn11 o Xyn10A. Para la producción de alto rendimiento, se utiliza una secuencia de ADN acortada, que codifica una forma truncada de los enzimas degradantes de carbohidratos deseados.

Antecedentes de la invención

Las paredes celulares vegetales consisten principalmente de una mezcla compleja de polisacáridos, principalmente celulosa, lignina y hemicelulosa. En la mayor parte del material vegetal, el xilano es el componente hemicelulosa principal, consistente de una cadena principal de residuos beta-D-xilopiranosilo 1,4-ligados que con frecuencia incluyen sustituyentes acetilo, arabinosilo y glucuronosilo. Los enzimas degradantes de carbohidratos resultan útiles como aditivos alimentarios, debido a sus efectos beneficiosos sobre la adsorción de componentes alimentarios y en el preblanqueo de la pulpa kraft, en la que se utilizan como alternativas simples y rentables a los compuestos químicos tóxicos que contienen cloro. El enzima principal necesario para incrementar la deslignificación de la pulpa kraft es la endo-\beta-1,4-xilanasa (EC 3.2.1.8), aunque se ha demostrado que la presencia de otros enzimas, tales como mananasa, lipasa y \alpha-galactosidasa, mejoran el efecto del tratamiento enzimático. En el blanqueo con adyuvantes enzimáticos, el pretratamiento con xilanasa elimina el xilano, conservando el contenido de celulosa. De esta manera, se reduce la necesidad de los compuestos químicos blanqueadores y/o se incrementa el brillo del papel. En las aplicaciones alimentarias, los efectos beneficiosos obtenidos tras la adición de enzima, incluyendo una tasa de crecimiento y una eficiencia alimentaria incrementadas, resultan de la reducción de la viscosidad intestinal y la liberación de nutrientes a partir del endosperma del grano y las capas de aleurona.

La utilización de tratamientos enzimáticos tanto en la industria alimentaria como de la pulpa y el papel se ha incrementado drásticamente. A modo de corolario, también se ha incrementado la demanda de enzimas degradantes de carbohidratos. Ello ha animado el desarrollo de nuevos procedimientos eficientes y rentables para la producción de cantidades suficientes de enzimas degradantes de carbohidratos que presenten propiedades adecuadas para la utilización en dichas industrias. Las xilanasas que son activas y estables a temperatura elevada y pH alcalino resultan especialmente deseables en muchos procedimientos industriales, debido a las altas temperaturas y condiciones alcalinas utilizadas en el blanqueo, así como a las altas temperaturas utilizadas en el procesamiento posterior, por ejemplo la peletización.

Es conocido que cepas de actinomicetes producen enzimas termoestables con óptimos alcalinos. Especialmente las cepas de actinomicetes termofílicos son una fuente útil de xilanasas para los procedimientos industriales. Sus actividades y estabilidad a temperatura elevada resultan adecuadas para procedimientos de blanqueo y en otras aplicaciones en las que resulta beneficioso llevar a cabo el tratamiento enzimático a temperaturas elevadas. Se han clonado genes útiles a partir de, por ejemplo, Thermomonospora fusca, Nonomuraea flexuosa DSM43186, anteriormente denominada Actinomadura flexuosa o Microtetraspora flexuosa, así como a partir de algunas especies de Streptomyces. Se ha descrito la clonación de dos xilanasas de Nonomuraea flexuosa en las patentes US nº 5.935.836, nº 6.300.114, nº 6.506.593 y nº 6.667.170.

Los deseados enzimas degradantes de carbohidratos resistentes a altas temperaturas con óptimos de pH extremos se originan de bacterias relativamente no estudiadas. Típicamente, presentan niveles de producción bajos y no resultan adecuados para la producción industrial a gran escala. Exista poca o prácticamente ninguna experiencia sobre la fermentación de dichas bacterias. De acuerdo con lo anterior, la transferencia de un gen originado de dichos microbios, y codificante del enzima deseado, en un organismo huésped heterólogo resulta una alternativa factible para producir el enzima deseado.

Se han producido enzimas bacterianos en huésped bacterianos y levaduras, tal como se da a conocer en, por ejemplo, las patentes US nº 5.306.633 y nº 5.712.142. La patente US nº 5.712.142 describe un procedimiento para incrementar la termoestabilidad de una celulasa bacteriana a partir de Acidothermus cellulyticus mediante corte proteolítico o mediante la expresión de una forma acortada o truncada del gen codificante de la celulasa de tamaño completo en el huésped levadura, Pichia pastoris. El documento WO nº 0196382 A2 describe un procedimiento para incrementar la termoestabilidad de la celulasa de Rhodothermus marinus mediante la expresión de una forma truncada del gen en Escherichia coli. De acuerdo con lo expresado anteriormente, se han descrito varios enzimas bacterianos degradantes de carbohidratos y es conocido cómo mejorar su termoestabilidad.

La truncación de una xilanasa multidominio procedente de la bacteria anaerobia Neocallimastix patriciarum se ha demostrado que mejora la expresión en E. coli, tal como se da a conocer en la patente WO nº 9325693 A1.

Los hongos filamentosos, incluyendo Aspergillus, Trichoderma y Penicillium, es conocido que son productores efectivos de proteínas homólogas y heterólogas. Son claramente los organismos-huésped más preferibles para la producción a gran escala de enzimas industriales, incluyendo la producción en masa de amilasas, glucoamilasas, celulasas, xilanasas, etc. Los primeros intentos de producir enzimas bacterianos en hongos filamentosos fueron desalentadores. Los rendimientos de enzimas bacterianos eran bajos, no superando unas cuantas decenas de miligramos por litro. En muchos de los informes, los enzimas se detectaban únicamente intracelularmente (Jeenes et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9:327-367, 1991; van den Hondel et al., en: J.W. Bennet y L.L. Lasure (ed.) More genetic manipulations in fungi: Academic Press, San Diego, Calif.).

Se han desarrollado y utilizado estrategias de fusión genética para mejorar los rendimientos de proteínas heterólogas en hongos filamentosos, tal como se da a conocer en las patentes US nº 5.364.770 y WO nº 94/21785, revisados por Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:1-11, 1997. La producción de enzimas bacterianos degradantes de carbohidratos a partir de hongos filamentosos utilizando fusiones génicas que comprenden una secuencia de ADN codificante de una proteína (polipéptido) secretable completa o parcial de hongo filamentoso como proteína portadora ha sido descrita en las patentes WO nº 97/27306 y US nº 2003/0148453. Utilizando casetes de expresión dados a conocer en dichas solicitudes de patente y que comprenden secuencias de ADN codificantes de un enzima bacteriano degradante de carbohidratos fusionado en el mismo marco de lectura con una proteína secretable completa o parcial de hongo filamentoso, Paloheimo et al. (Appl. Environ. Microbiol. 69:7073-7082, 2003) han demostrado que los niveles de producción se incrementan notablemente al fusionar el gen codificante del enzima bacteriano en el mismo marco de lectura con un polipéptido secretable de hongo filamentoso que presenta una estructura de dominio intacta.

El objetivo de la presente invención es mejorar adicionalmente los niveles de producción de enzimas degradantes de carbohidratos, particularmente enzimas bacterianos producidos mediante técnicas de ADN recombinante a partir de huéspedes fúngicos filamentosos.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un procedimiento y a constructos de ADN para mejorar los niveles de producción de un enzima degradante de carbohidratos, Nf xyn11A, utilizando técnicas de ADN recombinante y hongos filamentosos como huéspedes.

El enzima degradante de carbohidratos (CD) de la presente invención se encuentra activo sobre sustratos carbohidratos y es un enzima, en el que el enzima completo en su estado original (nativo o no modificado) presenta tres dominios o regiones características, que son un módulo catalítico (CAT) que contiene el sitio activo y un módulo de unión a carbohidrato (CBM), estando dichos módulos separados por una región conectora. Algunos módulos de unión a carbohidrato, tales como el módulo de unión a carbohidrato de AM50 (NfXyn10A) pueden presentar más de un subdominio.

El procedimiento para obtener el nivel incrementado de producción comprende una primera etapa, en la que se diseña un constructo de ADN. El constructo de ADN, que se introduce en un huésped hongo filamentoso comprende secuencias reguladoras y una secuencia acortada de ADN codificante de una forma truncada del enzima degradante de carbohidratos Nf xyn11A, que comprende la región catalíticamente activa de CAT y no presenta parte del módulo CBM. Las secuencias reguladoras preferentemente se derivan de hongos filamentosos y comprenden por lo menos una secuencia de señal.

La secuencia de ADN codificante de la forma truncada del enzima degradante de carbohidratos se origina de una cepa bacteriana, que es una cepa de actinomiceto Nonomuraea. La xilanasa de Nonomuraea flexuosa, en particular la xilanasa termoestable Nf xyn11A es un ejemplo de enzima degradante de carbohidratos, los rendimientos de la cual pueden incrementarse mediante la aplicación de técnicas de ADN recombinante y secuencias acortadas de ADN codificantes del enzima diana degradante de carbohidratos acortado, que no presenta parte o la totalidad del CBM, o la totalidad del CBM y parte o la totalidad de la región conectora.

Dichas secuencias de ADN pueden ser secuencias naturales aisladas de genomas bacterianos. Pueden ser secuencias sintéticas preparadas mediante procedimientos conocidos, tales como PCR. Entre las secuencia sintéticas se incluyen las secuencias de ADN de codones optimizados, en las que los codones de nucleótidos de secuencias de ADN bacteriano naturales se modifican para que resulten similares al uso de codones en el huésped hongo filamentoso. Las formas truncadas del enzima degradante de carbohidratos codificado por dichas secuencias de codones optimizados presentan la actividad catalítica correspondiente al enzima codificado por una secuencia de ADN natural.

La forma truncada de dicho enzima degradante de carbohidratos se expresa bajo el control de secuencias reguladoras originadas de los mismos o diferentes hongos filamentosos. Las secuencias reguladoras comprenden por lo menos una secuencia de señal derivada de un hongo filamentoso. El rendimiento puede mejorarse todavía más en el caso de que el enzima degradante de carbohidratos indicado anteriormente se expresa bajo el control de secuencias reguladoras que consisten de secuencias promotoras, secuencias terminadoras y, particularmente, secuencias de ADN codificantes de una proteína (polipéptido) portador que incluye una secuencia de señal. Las secuencias reguladoras pueden obtenerse a partir de los mismos o diferentes hongos filamentosos y combinarse de maneras arbitrarias. Lo anterior implica que el origen de las secuencias reguladoras y el orden de las mismas pueden variar.

Las secuencias de ADN codificantes de la proteína portadora pueden incluir la región codificante completa de la proteína degradante de carbohidratos secretable madura o una región seleccionada o dominio de la misma que en su forma secretable nativa consiste del módulo catalítico N-terminal (CAT) y un dominio de unión a carbohidrato C-terminal (CBD) separado por una región conectora (bisagra). La proteína portadora puede incluir el módulo catalítico (CAT), o el módulo catalítico (CAT) y parte o la totalidad de la región conectora (bisagra), o el módulo catalítico (CAT) y la totalidad de la región conectora (bisagra) y parte o la totalidad del dominio de unión a carbohidrato (CBD). La región nuclear Man5A o la región nuclear/bisagra Man5A de T. reesei (St\ring{a}lbrand et al., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097, 1995) son ejemplos de dichas proteínas portadoras.

La proteína degradante de carbohidratos secretable puede incluir únicamente el dominio catalítico (CAT) que puede utilizarse como polipéptido portador. XYNI y XYNII de T. reesei son ejemplos de dichas proteínas (Törrönen et al., Biotechnol. 10:1461-1465). Algunas proteínas secretables presentan su CBD en el extremo N-terminal del enzima. Un ejemplo de este tipo de enzima es Cel6A de T. reesei (CBHII) (Teeri et al., Gene 51:43-52, 1987). Un CBD de Cel6A consiste de una región A, regiones A+B o regiones A+B+B', en donde A es un dominio de unión a carbohidrato, B es una región bisagra (conectora) y B' es una región bisagra (conectora) duplicada. Estas regiones pueden utilizarse solas o en diferentes combinaciones como posibles polipéptidos portadores.

Las secuencias de señal pueden seleccionarse de entre diversos polipéptidos secretables de hongos filamentosos, especialmente las secuencias de señal de Trichoderma y de Aspergillus, incluyendo la secuencia de señal Man5A (St\ring{a}lbrand et al., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097, 1995) y las secuencia de señal Cel6A (Teeri et al., Gene 51:43-52, 1987).

Las secuencias promotoras pueden seleccionarse de entre diversos promotores de hongos filamentosos, especialmente de promotores de Trichoderma y de Aspergillus, incluyendo un promotor fuerte cel7A de Trichoderma (cbh1). Las secuencias terminadoras también pueden obtenerse de hongos filamentosos, resultando especialmente preferente una secuencia terminadora cel7A de Trichoderma.

En el caso de que la secuencia de ADN acortada sea una Nf xyn11A acortada (am24 (SEC ID nº 3) o am24* (SEC ID nº 5) expresada y secretada únicamente bajo el control de una secuencia de promotor y una de señal originadas de un hongo filamentoso sin ninguna proteína portador o dominio de la misma, el nivel de producción de Nf xyn11A truncado de secuencia SEC ID nº 12 es por lo menos 2 veces superior en matraces de agitación y con frecuencia más de 8 a 10 veces superior en un cultivo en fermentación que el nivel de producción obtenido al expresar y secretar el Nf xyn11A de longitud completa correspondiente bajo el control del mismo promotor y secuencia de señal sin una proteína portadora o partes de la misma.

En el caso de que la secuencia de ADN acortada sea un Nf xyn11A acortada (am24 (SEC ID nº 3) o am24* (SEC ID nº 5) expresada y secretada bajo el control de un promotor, secuencia de señal y una secuencia de ADN codificante de una proteína (polipéptido) portadora o dominio de la misma, siendo todas las secuencias reguladoras originarias de hongos filamentosos, el nivel de producción de Nf xyn11A truncado de secuencia SEC ID nº 12 es por lo menos dos veces superior (en matraces de agitación) que con una secuencia de ADN codificante del Nf xyn11A de longitud completa correspondiente expresado y secretado bajo el control de las mismas secuencias de promotor, señal y proteína portadora o dominio de la misma. Se obtienen niveles de producción todavía más altos en cultivos en fermentación. Debe indicarse que todavía podía conseguirse una mejora adicional en el caso de que se utilice una secuencia de ADN codificante de un enzima bacteriano truncado, aunque ya se conoce que se consigue un nivel de producción mejorada al expresar y secretar secuencias de ADN codificantes de un enzima bacteriano de longitud completa bajo el control de dominios intactos de proteína portadora secretable de hongo filamentoso (Paloheimo et al., Appl. Environ. Microbiol. 69:7073-7082, 2003).

Listado de secuencias

SEC ID nº 1

Secuencia de nucleótidos de Nf xyn11A (AJ508952), la región codificante se encuentra comprendida entre nt303 y nt1.337. La secuencia de GenBank AJ508952 muestra cualquier revisión realizada de la secuencia.

SEC ID nº 2

Secuencia de nucleótidos de am35, región codificante de Nf xyn11A para la proteína Nf xyn11A madura (AM35)

SEC ID nº 3

secuencia de nucleótidos de am34, incluyendo un codón de PARADA

SEC ID nº 4

secuencia de nucleótidos de am35*, al igual que am35 aunque se han modificado 9 codones en la secuencia (Ejemplo 10) (los cambios no alteran la secuencia de aminoácidos codificada)

SEC ID nº 5

secuencia de nucleótidos de am24*, al igual que am24 pero se han modificado 9 codones en la secuencia, al igual que am35* (Ejemplo 10)

SEC ID nº 6

secuencia de nucleótidos de Nfxyn10A (AJ508953), la región codificante se encuentra comprendida entre nt194 y nt1672. La secuencia de GenBank AJ508953 muestra cualquier revisión realizada de la secuencia.

SEC ID nº 7

secuencia de nucleótidos de am50, región codificante de Nfxyn10A para la proteína NfXyn10A madura (AM50)

SEC ID nº 8

Secuencia de nucleótidos codificante del núcleo de AM50 y de las regiones conectoras, incluye un codón de PARADA

SEC ID nº 9

Secuencia de nucleótidos codificante de la región del núcleo de AM50, incluye un codón de PARADA

SEC ID nº 10

Secuencia de aminoácidos de Nf xyn11A (AJ508952) codificada por el gen Nf xyn11A. La secuencia de GenBank AJ508952 muestra cualquier revisión realizada de la secuencia

SEC ID nº 11

r33,4 kDa=AM35=secuencia de aminoácidos para la proteína Nf xyn11A madura de longitud completa codificada por los genes am35 y am35*

SEC ID nº 12

AM24, secuencia de aminoácidos para la forma truncada de AM35 codificada por los genes am24 y am24*

SEC ID nº 13

r23,8 kDa, secuencia de aminoácidos para la forma truncada de AM35

SEC ID nº 14

r22,0 kDa, secuencia de aminoácidos de la forma truncada de AM35

SEC ID nº 15

NfXyn10A, secuencia de aminoácidos (AJ508953) codificada por el gen Nfxyn10A. La secuencia de GenBank AJ508953 muestra cualquier revisión realizada de la secuencia

SEC ID nº 16

AM50, secuencia de aminoácido para la proteína NfXyn10A madura de longitud completa

SEC ID nº 17

núcleo de AM50 + conector, secuencia de aminoácidos para la forma truncada de AM50

SEC ID nº 18

núcleo de AM50, secuencia de aminoácidos para la forma truncada de AM50

SEC ID nº 19

núcleo de AM50 + conector + dominios \alpha/\beta de la cola, secuencia de aminoácidos de la forma truncada de AM50

SEC ID nº 20

núcleo de AM50 + conector + dominio \alpha de la cola, secuencia de aminoácidos para la forma truncada de AM50

SEC ID nº 21

secuencia de aminoácidos de la secuencia conectora sintética codificante de una señal Lys-Arg de corte de proteasa de tipo Kex2 incluida en todos los constructos para garantizar el corte de la proteína de fusión

SEC ID nº 22

secuencia adicional de aminoácidos que precede al sitio Kex2 en el casete de expresión pALK1264, pALK1 131 y pALK1 134

SEC ID nº 23

secuencia de aminoácidos N-terminal de los polipéptidos Nf xyn11A maduro y Xyn11A recombinante, denominado r33,4 kDa, r23,8 kDa y r22,0 kDa

SEC ID nº 24

secuencia de nucleótidos para el sitio de reconocimiento NruI introducida en un conector Kex2

SEC ID nº 25

secuencia de nucleótidos para el conector Kex2 que facilita la construcción de fusiones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del gen xyn11A de Nonomuraea flexuosa y la secuencia de aminoácidos deducida. El codón de parada se muestra con un asterisco en la parte inferior de la secuencia. La secuencia de aminoácidos N-terminal madura, determinada a partir de la proteína Xyn11A purificada, se ha subrayado. Los ácidos glutámicos del sitio activo se marcan con una caja abierta. Las localizaciones del conector y del módulo de unión a carbohidrato se indican mediante una línea de puntos en la parte inferior de la secuencia de aminoácidos. Los sitios de corte de los polipéptidos r23,8 kDa y r22,0 kDa se señalan con un triángulo. Los sitios para la N-glucosilación putativa en huéspedes eucarióticos se señalan en negrita.

La figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos del gen xyn10A de N. flexuosa y la secuencia de aminoácidos deducida. El codón de parada se muestra con un asterisco en la parte inferior de la secuencia. Las secuencias peptídicas trípticas, obtenidas de la proteína Xyn10A purificada, se muestran mediante subrayado en la parte inferior de la secuencia de aminoácidos. Los ácidos glutámicos del sitio activo se señalan con una caja abierta. La localización putativa del conector y del módulo de unión a carbohidrato, que consiste de los subdominios \alpha, \beta y \gamma (Fujimoto et al., J. Mol. Biol. 300:575-585, 2000), se indica mediante una línea de puntos en la parte inferior de la secuencia de aminoácidos. Las repeticiones QxW presentes en los CBMs de la "superfamilia de la ricina" (Fujimoto et al., J. Mol. Biol. 300:575-585, 2000; Hirabayashi et al., J. Biol. Chem. 273:14450-14460, 1998) se señalan en negrita. La secuencia de nucleótidos continúa en la figura 2B.

La figura 2B muestra la continuación de la secuencia de nucleótidos ilustrada en la figura 2A.

La figura 3 muestra la estructura del casete de expresión pALK945, construido para producir la proteína Xyn11A de N. flexuosa madura recombinante utilizando el núcleo/bisagra Man5A de T. reesei como polipéptido portador. La fusión génica se expresó a partir del promotor de cel7A y se garantizó la terminación de la transcripción mediante la utilización de la secuencia de terminador de cel7A. La secuencia de man5A incluía los aminoácidos codificados M_{1}-G_{406} (St\ring{a}lbrand et al., J. Biotechnol. 29:229-242, 1993). El gen amdS (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479) se incluyó como marcador de transformación y se incluyó la región 3' flanqueante de cel7A, conjuntamente con el promotor de cel7A, para dirigir el casete de expresión al locus cel7A mediante recombinación homóloga. Se incluyó la secuencia de conector sintético para una Arg adicional para garantizar el corte de la proteína de fusión. Los aminoácidos codificados por la secuencia de man5A se presentan en fuente normal, los de xyn11A, en cursiva, y los del aminoácido sintético para el corte proteolítico, en negrita.

La figura 4A muestra una muestra de medio de cultivo de T. reesei a partir del que se purificaron los polipéptidos recombinantes de xilanasa (Ejemplo 7) en gel de SDS-poliacrilamida tras tinción con azul de Coomassie (carril 2) y tras análisis de transferencia western (carril 3). Se muestra mediante flechas la localización de los polipéptidos r33,4 kDa y r23,8 kDa y la proteína de fusión. La forma r22,0 kDa no era visible en el gel/transferencia western debido a la pequeña cantidad en el sobrenadante de cultivo. Los tamaños de los marcadores de peso molecular (en el carril 1) eran, de parte superior a parte inferior, 104, 80, 46,9, 33,5, 28,3 y 19,8 kDa. Se utilizó un anticuerpo policlonal preparado contra Nf xyn11A purificado para la detección de las formas heterólogas de xilanasa del filtro de la transferencia Western.

La figura 4B muestra las muestras de Nf xyn11A nativo purificado (carril 2) y las formas recombinantes de xilanasa polipéptido r33,4 kDa (carril 3), polipéptido r23,8 kDa (carril 4) y polipéptido r22,0 kDa (carril 5) corridos en gel de SDS-poliacrilamida y se tiñeron con azul de Coomassie. Los marcadores de peso molecular (carril 1) son los mismos que en la figura 4A.

La figura 5A muestra los perfiles de temperatura de las xilanasas Xyn11A purificadas a pH 5. Se determinó el efecto de la temperatura mediante incubación de la mezcla de reacción a pH 5 y diferentes temperaturas durante 60 minutos. Se expresa la actividad relativa (%) como porcentaje de la actividad máxima a la temperatura óptima. Las actividades relativas a pH 6 (no representadas) eran similares a las obtenidas a pH 5.

La figura 5B muestra los perfiles de temperatura de las xilanasas Xyn11A purificadas a pH 7. Se determinó el efecto de la temperatura mediante incubación de la mezcla de reacción a pH 7 y diferentes temperaturas durante 60 minutos. Se expresa la actividad relativa (%) como porcentaje de la actividad máxima a la temperatura óptima.

La figura 5C muestra los perfiles de temperatura de las xilanasas Xyn11A purificadas a pH 8. Se determinó el efecto de la temperatura mediante incubación de la mezcla de reacción a pH 8 y diferentes temperaturas durante 60 minutos. Se expresa la actividad relativa (%) como porcentaje de la actividad máxima a la temperatura óptima.

La figura 6A muestra la actividad residual de los enzimas purificados tras la incubación a 80ºC a pH 5. Se determinó la termoestabilidad mediante incubación de los polipéptidos Xyn11A a pH 5 durante un periodo de 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 150 y 245 minutos en ausencia de sustrato, después de los cual se midieron las actividades residuales a pH 7 y 70ºC durante 5 minutos.

La figura 6B muestra la actividad residual de los enzimas purificados tras la incubación a 80ºC a pH 7. Se determinó la termoestabilidad mediante incubación de los polipéptidos Xyn11A a pH 7 durante un periodo de 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 150 y 245 minutos en ausencia de sustrato, después de lo cual se midieron las actividades residuales a pH 7 y 70ºC durante 5 minutos.

La figura 7 muestra la estructura global del casete de expresión construido para estudiar el efecto de la truncación del gen am35 sobre los niveles de producción de xilanasa en Trichoderma reesei. Se expresaron las fusiones génicas a partir del promotor de cel7A y se garantizó la terminación de la transcripción mediante la utilización de la secuencia de terminador de cel7A. Los polipéptidos portadores utilizados se encontraban codificados por la secuencia de núcleo/bisagra de man5A (M_{1}-G_{410} en pALK1022, pALK1692, pALK1309 y pALK1131), la secuencia del CBD de cel6A (M_{1}-S_{86}) en pALK1285 y pALK1502 o la secuencia de man5A codificante de un fragmento del núcleo de Man5A (M_{1}-V_{227} en pALK1264, pALK1151 y pALK114). El bloque A del CBD de Cel6A codifica la cola de la proteína, y B, la región bisagra. En los plásmidos pALK1118 y pALK1276, se fusionó el gen de xilanasa con la secuencia de señal de man5A. Se incluyó una secuencia conectora sintética codificante de una señal Lys-Arg de corte de proteasa de tipo Kex2 (incluida como RDKR (SEC ID nº 18)) en todos los constructos para garantizar el corte de la proteína de fusión. Los casetes de expresión pALK1264, pALK1131 y pALK1134 también incluían una secuencia adicional codificante de GQCGG (SEC ID nº 19) que precedía al sitio Kex2. Los aminoácidos codificados por am35 (SEC ID nº 2) y am35* (SEC ID nº 4) son D_{44}-N_{344} (la proteína madura de longitud completa, fig. 1; SEC ID nº 11) y por las secuencias am35/am35* truncadas (am24 (SEC ID nº 3) y am24* (SEC ID nº 5) son D_{44}-L_{263} (fig. 1; SEC ID nº 12). En am35* (SEC ID nº 4) y am24* (SEC ID nº 5) se han modificado nueve codones, tal como se indica en el Ejemplo 10. Los cambios no alteran las secuencias de aminoácidos codificadas. El gen marcador amdS y la región 3' flanqueante de cel7A (para dirigir el casete de expresión al locus cel7A mediante recombinación homóloga) se incluyeron en todos los constructos después de la secuencia de terminador de cel7A (de manera idéntica al casete de expresión pALK945 mostrado en la fig. 3).

La figura 8 muestra un gel de SDS-poliacrilamida teñido con azul de Coomassie en el que se ha corrido una muestra del sobrenadante de cultivo de un transformante de T. reesei productor de la forma truncada de la xilanasa Nf xyn11A (AM24). Se utilizó el CBD de Ce16A como un polipéptido portador. Las formas purificadas r23,8 y r22,0 se corrieron en paralelo en el gel. Carriles 1. Un marcador de peso molecular (se muestra la masa molecular de las proteínas marcadoras relevantes), 2. y 3. Sobrenadante de cultivo de un transformante de T. reesei productor de Xyn11A truncado, 3. Xilanasa r22,0 kDa purificada, 5. xilanasa r23,8 kDa purificada.

La figura 9A muestra el casete de expresión para producir una forma truncada de NfXyn10A, el núcleo de NfXyn10A, en T. reesei. El núcleo incluye los aminoácidos A_{45}-N_{345} (fig. 2; SEC ID nº 18). El promotor de cel7A, el péptido de señal de cel6A y la secuencia de terminador de cel7A se utilizan (al igual que en el constructo pALK1285 y pALK1502, fig. 7) para la producción de NfXyn10A. Se utilizó el CBD de Cel6 (A+B) como polipéptido portador (al igual que en los constructos pALK1285 y pALK1502, fig. 7). Se incluye una secuencia codificante de un sitio Kex2 (SEC ID nº 18) entre las secuencias de portador y de xilanasa. El marcador amds y el fragmento 3' de cbh1 se incluyen en los constructos para producir Nf xyn11A.

La figura 9B muestra el casete de expresión para producir una forma truncada de NfXyn10A, el núcleo/conector de NfXyn10A en T. reesei. El núcleo/conector incluye los aminoácidos A_{45}-S_{367} (fig. 2; SEC ID nº 17). Las otras secuencias (promotor de cel7A, péptido de señal de cel6A, secuencia codificante del CBD de cel6A, terminador de cel7A, la secuencia codificante del sitio Kex2, el marcador amdS y el fragmento 3' de cbh1) son iguales a las presentes en los constructos en la fig. 9A.

La figura 9C muestra el casete de expresión para producir NfXyn10A de longitud completa en T. reesei. La xilanasa de longitud completa incluye los aminoácidos de NfXyn10A A_{45}-A_{492} (la proteína de longitud completa desde el extremo N-terminal, fig. 2; SEC ID nº 16). Las otras secuencias (promotor de cel7A, péptido de señal de cel6A, secuencia codificante de CBD de cel6A, terminador de cel7A, secuencia codificante del sitio Kex2, el marcador amdS y el fragmento 3' de cbh1) son iguales a las presentes en los constructos en la fig. 9A.

Lista de números de acceso de secuencias de nucleótidos

AJ508952

secuencia de nucleótidos xyn11A de N. flexuosa DSM43186

AJ508953

secuencia de nucleótidos xyn10A de N. flexuosa DSM43186

Organismos donantes

Nonomuraea flexuosa DSM43186 (ATCC nº 35864)

Descripción general de la invención Abreviaturas y nomenclatura

Nf

Nonomuraea flexuosa

xyn10A

gen de xilanasa de la familia 10

Xyn10A

proteína de xilanasa de la familia 10

xyn11A

gen de xilanasa de la familia 11

Xyn11A

proteína de xilanasa de la familia 11

CBM, CBD

módulo/dominio de unión a carbohidratos, estructura parcial del enzima degradante de carbohidratos

CBM

módulo de unión a carbohidratos, en la presente memoria el término CBM se utiliza para los enzimas truncados degradantes de carbohidratos

CBD

dominio de unión a carbohidratos, en la presente memoria el término CBD se utiliza para dominios de proteína portadora

cel7A(cbh1)

gen de celobiohidrolasa 1 en Trichoderma reesei

cel7B(egl1)

gen de endoglucanasa 1 de Trichoderma reesei

cel6A(cbh2)

gen de celobiohidrolasa 2 de Trichoderma reesei

cel5A(egl2)

gen de endoglucanasa 2 de Trichoderma reesei

man5A

gen de mananasa de Trichoderma reesei

Nf xyn11A

gen de xilanasa de N. flexuosa de la familia 11

Nfxyn10A

gen de xilanasa de N. flexuosa de la familia 10

am35

gen Nf xyn11A codificante de la forma de longitud completa de la proteína madura Nf xyn11A (aminoácidos D_{44}-N_{344})

am24

forma acortada de Nf xyn11A codificante de la forma truncada de la proteína Nf xyn11A madura (aminoácidos D_{44}-L_{263})

am35*

am35, aunque incluyendo los cambios de codones siguientes: Gly_{53} GGG a GGC, Ala_{66} GCG a GCC, Gly_{68} GGG a GGC, Arg_{85} CGG a CGC, Gly_{88} GGG a GGC, Gly_{100} GGA a GGC, Arg_{101} CGG a CGC, Arg_{102} CGG a CGC y Val_{104} GTG a GTC

am24*

am24 aunque incluyendo los mismos cambios de codones que am35*

am50

gen Nfxyn10A codificante de la forma de longitud completa de la proteína NfXyn10A madura (aminoácidos A_{45}-A_{492})

AM35

igual que r33,4 kDa, ver posteriormente, codificado por am35 y am35*

AM24

forma truncada de AM35, codificada por am24 y am24* (aminoácidos D_{44}-L_{263})

r33,4 kDa

proteína Nf xyn11A madura recombinante de longitud completa (aminoácidos D_{44}-N_{344})

r23,8 kDa

forma cortada de la proteína Nf xyn11A madura recombinante de longitud completa (aminoácidos D_{44}-V_{260})

r22,0 kDa

forma cortada de la proteína Nf xyn11A madura recombinante de longitud completa (aminoácidos D_{44}-N_{235})

AM50

proteína NfXyn10A madura recombinante de longitud completa (aminoácidos A_{45}-A_{492}), codificada por am50

Clasificación de los enzimas activos sobre carbohidratos

Puede encontrarse información sobre la nomenclatura de los enzimas degradantes de carbohidratos, incluyendo celulasas, xilanasas, mananasas y otros, en Coutinho P.M. y Henrissat B., 1999, servidor Carbohydrate-Active Enzymes en URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/.

Descripción general de la invención Terminología

En la presente invención, la mayoría de definiciones presentan el mismo significado que el que presentan generalmente en los campos científicos correspondientes. Algunas expresiones se utilizan de una manera algo diferente. Por lo tanto, se explican en mayor detalle a continuación.

La expresión "enzima degradante de carbohidratos (CD)" se refiere a un enzima activo sobre un sustrato carbohidrato y que presenta un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidratos (CBM) separados por una región conectora. Los términos "dominio" o "región" también se utilizan en lugar del término "módulo". Los enzimas degradantes de carbohidratos bacterianos pueden obtenerse de varias cepas bacterianas diferentes, incluyendo cepas actinomicetes de Nonomuraea, Thermomonospora, particularmente Nonomuraea flexuosa o Thermomonospora fusca. El procedimiento aparentemente resulta aplicable a enzimas obtenibles de algunos otros organismos, por ejemplo xilanasas obtenibles de Chaetomium, particularmente C. thermophilum, que es un hongo filamentoso. Entre los enzimas degradantes de carbohidratos se incluyen los enzimas degradantes de celulosa y de hemicelulosa, particularmente algunos enzimas específicos degradantes de manano. Resultan particularmente útiles las xilanasas termoestables, incluyendo NfXyn10A o Nf xyn11A. Puede encontrarse información sobre los enzimas degradantes de carbohidratos y sus estructuras, por ejemplo, en Gilkes et al., Eur. J. Biochem. 202:367-377, 1991; Teeri et al., J. Biotechnol. 24:169-176, 1992; St\ring{a}lbrand et al., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097, 1995; Tomme et al., Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler & Penner, eds), Cellulose-binding domains: classification and properties, páginas 142 a 163, American Chemical Society, Washington, 1995). En la mayoría de enzimas degradantes de carbohidratos, el CBM se encuentra situado en el extremo C-terminal de la molécula, aunque en algunos enzimas, por ejemplo en Ce16 de T. reesei (CBHII) y en Ce15A (EGII), presentan su CBM en el extremo N-terminal del enzima. La provisión de niveles de producción más altos mediante la eliminación del CBM o parte del mismo, o del CBM y el conector o parte del mismo de los enzimas degradantes de carbohidratos bacterianos se cree que funciona incluso en el caso de que el CBM no se encuentre situado en el extremo C-terminal del enzima degradante de carbohidratos utilizado para ejemplificar la invención.

La expresión "forma truncada el enzima degradante de carbohidratos" se refiere a un enzima, particularmente a un enzima bacteriano, por ejemplo, de una cepa de actinomicetes que carece de parte de la secuencia de aminoácidos. Típicamente, lo anterior significa que una parte o la totalidad del CBM, o alternativamente la totalidad del CMB y una parte o la totalidad de la región conectora se encuentra ausente de la forma truncada. La forma truncada del enzima contiene un dominio catalítico intacto o por lo menos una región del dominio catalítico que resulta esencial para la actividad catalítica del enzima degradante de carbohidratos (CD). El enzima truncado se expresa y se secreta bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo promotores y secuencias de señal.

La expresión "región catalíticamente activa de CAT" se refiere a que la región incluye por lo menos el sitio activo del enzima, proporcionando la especificidad para su sustrato particular y contribuyendo los residuos aminoácidos que participan directamente en la formación y rotura de enlaces químicos. Los residuos aminoácidos del sitio activo se encuentran conservados dentro de diferentes familias de CD. Los sitios activos de las endo-1,4-xilanasas de la familia 10 y de la familia 11, por ejemplo, contienen dos ácidos glutámicos conservados, que resultan esenciales para la actividad catalítica. La región catalíticamente activa de CAT presenta una actividad catalítica similar a la del CAT intacto correspondiente o el enzima degradante de carbohidratos intactos y puede medirse, por ejemplo, con ensayos de actividad enzimática.

La expresión "constructo de ADN" se refiere a un constructo de expresión o de transformación. El constructo de ADN comprende por lo menos una secuencia acortada de ADN, que se origina de una bacteria y que codifica una forma acortada de dicho enzima degradante de carbohidratos bacteriano, preferentemente en combinación con secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen un promotor, una secuencia de señal con o sin un secuencia portadora, y una secuencia terminadora que se origina de un hongo filamentoso. El constructo de ADN incluye por lo menos las secuencias de ADN, que resultan esenciales para la expresión competente y la secreción de la forma acortada del enzima degradante de carbohidratos deseado. Los constructos de ADN pueden proporcionarse en dos formas diferentes, en forma de casete de expresión o de plásmido de expresión.

En un plásmido de expresión, el constructo de ADN puede contener además elementos plasmídicos y secuencias de gen informador para la replicación y selección en E. coli. Un casete de expresión consiste favorablemente de las secuencias de ADN que resultan esenciales para la expresión y secreción de los enzimas bacterianos en hongos filamentosos. El casete de expresión no incluye elementos plasmídicos y secuencias de informador. El marcador de selección puede incluirse en el plásmido/casete de expresión o puede transformarse separadamente en el huésped fúngico filamentoso mediante la utilización de un procedimiento de cotransformación. En otras palabras, los elementos plasmídicos y secuencias de informador se extraen de los plásmidos de expresión con el fin de obtener los casetes de expresión para la transformación. Sin embargo, ambas formas pueden incluir, y preferentemente incluyen secuencias que permiten la transformación dirigida a locus en el huésped fúngico filamentoso. Sin embargo, ambas formas pueden incluir, y preferentemente incluyen, secuencias que permiten la transformación dirigida a locus en el huésped fúngico filamentoso. El constructo de ADN de esta manera puede ser dirigido a un locus seleccionado en el genoma del huésped.

La expresión "secuencias reguladoras" se refiere a secuencias de ADN que controlan la expresión y secreción del enzima degradante de carbohidratos, presentando la estructura definida anteriormente. Las secuencias reguladoras utilizadas en la presente invención preferentemente se originan de hongos filamentosos, tales como Aspergillus y Trichoderma, particularmente Trichoderma reesei.

Las secuencias reguladoras comprenden por lo menos una secuencia de señal derivada de un hongo filamentoso, y también por lo menos un promotor de un hongo filamentoso, incluyendo el promotor fuerte de cel7A de Trichoderma (cbh1). En una forma de realización preferente de la invención, la secuencia acortada de ADN codificante de la forma truncada del enzima degradante de carbohidratos se fusiona en el mismo marco de lectura con una secuencia de ADN codificante de una proteína (polipéptido) portadora. La proteína portadora preferentemente se encuentra codificada por secuencias de ADN que pueden obtenerse y construirse a partir de dominios derivados de los mismos o diferentes hongos filamentosos y codifican uno o más dominios preferentemente intactos de un enzima secretable de hongo filamentoso. La estructura de un dominio intacto es similar a la región correspondiente en el enzima de longitud completa debido al plegamiento correcto de la secuencia de aminoácidos primaria. Por lo tanto, las rutas de secreción de los polipéptidos portadores que contienen uno o más dominios intactos del enzima secretable del hongo filamentoso se espera que resulten similares al enzima de longitud completa nativo. Los enzimas secretables aplicables pueden comprender un dominio nuclear que contiene el sitio activo o catalítico del enzima y un dominio de unión a sustrato o un dominio de unión a carbohidrato (CBD) unido a una región bisagra, aunque la proteína portadora también puede ser un enzima secretable naturalmente consistente de únicamente la región nuclear, tal como ejemplifican determinadas xilanasas de hongo filamentoso, por ejemplo XYNI y XYNII de T. reesei. También puede utilizarse un CBD intacto o un CBD y un conector con el fin de conseguir un nivel de producción elevado. Pueden combinarse diferentes dominios o regiones de enzimas secretables filamentosos derivados de diferentes hongos filamentosos en orden variable y arbitrario. Las secuencias de ADN codificantes de las secuencias reguladoras, incluyendo la proteína portadora pueden construirse mediante combinación de las secuencias de ADN derivadas de diferentes fuentes de hongo filamentoso.

Entre las combinaciones más preferidas se incluyen constructos en los que la proteína portadora es un núcleo de Man5A de T. reesei o una región nuclear/bisagra de Man5A, o un CBD de Cel6A de T. reesei (A, A+B o A+B+B'), en donde A se refiere al dominio de unión a sustrato o cola; B se refiere a la región conectora (bisagra), y B' se refiere a una región conectora (bisagra) duplicada. Dichas secuencias de ADN codificantes del polipéptido portador preferentemente se combinan con un promotor de cel7A (cbh1). Resulta posible construir una multitud de otras combinaciones. La invención incluye, aunque sin limitación, los dominios siguientes: CBDs de Trichoderma de Cel6A (CBHII) y Ce15A (EGII) que incluye un dominio de CBD en su extremo N-terminal, xilanasa de Trichoderma (XYNI, XYNII) y CBDs de Trichoderma de Ce17A (CBHI), Ce17B (EGI), Ce161A (EGIV), Ce145 (EGV) y Ce174 (EGVI) que incluye un CBD en su extremo C-terminal. Las proteínas/polipéptidos de Aspergillus codificadas por glaA (glucoamilasa) y las proteínas/polipéptidos de Penicillium codificados por xynA (Alcocer et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:726-732, 2003) y las estructuras correspondientes procedentes de otros organismos.

Se encuentran algunas otras proteínas secretables de hongo filamentoso que presentan dominios aplicables entre los polipéptidos portadores descritos en Gouka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:1-11, 1997.

Entre las combinaciones más preferidas, se incluyen la región nuclear o nuclear/bisagra de Man5A como polipéptido portador, el conector Kex-2 (SEC ID nº 21) con o sin la secuencia adicional (SEC ID nº 22) que precede al conector Kex-2 y la forma truncada del polipéptido AM35, es decir AM24 (SEC ID nº 12).

Entre las combinaciones más preferidas, se incluyen además la región CBD de Ce16A (A, A+B o A+B+B') como polipéptido portador, el conector Kex-2 (SEC ID nº 21) con o sin la secuencia adicional (SEC ID nº 22) que precede al conector Kex-2 y la forma truncada del polipéptido AM35, es decir AM24 (SEC ID nº 12).

En la presente invención, la expresión "hongo filamentoso" se utiliza en varios contextos, incluyendo un organismo huésped y un organismo donante de secuencias reguladoras. Entre los hongos filamentosos preferentes se incluye cualquier hongo filamentoso transformable en el que pueda conseguirse la expresión, más preferentemente incluyen, aunque sin limitación, cepas de Trichoderma, Aspergillus y Penicillium. Son huéspedes y organismos donantes particularmente preferentes, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Penicillium sp., Humicola sp., incluyendo Humicola insolens, Chrysosporium sp., Fusarium sp., Hypocrea sp. y Emericella sp., etc.

La expresión "un nivel de producción incrementado" se refiere a que el nivel de producción de la forma truncada del enzima degradante de carbohidratos bacteriano es más alto que el nivel de producción del enzima de longitud completa en un constructo similar que de otra manera es idéntico, pero difiere en la longitud de la secuencia de ADN codificante del enzima bacteriano. Este incremento del nivel de producción se mide en este caso como un incremento de actividad (Tabla 4), debido a que el incremento de actividad en este caso es independiente de la actividad específica, tal como demuestran los resultados mostrados en la Tabla 1. Debe indicarse que el incremento de eficacia o del nivel de producción se mide como actividad de xilanasa del medio de cultivo de transformantes de una copia isogénicos o de células huésped que contienen únicamente una copia del constructo de ADN en cuestión. Además, la copia única isogénica se encuentra localizada en el mismo locus, por ejemplo en el locus cbh1. Por lo tanto, se excluye inequívocamente que el incremento del nivel de producción podría estar provocado por la introducción de múltiples copias del constructo de ADN o de diferencias en el sitio de integración. Los transformantes analizados difieren únicamente en que los constructos de ADN de la presente invención comprenden una secuencia de ADN acortada codificante de una forma truncada del enzima degradante de carbohidratos de longitud completa Nf xyn11A, mientras que el constructo de ADN de la técnica anterior comprende una secuencia de ADN codificante del enzima de longitud completa correspondiente. Los niveles de producción de acuerdo con lo anterior se basan en comparaciones no ambiguas.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención, se demuestra que el nivel de producción de un enzima degradante de carbohidratos (CD), particularmente el enzima bacteriano Nf xyn11A originado de Nonomuraea flexuosa, producido en un huésped Trichoderma reesei, puede incrementarse no sólo mediante estrategias de fusión tal como se describe en Paloheimo et al., Appl. Environ. Microb. 69:7073-7082, 2003, sino también mediante la utilización de secuencias de ADN truncado codificante de un Nf xyn11A truncado de secuencia SEC ID nº 12. Mediante la expresión de dichas secuencias de ADN acortadas, se incrementan los rendimientos del enzima degradante de carbohidratos truncado Nf xyn11A. La función, incluyendo la actividad específica del enzima truncado es igual o similar a la obtenida con el enzima de longitud completa correspondiente. Las preparaciones obtenidas con el procedimiento y los constructos de la presente invención resultan útiles en procedimientos industriales que requieren temperaturas y pHs elevados.

En los ejemplos siguientes se describe la invención en mayor detalle.

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Ejemplo 1

Procedimientos utilizados en el análisis y caracterización de proteínas (polipéptidos) a. Ensayos de proteínas y de enzimas

Las concentraciones de proteínas en el medio de cultivo y en las muestras purificadas de enzima se sometieron a ensayo tras la precipitación con TCA mediante el procedimiento de Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193:265-275, 1951) utilizando albúmina de suero bovino como proteína estándar. Durante las purificaciones enzimáticas, se realizó un seguimiento de las proteínas a 280 nm. Se sometió a ensayo la actividad de xilanasa mediante la utilización de xilano de abedul al 1% (p/v) (Roth nº 7500, Roth, Karlsruhe, Alemania) como sustrato en tampón de citrato-fosfato de McIlvaine 50 mM según el procedimiento de Bailey et al. (Enzyme Microb. Technol. 3:53-157, 1992). Durante la purificación de enzima y la determinación de la actividad específica de las proteínas puras, el ensayo se llevó a cabo a pH 7, 60ºC durante 5 minutos, o de otra manera tal como se indica en las leyendas de las figuras. Para la caracterización de los polipéptidos Xyn11A purificados, el tampón se suplementó con BSA al 0,1%, excepto por la determinación de la termoestabilidad, que se llevó a cabo sin BSA.

b. Electroforesis de proteínas

Las muestras se corrieron en geles "slab" de poliacrilamida al 12% que contenían SDS al 0,1% en un sistema de electroforesis Mini Protean II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Calif.) y se tiñeron con azul brillante de Coomassie R250. La detección de la xilanasa y de los polipéptidos xilanasa en los filtros de transferencia western se llevó a cabo con un anticuerpo policlonal de conejo cultivado contra la xilanasa Nf xyn11A purificada, preparada en Diabor Ltd. (Oulu, Finlandia) y el sistema Protoblot AP (Promega Corp., Madison, Wisc.).

c. Preparación y secuenciación de los péptidos

Las fracciones purificadas que contenían actividad de xilanasa se sometieron a digestión tríptica tal como se describe en Fagerström y Kalkkinen (Biotechnol. Appl. Biochem. 21:223-231, 1995). Se llevó a cabo la secuenciación mediante degradación Edman en un secuenciador de fase líquida pulsado con gases (Kalkkinen y Tilgmann, J. Protein Chem. 7:242-243, 1988) y los aminoácidos feniltiohidantoína se analizaron en línea mediante la utilización de HPLC en fase reversa en orificio estrecho. Para la secuenciación N-terminal, se transfirieron los geles de SDS-PAGE a un filtro de PVDF y las manchas de proteínas se sometieron directamente a degradación Edman tal como se ha indicado anteriormente. La secuenciación se llevó a cabo en el Institute of Biotechnology (Helsinki, Finlandia). Se determinaron los extremos C-terminales de los polipéptidos recombinantes purificados en el Protein Analysis Center en el Karolinska Institutet (Stockholm, Suecia).

d. Estimación del pI y determinación de la masa molecular

El pI de las xilanasas purificadas se estimó mediante cromatoenfoque en 4 ml de una columna Mono P HR 5/20 preempaquetada (Amersham Biosciences) equilibrada con Tris-CH_{3}COOH 75 mM (pH 9,5) y se eluyó con Polybuffer 96 al 10% (Amersham Biosciences) en Tris-CH_{3}COOH 75 mM (pH 6,3). Se midió el pH de la fracción que contenía actividad de xilanasa. Se determinaron las masas moleculares de las xilanasas purificadas mediante un espectrómetro de masas MALDI-TOF Bruker Biflex Reflector (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).

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Ejemplo 2

Técnicas de ADN utilizadas en la construcción de plásmidos y cepas

Se utilizaron procedimientos estándares de ADN (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989) para construir los plásmidos, para transformar E. coli y para llevar a cabo las transferencias southern. Se utilizó cada enzima y kit según las instrucciones del proveedor. Se obtuvieron los enzimas para las modificaciones del ADN de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania), New England Biolabs (Beverly, Mass.) y Finnzymes (Espoo, Finlandia). Se utilizaron columnas Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) o kits Miniprep Magic (Promega, Madison, Wisc.) en los aislamientos de plásmidos. Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando el sintetizador de ADN ABI 381A o se obtuvieron de Sigma-Genosys. Las reacciones de secuenciación se analizaron mediante la utilización del analizador genético ABI 373A o ABI Prism^{TM} 310 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Se llevaron a cabo reacciones en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un controlador térmico programable PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown, Mass.). Se aislaron fragmentos de ADN para la subclonación y las transformaciones a partir de geles de agarosa de bajo punto de fusión (BioWhittaker Molecular Applications Inc., Rockland, Maine) mediante el procedimiento con fenol de congelación-descongelación (Benson, BioTechniques 2:66-68, 1984), mediante la utilización de \beta-agarasa (New England Biolabs) o mediante la utilización del kit de extracción en gel Qiaex II (Qiagen GmbH).

Se aislaron los ADNs genómico tal como se describe en Raeder y Broda, Lett. Appl. Microbiol. 1:17-20, 1985. Se utilizaron casetes de expresión marcados con digoxigenina (Roche Diagnostics GmbH) como sondas en las hibridaciones en filtro southern.

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Ejemplo 3

Cepas microbianas utilizadas como huéspedes y en la construcción de plásmidos, medios de cultivo y condiciones de cultivo

Se propagaron plásmidos en Escherichia coli XL1-Blue o XL10-Gold (Stratagene, La Jolla, Calif.). Los esqueletos de vector utilizados en las construcciones de plásmido eran pUC18 (base de datos EMBL nº de acceso L09136), pUC19 (L09137), pBluescript SK- y pBluescript II KS^{+} o KS^{-} (Stratagene). Todos los cultivos de E. coli se llevaron a cabo durante la noche a 37ºC en medio Luria-Bertani en el que se había añadido ampicilina (50 \mug/ml).

Se utilizaron las cepas ALKO3620 y ALKO4468 de Trichoderma reesei como cepas parentales para las transformaciones. T. reesei ALKO3620 es un cepa negativa para endoglucanasa II. Se construyó a partir de la cepa mutante baja en proteasas ALKO2221 derivada de la cepa VTT-D-79125 (Bailey y Nevalainen, Enzyme Microb. Technol. 3:153-157, 1981) mediante mutagénesis con UV (Mäntylä et al., 2nd Eur. Conf. Fungal Genetics, abstr. B52, 1994) de la manera siguiente. Se sustituyó el gen de la endoglucanasa 2 (cel5A o egl2, originalmente denominado egl3; Saloheimo et al., Gene 63:11-21, 1988) por el gen marcador codificante de resistencia a la fleomicina procedente de Streptoalloteichus hindustanus, Sh ble (Drocourt et al., Nucleic Acids Res. 18:4009, 1990). Se utilizó el fragmento BglII-XbaI de 3,3 kb del plásmido pAN8-1 (Matheucci et al., Gene 8:103-106, 1995) que contenía el gen ble flanqueado por el promotor gpd de Aspergillus nidulans y el terminador trpC. Se aislaron las secuencias flanqueantes de cel5A en el casete de sustitución (siendo la región 5' el fragmento XhoI-SacI de 1,4 kb aproximadamente 2,2 kb cadena arriba del gen cel5A y la región 3' del fragmento AvrII-SmaI de 1,6 kb aproximadamente 0,2 kb desde el extremo del gen cel5A) a partir del clon egl3\lambda (Saloheimo et al., Gene 63:11-21, 1988). La estrategia para la sustitución fue la descrita en Suominen et al., Mol. Gen. Genet. 241:523-530, 1993. T. reesei ALKO4468 es una cepa negativa para endoglucanasas I y II. Se construyó a partir de la cepa ALKO3620 mediante la sustitución adicional del gen de la endoglucanasa 1, cel7B (egl1, Penttilä et al., Gene 45:253-263, 1986) por el gen de la higromicina B fosfotransferasa de E. coli, hph (Gritz et al., Gene 45:179-188, 1983), que proporciona resistencia a la higromicina B. Se utilizó el fragmento NotI-NsiI de 1,7 kb procedente del plásmido pRLM_{EX}30 (Mach et al., Curr. Genet. 25:567-570, 1994) en el que el gen hph se expresa a partir del promotor piruvato quinasa (pki) de T. reesei y la transcripción se terminó utilizando las secuencias de terminador de cel6A. El plásmido pRLM_{EX}30 fue amablemente proporcionado por el profesor Christian P. Kubicek (Institut für Biochemische Technologie, TU Wien, Austria). Las regiones flanqueantes de cel7B fueron las descritas en Suominen et al., Mol. Gen. Genet. 241:523-530, 1993). Las sustituciones de una copia de los genes cel5A y cel7B por los genes marcadores en T. reesei ALKO3620 y ALKO4468 se verificaron mediante análisis de transferencia southern tal como se describe en Suominen et al., Mol. Gen. Genet. 241:523-530,
1993).

Se esporularon las cepas de T. reesei en agar-PD inclinado (caldo patata-dextrosa, Difco, Detroit, Mis.). Los transformantes se seleccionaron en medio mínimo de Trichoderma que contenía acetamida como fuente de nitrógeno (Penttilä et al., Gene 61:155-164, 1987). Se obtuvieron los micelos fúngicos para los aislamientos de ADN tras cultivar las cepas durante dos días en medio mínimo de Trichoderma que contenía peptona proteasa al 2% (Difco). Se utilizaron medios complejos inductores de celulasa basados en lactosa (Joutsjoki et al., Curr. Genet. 24:223-228, 1993) para la producción de enzimas en matraces de agitación y en fermentaciones. Los transformantes se cribaron utilizando cultivos de 50 ml y los micelios para los aislamientos de ARN se recogió a partir de cultivos de 200 ml. Los cultivos en matraz de agitación se cultivaron durante 7 días a 30ºC, 250 rpm. Los cultivos en fermentador a escala de laboratorio se llevaron a cabo durante 5 días en fermentadores Braun Biostat M de 1 litro (B. Braun).

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Ejemplo 4

Cultivo de Nonomuraea flexuosa para la producción de enzimas

Se cultivo Nonomuraea flexuosa DSM43186 (ATCC nº 35864) en placas de medio mineral de copos de avena (medio nº 84, catálogo de cepas del Deutsche Sammlung von Microorganismen und Cellkulturen GmbH, 1983) a 50ºC. Se inoculó una colonia esporulante en medio XPYB, el medio GPYB (Greiner-Mei et al., Syst. Appl. Microbiol. 9:97-109, 1987) suplementado con xilano de avena espelta al 0,5% (Sigma X-0627, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Mo.) en lugar de glucosa, tal como se describe en Holtz et al. (Antonie Leeuwenhoek 59:1-7, 1991) y se incubó en un matraz de agitación durante 2 ó 3 días (250 rpm, 50 a 55ºC), después de lo cual se utilizó el cultivo en matraz de cultivo como cultivo seminal para la fermentación. Se llevaron a cabo en fermentadores a escala de laboratorio durante 3 días a 50ºC en fermentadores Braun Biostat M de 1 litro (B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Alemania) en el medio indicado anteriormente.

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Ejemplo 5

Producción heteróloga de la xilanasa AM35 termoestable de Nonomuraea flexuosa en Trichoderma

El gen codificante para la xilanasa Nf xyn11A (AM35) (am35 o Nf xyn11A; nº de acceso de EMBL AJ508952) se aisló a partir de una biblioteca ZAP Express® de lambda preparada a partir de ADN cromosómico de Actinomadura (Nonomuraea) flexuosa DSM43186 (ATCC nº 35864) parcialmente digerido (Sau3\Lambda) y fraccionado según tamaño tal como se describe en la patente US nº 6.300.113. La secuencia de nucleótidos del gen y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la fig. 1.

Se construyó la cepa transformante ALKO4396 de T. reesei productora de Nf xyn11A recombinante mediante la transformación del casete de expresión pALK945 (Fig. 3) a T. reesei ALKO3620. El gen am35 se expresa a partir del promotor cbh1 en forma de una fusión con un polipéptido portador codificado por la secuencia nuclear/bisagra de man5A. La construcción del plásmido pALK945 y la cepa se llevaron a cabo tal como se describe en Paloheimo et al., Appl. Environ. Microbiol. 69:7073-7082, 2003).

Se esporuló la cepa transformante ALKO4396 de T. reesei en agar-caldo patata-dextrosa (PD) inclinado (Difco, Detroit, Mis.) a 30ºC. Para la producción de enzima en un fermentador a escala de laboratorio, se utilizó el medio complejo inductor de celulasa basado en lactosa (Joutsjoki et al., Curr. Genet. 24:223-228, 1993). Las fermentaciones se llevaron a cabo durante 5 días en fermentadores Braun Biostat M de 1 litro.

Además de la proteína de longitud completa, se observó que el medio de cultivo de T. reesei ALKO4396 recombinante, en un filtro western, contenía formas más cortas de Xn11A y cantidades reducidas de proteína de fusión Man5A-Xyn11A no procesada (fig. 4A).

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Ejemplo 6

Purificación de Xyn11A de N. flexuosa y los polipéptidos Xyn11A recombinantes

La purificación de la xilanasa Nf xyn11A nativa a partir del medio de cultivo de N. flexuosa DSM43186 y las xilanasas Xyn11A recombinantes de T. reesei ALKO4396 se llevó a cabo mediante la combinación de la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y la filtración en gel, de la manera siguiente. El medio de cultivo de fermentadores de 1 litro se centrifugó a 8.000xg durante 30 minutos a 4ºC. Se ajustó el pH del sobrenadante a 9,1 con NaOH 1 M y se diluyó con agua destilada (hasta una conductividad de 4 mS/cm). Esta muestra se aplicó a un intercambiador iónico DEAE Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) (columna SR, 5x15,5 cm de diámetro, 300 ml) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 20 mM (pH 9,1) utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) (Amersham Biosciences) a 4ºC. El caudal era de 20 ml/minuto. La columna se lavó con 400 ml de Na_{2}HPO_{4} 20 mM (pH 9,1).

Las proteínas del eludo se recogieron en fracciones de 100 ml. La elución de las proteínas unidas de la columna de DEAE se consiguió mediante un gradiente lineal entre Na_{2}HPO_{4} 20 mM (pH 9,1) y Na_{2}HPO_{4} 20 mM (pH 9,1) que contenía NaCl 0,5 M a un caudal de 20 ml/minuto durante 30 minutos, se recogieron fracciones de 5 ml. Finalmente, la columna se lavó con 300 ml de Na_{2}HPO_{4} 20 mM (pH 9,1) que contenía NaCl 0,5 M. Las fracciones se analizaron para la actividad de xilanasa y se evaluó la pureza de las proteínas mediante SDS-PAGE y transferencias western.

Las fracciones eluidas que contenían actividad de xilanasa se agruparon (hasta 500-600 ml) y se ajustaron para que contuviesen NaCl 2 M y se aplicaron a una columna de fenil-sefarosa Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) (columna XR50/30, 5x11 cm, 215 ml) equilibrada con NaH_{2}PO_{4} 40 mM (pH 9,1) que contenía NaCl 2 M. Tras lavar con 400 ml de Na_{2}HPO_{4} 40 mM (pH 9,1) que contenía NaCl 2 M, se llevó a cabo la elución a un caudal de 20 ml/minuto con un gradiente en dos etapas. En primer lugar, se separaron las proteínas utilizando un gradiente lineal (400 ml) de concentración decreciente de NaCl (2 a 0 M) en NaH_{2}PO_{4} 40 mM (pH 9,1). Tras lavar con 200 ml de Na_{2}HPO_{4} 40 mM (pH 9,1), las proteínas se eluyeron con un gradiente creciente (600 ml) de etilenglicol al 0-60% en Na_{2}HPO_{4} 40 mM (pH 9,1). Finalmente, la columna se lavó con 200 ml de etilenglicol al 60% en Na_{2}HPO_{4} 40 mM (pH 9,1). Se recogieron fracciones de 10 ml y se analizaron para la actividad de xilanasa y la pureza.

Se concentraron las fracciones agrupadas de la HIC que contenían xilanasas de diferentes masas moleculares en una unidad de ultrafiltración Amicon (Millipore Corp., Billerica, Mass.) con membrana Diaflo® (PM10 62 mm 10 PK), valor de corte: 10 kDa. La muestra concentrada (10 ml) se sometió a cromatografía de exclusión en gel en una columna de grado preparativo HiLoad 26/60 Superdex 75 (2,6x61 cm, 320 ml) equilibrada con Na_{2}HPO_{4} 40 mM (pH 9,1) que contenía NaCl 0,1 M. Se llevó a cabo la elución con 400 ml de Na_{2}HPO_{4} 40 mM (pH 9,1) que contenía NaCl 0,1 M. Se analizaron fracciones de 6 ml para la pureza de la actividad de xilanasa.

Con el medio de cultivo de N. flexuosa, se encontró aproximadamente la mitad de la actividad de xilanasa cargada en la columna DEAE-sefarosa FF en el eluido, y la mitad se encontraba unida a la columna de DEAE. Con el medio de cultivo de T. reesei, la actividad de xilanasa se encontraba en el eluido. La mayor parte de las proteías nativas de T. reesei, por ejemplo las celulasas y la región nuclear/bisagra de mananasa utilizada como una pareja de fusión se encontraban unidos a la columna de DEAE.

Las fracciones de eluido que contenían actividad de xilanasa se agruparon para el análisis de HIC. Tras la columna de fenil-sefarosa 6 FF, se separaron tres formas diferentes de xilanasa Xyn11A recombinante (fig. 4B). La forma de 37 kDa (en el SDS-PAGE, carril 3) correspondía a la Nf xyn11A nativa purificada a partir del medio de cultivo de N. flexuosa. Las formas más cortas presentaban masas moleculares de 30 kDa (carril 4) y de 27 kDa (carril 5) en el SDS-PAGE. Estas formas más cortas eluyeron de la columna de fenil-sefarosa 6 FF con NaCl 0 M, en primer lugar la forma de 30 kDa y la forma de 27 kDa en fracciones posteriores. El polipéptido de 37 kDa eluyó a una concentración de etilenglicol de 15% a 30%. La xilanasa de 30 kDa se purificó adicionalmente utilizando la filtración en gel Superdex 75.

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Ejemplo 7

Caracterización de la Xyn11A nativa y los polipéptidos Xyn11A recombinantes

Las características de la Nf xyn11A nativa y los tres polipéptidos Xyn11A recombinantes se presentan en la Tabla 1. Las masas moleculares estimadas a partir del SDS-PAGE fueron significativamente más altas que las deducidas de la secuencia de aminoácidos o determinadas mediante el análisis de la proteína con el espectrómetro de masas. La masa molecular de la Nf xyn11A nativa se determinó que era 32.857 Da, correspondiente al peso molecular calculado (32.876 Da) del enzima maduro. Representa la proteína de longitud completa, consistente del dominio catalítico y el CBM separado por la región conectora. La masa molecular de Xyn11A de longitud completa recombinante era de 33.429 Da, que es 572 Da más alta que la de la Nf xyn11A nativa y 553 Da más alta que el valor calculado. Las masas moleculares de los polipéptidos de 30 kDa y de 27 kDa se determinó que eran de 23.769 Da y 21.974 Da, respectivamente. Los polipéptidos Xyn11A recombinantes se denominaron polipéptidos r33,4 kDa, r23,8 kDa y r22,0 kDa (Tabla 1) basándose en sus masas moleculares en la espectrometría de masas. El extremo N-terminal de los cuatro polipéptidos era DTTITQ (SEC ID nº 20), lo que sugiere un procesamiento diferente del extremo C-terminal en los polipéptidos r23,8 kDa y r22,0 kDa. Los sitios de procesamiento C-terminal se muestran en la fig. 1.

Las actividades específicas de los polipéptidos Nf xyn11A y de Xyn11A recombinante eran similares en el sustrato de xilano de abedul (15.568 a 17.367 nkat/mg) (Tabla 1). Además, los pIs de las proteínas de longitud completa, Nf xyn11A y el polipéptido r33,4 kDa eran muy similares (8,5 frente a 8,6), aunque ambos diferían del valor calculado a partir de la secuencia de aminoácidos (7,9). Los pIs de los polipéptidos r23,8 kDa y r22,0 kDa sin los CBMs eran inferiores a los de los enzimas de longitud completa (7,6 y 8,2 frente a 8,5-8,6).

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Ejemplo 8

Dependencias de la temperatura y del pH de las xilanasas Xyn11A purificadas

Se determinaron los óptimos de pH y de temperatura para la actividad de xilanasa mediante la incubación de las muestras de Xyn11A a diferentes valores de pH (pH 5 a 8) a temperaturas de entre 60ºC y 80ºC durante 60 minutos. Tanto a pH 5 (fig. 5A) como a pH 6 (datos no mostrados), la actividad máxima se alcanzó a 80ºC, y a un pH de 7 a 70ºC (fig. 5B). A todos los pH, la Nf xyn11A nativa fue la más termofílica. Lo anterior se observó especialmente a pH 8, en el que el óptimo para Nf xyn11A se encontraba a 70ºC, y para los polipéptidos Xyn11A recombinantes, a 60ºC (fig. 5C). Se determinó la termoestabilidad de los enzimas en ausencia de BSA. A 70ºC, no se observó reducción de la actividad enzimática incluso tras varias horas de incubación. A 80ºC, la reducción dependía del pH y de la forma del enzima. A pH 5, los polipéptidos r22,0 kDa y r23,8 kDa eran más estables (vidas medias de 123 minutos y 157 minutos) que los polipéptidos Xyn11A de longitud completa, r33,4 kDa y Nf xyn11A (vidas medias de 13 minutos y 32 minutos) (fig. 6, Tabla 1). Los enzimas se comportan de manera similar también a pH 7, aunque las vidas medias eran más cortas, 63 a 95 minutos para los polipéptidos r22.0 kDa y r23.8 kDa, y 17 a 31 minutos para los enzimas de longitud completa.

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Ejemplo 9

Experimentos de blanqueo utilizando las formas Xyn11A purificadas

El medio de cultivo de N. flexuosa, la Xyn11A nativa purificada y los polipéptidos Xyn11A recombinantes producidos en T. reesei se sometieron a ensayo en un blanqueo con peróxido en una sola etapa utilizando pulpa kraft de madera blanda finlandesa delignificada con oxígeno (brillo inicial: 34% ISO, número kappa: 20 y contenido de materia seca: 29,9%) a 100 nkat/g de materia seca de pulpa, el sobrenadante de N. flexuosa también era de 50 nkat/ml). Los enzimas purificados se suplementaron con medio de cultivo de T. reesei para estabilizar los enzimas. La cantidad de medio de cultivo correspondía a la proporción entre la actividad de termoxilanasa y el contenido total de proteínas en el medio de cultivo de T. reesei recombinante original utilizado para las purificaciones de enzimas. Tras estas adiciones, las mezclas resultan similares a las preparaciones de enzimas que debían utilizarse para las aplicaciones industriales reales. Los tratamientos de las pulpas se llevaron a cabo a una consistencia del 3% a 80ºC y pH de 8 durante una hora. La pulpa de referencia se trató de manera similar, sin adición de enzima. Tras los tratamientos de enzimas, las pulpas se lavaron con agua destilada. Se llevó a cabo la quelación mediante la adición de EDTA hasta el 0,2% de la materia seca y se llevó a cabo a una consistencia de 3,0% a pH 5 durante una hora. Se blanqueó la pulpa a una consistencia de la misma de 10% a 80ºC durante tres horas (H_{2}O_{2} al 3%, NaOH al 3%, ácido dietilentriamina-pentaacético al 0,2%, MgSO_{4} al 0,5% en volumen), después de lo cual la pulpa se acidificó con H_{2}SO_{4}, se lavó con agua destilada y se fabricaron hojas de papel de prueba con la misma.

Los azúcares reductores en la pulpa quelada se analizaron mediante el procedimiento del ácido dinitrosalicílico. La calidad de las pulpas blanqueadas y lavadas se analizó mediante la determinación del número kappa según el procedimiento de ensayo TAPPI T 236 y la viscosidad según el procedimiento escandinavo SCAN28. El brillo de los pañuelos se analizó según ISO 2470. Se determinó el consumo de peróxido mediante titulación.

En el experimento de blanqueo con peróxido en una sola etapa llevado a cabo con el medio de cultivo de N. flexuosa, la extracción de la lignina (0,7 a 1,1 unidades kappa dependiente de la dosis de enzima) y el incremento del brillo (1,0 a 1,1 unidades ISO) se obtuvieron sin reducción de la resistencia de la pulpa determinada por la viscosidad (Tabla 2). El medio de cultivo de T. reesei incrementó el brillo en 0,9 unidades ISO. Se obtuvo un incremento adicional de 1,1 a 1,6 unidades ISO con los polipéptidos Xyn11A recombinantes purificados, r33,4 kDa, r23,8 kDa y r22,0 kDa, siendo el polipéptido r22,0 kDa el menos eficiente (Tabla 2).

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Ejemplo 10

Construcción de los casetes de expresión para la producción heteróloga de Nf xyn11A (AM35) y Nf xyn11A truncada (AM24) en T. reesei

Para la producción de Nf xyn11A (AM35) y Nf xyn11A truncado (AM24) en T. reesei, se construyeron varios casetes de expresión que incluían una secuencia de señal fúngica o la secuencia de señal fúngica y un polipéptido portador variable para dichas dos proteínas. Se expresaron los genes am35/am35* (ver posteriormente) y am24/am24* (ver posteriormente) a partir del promotor de cel7A de T. reesei. Los casetes de expresión construidos se listan en la Tabla 3 y se muestra su estructura general en la fig. 6. La Tabla 3 también incluye la otra información relevante sobre los constructos. El promotor, terminador de transcripción y secuencias 3' flanqueantes fueron las indicadas en Karhunen et al., Mol. Gen. Genet. 241:515-522, 1993. El gen codificante para acetamidasa (amdS) se utilizó como marcador en las transformaciones. El gen amdS se aisló de p3SR2 (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:75-479, 1985). Se ligó un fragmento SpeI-XbaI de 3,1 kb entre el terminador de cel7A y la región 3' flanqueante. Además de dichos dos genes, am35 y am24, con el uso nativo de los codones, se realizaron los 9 cambios siguientes en los codones en algunos de los constructos (ver la Tabla 3) para que los codones fuesen más favorables para T. reesei: Gly_{53} GGG por GGC, Ala_{66} GCC por GCC, Gly_{68} GGG por GGc, Arg_{85} CGG por CGC, Gly_{88} GGG por GGC, Gly_{100} GGA por GGC, Arg101 CGG por CGC, Arg_{102} CGG por CGC, y Val_{104} GTG por GTC. Los genes, incluyendo los cambios indicados anteriormente, se denominaron am35* y am24*. Los cambios no modificaron la secuencia de aminoácidos codificada por los genes, en comparación con am35 y am24.

Al producir la Xyn11A de longitud completa de N.flexuosa, los genes am35 y am35* se incluyeron en los casetes de expresión en forma de un fragmento de 1,3 kb que terminaba en el sitio MluI aproximadamente 250 pbs después del codón de parada, o en forma de una fusión exacta de am35 con el terminador cbh1. Los genes acortados, am24 y am24* terminaban en el nucleótido 1.091 (fig. 1) y se fusionaron exactamente con el terminador cbh1, incluyendo el codón de parada. Todos los genes se fusionaron entre la secuencia codificante de la Asp_{44} N-terminal (desde el nucleótido 432, fig. 1) hasta la secuencia de señal de man5A (pALK1118 y pALK1276, nucleótidos 1 a 57 de man5A) o a una secuencia codificante de un polipéptido portador. Las secuencias del polipéptido portador incluían la secuencia codificante de núcleo/bisagra de man5A (pALK1022, pALK1309, pALK1131 y pALK1692, 1 a 1.359), la secuencia codificante de un fragmento del núcleo de man5A (pALK1264, pALK1151 y pALK1154, 1 a 681) y el CBD/bisagra de cel6A (bloques A y B en pALK1285 y pALK1502, 1 a 306). Para la secuencia de man5A, ver St\ring{a}lbrand et al., Appl. Environ. Microbiol. 61:1090-1097, 1995). Para la secuencia de cel6A, (ver Teeri et al., Gene 51:43-52, 1987). Se incluyó una secuencia sintética codificante del dipéptido Lys-Arg, una diana de una proteína de tipo Kex2 (Calmels et al., J. Biotechnol. 17:51-66, 1991) se incluyó en los conectores de todos los constructos, incluyendo la proteína portadora (no en los constructos de secuencia de señal pALK1118 y pALK1276). Además, los conectores de pALK1264, pALK1151 y pALK1154 se encontraban precedidas por una secuencia codificante de los aminoácidos Gly-Gln-Cys-Gly-Gly (SEC ID nº 22). Esta secuencia adicional se incluyó para incrementar la longitud del conector entre este portador no intacto y la xilanasa recombinante. Una secuencia idéntica, natural en el polipéptido Man5A, precede a la secuencia de la xilanasa en pALK1022.

Se sintetizaron mediante PCR fusiones exactas entre el promotor de cel7A y las secuencias de señal, portador, conector, las secuencias de xyn11A y el terminador. Se introdujo un sitio de reconocimiento NruI (TCGCGA (SEC ID nº 24)) en el conector Kex2 (codificado por una secuencia CGC GAC AAG CGC (SEC ID nº 25)) para facilitar la construcción de las fusiones. Se seleccionó el codón CGC para la argininas en el conector y el tercer nucleótido del codón nativo que precede al conector se cambió por T, en caso necesario. Las modificaciones realizadas no cambiaron los aminoácidos codificados por los constructos.

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Ejemplo 11

Transformación de Trichoderma y análisis de los transformantes

Se transformaron protoplastos de T. reesei con casetes de expresión lineales aislados del esqueleto del vector mediante EcoRI. Los casetes de expresión se transformaron en T. reesei cepa ALK03620 (Ce15A-) y/o en ALKO4468 (Ce15A^{-}, Ce17B^{-}), ver la Tabla 4. Las transformaciones se llevaron a cabo tal como en Penttilä et al. (Gene 61:155-164, 1987) con las modificaciones indicadas en Karhunen et al. (Mol. Gen. Genet. 241:515-522, 1993). Los transformantes se purificaron en placas de selección mediante conidios únicos antes de esporularlas sobre PD. Se cribó el direccionamiento al locus cel7A como fenotipo negativo para Cel7A utilizando el sistema de transferencia de puntos Minifold I-SRC 96 (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). El anticuerpo monoclonal CI-258 o CI-261 (Aho et al., Eur. J. Biochem. 200:643-649, 1991) se utilizó en la detección de la proteína Ce17A mediante el sistema ProtoBlot Western blot AP (Promega). Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron mediante la utilización de transferencias southern en las que se incluyeron varios digeridos genómicos y se utilizaron los casetes de expresión respectivos como sondas. Se seleccionaron las cepas que contenían una sustitución de cel7A por una copia del casete de expresión para estudios posteriores.

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Ejemplo 12

Producción de las xilanasas AM35 y AM24 por parte de transformantes de T. reesei de una sola copia

Anteriormente los presentes inventores han demostrado (Paloheimo et al., App. Environ. Microbiol. 69:7073-7082, 2003) que, al utilizar un polipéptido portador con una estructura de dominio intacta, se obtuvo un nivel de producción más alto de AM35 en T. reesei en comparación con los constructos sin un portador o con un portador de estructura de dominio no intacta. Además, las proteínas AM35 recombinantes presentaban la misma termoestabilidad que la actividad de xilanasas en el sobrenadante de cultivo de N. flexuosa. Las actividades de xilanasas eran estables durante por lo menos dos horas a 70ºC, pH 7. También se observó que los sobrenadantes de cultivo incrementaban el brillo de la pulpa en el blanqueo con peróxido a escala de laboratorio de pulpa kraft a temperatura y pH elevados de la misma manera que el sobrenadante de cultivo de N. flexuosa.

Los casetes de expresión contenían el gen am35/am35* codificante de Xyn11A de longitud completa o una versión acortada de la misma, am24/am24* codificante de la proteína Xyn11A truncada. Ambas estas proteínas fueron producidas utilizando tres polipéptidos portadores diferentes y también sin un polipéptido portador (únicamente se incluyó una secuencia de señal fúngica). Los portadores presentaban una estructura de dominio intacta, tal como en núcleo/bisagra de Man5A de CBD/bisagra de Cel6A o una estructura de dominio no intacta, tal como el fragmento núcleo/bisagra de Man5A.

Los casetes de expresión mostrados en la Tabla 3 (fig. 6) se aislaron a partir de los plásmidos de expresión y se transformaron en T. reesei ALKO3620 y/o ALKO4468. Los transformantes que contenían la sustitución de una copia del gen cel7A por los casetes de expresión se cribaron para el análisis posterior. Varias cepas paralelas de una copia de cada constructo eran similares en términos de niveles de actividad de proteína y de xilanasa analizados en los sobrenadantes de cultivo de cultivos en matraz de agitación. Se seleccionó un representante de una copia de cada constructo para su cultivo en un fermentador. Los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en fermentador se analizaron para la cantidad de proteína y las actividades de xilanasa (Tabla 4).

Los resultados de los cultivos en fermentador (Tabla 4) demostraron que las mejores actividades de xilanasa se obtenían de los transformantes de T. reesei que incluían los constructos en los que se utilizaron los genes acortados, am24 o am24*. El incremento de actividad de xilanasa se observó con todos los portadores sometidos a ensayo y también en el caso de que no se incluyese ninguna proteína portadora (por ejemplo RF5024 vs. RF5724, RF5725 vs. ALKO4405, RF5139 vs. RF5013, RF4861 vs. ALKO4823). Los cambios realizados en los codones no presentaron ningún efecto sobre el nivel de producción de xilanasa (ALKO4405 vs. RF5510 y RF4861 vs. RF4878). Además, se obtuvieron niveles similares de actividad del transformante con el constructo en el que se fusionó exactamente el gen de xilanasas con la secuencia de terminador, en comparación con el transformante que incluía el constructo en el que se encontraba una fusión no exacta del gen de xilanasa con el terminador (RF5745 vs. ALKO4405). Este nivel similar de actividad se obtuvo aunque, por un motivo desconocido, el nivel de proteínas totales en el sobrenadante de cultivo de RF5745 que incluía una fusión exacta de terminador era inferior a la del transformante correspondiente con una fusión no exacta de terminador. Ambas cepas de huésped T. reesei utilizados, transformados con el mismo casete de expresión, produjeron una cantidad similar de actividad (RF5725 vs. ALKO4812).

Debido a que las actividades específicas de las proteínas AM35 y AM24 son muy similares entre sí (Tabla 1, r33,4 y r23,8 kDa), puede concluirse que el acortamiento del gen de xilanasa de Nonomuraea incrementa el nivel de producción de la xilanasa en T. reesei. En el caso de que se utilizasen portadores con una estructura de dominio intacta (núcleo/bisagra de Man5A y CBD/bisagra de Cel6A), los niveles de actividad de xilanasa medidos en los sobrenadantes de cultivo eran más de tres veces superiores para los constructos en los que se producía AM24, en comparación con los constructos correspondientes para AM35. Para los constructos en los que no se había incluido ningún polipéptido portador o el portador era un fragmento de Man5A (estructura de dominio no intacta), el incremento de actividad de xilanasa en el sobrenadante de cultivo era incluso más alto, de entre más de 5 y más de 10 veces. De esta manera, incluso sin portador o mediante la utilización de portador que presentaba una estructura no óptima, el rendimiento de la xilanasa bacteriana pudo incrementarse hasta un nivel inesperadamente alto al expresar un gen de xilanasa acortado en T. reesei.

Los incrementos de los niveles de actividad de xilanasas también se observaron en los cultivos en matraz de agitación. En el caso de que no se utilizase polipéptido portador, el incremento de actividad de xilanasa (RF5024 comparado con RF5724) era aproximadamente 2,8 veces y alcanzó 4.900 nkat/ml. En el caso de que se utilizase núcleo/bisagra de Man5A como portador (RF5725 comparado con ALKO4405, el incremento de actividad era aproximadamente de 2,7 veces (RF5725 produjo aproximadamente 21.000 nkat/ml). Mediante la utilización del portador CBD de Cel6A (RF5139 vs. RF5013), el incremento de actividad fue incluso más alto, aproximadamente de 5,6 veces. Este elevado incremento se debió al nivel más bajo de actividad en los matraces de agitación de las cepas productoras de AM35 con el polipéptido portador CBD de Cel6A (por ejemplo RF5013 produjo aproximadamente 3.000 nkat/ml, y la actividad de los cultivos de RF5139 fue de aproximadamente 16.800 nkat/ml).

La fig. 8 muestra que el producto xilanasa AM24 de un transformante de T. reesei (se utilizó el portador CBD de Cel6A). Además de la proteína que presentaba la masa molecular esperada, también puede detectarse una forma xilanasa que presenta una masa molecular más baja (correspondiente a r22,0 kDa) en el sobrenadante de cultivo. Esta forma se debe a un corte proteolítico de la proteína AM24.

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Ejemplo 13

Utilización de los sobrenadantes de cultivo de T. reesei que contenían la xilanasa Nf xyn11A (AM24) truncada recombinante en el blanqueo

Se sometieron a ensayo sobrenadantes de cultivo de un transformante de T. reesei productor de la proteína Xyn11A truncada recombinante (AM24) en el blanqueo de pulpa kraft (abedul y pino escandinavos). Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 5 y 6. Pudo obtenerse el mismo brillo con un consumo más bajo de ClO_{2} en ambos experimentos de blanqueo al utilizar AM24 en comparación con el blanqueo de referencia sin un tratamiento con la preparación de xilanasa.

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Ejemplo 14

Utilización de sobrenadantes de cultivo de T. reesei que contenían la xilanasa AM24 recombinante en aplicaciones alimentarias

Se llevaron a cabo dos experimentos de alimentación con pollos utilizando la preparación de xilanasa AM24. Los resultados de los ensayos demostraron un buen efecto de AM24 sobre las aves de corral. El peso corporal en la dieta basada en trigo-cebada se incrementó, en comparación con las aves de control no suplementadas, en 3,4%, y en alimento de trigo y haba de soja, en 3,1% a 3,7%. Además, se incrementó significativamente la digestibilidad de los nutrientes según medición del índice de conversión del alimento. La preparación de xilanasa AM24 era por lo menos tan efectiva como XYNII de T. reesei (XYLII), utilizada durante años en nutrición animal. La ventaja de la xilanasa AM24 es la elevada estabilidad frente al calor en comparación con, por ejemplo, T. reesei XYNII (XYLII), que es una gran mejora para varios procedimientos de producción alimentaria.

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Ejemplo 15

Producción de NfXyn10A (AM50) y dos formas truncadas de NfXyn10A en T. reesei

El gen codificante de la xilanasa NfXyn10A (AM50) (am50 o Nfxyn10A; nº de acceso de EMBL AJ508953) se aisló de una biblioteca ZAP Express® de lambda preparado a partir de ADN cromosómico de Actinomadura (Nonomuraea) flexuosa DSM43186 (ATCC nº 35864) parcialmente digerido (Sau3A) y fraccionado por tamaño, tal como se describe en la patente US nº 6.300.113. La secuencia de nucleótidos del gen y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la fig. 2. Se construyeron tres casetes de expresión (fig. 9) para la producción de la proteína AM50 de longitud completa (aminoácidos A_{45}-A_{492} de la fig. 2) y dos formas truncadas a partir de la misma, el núcleo (A_{45}-N_{345}) y el núcleo/conector que carecía de los tres subdominios o los subdominios \gamma y \beta de la cola. Las masas moleculares estimadas de los diferentes polipéptidos serían (desde A_{45} N-terminal, sin ningún grupo sacárido añadido): núcleo de 34,0 kDa, núcleo-conector de 35,9 kDa, subdominio \alpha de núcleo-conector de la cola: 40,6 kDa, núcleo-conector-subdominios \alpha+\beta de la cola: 44,8 kDa, núcleo-conector-subdominios \alpha+\beta+\gamma de la cola (proteína madura de longitud completa): 49,1 kDa. Se utilizaron los procedimientos de biología molecular estándares, reacciones de PCR e hibridación de oligonucleótidos para preparar fusiones exactas entre diferentes secuencias codificantes del promotor cbh1, la secuencia de señal de cel6A y la secuencia codificante del CBD de Cel6A (A+B), sitio Kex2 (RDKR), secuencia codificante de Nfxyn10A (núcleo o núcleo/bisagra o la proteína de longitud completa) y el terminador cbh1. Los sitios de restricción al final y al inicio de los fragmentos que deben fusionarse se incluyen en los oligonucleótidos para permitir la fácil construcción de las fusiones. Finalmente, el gen marcador amdS y la región 3' flanqueante de cbh1 se incluyen al igual que en los constructos preparados para expresar los genes am35/am24. Los casetes de expresión se aíslan del esqueleto del vector utilizando digestión con EcoRI y se transforman en la cepa huésped de T. reesei. Se utilizan los mismos procedimientos para la transformación, manipulación y selección de los transformantes, que para la construcción de las cepas productoras de Nf xyn11A; los transformantes se purifican mediante conidios únicos y se criban en cultivos en matraz de agitación mediante la medición de la actividad de xilanasa en los sobrenadantes de cultivo. Los transformantes de una sola copia en los que el casete de expresión sustituye el locus cbh1 se seleccionan basándose en los resultados de nivel de producción de xilanasa y el análisis de transferencia southern de los genomas. Se muestra la producción incrementada de xilanasa de las cepas productoras de las formas truncadas de la proteína NfXyn10A, en comparación con las cepas productoras de NfXyn10A de longitud completa mediante la utilización de ensayos de actividad, SDS-PAGE y procedimientos de transferencia western.

El sobrenadante o sobrenadantes de cultivo se utilizan en los ensayos de aplicación, tanto para el blanqueo de la pulpa kraft como para las aplicaciones alimentarias, para demostrar el efecto de la xilanasa o xilanasas.

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TABLA 1 Características de Nf xyn11A purificado y los polipéptidos Xyn11A recombinantes

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1

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TABLA 2 Blanqueo con peróxido utilizando el medio de cultivo de N. flexuosa y los polipéptidos Xyn11A recombinantes purificados

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2

TABLA 3 Constructos utilizados para expresar el gen am35/am35* de N. flexuosa y el gen am35/am35* acortado (am24/am24*)

3

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TABLA 4 Producción de xilanasa a partir de transformantes de Trichoderma reesei de una sola copia en fermentaciones a escala de laboratorio

4

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TABLA 5 Termoxilanasa en el blanqueo de pulpa kraft industrial de abedul

La secuencia utilizada fue X/D-EO-D, el número kappa de la pulpa kraft de abedul original utilizada (de hojas de prueba) era de 14,4 y el brillo era de 44,1%. La actividad de la preparación de enzimas utilizada era de 187.000 nkat/ml (medida a pH 7, 70ºC utilizando un tiempo de reacción de 5 minutos). ND=no determinado. Todos los valores de pH se midieron en la suspensión de pulpa a la temperatura de reacción. Las muestras de pulpa se acidificaron a pH 4,5 con SO_{2}-agua antes de la preparación de las hojas para eliminar los compuestos químicos residuales. Las propiedades de la pulpa se analizaron según los procedimientos ISO estándares, brillo: ISO 2470 (hoja de pulpa partida), número kappa: ISO 302. tp=tonelada de pulpa. aCl=cloro activo.

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5

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TABLA 5 (continuación)

6

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TABLA 6 Termoxilanasa en blanqueo de pulpa kraft de madera blanda

Se utilizó la secuencia X/D-E-D-E-D. El número kappa de la pulpa original era de 28,9 (de la hoja de prueba), brillo de 28,2% y viscosidad de 1.180 ml/g. La actividad de la preparación de enzima utilizada era de 187.000 nkat/ml (medida a pH 7, 70ºC, tiempo de reacción de 5 minutos). ND=no realizado. Todos los valores de pH se midieron en la suspensión de pulpa a la temperatura de reacción. Las muestras de pulpa se acidificaron hasta pH 4,5 con SO2-agua antes de la preparación de la hoja de prueba para eliminar los compuestos químicos residuales. Las propiedades de la pulpa se analizaron según los procedimientos ISO estándares: brillo: ISO 2470 (hoja de pulpa partida), número kappa: ISO 302, viscosidad: ISO 5351/1, tp=tonelada de pulpa, aCl=cloro activo.

7

TABLA 6 (continuación)

8

<110> AB Enzimes Oy

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<120> Procedimiento y constructos de ADN destinados a incrementar el nivel de producción de enzimas degradantes de carbohidratos en hongos filamentosos

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<130> A3834PC EP

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<150> US 06/562.692

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<151> 2004-04-16

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<150> FI 20040551

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<151> 2004-04-16

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<150> PCT/Fl 2005/050123

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<151> 2005-04-15

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<160> 25

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 1375

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> Secuencia de nucleótidos de Nf xyn11A (AJ508952), estando comprendida la región codificante entre nt 303 y nt 1337

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<222> (1)..(1375)

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<400> 1

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9

10

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<210> 2

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<211> 906

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> am35, región codificante de Nf xyn11A para la proteína Nf Xyn11A (AM35) madura

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<222> (1)..(906)

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<400> 2

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11

12

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<210> 3

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<211> 663

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> am24, forma acortada de am35, incluye un codón de PARADA

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<222> (1)..(663)

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<400> 3

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13

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<210> 4

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<211> 906

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> am35*, al igual que am35 aunque se han modificado 9 codones en la secuencia (Ejemplo 10) (los cambios no alteran la secuencia de aminoácidos codificada)

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<222> (1)..(906)

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<400> 4

14

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<210> 5

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<211> 663

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> arr24*, al igual que arr24 pero se han modificado 9 codones en la secuencia al igual que am35* (Ejemplo 10)

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<222> (1)..(663)

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<400> 5

15

16

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<210> 6

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<211> 1864

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Secuencia de nucleótidos de Nf xyn10A (AJ508953), estando comprendida la región codificante entre nt 194 y nt 1672

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<222> (1)..(1864)

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<400> 6

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17

18

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<210> 7

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<211> 1347

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> am50, región codificante de Nf xyn10A para la proteína Nf Xyn10A (AM50)

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<222> (1)..(1347)

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<400> 7

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19

20

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<210> 8

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<211> 972

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Secuencia codificante del núcleo de AM50 y de las regiones conectoras, incluye un codón de PARADA

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<222> (1)..(972)

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<400> 8

21

22

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<210> 9

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<211> 906

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Secuencia codificante de la región del núcleo de AM50, incluye un codón de PARADA

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<222> (1)..(906)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 344

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> Secuencia de aminoácidos de Nf Xyn11A (AJ508952) codificada por el gen de Nf xyn11A

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<222> (1)..(344)

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<400> 10

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24

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 301

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> r33. 4 kDa = AM35 = proteína Nf Xyn11A madura de longitud completa, codificada por los genes am35 y am35*

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<222> (1)..(301)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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26

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 220

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> AM24, forma truncada de AM35, codificada por los genes am24 y am24*

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(220)

\newpage

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<400> 12

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28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 217

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> r 23. 8 kDa, forma truncada de AM35

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<222> (1)..(217)

\newpage

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<400> 13

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29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 193

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> r 22. 0 kDa, forma truncada de AM35

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<222> (1)..(193)

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<400> 14

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30

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<210> 15

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<211> 492

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Nf Xyn10A, la secuencia de aminoácidos (AJ508953) codificada por el gen de Nf xyn10A

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<222> (1)..(492)

\newpage

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<400> 15

31

32

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<210> 16

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<211> 448

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> AM50, Nf Xyn10A madura de longitud completa

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<222> (1)..(448)

\newpage

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<400> 16

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 17

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<211> 323

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> núcleo de AM50 + conector, forma truncada de AM50

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<222> (1)..(323)

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<400> 17

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35

36

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<210> 18

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<211> 301

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> núcleo de AM50, forma truncada de AN50

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<222> (1)..(301)

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<400> 18

37

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 406

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> núcleo de AM50 + conector + dominios alfa/beta de la cola

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<222> (1)..(406)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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39

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 366

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> núcleo de AM50 + conector + dominio alfa de la cola

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(366)

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<400> 20

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41

42

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> Secuencia conectora sintética codificante de cada señal Lys-Arg de corte de proteasa de tipo Kex2- incluida en todos los constructos para garantizar el corte de la proteína de fusión

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<222> (1)..(4)

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<400> 21

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\hskip1cm

43

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<210> 22

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> Secuencia adicional que precede al sitio Kex2 en el casete de expresión pALK1264, pALK1131 y pALK1134

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<222> (1)..(5)

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<400> 22

\hskip1cm

44

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<210> 23

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> Secuencia N-terminal de los polipéptidos Nf Xyn11A maduros y Xyn11 A recombinantes, denominado r 33.4 kDa, r 23.8 kDa y r 22.0 kDa

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<222> (1)..(6)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

45

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<210> 24

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<211> 6

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> Sitio de reconocimiento Nr ul introducido en un conector Kex2

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<222> (1)..(6)

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<400> 24

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcgcga

\hfill

6

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

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<211> 12

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<212> ADN

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<213> Nonomuraea flexuosa

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<220>

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<221> Conector Kex2 que facilita la construcción de fusiones

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<222> (1)..(12)

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<400> 25

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgacaagc gc

\hfill

12

Claims (14)

1. Procedimiento de ADN recombinante para la obtención en un huésped hongo filamentoso de un nivel de producción más alto de enzima termoestable degradante de xilano de Nonomureae flexuosa Nf xyn11A, que en su estado de longitud completa original presenta una estructura constituida por un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidratos (CMB) separado por una región conectora, caracterizado porque un constructo de ADN, que comprende unas secuencias reguladoras derivadas de hongos filamentosos y una secuencia de ADN acortada codificante de una forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A de longitud completa, cuya forma truncada es la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 12 y contiene la región catalíticamente activa de CAT, pero no presenta parte del CBM, se introduce en un huésped hongo filamentoso y se permite que se exprese y secrete dicho enzima Nf xyn11A truncado bajo el control de dichas secuencias reguladoras derivadas de hongo filamentoso, que incluyen una secuencia promotora, una secuencia de señal con o sin una secuencia portadora, y una secuencia de terminador derivada de un hongo filamentoso.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las secuencias de ADN codificantes del polipéptido portador se derivan de hongos filamentosos y codifican regiones o dominios seleccionados de un enzima degradante de carbohidratos secretable.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la secuencia de ADN codifica la región nuclear o nuclear/bisagra del polipéptido portador Man5A, o el dominio de unión a carbohidrato (CBD) de Cel6A constituido por una región A, A+B o A+B+B', siendo A un dominio de unión a carbohidrato, siendo B una región bisagra y siendo B' una región bisagra duplicada.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las secuencias de promotor comprenden promotores de Trichoderma o de Aspergillus.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el promotor de Trichoderma es el promotor de cel7A (cbhl).

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el nivel de producción más alto obtenido con dicho constructo de ADN codificante de la forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A medido como un incremento de actividad de transformantes de una sola copia es más alto que el nivel de producción obtenido con otro constructo de ADN correspondiente, que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa correspondiente.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el nivel de producción más alto alcanzado con el constructo de ADN codificante de la forma truncada del enzima Nf xyn11A es por lo menos 2 veces más alto que el nivel de producción alcanzado con otro constructo de ADN correspondiente, que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa correspondiente.

8. Constructo de ADN para la obtención en un huésped hongo filamentoso de un nivel de producción más alto de enzima termoestable Nf xyn11A degradante de xilano de Nonomuraea flexuosa que presenta en su estado de longitud completa original un módulo catalítico (CAT) y un módulo de unión a carbohidrato (CBM) separado por una región conectora, caracterizado porque dicho constructo de ADN comprende unas secuencias reguladoras derivadas de hongo filamentoso, incluyendo un promotor, una secuencia de señal con o sin una secuencia portadora, y una secuencia de terminador y una secuencia de ADN acortada codificante de una forma truncada de dicho enzima Nf xyn11A de longitud completa, cuya forma truncada es la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 12 y contiene la región catalítica activa de CAT, pero no presenta parte del CBM.

9. Constructo de ADN según la reivindicación 8, en el que las secuencias de ADN codificantes del polipéptido portador son secuencias de ADN derivadas de los mismos o diferentes hongos filamentosos y codifican regiones o dominios seleccionados de un enzima degradante de carbohidratos secretable.

10. Constructo de ADN según la reivindicación 9, en el que la secuencia de ADN codifica la región nuclear o nuclear/bisagra del polipéptido portador, o CBD de Cel6A que consiste en una región A, A+B o A+B+B', siendo A un dominio de unión a carbohidrato, siendo B un dominio bisagra y siendo B' un dominio bisagra duplicado.

11. Constructo de ADN según la reivindicación 8, en el que las secuencias de promotor comprenden promotores de Trichoderma o de Aspergillus.

12. Constructo de ADN según la reivindicación 11, en el que el promotor de Trichoderma es el promotor de cel7A (cbh1).

13. Constructo de ADN según la reivindicación 8, en el que el nivel de producción de dicho constructo de ADN codificante del enzima Nf xyn11A truncado medido como un incremento de actividad a partir del transformante de una sola copia es más alto que el nivel de producción obtenido con otro constructo de ADN correspondiente que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa correspondiente.

14. Constructo de ADN según la reivindicación 13, en el que el nivel de producción más alto alcanzado con dicho constructo de ADN codificante de la forma truncada del enzima Nf xyn11A es por lo menos dos veces más alto que el nivel de producción alcanzado con otro constructo de ADN correspondiente, que es idéntico a dicho constructo de ADN excepto en que comprende una secuencia de ADN codificante del enzima Nf xyn11A de longitud completa.