ES2262197T3 - Endoglucanasa. - Google Patents

Endoglucanasa.

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ES2262197T3
ES2262197T3 ES97948752T ES97948752T ES2262197T3 ES 2262197 T3 ES2262197 T3 ES 2262197T3 ES 97948752 T ES97948752 T ES 97948752T ES 97948752 T ES97948752 T ES 97948752T ES 2262197 T3 ES2262197 T3 ES 2262197T3
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Martin Schulein
Mads Eskelund Bjoernvad
Iben Angelica Noerrevang
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Novozymes AS
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Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PREPARADO DE ENZIMA QUE COMPRENDE UNA ENDO - 1,4 - BE - GLUCANASA QUE TIENE UNA ACTIVI DAD OPTIMA A UNA TEMPERATURA DE MAS DE 85 GRADOS C QUE ES ENDOGENA A UNA CEPA QUE PERTENECE A LA BACTERIA FILUM GRAM POSITIVO (POR EJEMPLO CEPA DICTYOGLOMUS SP., DSM 6262, O QUE TIENE UNA ACTIVIDAD HACIA LA CARBOXIMETILCELULOSA (PRUEBA CMC) A 70 GRADOS C Y UN PH 10 QUE ES MAS ELEVADO QUE EL 50% CON RELACION A LA ACTIVIDAD A 70 GRADOS C Y AL PH OPTIMO; Y UN PRODUCTO DE SINTESIS DE ADN QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA ENDO - 1, 4 - BE - GLUCANASA; LA ENZIMA ES UTIL, POR EJEMPLO, EN LA INDUSTRIA TEXTIL PARA MEJORAR LAS PROPIEDADES DE LAS FIBRAS O DE LOS TEJIDOS CELULOSICOS O PARA DAR LA APARIENCIA LAVADA A LA PIEDRA DE DENIM O EN PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA INDUSTRIAL O EN MATERIAL POLIMERICO DE EXTRUSION EN CALIENTE O EN LA CONVERSION DE BIOMASA A AZUCARES; O EN LA PRODUCCION DE ALCOHOL O PARA LA PREDIGESTION DE, POR EJEMPLO, GRANOS QUE SE UTILIZAN EN LA PRODUCCION DE ALIMENTOS PARA ANIMALES, O EN LA PRODUCCION DE CAFE INSTANTANEO Y OTROS PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCION SIMILARES.

Description

Endoglucanasa.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una enzima con actividad celulolítica a temperatura alta, especialmente una endoglucanasa; una secuencia de ADN clonada que codifica la enzima con actividad celulolítica; un método para proporcionar un gen que codifica tal enzima; un método para producir la enzima; una composición enzimática que comprende la enzima con actividad celulolítica; y el uso de dicha enzima y composición enzimática para varias aplicaciones industriales.
Antecedentes de la invención
Las celulasas o enzimas celulolíticas son enzimas implicadas en la hidrólisis de la celulosa. En la hidrólisis de la celulosa nativa, es sabido que hay tres tipos más importantes de enzimas de celulasa implicadas, es decir celobiohidrolasa (1,4-beta-D-glucan celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91), endo-beta-1,4-glucanasa (endo-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4) y beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21).
Especialmente las endoglucanasas (EC Nº. 3.2.1.4) constituyen un grupo interesante de hidrolasas para los usos industriales mencionados. Las endoglucanasas catalizan la endohidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa e hidroxi etilcelulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mezclados tales como beta-D-glucanos de cereales o xiloglucanos y otra materia vegetal que contiene partes celulósicas. El nombre autorizado es glucan endo-1,4-beta-D-glucan 4-glucano hidrolasa, pero se usa el término abreviado endoglucanasa en la presente descripción. Se puede hacer referencia a T.-M. Enveri, "Microbial Cellulases" en W.M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, p. 183-224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Vol. 160, pág. 200-391 (editado por Wood, W.A. y Kellogg, S.T.); Béguin, P., "Molecular Biology of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Vol. 44, págs. 219-248; Béguin, P. y Aubert, J-P., "The biological degradation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) p.25-58; Henrissat, B., "Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Vol. 1, págs. 169-196.
Las celulasas son sintetizadas por un gran número de microorganismos que incluyen hongos, actinomicetos, mixobacterias y bacterias reales pero también por plantas. Especialmente se han identificado las endoglucanasas de una amplia variedad de especificidades. Se han descrito muchas endoglucanasas bacterianas (Henrissat, B. y Bairoch, A. (1993) Biochem J. 293:781-788; Gilbert, H.J. and Hazlewood, G.P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139:187-194).
La subdivisión Clostridia es un grupo muy diverso de bacterias anaeróbicas que comprenden géneros fisiológicamente muy diferentes. Previamente, el género Clostridium fue considerado un género que incluía todas las bacterias anaeróbicas formadoras de endoesporas. No obstante la introducción de herramientas taxonómicas moleculares tales como la secuenciación del ADNr 16S han revelado que el grupo es heterogéneo a un nivel de género muy superior. Además, varios géneros de anaeróbicas no formadoras de esporas fueron clasificados dentro de las Clostridia, que resultaron como un grupo taxonómico superior, una subdivisión. Esto está de acuerdo con los hábitats muy diversificados para estos organismos. La subdivisión Clostridia, por ejemplo, comprende especies con una temperatura de crecimiento óptima de una gama muy amplia.
El género Dictyoglomus comprende bacterias anaeróbicas termófilas extremas filogenéticamente situadas dentro de la subdivisión Clostridia. Dictyoglomus spp. están entre los organismos más termofílicos dentro de la subdivisión Clostridia. En el árbol filogenético del ADNr 16S, se producen Dictyoglomus con otros géneros termofílicos tales como Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium y Syntrophomonas como familia más cercana. No obstante, los Dictyoglomus forman una rama profunda que confirma que los Dictyoglomus de hecho deberían ser considerados como un género separado.
La cepa B1 de Dictyoglomus sp. fue aislada de un residuo y una muestra de pulpa de un tanque de enfriamiento de masa pulposa, es decir de un entorno termofílico artificial. Una xilanasa de este organismo ha sido descrita con respecto de la temperatura óptima (alrededor de 90ºC). La producción de xilanasa de esta cepa ha sido sometida a estudios para la optimización de la fermentación. Nunca se informó de la presencia de endoglucanasa de especies del género Dictyoglomus. Dentro de las celulasas del tipo filum clostridia han sido descritas de diferentes especies algunas de las cuales son termofílicas. En pocos casos la termostabilidad de las endoglucanasas ha sido determinada, una de las especies más estudiadas es Clostridium thermocellum que ha sido probado estable hasta 80ºC. Thermoanaerobacter cellulyticus produce al menos dos endoglucanasas con estabilidad hasta 80ºC. También una cepa de Thermotoga maritima demostró producir dos betaglucanasas termoestables (Liebl et al.(1996), Microbiol. Immunol. 142: 2533-2542).
Se puede hacer referencia a: Hudson et al. (1991) The cellulase activity of an extreme thermophile, Appl. Microbiol. Biotechnol. 35:270-273; Mathrani and Ahring (1991) Isolation and characterization of strictly xylan-degrading Dictyoglomus from man-made thermophilic environment, Arch. Microbiol. 157:13-17; Adamsen et al. (1995) Optimization of extracellular xylanase production by Dictyoglomus sp B1 in continuous-culture, Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:327-332; Maidak et al. (1994) The Ribosomal Database Project, Nuc. Acids Res. 22:3485-3487; Honda et al. (1987) Cloning and expression in E.coli of a Thermoanaerobacter cellulyticus gene encoding for heatstable beta-glucanase, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25:480-483; Honda et al. (1988) Isolation of a new cellulase gene from a thermophilic anaerobe and its expression in E. coli, Appl. Microbiol. Biotechnol. 29:264-268.
Un uso industrial muy importante de las enzimas celulolíticas es el uso para el tratamiento de telas o tejidos celulósicos, p. ej. como ingredientes en composiciones detergentes o composiciones suavizantes para tejidos, para biopulir una tela nueva (acabado de prendas), y para obtener un aspecto "lavado a la piedra" de tejidos con celulosa, especialmente en la tela vaquera, y se han propuesto diferentes métodos para este tipo de tratamiento, p. ej. en GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 and EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, WO 95/24471 y WO 95/26398. Otro uso industrial importante de las enzimas celulíticas es el uso para el tratamiento de la pasta de papel, p. ej. para mejorar el drenaje o para el desentintado del papel reciclado.
Es también sabido que las celulasas pueden o no tener un dominio de unión a celulosa (un CBD). El CBD realza la unión de la enzima a una fibra con celulosa y aumenta la eficacia de la parte activa catalítica de la enzima.
Hay una necesidad de suministrar preparaciones enzimáticas de celulasas factibles económicamente que puedan ser usadas para aplicaciones donde sea deseable una actividad celulasa, preferiblemente endoglucanasa, a altas temperaturas.
El objetivo de la presente invención es el de proporcionar composiciones enzimáticas nuevas o enzimas recombinantes con actividad celulolítica sustancial a condiciones de alta temperatura y rendimiento mejorado en aplicaciones industriales, p. ej. en el tratamiento de la pasta de papel, tratamiento textil, procesos de lavandería, procesos de extracción o en piensos.
Resumen de la invención
Los inventores han tenido ahora éxito en la clonación y caracterización de una secuencia de ADN del género bacteriano Dictyoglomus que codifica una enzima que expone actividad celulolítica a temperaturas extremadamente altas en un margen de pH muy amplio, de ese modo permitiendo preparar una composición enzimática celulolítica monocomponente con las propiedades deseadas.
En consecuencia, en un primer aspecto, la invención se refiere a una preparación enzimática que tiene actividad de endoglucanasa con actividad óptima a una temperatura superior a 85ºC, preferiblemente superior a 90ºC, más preferiblemente superior 95ºC, especialmente superior a 100ºC.
En su segundo aspecto, la invención se refiere a una preparación enzimática con actividad endoglucanasa hacia la carboximetilcelulosa (ensayo CMC) a 70ºC y pH 10 superior al 50%, preferiblemente superior al 55%, más preferiblemente superior al 60%, más preferiblemente superior al 65%, especialmente superior al 70%, con respecto a la actividad a 70ºC y pH óptimo. En su tercer aspecto, la invención se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima con actividad endoglucanasa y actividad óptima por encima de 85ºC, preferiblemente por encima de 90ºC, más preferiblemente por encima de 100ºC, secuencia de ADN que comprende
a) la secuencia de ADN correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia coli, o
b) un análogo de la secuencia de ADN correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia coli, el cual
i) es homólogo, preferiblemente al menos un 70% homólogo, con la secuencia de ADN correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia coli, o
ii) se hibridiza con la misma sonda de oligonucleótidos que la secuencia de ADN correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia coli, o
iii) codifica un polipéptido que es homólogo, preferiblemente al menos un 70% homólogo, con el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia coli.
En su cuarto, quinto y sexto aspecto la invención proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN clonada de la invención, una célula que comprende la secuencia de ADN donada o el vector de expresión y un método para producir una enzima que expone actividad celulolítica, dicho método comprende el cultivo de la célula bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
En otro aspecto la invención proporciona una enzima aislada que muestra actividad celulolítica, caracterizada por (i) estar libre de impurezas homólogas y (ii) la enzima es producida por el método anteriormente descrito.
La invención además se refiere a una enzima aislada que tiene actividad celulolítica, preferiblemente una endoglucanasa, que es codificada por el constructo de ADN de la invención.
Además, la presente invención se refiere al uso de esta enzima o a la preparación enzimática de la invención para aplicaciones industriales como en la industria textil para mejorar las propiedades de las fibras o tejidos celulósicos o para proporcionar un aspecto lavado a la piedra en la tela vaquera; o en procesos de limpieza industrial; o material polimérico extrudido caliente; o en la conversión de biomasa en azúcares; o en la producción de alcoholes; o para la predigestión de p. ej. granos usados en la producción de alimentos; o en la producción de café instantáneo o procesos de extracción similares.
La invención también se refiere a un cultivo biológico substancialmente puro aislado de la cepa DSM 11201 de Escherichia coli que comprende una secuencia de ADN de codificación de celulasa, o cualquier mutante de dicha cepa de E.coli.
Descripción detallada de la invención
En este contexto la frase "los 20 residuos aminoácidos de origen natural" se refiere a los 20 residuos aminoácidos normalmente encontrados en las proteínas y conocidos de forma convencional como alanina (Ala o A), valina (Val o V), leucina (Leu o L), isoleucina (Ile o 1), prolina (Pro o P), fenilalanina (Phe o F), triptófano (Trp o W), metionina (Met o M), glicina (Gly o G), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), cisteína (Cys o C), tirosina (Tyr o Y), asparraguina (Asn o N), glutamina (Gln o Q), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), lisina (Lys o K), arginina (Arg o R), y histidina (His o H). La enzima y la preparación enzimática de la invención es activa en un margen de pH amplio, preferiblemente activa a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11, preferiblemente entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 10.
En una forma de realización preferida, la enzima o la preparación enzimática de la invención es obtenible de o endógena a una cepa perteneciente a las filum Bacterias Gram Positivas, más preferiblemente la cepa perteneciente a la subdivisión Clostridia, incluso más preferiblemente perteneciente al género Dictyoglomus.
En este contexto la expresión "una secuencia de ADN clonada", bien parcial o completa, se refiere a una secuencia de ADN clonada por el procedimiento de clonación estándar usado en ingeniería genética para recolocar un segmento de ADN desde su ubicación natural a un sitio diferente donde será reproducido. El proceso de donación implica la escisión y aislamiento del segmento de ADN deseado, inserción del trozo de ADN en la molécula del vector e incorporación del vector recombinante en una célula donde se replicarán múltiples copias o clones del segmento de ADN.
La "secuencia de ADN clonada" de la invención puede de forma alternativa ser denominada "constructo de ADN" o "secuencia de ADN aislada".
La secuencia de ADN puede ser de origen genómico, ADNc, o sintético o cualquier combinación de éstos.
La parte de codificación de celulasa de la secuencia de ADN donada en el plásmido pSJ1678 presente en DSM 11201 de Escherichia coli y/o una secuencia de ADN análoga de la invención puede ser clonada de una cepa del género bacteriano Dictyoglomus, preferiblemente la cepa de Dictyoglomus, DSM 6262, que produce la enzima con actividad celulasa, preferiblemente endoglucanasa, u otro organismo o un organismo relacionado como se describe más abajo.
De forma alternativa, la secuencia análoga puede ser construida basándose en la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia coli, p. ej. puede ser una secuencia sustituta de ésta, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no den lugar a otra secuencia de aminoácidos de la celulasa codificada por la secuencia de ADN, pero que se corresponda con el uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente (es decir una variante de la celulasa de la invención).
Cuando se realizan sustituciones de nucleótidos, los cambios en los aminoácidos son preferiblemente de una naturaleza inferior, es decir sustituciones de aminoácidos conservadoras que no influyen significativamente en el pliegue o la actividad enzimática de la proteína, eliminaciones pequeñas, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal, un péptido de enlace pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina), aminoácidos acídicos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina y asparraguina), aminoácidos hidrofóbicos (tales como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y pequeños aminoácidos (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina). Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, ver p. ej. Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95-107.
Será evidente para los expertos en la técnica que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula y además resultarán en un polipéptido activo. Los aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificada por la secuencia de ADN clonada de la invención, y en consecuencia preferiblemente no sometida a sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis sito dirigida o mutagénesis de barrido de alanina (ver. p. ej. Cunningham and Wells, (1989), Science 244, 1081-1085). En esta técnica las mutaciones son introducidas en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas por su actividad biológica (es decir celulolítica) para identificar residuos aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción enzima-sustrato pueden también ser determinados por análisis de la estructura cristalina como está determinado por tales técnicas como el análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (ver p. ej. de Vos et al., (1992), Science 255, 306-312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett. 309, 59-64).
La endoglucanasa codificada por la secuencia de ADN del constructo de ADN de la invención puede comprender un dominio de unión a celulosa (CBD) existente como una parte íntegra de la enzima codificada, o se puede introducir un CBD de otro origen en la endoglucanasa creando así un híbrido enzimático. En este contexto, el término "dominio de unión a celulolosa" se destina a ser entendido tal y como está definido por Peter Tomme et al. "Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" en "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición clasifica más de 120 dominios de enlace de celulosa en 10 familias (I-X), y demuestra que los CBDs se encuentran en varias enzimas tales como las celulasas, xilanasas, mananasas, arabinofuranosidasas, acetil esterasas y quitinasas. Los CBDs también han sido encontrados en algas, p. ej. el alga rojo Porphyra purpurea como una proteína de unión a polisacáridos no hidrolítica, ver Tomme et al., op.cit. No obstante, la mayor parte de los CBDs son de celulasas y xilanasas, los CBDs se encuentran en los terminales N y C de las proteínas o son internos. Los híbridos enzimáticos son conocidos en la técnica, ver p. ej. WO 90/00609 y WO 95/16782, y pueden ser preparados mediante la transformación en una célula huésped de un constructo de ADN que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio de unión a celulosa ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa y haciendo crecer la célula huésped para expresar el gen fundido. Los híbridos enzimáticos pueden ser descritos por la fórmula
siguiente:
CBD-MR-X
donde CBD es la región N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente al menos al dominio de unión a celulosa; MR es la región media (el enlazador), y puede ser un enlace, o un grupo de unión corto preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 40 átomos de carbono; o es preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 aminoácidos, más preferiblemente de 2 a 40 aminoácidos; y X es una región N-terminal o C-terminal de un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de la invención.
La secuencia de ADN de la presente invención puede ser clonada de la cepa DSM 11201 de Escherichia coli usando métodos estándar p. ej. como se describe por Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY.
La secuencia de ADN de la invención puede también ser clonada por cualquier método general que implique
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donación, en vectores adecuados, un banco de ADN de cualquier organismo, p. ej. Dictyoglomus, supuesto para producir la endoglucanasa de interés,
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transformación de células huéspedes adecuadas con dichos vectores,
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cultivo de las células huéspedes bajo condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés codificado por un clon en el banco de ADN,
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selección de clones positivos determinando cualquier actividad celulolítica de la enzima producida por tales clones, y
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aislamiento del ADN que codifica la enzima de tales clones.
De forma alternativa, el ADN que codifica una celulasa de la invención puede, conforme a procedimientos bien conocidos, convenientemente ser donado a partir de una fuente adecuada, tal como cualquiera de los organismos abajo mencionados, usando sondas de oligonucleótidos sintéticas preparadas basándose en la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia coli,
Homología de secuencias de ADN
La homología de la secuencia de ADN a la que se ha hecho referencia arriba está determinada como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia desde la segunda. La homología puede de manera adecuada ser determinada mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). El uso de GAP con los ajustes siguientes para la comparación de la secuencia de ADN: penalización de creación de espacios de 5.0 y penalización de extensión de espacios de 0.3, la secuencia de ADN (parcial) muestra un grado de identidad de al menos el 60%, preferiblemente de al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 97% con la secuencia de ADN correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia coli.
Hibridación
La hibridación a la que se ha hecho referencia arriba se destina a indicar que la secuencia de ADN (parcial) análoga se hibridiza a una sonda de oligonucleótidos correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia coli bajo condiciones específicas determinadas que están descritas con detalle abajo.
Las condiciones adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga implica el prerremojo del filtro conteniendo los fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 x SSC (citrato de solución salina estándar) durante 10 min, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 X SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x solución de Denhardt's (Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989), seguido de hibridación en la misma solución conteniendo una sonda cebada aleatoriamente (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), marcada en ^{32}P-DCTP (actividad específica > 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% de SDS a preferiblemente no más de 55ºC, más preferiblemente no más de 60ºC, más preferiblemente no más de 65ºC, incluso más preferiblemente no más de 70ºC, especialmente no más de 75ºC.
Las moléculas a las que la sonda de oligonucleótidos hibridiza bajo estas condiciones son detectadas usando una película de rayos x.
Homología a secuencias de aminoácidos
La homología del polipéptido al que se ha hecho referencia arriba está determinada como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia desde la segunda. La homología puede de manera adecuada ser determinada mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443- 453 Usando GAP con los ajustes siguientes para la comparación de la secuencia polipeptídica: penalización de creación de espacios de 3.0 y penalización de extensión de espacios de 0.1, el polipéptido codificado por una secuencia de ADN (parcial) análoga muestra un grado de identidad de al menos el 60%, preferiblemente de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, especialmente al menos el 97% con el polipéptido codificado por la parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia coli.
Reactividad cruzada inmunológica
Los anticuerpos para ser usados para determinar la reactividad cruzada inmunológica pueden ser preparados usando una enzima celulolítica purificada. Más específicamente, el antisuero contra la endoglucanasa de la invención puede ser aumentado inmunizando conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente págs. 27-31). Las inmunoglobulinas purificadas pueden ser obtenidas de los antisueros, por ejemplo por precipitación de sales ((NH_{4})_{2} SO_{4}), seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de las proteínas puede hacerse bien por análisis de doble difusión de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., Capítulo 2).
Fuentes microbianas
La taxonomía aplicada a continuación es conforme a Maidak et al. 1996 (The Ribosomal Database Project. Nucl. Acids Res. 24:82-85).
Para el objetivo de la presente invención los términos "obtenido de" u "obtenible de" como se utiliza en este caso en relación con una fuente específica, significa que la enzima es producida o puede ser producida por la fuente específica, o por una célula donde un gen de la fuente ha sido insertado.
Está actualmente contemplado que la celulasa de la invención puede ser obtenida de una bacteria, en particular unas Bacterias gram positivas, preferiblemente de la subdivisión Clostridia, en particular una cepa del género Dictyoglomus. Está actualmente contemplado que una secuencia de ADN que codifica unos homólogos enzimáticos a la enzima de la invención puede ser obtenida a partir de otras cepas bacterianas, especialmente cepas del género Dictyoglomus.
Un aislamiento de una cepa de Dictyoglomus sp. del cual puede derivar una celulasa de la invención está públicamente disponible por Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, DSM 6262.
Además, el plásmido pSJ1678 que comprende la secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa de la invención ha sido transformado en una cepa de la Escherichia coli que fue depositada por los inventores según el Tratado de Budapest en la Reconocimiento Internacional del Depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, República federal de Alemania, el 11 Octubre 1996 bajo el número de deposición DSM 11201.
Vectores de expresión recombinantes
Un vector recombinante que comprende un constructo de ADN que codifica la enzima de la invención puede ser cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector a menudo dependerá de la célula huésped en la que se debe introducir. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirse en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped en parte o en su totalidad y se replica con el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de expresión donde la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención está operativamente enlazada a segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de expresión está derivado del ADN plásmido o vírico, o puede contener elementos de ambos. Los términos, "enlazado operativamente" indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionen en concierto para sus objetivos previstos, p. ej. la transcripción se inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica para la enzima.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede derivar de proteínas que codifican genes bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en células huéspedes bacterianas incluyen el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus Stearothermophilus, el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de proteasa alcalina de Bacillus subtilis, o el gen de xilosidasa de Bacillus pumilus, o los promotores P_{R} o P_{L} del fago Lambda o los promotores lac, trp o tac de E. coli.
La secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención puede también, en caso de necesidad, estar operativamente conectado a un terminador adecuado.
El vector recombinante de la invención puede además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión.
El vector puede también comprender un marcador seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, o un gen que codifica la resistencia a p. ej. antibióticos tipo canamicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, espectinomicina, o similares, o resistencia a metales pesados o herbicidas.
Para dirigir una enzima de la presente invención en la vía secretora de las células huéspedes, una secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en el vector recombinante. La secuencia señal secretora está unida a la secuencia de ADN que codifica la enzima en el marco de lectura correcto. Las secuencias señal secretoras están normalmente situadas en 5' de la secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia señal secretora puede ser aquella normalmente asociada con la enzima o puede ser de un gen que codifica otra proteína segregada.
Los procedimientos usados para ligar las secuencias de ADN que codifican para la presente enzima, el promotor y opcionalmente el terminador y/o secuencia señal secretora, respectivamente, o para ensamblar estas secuencias por esquemas de amplificación por PCR adecuados, y para insertarlas en vectores adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación o integración, son conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., op.cit.).
Células huéspedes
La secuencia de ADN que codifica la presente enzima introducida en la célula huésped puede ser bien homóloga o heteróloga al huésped en cuestión. Si fuera homóloga a la célula huésped, es decir producida por la célula huésped de forma natural, normalmente será conectada de forma operativa a otra secuencia del promotor o, en su caso, otra secuencia señal secretora y/o secuencia de terminación distinta de su entorno natural. El término "heteróloga" se destina a incluir una secuencia de ADN que codifica una enzima nativa al organismo huésped en cuestión. El término "heteróloga" se destina a incluir una secuencia de ADN no expresada por la célula huésped en la naturaleza. Así, la secuencia de ADN puede ser de otro organismo, o puede ser una secuencia sintética.
La célula huésped en la cual el constructo de ADN o el vector recombinante de la invención es introducido puede ser cualquier célula que sea capaz de producir la presente enzima e incluye bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas más grandes. Una célula huésped preferida incluye células fúngicas procariotas, arqueales y filamentosas.
Ejemplos de células huéspedes fúngicas que, en cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son células de hongos filamentosos tales como como cepas de cualquiera de los géneros Aspergillus, Fusarium y Trichoderma, más específicamente las cepas de las especies Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminerarum y Trichoderma reesei.
Ejemplos de células huéspedes bacterianas que, en cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son bacterias gram-positivas tales como cepas de Bacillus, tales como cepas de B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. liquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium o B. thuringiensis, o cepas de Streptomyces, tales como S. lividans o S. murinus, o bacterias gram-negativas tales como Escherichia coli. La transformación de las bacterias puede ser efectuada por transformación de los protoplastos, electroporación, conjugación, o usando células competentes de modo conocido per se (ver Sambrook et al., supra).
Al expresar la enzima en bacterias tales como E. coli, la enzima puede ser retenida en el citoplasma, normalmente como gránulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión), o pueden ser dirigidos al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En ése caso, las células son lisadas y los gránulos son recuperados y desnaturalizados tras lo cual la enzima es replegada diluyendo el agente desnaturalizante. En este caso, la enzima puede ser recuperada del espacio periplásmico interrumpiendo las células, p. ej. por sonicación o impacto osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperando la enzima.
Al expresar la enzima en bacterias gram-positivas tales como cepas de Bacillus o Streptomyces, la enzima puede ser retenida en el citoplasma, o puede ser dirigida al medio extracelular por una secuencia de secreción bacteriana. En este caso, la enzima puede ser recuperada del medio como se describe abajo.
Método para producir una enzima celulolítica
La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada según la invención, donde una célula huésped adecuada, que ha sido transformada con una secuencia de ADN que codifica la enzima, está cultivada bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es recuperada del cultivo.
Tal y como se define aquí, un polipéptido aislado (p. ej. una enzima) es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos, p. ej., al menos aproximadamente el 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente el 40% de pureza, más preferiblemente aproximadamente el 60%, incluso más preferiblemente aproximadamente el 80% de pureza, más preferiblemente aproximadamente el 90% de pureza, e incluso más preferiblemente aproximadamente el 95% de pureza, según se determina por SDS-PAGE.
Los términos "polipéptido aislado" puede de forma alternativa ser denominado "polipéptido purificado".
Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima es transformado en una célula huésped heteróloga es posible permitir la producción recombinante heteróloga de la enzima de la invención.
De ese modo es posible hacer una composición celulolítica altamente purificada o monocomponente, caracterizada por estar libre de impurezas homólogas.
En este contexto impurezas homólogas significa cualquier impureza (p. ej. otros polipéptidos distintos de la enzima de la invención) que se originan a partir de la célula homóloga donde se origina la enzima de la invención.
En la presente invención la célula huésped homóloga puede ser una cepa de Dictyoglomus sp.
El medio cultivo o las células huéspedes transformadas pueden ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer las células huéspedes en cuestión. La enzima celulolítica expresada puede convenientemente ser segregada en el medio de cultivo y puede ser recuperada de éste por procedimientos bien conocidos que incluyen la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, precipitación de los componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como el sulfato de amonio, seguido de procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, o similares.
Composiciones enzimáticas
En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a una composición enzimática que comprende una enzima que muestra actividad celulolítica según el modo descrito anteriormente.
La composición enzimática de la invención puede, además de la celulasa de la invención, comprender uno o más tipos de enzimas, por ejemplo la hemicelulasa tal como la xilanasa y la mananasa, otros componentes de celulasa o de endoglucanasa, quitinasa, lipasa, esterasa, pectinasa, cutinasa, fitasa, oxidorreductasa, proteasa, o amilasa.
La composición enzimática puede ser preparada conforme a los métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición enzimática puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. La enzima para ser incluida en la composición puede ser estabilizada conforme a los métodos conocidos en la técnica.
Las celulasas termoestables tienen usos potenciales en muchas industrias diferentes y aplicaciones. Se dan a continuación ejemplos de usos preferidos de la composición enzimática de la invención. La dosificación de la composición enzimática de la invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición pueden ser determinadas en base a los métodos conocidos en la técnica.
La composición enzimática según la invención puede ser útil para al menos uno de los objetivos siguientes.
Usos
En la industria textil las celulasas son usadas para el tratamiento del algodón y otros materiales celulósicos para obtener un tratamiento de superficie de las fibras que resultan en tejidos con propiedades alteradas tales como una tendencia al frisado reducida, la eliminación de pelusa, un tejido más suave, mejores efectos para el tacto o visuales. Especialmente las celulasas se utilizan para producir un aspecto "lavado a la piedra" de la tela vaquera. El uso de celulasas a altas temperaturas permite crear nuevos aspectos tanto de tejidos de algodón/celulósicos vaqueros y no vaqueros. Las celulasas termoestables pueden ser incluidas en tratamientos a altas temperaturas de tejidos que no habían sido posibles antes, el lavado de la celulasa a 80ºC o bajo condiciones de vapor con una proporción de lejía muy baja es posible y da el potencial de crear aspectos nuevos.
El uso de celulasas termoestables en procesos de limpieza industrial permite hacer un proceso de limpieza más fácil cuando el material indeseado por extraer se basa en materia celulósica. Ejemplos son la limpieza de membranas de ultra filtración, tuberías y similares en la industria de alimentos/piensos.
La incorporación de celulasa en materiales de plástico y poliméricos termoestables extrudidos por calor con relleno de celulosa, resultará en una degradabilidad más alta de estos materiales en la naturaleza.
Materiales lignocelulósicos componen una gran parte de los residuos agrícolas y forestales y del papel que es muy dominante en los residuos municipales. Estos residuos son normalmente quemados, lo cual desde el punto de vista de la energía es un desperdicio enorme de recursos. Se ha dedicado mucho trabajo a la tarea de desarrollar un proceso eficaz y económico para la conversión de esta biomasa en azúcares que puedan ser fermentados para producir p. ej. alcohol para el uso como combustible. Los procesos propuestos para la conversión de lignocelulósicos en azúcares incluyen el uso de celulasas pero se necesitan dosificaciones muy altas que las hacen irreales en una gran escala industrial desde un punto de vista económico. El uso de celulasas termoestables con propiedades liquefactantes hace este proceso de bioconversión más real. El tratamiento a altas temperaturas abre la estructura de la pared celular en una cantidad de materiales vegetales y hace la celulosa más accesible para el ataque enzimático.
En la producción industrial de alcohol de distintos tipos de granos, el proceso tradicional incluye la licuefacción con alfa amilasa a temperaturas alrededor de 80-100ºC. La inclusión de celulasa en esta fase aumentará el rendimiento de los azúcares fermentables. Esta prelicuefacción de celulosa también hace real la inclusión de celulasas tradicionales en el siguiente proceso, debido a un nivel de hidrólisis más alto que sin prelicuefacción.
La predigestión de granos; centeno, cebada, maíz, etc para la producción de piensos es otro uso potencial de la celulasa termoestable, para aumentar la digestibilidad del pienso en el animal.
La extracción de café para la producción de café instantáneo se realiza a temperaturas entre 85-150ºC en una batería de columnas de filtración. El agua pasa a contracorriente de la célula más extraída hasta la recién llenada con café fresco. La temperatura de operación para las células con el café fresco es de aprox. 100ºC. La inclusión de celulasas termófilas en este punto aumentará la capacidad de las columnas puesto que la materia soluble es liberada más fácilmente cuando la estructura de la pared celular está abierta.
La inclusión de celulasas en otros procesos a altas temperaturas tradicionales para la extracción de compuestos de aceite o de aroma/sabor de fuentes vegetales naturales aumentará la capacidad o rendimiento de la misma manera que para la extracción de café. Un ejemplo es la extracción de aceite de palma o aceite de avellana de palma que es un proceso acuoso a alta temperatura.
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Materiales y métodos Organismos depositados
DSM 11201 de Escherichia coli conteniendo el plásmido que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima celulolítica de la invención, en el vector de donación pSJ1678.
Otras cepas
Una cepa de E. coli: Células de SJ2 de E. coli (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis J. Bacteriol., 172;4315-4321), fueron preparadas para y transformadas por electroporación usando un electroporador Gene Pulser^{TM} de BIO-RAD según está descrito por el proveedor.
Plásmido
pSJ1678 como se describe en la solicitud internacional publicada como WO 94/19454.
Métodos de biología molecular generales
Las manipulaciones de ADN y transformaciones fueron realizadas usando métodos estándares de biología molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Las enzimas para las manipulaciones del ADN fueron usadas según las especificaciones de los proveedores.
Aislamiento de la secuencia de ADN que codifica la enzima celulítica de la invención
La secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa de la invención, puede ser obtenida del organismo de E. coli, DSM 11201, depositado, por extracción del ADN plásmido por métodos conocidos en la técnica (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY).
Clonación del gen de endoglucanasa Preparación de ADN genómico
Una cepa DSM 6262 de Dictyoglomus sp., fue propagada en un 1 matraz de vidrio de 1 l durante 2 días a 70ºC en el medio como se describe abajo.
Composición del medio anaeróbico estricto para la cepa DSM 6262
1.0 g de NH_{4}Cl, 0.1 g de NaCl, 0.1 g de MgCl_{2}, 0.05 g de CaCl_{2}, 0.4 g de K_{2}HPO_{4}.3H_{2}O, 0.75 g de extracto de levadura, 4.0 g de xilano de haya (Lenzing), 0.5 mg de Resazurina, 1.0 ml de metal traza^{#},
^{#}solución de metal traza: 1.0 ml de solución de vitamina, 3.0 g de NaHCO_{3}, H_{2}O a 1 L.
2.0 g de FeCl_{2}.4H_{2}O, 0.05 g de ZnCl_{2}, 0.05 g de MnCl_{2}, 0.05 g de AlCl_{3}, 0.05 g de NiCl_{2}, 0.1 g de Na_{2}SeO_{3}.5H_{2}O, 0.05 g de H_{3}BO_{3}, 0.03 g de CuCl_{2}, 0.05 g de (NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}.4H_{2}O, 0.05 g de CoCl_{2}.6H_{2}O, 0.5 g de EDTA, 1.0 ml de HCl Conc., H_{2}O hasta 1 l.
Se enjuaga y dispensan 10 ml por botella bajo N_{2}/CO_{2} (4:1). Se hace un tope con topes de caucho impermeables al O_{2} y autoclave a 140ºC durante 20 min. Se añaden 0.1 ml de solución de vitamina DSM #141 de una solución anaeróbica filtroesterilizada y 0.2 ml de 2.5 g/l de Na_{2}S.9H_{2}O de solución madre sometida a autoclave justo antes de la inoculación con la técnica de la jeringa anaeróbica estéril.
Las células fueron cosechadas, y el ADN genómico aislado por el método descrito por Pitcher et al. (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol. 8:151-156).
Construcción de un banco genómico
ADN genómico fue parcialmente digerido con la enzima de restricción Sau3A, y dividido por tamaño por electroforesis en un gel de agarosa al 0.7%. Los fragmentos entre 2 y 7 kb de tamaño fueron aislados por electroforesis en papel de DEAE-celulosa (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295-298).
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Los fragmentos de ADN aislados fueron ligados a ADN del plásmido pSJ1678 digerido con BamHI, y la mezcla de ligadura fue usada para transformar SJ2 de E. coli.
Las células fueron puestas en placas de LB agar que contenían 0.1% de CMC (Sodio-carboxi-metil-celulosa, Aqualon, Francia) y 9 \mug/ml de Cloranfenicol para dar 500-1000 C.F.U./placa y se incubaron durante toda la noche a 37ºC.
Identificación de clones positivos por actividad
Después de la incubación las colonias fueron réplicas puestas en placas sobre un grupo de placas de agar LB+CAM y luego fueron incubadas adicionalmente a 37ºC durante aprox. 20 horas. Una capa que contenía un 0.1% de CMC, 1% de HSB agarosa en un tampón apropiado con pH 7 fue vertida sobre las placas de las réplicas e incubadas durante aprox. 20 horas a 65ºC. Las colonias positivas de endoglucanasas fueron identificadas por coloración con una solución acuosa al 0.1% de Rojo Congo (Sigma, EEUU) seguido del lavado en 2 M de NaCl. Aparecieron unos halos en las posiciones donde había clones positivos de endoglucanasa.
Las células de colonias de enzimas positivas fueron extendidas para el aislamiento de las colonias individuales en agar, y una colonia individual productora de enzimas fue seleccionada para cada una de las colonias productoras de endoglucanasas identificadas.
Caracterización de clones positivos
Se obtuvieron los los clones positivos de endoglucanasa de las placas de realineación como colonias individuales, y los plásmidos fueron extraídos. Los fenotipos fueron confirmados por retransformación de SJ2 de E.coli, y los plásmidos caracterizados por digestiones de restricción.
Medios
TY y LB agar (como se describe en Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995).
Condiciones de hibridación
(Para su uso en la propiedad ii) de evaluación del constructo de ADN de la invención)
Las condiciones adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga implican el preremojo del filtro conteniendo los fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 X SSC (citrato de solución salina estándar) durante 10 min, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 X SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x solución de Denhardt's (Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989), seguido de la hibridación en la misma solución que contiene una sonda cebada aleatoriamente (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Chem. 132:6-13), marcada en ^{32}P-dCTP (actividad específica > 1 X 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% SDS preferiblemente a no más de 55ºC, más preferiblemente no más de 60ºC, más preferiblemente no más de 65ºC, incluso más preferiblemente no más de 70ºC, especialmente no más de 75ºC.
La sonda de nucleótidos para usar en la hibridación es la parte de codificación de endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia coli.
Reacción cruzada inmunológica
Los anticuerpos para ser usados para determinar la reacción cruzada inmunológica pueden ser preparados usando una endoglucanasa purificada. Más específicamente, el antisuero contra la endoglucanasa de la invención puede ser aumentado inmunizando conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, capítulo 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente págs. 27-31). Las inmunoglobulinas purificadas pueden ser obtenidas de los antisueros, por ejemplo por precipitación de sal ((NH_{4})_{2}
SO_{4}), seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en DEAE- Sephadex. La caracterización inmunoquímica de las proteínas puede hacerse bien por análisis de doble difusión de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., Capítulo 2).
Los ejemplos no limitativos siguientes ilustran la invención.
Ejemplo 1 Clonación y expresión de una endoglucanasa de DSM 6262 de Dictyoglomus sp
Un banco de Dictyoglomus sp., DSM 6262, fue construido en E. coli y seleccionado como se describe en Materiales y Métodos. Un transformante positivo aislado fue DSM 11201 conteniendo el plásmido pSJ1678 que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima celulolítica de la invención.
El clon de E. coli aislado fue simultáneamente evaluado en placas de LB+CAM agar conteniendo 0.1% de AZCL Beta-glucano, AZCL xiloglucano, AZCL HE celulosa, AZCL xilano, AZCL curdlano o AZCL galactomanano. Las placas fueron incubadas durante aprox. 48 horas a 37ºC seguido de la incubación a 65ºC. La actividad enzimática fue identificada por halos azules alrededor de las colonias. El clon fue encontrado positivo en AZCL Beta-glucano, AZCL xiloglucano y AZCL HE celulosa.
Preparación de la solución enzimática del clon DSM 11201 de E. coli
DSM 11201 fue inoculado como un precultivo en un frasco de agitación conteniendo 200 ml de medio Super-Broth con la composición siguiente (por litro): Triptona 32 g, extracto de levadura 20 g, NaCl 5 g, CMC 5 g, pH 7.2-7.3 ajustado con 1 M de NaOH. Se sometió a autoclave 121ºC, 20 minutos.
Después de la esterilización se añadió cloranfenicol a una concentración final de 6 mg/ml. El frasco de agitación fue incubado en un agitador giratorio a 280 rpm, 37ºC, durante 16 horas. 1 ml del cultivo fue inoculado a 100 frascos de agitación con 200 ml del medio Super-Broth y se incubó a 37ºC, 280 rpm entre 16 y 18 horas. Se centrifugó a 3000 rpm el cultivo de 20 litros de E. coli, se resuspendió el granulado en 800 ml de tampón Tris-maleato 50 mM, pH 7.0. Las células se rompieron a 800 bar con un Homogenizador de laboratorio de alta presión Rannie. Se centrifugó durante 1 hora, 10.000 rpm y se recogió el sobrenadante claro.
Ejemplo 2 Purificación y caracterización de la endoglucanasa clonada de DSM 6262 de Dictyoglomus sp
600 ml de extracto celular de E. coli fueron tratados en primer lugar por calor a 70ºC durante 5 min seguido de centrifugado a 5000 rpm durante 20 min. El sobrenadante fue filtrado a través de un filtro D de Whatman y en total se obtuvieron 200 ml con una actividad de 11 CMCU por ml (determinación de CMCU, ver abajo).
La solución fue pasada por una columna de S-Sepharose equilibrada con un tampón de acetato de sodio 0.05 M con pH 5.0. La endoglucanasa unida fue eluida con 0.5 M de cloruro sódico y en total un volumen de 300 ml se obtuvo con 2 CMCU/ml. Esta solución fue ajustada a pH 9.0 y equilibrada con 20 mM de tampón de etanolamina con pH 9.0 en una célula de ultrafiltración Amicon con una membrana con un corte de 10 kD. Después, cuando la conductividad está alrededor de 250 micro S/cm la solución es aplicada a una Columna de Q-sepharose equilibrada con el mismo tampón. La endoglucanasa se enlazará y puede ser eluida usando un gradiente de cloruro sódico. Debido a la conductividad demasiado alta en la primera prueba obtuvimos sólo 2 ml con 65 CMCU/ml.
Finalmente, la solución fue concentrada y aplicada a una columna de tamaño Superdex 200 en 0.1 M de acetato sódico pH 6.0 y la endoglucanasa pura eluida en un volumen de 22 ml que fue concentrada usando una célula de ultrafiltración Amicon con una membrana con un corte de 6 kD. Se obtuvo 1 ml con 40 CMCU por ml. Esta muestra mostró una única banda en SDS-PAGE con un PM de 30 kD y un pl de 6.5. La proteína fue electrotransferida y aplicada para la secuenciación N-terminal usando un secuenciador de Applied Biosystems modelo 473A. El secuenciador de proteínas fue accionado según las instrucciones del fabricante y se obtuvo la secuencia siguiente:
QTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFFNIAAY-
La endoglucanasa pura tiene actividad en p-nitrofenil-beta-D-celobiosida (Sigma), CMC, HE celulosa (Megazime) y celulosa ácida inflada.
Una unidad CMCU está definida como la cantidad de enzima que libera el equivalente a 1 mmol de glucosa por min bajo condiciones estándar.
Condiciones estándar: ensayo de CMC a 70ºC
La enzima es incubada durante 20 min. en una solución CMC al 0.75% (7L de Hércules) en un tampón de barbiturato de sodio 0.1 M pH 8.5. Tras la incubación se determina el aumento de los grupos terminales de reducción usando PHBAH (SIGMA H-988253H7704 (HIDRACIDA DE ÁCIDO p-HIDROXI BENZOICO)) y con una glucosa estándar se calcula la formación de grupos terminales de glucosa equivalentes por min. (Lever, M. (1972) A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. vol 47, página 273-279).
La endoglucanasa mostró 137 CMCU/mg de proteína a 70ºC y pH 8.5 (50 CMCU por A_{280}).
Perfil de la actividad de la temperatura de la endoglucanasa
La endoglucanasa fue incubada en el ensayo CMCU a pH 8.5 a temperaturas diferentes y la actividad después de 20 min. de incubación fue determinada según el modo descrito anteriormente. no se realizaron incubaciones por encima de 90ºC. La cantidad de azúcar de reducción obtenida a esta temperatura fue la máxima y se usó para el cálculo de la actividad relativa a temperaturas inferiores.
Temp. Actividad rel.
90ºC 100%
80ºC 76%
70ºC 40%
60ºC 26%
50ºC 14%
40ºC 7%
Perfil de actividad del pH
La endoglucanasa fue incubada en el ensayo de CMCU a 70ºC usando tampones diferentes en el intervalo de pH entre 4.5 y 11 y la actividad después de 20 min. de incubación fue determinada según el modo descrito anteriormente.
Tampones:
pH 4.5, 5.0 y 5.5; 0.1 M de Na-acetato
\quad
pH 6.0; 0.1 M de Na-MES
\quad
pH 6.5, 7.0 y 7.5; 0.1 M de Na-MOPS
\quad
pH 8.0 y 8.5; 0.1 M de EPPS
\quad
pH 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 y 11.0; 0.1 M de Na-glicina
Se obtuvo más del 50% de la actividad relativa en el intervalo de pH 5.5 a 11.
Ensayo de p-nitrofenil-beta-D-celobiosida
Una unidad de PNPU está definida como la cantidad de enzima que libera un mmol de p-nitrofenol por minuto de p-nitrofenil-beta-D-celobiosida (Sigma) bajo condiciones estándar.
Método: Cinética del estado estacionario, detección directa del producto p-nitrofenol, da un color amarillo, que es detectado a 405 nm. La actividad es medida como el aumento de la absorbancia, la parte lineal de la curva se utiliza para determinar la pendiente (AU/seg). La actividad se calcula usando una absorbencia de p-nitrofenol en un tampón fosfato con pH 7.5: Absorbencia en una cubeta de 1 cm, 1 mM de 0.018 a 405 nm (0.014 a 420 nm).
Condiciones del ensayo
475 ml de 10 mM de p-NP-beta-d-celobiosido en 0.1 M de tampón Na-fosfato , pH 7.5
25 ml de solución enzimática
Procedimiento
La medición se hace en un Espectrofotómetro HP 8452A Diode Array controlado termostáticamente a 70ºC en una cubeta de 0.75 ml, 1 cm de ancho.
Se mide la absorbencia a 405 nm en 300 seg con una medición cada 20 seg.
La endoglucanasa mostró 170 PNPU por A_{280} a 70ºC y pH 7.5.
Celulosa hinchada ácida
Se preparó una solución madre de PASC de la siguiente manera usando acetona helada y ácido fosfórico. 5 gramos de celulosa (Avicel®) fueron humedecidos con agua, y se añadieron 150 ml de ácido orto-fosfórico al 85%. La mezcla fue colocada en un baño de hielo bajo agitación lenta durante 1 hr. Luego se añadieron 100 ml acetona helada con agitación. La pasta fue transferida a un filtro Buchner con el disco pyrex sinterizado número 3 y luego lavada tres veces con 100 ml de acetona helada, y aspirada hasta secarse en la mayor medida posible después de cada lavado. Finalmente, la torta de filtración fue lavada dos veces con 500 ml de agua, aspirada hasta secarse en la mayor medida posible después de cada lavado. El PASC fue mezclado con agua desionizada a un volumen total de 300 ml, mezclado hasta su homogeneidad (usando el Homogenizador Ultra Turrax) y almacenado en el frigorífico (hasta un mes).
Equilibrado del sustrato con tampón: 20 gramos de solución madre de celulosa inflada por ácido fosfórico PASC fueron centrifugados durante 20 min a 5000 rpm., el sobrenadante fue colado; el sedimento fue resuspendido en 30 ml de tampón y centrifugado durante 20 min. a 5000 rpm., el sobrenadante fue colado, y el sedimento fue resuspendido en el tampón hasta un total de 60 g correspondiente a una concentración de sustrato de 5 g de celulosa/litro.
Tampón para la determinación del pH 8.5 : 0.1 M Barbital.
Procedimiento 1. Dilución de muestras enzimáticas
La solución enzimática está diluida en el mismo tampón que el sustrato.
2. Reacción enzimática
El sustrato en la solución del tampón es precalentado durante 5 min. a 80ºC (2 ml).
Luego se añade la solución enzimática (diluida) 0.5 ml y se mezcla durante 5 seg. Se obtienen blancos enzimáticos añadiendo el reactivo de parada antes de la solución enzimática. Se incuba durante 20 min. a 80ºC. La reacción es detenida añadiendo 0.5 ml de solución de NaOH al 2% y se mezcla durante 5 seg.
Las muestras son centrifugadas durante 20 min. a 5000 rpm. 1 ml de sobrenadante es mezclado con 0.5 ml de reactivo PHBAH y se hierve durante 10 min. Los tubos de ensayo son enfriados en un baño de agua helada.
3. Determinación de grupos terminales de reducción
La absorbancia a 410 nm es medida usando un espectrofotómetro. Se obtuvo una curva de glucosa estándar usando concentraciones de glucosa de 5, 10, 15 y 25 mg/l en el mismo tampón y añadiendo el reactivo PHBAH antes de la ebullición. La liberación del equivalente de la glucosa de reducción se calcula usando esta curva estándar.
Determinación de K_{cat} y K_{m}
Actividad catalítica en la celulosa inflada por ácido fue determinada usando el ensayo según el modo descrito anteriormente bajo condiciones estándar a pH 8.5 y 80ºC con concentraciones de sustrato diferentes. Las constantes cinéticas fueron calculadas usando el programa informático cinético Grafit de Michaëlis-Menten. En base a la composición de los aminoácidos de la endoglucanasa, se determinó que el coeficiente de extinción molar era 85630. En consecuencia, los datos siguientes fueron obtenidos:
K_{cat} = 77 por seg.
K_{m} = 2.5 gramo celulosa hinchada por ácido por litro.
Ejemplo 3 Expresión de una endoglucanasa termoestable en Bacillus subtilis
La cepa de Bacillus subtilis descrita abajo, que comprende el plásmido de expresión que codifica la endoglucanasa termoestable clonada de DSM 6262 de Dictyoglomus sp., fue depositada por los inventores según el Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, República federal de Alemania, el 16 Diciembre 1997 bajo el número de deposición DSM 11903.
Materiales Cepas
SJ2 de E. coli (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sj\diameterholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321) Se prepararon y transformaron las células electrocompetentes usando un Bio-rad GenePulser^{TM} según lo recomendado por el fabricante.
A164 de B.subtilis. Esta cepa es un derivado de ATCC 6051a de B.subtilis, teniendo una esporulación deficiente y habiendo tenido los genes apr y npr interrumpidos. Las interrupciones fueron realizadas esencialmente como se describe en (Eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch and Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for microbiology, pág.618). Las células competentes fueron preparadas y transformadas como se describe por Yasbin, R.E., Wilson, G.A. and Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121:296-304.
Plásmidos
pUB110. plásmido descrito en (McKenzie,T., Hoshino,T., Tanaka,T. and Sueoka, N. The nucleotide sequence of pUB110: some salient features in relation to replication and its regulation Plasmid 15 (2), 93-103 (1986)) y (McKenzie,T., Hoshino,T., Tanaka,T. and Sueoka,N. Correction. A revision of the nucleotide sequence and functional map of pUB110 Plasmid 17 (1), 83-85 (1987)).
pMUTIN-4-MCS: El plásmido puede ser obtenido por Laboratoire de Genetique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique, 78352 Jouy en Josas - CEDEX, Francia.
Medios
LB agar (como se describe en Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995).
LBPG es LB agar suplementado con 0.5% de Glucosa y 0.05 M de fosfato potásico, pH 7.0.
AZCL-HE-celulosa se añade a LBPG-agar al 1%. AZCL-HE-celulosa es de Megazyme, Australia.
El medio BPX está descrito en la solicitud internacional publicada como WO 91/09129.
Métodos
El plásmido fue construido y el clon fue esencialmente establecido como sigue:
El pMUTIN4MCS es un plásmido de E. coli que tiene un promotor híbrido SPAC (Yansura et al. (1984) Use of E. coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis, PNAS, Vo181, pp. 439-443) y un gen lacZ bajo control transcripcional de este promotor. Además el plásmido contiene el gen lacl bajo control de un promotor penP de Bacillus spe. Así cuando esté en B.subtilis el lacl será expresado y enlazado con el operador del promotor-operador SPAC, luego esto inhibirá la transcripción de la secuencia descendente. El Promotor es el mismo que en Yansura et al., no obstante el operador fue modificado en un palíndromo perfecto. Un sitio HindIII justo debajo de la región del promotor- operador permitió disgregar el gen lacZ por inserción de otro gen, es decir el gen de endoglucanasa de esta invención, dejando así la expresión de la endoglucansa bajo el control del promotor-operador SPAC.
En el plásmido pMUTIN4MCS de E.coli un centro de unión del ribosoma (RBS) y un péptido señal con un sitio SacII para los fines de clonación, fueron clonados como un fragmento hindIII-SacI. Estableciendo así el centro de unión del siguiente ribosoma y la secuencia de ADN que codifica el péptido señal:
1
La secuencia de ADN que codifica un péptido señal de Bacillus sp. está escrita en itálico, la cual al ser fundida en otra secuencia de ADN que codifica la parte madura de una proteína la dirigirá al exterior de una célula de
Bacillus sp.
La secuencia anterior codifica el sitio HindIII de pMUTIN4MCS directamente seguido de un RBS de Bacillus subtilis y una secuencia de ADN que codifica un péptido señal de Bacillus spe. que termina con un sitio SacII introducido artificialmente seguido de un sitio de restricción NotI y SacI. El plásmido fue establecido en SJ2 de E.coli por electroporación y se dispuso en placas de LB-agar con 100 pg/ml de ampicilina y se incubaron las células durante toda la noche a 37ºC. El plásmido resultante fue denominado pMUTIN4-señal SacII-NotI.
El gen de endoglucanasa termoestable fue clonado como un fragmento de PCR digerido por SacII-EagI.
El fragmento de PCR se obtuvo usando el kit HiFi Expand PCR de Boehringer Mannheim y se realizó la reacción según lo recomendado por el fabricante. El fragmento de ADN fue amplificado a partir del plásmido pDSM11201. El gen de endoglucanasa termoestable fue originalmente clonado de DSM6262 de Dictyoglomus spe. y depositado como un clon (DSM 11201) de E.coli que comprende un plásmido con el gen de endoglucanasa. Los dos cebadores de la PCR usados fueron los siguientes:
2
El fragmento de PCR y el pMUTIN4-señal SacII-NotI fueron digeridos con SacII-EagI, ligados juntos y usados para transformar SJ2 de E.coli por electroporación y fueron dispuestos en placas de LB-agar con 100 pg/ml de ampicilina y se incubaron las células durante toda la noche a 37ºC. El plásmido resultante en SJ2 fue denominado
pMB447A.
Después de haber clonado el gen de endoglucanasa en fusión con el péptido señal anterior (en el sitio de SacII-No/EagI) resultó el marco de lectura abierto siguiente bajo el control transcripcional del promotor-operador SPAC:
3
4 
\newpage
y la proteína derivada:
5
Con el objetivo de poder propagar el pMB447A en Bacillus subtilis el plásmido de E.coli fue fundido en un derivado de pUB110 (un plásmido propagable en B.subtilis): En el sitio NciI de pUB110 un sitio SacI y NotI fueron introducidos usando un poliligador, el inserto resultante tuvo la secuencia siguiente:
CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG
Los dos sitios de NciI que resaltan entre estos son los sitios SacI y EagI (NotI).
Este plásmido fue luego digerido con SacI y EagI y ligados a pMB447A digerido con SacI-EagI, la ligadura fue usada para transformar A164 de Bacillus subtilis. Los clones fueron establecidos y crecidos durante toda la noche en placas de LBPG-10 Kana AZCL-HE-celulosa. Al día siguiente estas placas fueron incubadas a 70ºC durante 5 horas y la aparición de halos azules indicó la expresión positiva de la endoglucanasa termoestable.
Al analizar el ADN del plásmido aislado del clon MB505 (DSM 11903) fue evidente que el plásmido había sufrido la recombinación y el plásmido resultante fue más pequeño que el tamaño esperado del plásmido de 12.5 kb. Así resultó que el plásmido había perdido la mayor parte del plásmido de E.coli pMUTIN 4 Señal SacII-NotI, dando como resultado un plásmido del tamaño aproximado de 5.5 kb.
El plásmido resultante tiene las características esenciales siguientes:
La endoglucanasa codificada en el plásmido de DSM 11903 fue positivamente expresada sin tener que añadir IPTG y el plásmido confirió resistencia a 10 pg/ml de Canamicina.
El MB505 fue cultivado 5 días en frascos de agitación de 500 ml con dos deflectores y 100 ml de medio BPX a 37ºC a 300 rpm.
Purificación v caracterización
5000 ml de fluido del cultivo del frasco de agitación de Bacillus con el clon MB 505 fueron recibidos, y el fluido del cultivo fue tratado con calor calentándolo a 70ºC y manteniéndose a esta temperatura durante 5 min bajo agitación. Luego se enfrió y centrifugó a 9000 rpm durante 20 min. Se obtuvieron 4000 ml de sobrenadante claro que contenían 2.4 CMCU por ml.
El CMCU fue determinado a 70ºC y pH 8.5.
6000 CMCU fue aplicado a 3000 ml de DEAE A-50 Sephadex equilibrados en un tampón de Mes 50 mM pH 6.2. El material no ligado contenía un total de 5700 CMCU.
El material no ligado fue aplicado a una columna Q-Spharose de 1000 ml equilibrada con 20 mM de tampón de etanolamina pH 9.5. La enzima ligada fue eluida usando un gradiente de NaCl.
El producto parcialmente purificado fue concentrado usando una célula de ultrafiltración de amicon con una membrana con un límite de corte de 6 kDa.
La fracción concentrada fue formulada con el 40% de nonopropilenglicol.
Se obtuvo un total de 250 ml con una concentración de 9.7 CMCU por ml (2425 CMCU en total) y se usó para ensayos de aplicación.
Métodos inmunológicos
La celulasa altamente purificada de Dictyoglomus (del Ejemplo 2) fue usada para la producción de antisuero.
El procedimiento de inmunización fue conducido en DAKO usando conejos. Cada conejo fue inmunizado con 100 \mul de celulasa (0.4 mg de proteína por ml) mezclada con 100 \mul de adyuvante. Cada conejo fue inmunizado 15 veces con un intervalo de una semana. El suero de conejo fue recogido y la gammaglobulina fue purificada del suero.
Placas Mancini, por ejemplo 25 ml de gel de agarosa al 1% (15*10 cm), con 50 \mul de gammaglobulina (A280 =106.5) y con pocillo de 4 mm donde 10 pl de muestra fueron aplicados y se incubó durante 1 día a la temperatura ambiente en una cámara húmeda.
La placa fue lavada en 0.95 de agua de NaCl varias veces y coloreada con azul Coomassie según el procedimiento estándar.
Los diámetros siguientes fueron obtenidos de la celulasa de Dictyoglomus altamente purificada o del MB505 parcialmente purificado formulados, respectivamente:
Celulasa de Dictyoglomus altamente purificada
40 CMCU dieron 11.5 mm de diámetro.
20 CMCU dieron 9.5 mm de diámetro.
10 CMCU dieron 7 mm de diámetro
MB505 formulado
10 CMCU 8 mm de diámetro.
Otra familia de 12 celulasas (p. ej. de los géneros fúngicos de Trichoderma, Humicola, Aspergillus) no formaron ningún inmunoprecipitado bajo estas condiciones.
Ejemplo 4 Biopulido de Celulasa de Dictyoglomus a 90ºC Experimental Materiales y equipamiento
Aparato:
Mathis Pad-steam Range, tipo: PSA-HTF
Tejido:
Tejido de algodón entrelazado blanqueado (Test fabrics Inc.): N.O. blanco, 100% algodón, estilo 460. El tejido fue cortado en trozos de un tamaño 20x30 cm (aprox. 12.5 g cada uno).
Enzima:
Dictyoglomus, lote MB505;9.7 CMC U/ml
Tampón:
15 mM tampón de fosfato pH 6.0
\quad
15 mM tampón de fosfato pH 8.1
Procedimiento de relleno
Muestras de tejido fueron acondicionadas en una habitación climatizada (65\pm2% humedad relativa y 70\pm3ºF temperatura) estándar AATCC (Asociación Americana de Químicos y Coloristas) durante al menos 24 horas. Se obtuvo su peso.
Se hicieron soluciones enzimáticas mezclando la enzima con el tampón. El pH fue ajustado y la actividad enzimática en las soluciones fue mostrada en la tabla 1 abajo. Las muestras fueron sumergidas en soluciones enzimáticas durante menos de 45 segundos y luego rellenas. Después del relleno, las muestras fueron pesadas y colgadas en el vaporizador de Mathis inmediatamente. El porcentaje de solución en el tejido mostrado como detección de humedad de las muestras de tejido fue también presentado en la tabla 1:
TABLA 1
Tejido (#) Solución enzimática pH de la solución Detección de humedad
(CMCU/ml) (% p/p)
1 0 6 125
2 0 8.1 128
3 4.8 6 130
4 4.8 8.1 131
5 9.7 6 137
6 9.7 8.1 137 
\vskip1.000000\baselineskip
Biopulido en el vaporizador
Las muestras de tejido fueron tratadas en un vaporizador con las condiciones siguientes:
Temperatura: 90ºC
Tiempo: 90 min
Humedad relativa: 100%
Todas las muestras son transferidas y enjuagadas en agua desionizada durante al menos 5 minutos. Se secaron al aire y luego se acondicionaron en la habitación climatizada AATCC durante al menos 24 horas antes de la
evaluación.
\vskip1.000000\baselineskip
Evaluación
Pérdida de resistencia:
la resistencia del tejido fue medida en el modelo C de probador de Mullen Burst según ASTM D3786-87. Los datos son un promedio de al menos 8 medidas.
Nota de frisado:
Medido según ASTM D 4970-89 usando un Probador Matindale Pilling a 500 revoluciones. El frisado en el tejido es evaluado visualmente desde la escala 1 a 5, donde 1 es un frisado muy severo y 5 no está frisado. Los datos son un promedio de al menos 2 medidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados y Conclusiones
Los resultados están resumidos abajo y los datos están mostrados en la Tabla 2 y 3.
1.
Cuando la concentración enzimática aumenta, aumenta la nota de frisado (en la tabla 3),
2.
La celulasa de Dictyoglomus da mejor nota de frisado a pH 8.1 que a pH 6.0 (Tabla 3),
3.
Con estas condiciones, el Biopulido da una pequeña pérdida de resistencia del tejido a pH 6.0 (menos del 5%), pero no se detectó pérdida de resistencia a pH 8.1.
Se puede concluir que el biopulido del tejido de algodón con celulasa de Dictyoglomus mejora la resistencia de frisado del tejido significativamente con las condiciones de este estudio. Con condiciones preferidas tales como pH de aproximadamente 8, se obtuvo buena resistencia de frisado sin pérdida de resistencia detectable.
TABLA 2
Tejido (#) Pérdida de resistencia (%) Nota de frisado (500 rev)
1 0 1.5
2 0 2
3 2.4 2
4 0 2.75
5 3.5 2.5
6 0 3 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
Celulasa (CMCU/g) Nota de frisado 500 rev, pH 6 Nota de frisado 500 rev, pH 8.1
0 1.5 2.0
4.8 2.0 2.8
9.7 2.5 3.0
8
9
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(I)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: Novo Nordisk A/S
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(B)
CALLE: Novo Alle
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(C)
CIUDAD: Bagsvaerd
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(E)
PAÍS: Dinamarca
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(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 45 4449 3256
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Una endoglucanasa nueva
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
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(iv)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
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(B)
ORDENADOR: PC IBM Compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 867 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
TIPO DE CADENA: única
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(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
6 
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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 288 aminoácidos
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(B)
TIPO: Aminoácido
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(C)
TIPO DE CADENA: único
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(D)
TOPOLOGÍA: Lineal
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
7

Claims (29)

1. Preparación enzimática con actividad endo-1,4-\beta-glucanasa, preparación que comprende
a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o
b) un polipéptido que muestra al menos el 70% de identidad con la SEC ID NO:2, donde el polipéptido de a) o b) tiene actividad óptima por encima de 85ºC y más del 50% de la actividad relativa en el intervalo de pH 5.5 a 11.
2. Preparación enzimática según la reivindicación 1 donde dicho polipéptido está codificado por
a) un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID NO:1 o
b) un polinucleótido que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia SEC ID NO:1.
3. Preparación enzimática según la reivindicación 1 o 2 que tiene actividad óptima a una temperatura superior a 85ºC.
4. Preparación según la reivindicación 1, 2 o 3, donde la preparación enzimática es obtenible de o es endógena a una cepa de las filum Bacterias Gram Positivas.
5. Preparación según la reivindicación 4, donde la cepa pertenece a la subdivisión Clostridia, preferiblemente al género Dictyoglomus.
6. Preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que es activa a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11, preferiblemente entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 10.
7. Preparación enzimática según la reivindicación 1 o 2, donde la actividad hacia la carboximetilcelulosa (ensayo de CMC) a 70ºC y pH 10 es superior al 50% con respecto a la actividad a 70ºC y pH óptimo.
8. Preparación según la reivindicación 7, donde la actividad relativa es superior al 55%, preferiblemente superior al 60%, más preferiblemente superior al 65%, especialmente superior al 70%.
9. Preparación según la reivindicación 7 u 8, donde la preparación enzimática es obtenible de o endógena a una cepa de las filum Bacterias Gram Positivas.
10. Preparación según la reivindicación 9, donde la cepa pertenece a la subdivisión Clostridia, preferiblemente al género Dictyoglomus.
11. Constructo de ADN que codifica una endoglucanasa con actividad óptima por encima de 85ºC y más del 50% de actividad con respecto al intervalo de pH 5.5 a 11, cuyo constructo comprende
a) la secuencia de polinucleótidos de la SEC ID NO:1 o
b) un polinucleótido que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de a).
12. Constructo de ADN según la reivindicación 11, donde la secuencia de ADN es aislada de o producida en base a un banco de ADN de un procariota o un arqueal, preferiblemente de una bacteria.
13. Constructo de ADN según la reivindicación 12, donde la secuencia de ADN es aislada de o producida en base a un banco de ADN de una cepa de las filum Bacterias Gram Positivas, preferiblemente a la subdivisión Clostridia, en particular una cepa de Dictyoglomus.
14. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde la secuencia de ADN está aislada de DSM 11201 de Escherichia coli.
15. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 11-14 que además comprende una secuencia de ADN que codifica un dominio de unión a celulosa (CBD).
16. Constructo de ADN según la reivindicación 15 que además comprende una secuencia de ADN que codifica un dominio de unión a celulosa (CBD), el dominio de unión a celulosa y el núcleo de la enzima (dominio catalíticamente activo) de la enzima codificada por la secuencia de ADN del constructo de ADN estando operativamente
enlazado.
17. Vector de expresión recombinante que comprende un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 11-16.
18. Célula que comprende un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 11-16 o un vector de expresión recombinante según la reivindicación 17.
19. Célula según la reivindicación 18, que es una célula procariótica, en particular una célula bacteriana, o una célula endógena de la cual se origina la secuencia de ADN, que codifica una enzima que muestra actividad endoglucanasa.
20. Célula según la reivindicación 19, donde la célula pertenece a una cepa de Bacillus, preferiblemente a una cepa del grupo que compuesto por Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus liquefaciens y Bacillus licheniformis.
21. Célula según la reivindicación 19, donde la célula pertenece a una cepa de un hongo filamentoso, preferiblemente a una cepa del grupo compuesto por los géneros Aspergillus, Fusarium y Trichoderma, más preferiblemente a una cepa del grupo compuesto por las especies Aspergillus Níger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminerarum y Trichoderma reesei.
22. Célula según la reivindicación 19, donde la célula pertenece a una cepa de Dictyoglomus.
23. Célula según la reivindicación 18, donde la célula pertenece a una cepa de Saccharomyces, preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
24. Método para producir una enzima que tiene actividad endoglucanasa y actividad óptima por encima de 85ºC, el método comprendiendo el cultivo de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 18-23 bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
25. Enzima que tiene actividad endoglucanasa termoestable y actividad óptima por encima de 85ºC y más del 50% de la actividad relativa en el intervalo de pH 5.5 a 11, enzima que está codificada por un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 11-16.
26. Preparación enzimática que está enriquecida con la enzima según la reivindicación 25.
27. Preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y 26, que adicionalmente comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo compuesto por mananasas, galactanasas, xilanasas, arabinanasas, pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectin liasas, pectato liasas, pectina metil-esterasas, endoglucanasas, proteasas, lipasas, amilasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, celobiohidrolasas y transglutaminasas.
28. Cultivo biológico substancialmente puro aislado de la cepa DSM 11201 de Escherichia coli.
29. Uso de la enzima según la reivindicación 25 o de la preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, 26 y 27 en la industria textil para mejorar las propiedades de las fibras o tejidos celulósicos o para porporcionar un aspecto lavado a la piedra de la tela vaquera; o en procesos de limpieza industrial; o material polimérico extrudido por calor; o en la conversión de biomasa en azúcares; o en la producción de alcohol; o para la predigestión de p. ej. granos usados en la producción de piensos; o en la producción de café instantáneo o en procesos de extracción similares.
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