ES2262197T3 - Endoglucanasa. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PREPARADO DE ENZIMA QUE COMPRENDE UNA ENDO - 1,4 - BE - GLUCANASA QUE TIENE UNA ACTIVI DAD OPTIMA A UNA TEMPERATURA DE MAS DE 85 GRADOS C QUE ES ENDOGENA A UNA CEPA QUE PERTENECE A LA BACTERIA FILUM GRAM POSITIVO (POR EJEMPLO CEPA DICTYOGLOMUS SP., DSM 6262, O QUE TIENE UNA ACTIVIDAD HACIA LA CARBOXIMETILCELULOSA (PRUEBA CMC) A 70 GRADOS C Y UN PH 10 QUE ES MAS ELEVADO QUE EL 50% CON RELACION A LA ACTIVIDAD A 70 GRADOS C Y AL PH OPTIMO; Y UN PRODUCTO DE SINTESIS DE ADN QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA ENDO - 1, 4 - BE - GLUCANASA; LA ENZIMA ES UTIL, POR EJEMPLO, EN LA INDUSTRIA TEXTIL PARA MEJORAR LAS PROPIEDADES DE LAS FIBRAS O DE LOS TEJIDOS CELULOSICOS O PARA DAR LA APARIENCIA LAVADA A LA PIEDRA DE DENIM O EN PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA INDUSTRIAL O EN MATERIAL POLIMERICO DE EXTRUSION EN CALIENTE O EN LA CONVERSION DE BIOMASA A AZUCARES; O EN LA PRODUCCION DE ALCOHOL O PARA LA PREDIGESTION DE, POR EJEMPLO, GRANOS QUE SE UTILIZAN EN LA PRODUCCION DE ALIMENTOS PARA ANIMALES, O EN LA PRODUCCION DE CAFE INSTANTANEO Y OTROS PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCION SIMILARES.
Description
Endoglucanasa.
La presente invención se refiere a una enzima
con actividad celulolítica a temperatura alta, especialmente una
endoglucanasa; una secuencia de ADN clonada que codifica la enzima
con actividad celulolítica; un método para proporcionar un gen que
codifica tal enzima; un método para producir la enzima; una
composición enzimática que comprende la enzima con actividad
celulolítica; y el uso de dicha enzima y composición enzimática
para varias aplicaciones industriales.
Las celulasas o enzimas celulolíticas son
enzimas implicadas en la hidrólisis de la celulosa. En la
hidrólisis de la celulosa nativa, es sabido que hay tres tipos más
importantes de enzimas de celulasa implicadas, es decir
celobiohidrolasa
(1,4-beta-D-glucan
celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91),
endo-beta-1,4-glucanasa
(endo-1,4-beta-D-glucan
4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4) y
beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21).
Especialmente las endoglucanasas (EC Nº.
3.2.1.4) constituyen un grupo interesante de hidrolasas para los
usos industriales mencionados. Las endoglucanasas catalizan la
endohidrólisis de los enlaces
1,4-beta-D-glicosídicos
en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa
e hidroxi etilcelulosa), liquenina, enlaces
beta-1,4 en beta-1,3 glucanos
mezclados tales como
beta-D-glucanos de cereales o
xiloglucanos y otra materia vegetal que contiene partes
celulósicas. El nombre autorizado es glucan
endo-1,4-beta-D-glucan
4-glucano hidrolasa, pero se usa el término
abreviado endoglucanasa en la presente descripción. Se puede hacer
referencia a T.-M. Enveri, "Microbial Cellulases" en W.M.
Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science
Publishers, p. 183-224 (1983); Methods in
Enzymology, (1988) Vol. 160, pág. 200-391 (editado
por Wood, W.A. y Kellogg, S.T.); Béguin, P., "Molecular Biology
of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Vol. 44,
págs. 219-248; Béguin, P. y Aubert,
J-P., "The biological degradation of
cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994)
p.25-58; Henrissat, B., "Cellulases and their
interaction with cellulose", Cellulose (1994), Vol. 1, págs.
169-196.
Las celulasas son sintetizadas por un gran
número de microorganismos que incluyen hongos, actinomicetos,
mixobacterias y bacterias reales pero también por plantas.
Especialmente se han identificado las endoglucanasas de una amplia
variedad de especificidades. Se han descrito muchas endoglucanasas
bacterianas (Henrissat, B. y Bairoch, A. (1993) Biochem J.
293:781-788; Gilbert, H.J. and Hazlewood,
G.P. (1993) J. Gen. Microbiol.
139:187-194).
La subdivisión Clostridia es un grupo muy
diverso de bacterias anaeróbicas que comprenden géneros
fisiológicamente muy diferentes. Previamente, el género
Clostridium fue considerado un género que incluía todas las
bacterias anaeróbicas formadoras de endoesporas. No obstante la
introducción de herramientas taxonómicas moleculares tales como la
secuenciación del ADNr 16S han revelado que el grupo es heterogéneo
a un nivel de género muy superior. Además, varios géneros de
anaeróbicas no formadoras de esporas fueron clasificados dentro de
las Clostridia, que resultaron como un grupo taxonómico superior,
una subdivisión. Esto está de acuerdo con los hábitats muy
diversificados para estos organismos. La subdivisión Clostridia, por
ejemplo, comprende especies con una temperatura de crecimiento
óptima de una gama muy amplia.
El género Dictyoglomus comprende
bacterias anaeróbicas termófilas extremas filogenéticamente
situadas dentro de la subdivisión Clostridia. Dictyoglomus
spp. están entre los organismos más termofílicos dentro de la
subdivisión Clostridia. En el árbol filogenético del ADNr 16S, se
producen Dictyoglomus con otros géneros termofílicos tales
como Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium y
Syntrophomonas como familia más cercana. No obstante, los
Dictyoglomus forman una rama profunda que confirma que los
Dictyoglomus de hecho deberían ser considerados como un
género separado.
La cepa B1 de Dictyoglomus sp. fue
aislada de un residuo y una muestra de pulpa de un tanque de
enfriamiento de masa pulposa, es decir de un entorno termofílico
artificial. Una xilanasa de este organismo ha sido descrita con
respecto de la temperatura óptima (alrededor de 90ºC). La
producción de xilanasa de esta cepa ha sido sometida a estudios
para la optimización de la fermentación. Nunca se informó de la
presencia de endoglucanasa de especies del género
Dictyoglomus. Dentro de las celulasas del tipo filum
clostridia han sido descritas de diferentes especies algunas de las
cuales son termofílicas. En pocos casos la termostabilidad de las
endoglucanasas ha sido determinada, una de las especies más
estudiadas es Clostridium thermocellum que ha sido probado
estable hasta 80ºC. Thermoanaerobacter cellulyticus produce
al menos dos endoglucanasas con estabilidad hasta 80ºC. También una
cepa de Thermotoga maritima demostró producir dos betaglucanasas
termoestables (Liebl et al.(1996), Microbiol. Immunol. 142:
2533-2542).
Se puede hacer referencia a: Hudson et
al. (1991) The cellulase activity of an extreme thermophile,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 35:270-273;
Mathrani and Ahring (1991) Isolation and characterization of
strictly xylan-degrading Dictyoglomus from
man-made thermophilic environment, Arch. Microbiol.
157:13-17; Adamsen et al. (1995)
Optimization of extracellular xylanase production by
Dictyoglomus sp B1 in continuous-culture,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:327-332;
Maidak et al. (1994) The Ribosomal Database Project, Nuc.
Acids Res. 22:3485-3487; Honda et al.
(1987) Cloning and expression in E.coli of a
Thermoanaerobacter cellulyticus gene encoding for heatstable
beta-glucanase, Appl. Microbiol. Biotechnol.
25:480-483; Honda et al. (1988) Isolation of
a new cellulase gene from a thermophilic anaerobe and its
expression in E. coli, Appl. Microbiol. Biotechnol.
29:264-268.
Un uso industrial muy importante de las enzimas
celulolíticas es el uso para el tratamiento de telas o tejidos
celulósicos, p. ej. como ingredientes en composiciones detergentes
o composiciones suavizantes para tejidos, para biopulir una tela
nueva (acabado de prendas), y para obtener un aspecto "lavado a
la piedra" de tejidos con celulosa, especialmente en la tela
vaquera, y se han propuesto diferentes métodos para este tipo de
tratamiento, p. ej. en GB-A-1 368
599, EP-A-0 307 564 and
EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO
91/10732, WO 91/17244, WO 95/24471 y WO 95/26398. Otro uso
industrial importante de las enzimas celulíticas es el uso para el
tratamiento de la pasta de papel, p. ej. para mejorar el drenaje o
para el desentintado del papel reciclado.
Es también sabido que las celulasas pueden o no
tener un dominio de unión a celulosa (un CBD). El CBD realza la
unión de la enzima a una fibra con celulosa y aumenta la eficacia
de la parte activa catalítica de la enzima.
Hay una necesidad de suministrar preparaciones
enzimáticas de celulasas factibles económicamente que puedan ser
usadas para aplicaciones donde sea deseable una actividad celulasa,
preferiblemente endoglucanasa, a altas temperaturas.
El objetivo de la presente invención es el de
proporcionar composiciones enzimáticas nuevas o enzimas
recombinantes con actividad celulolítica sustancial a condiciones
de alta temperatura y rendimiento mejorado en aplicaciones
industriales, p. ej. en el tratamiento de la pasta de papel,
tratamiento textil, procesos de lavandería, procesos de extracción
o en piensos.
Los inventores han tenido ahora éxito en la
clonación y caracterización de una secuencia de ADN del género
bacteriano Dictyoglomus que codifica una enzima que expone
actividad celulolítica a temperaturas extremadamente altas en un
margen de pH muy amplio, de ese modo permitiendo preparar una
composición enzimática celulolítica monocomponente con las
propiedades deseadas.
En consecuencia, en un primer aspecto, la
invención se refiere a una preparación enzimática que tiene
actividad de endoglucanasa con actividad óptima a una temperatura
superior a 85ºC, preferiblemente superior a 90ºC, más
preferiblemente superior 95ºC, especialmente superior a 100ºC.
En su segundo aspecto, la invención se refiere a
una preparación enzimática con actividad endoglucanasa hacia la
carboximetilcelulosa (ensayo CMC) a 70ºC y pH 10 superior al 50%,
preferiblemente superior al 55%, más preferiblemente superior al
60%, más preferiblemente superior al 65%, especialmente superior al
70%, con respecto a la actividad a 70ºC y pH óptimo. En su tercer
aspecto, la invención se refiere a un constructo de ADN que
comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima con actividad
endoglucanasa y actividad óptima por encima de 85ºC,
preferiblemente por encima de 90ºC, más preferiblemente por encima
de 100ºC, secuencia de ADN que comprende
a) la secuencia de ADN correspondiente a la
parte de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN
que se puede obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia
coli, o
b) un análogo de la secuencia de ADN
correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de
la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido en DSM 11201
de Escherichia coli, el cual
i) es homólogo, preferiblemente al menos un 70%
homólogo, con la secuencia de ADN correspondiente a la parte de
codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se puede
obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia coli, o
ii) se hibridiza con la misma sonda de
oligonucleótidos que la secuencia de ADN correspondiente a la parte
de codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se
puede obtener del plásmido en DSM 11201 de Escherichia coli,
o
iii) codifica un polipéptido que es homólogo,
preferiblemente al menos un 70% homólogo, con el polipéptido
codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de
ADN correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa
de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido en DSM
11201 de Escherichia coli.
En su cuarto, quinto y sexto aspecto la
invención proporciona un vector de expresión que comprende la
secuencia de ADN clonada de la invención, una célula que comprende
la secuencia de ADN donada o el vector de expresión y un método
para producir una enzima que expone actividad celulolítica, dicho
método comprende el cultivo de la célula bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima
del cultivo.
En otro aspecto la invención proporciona una
enzima aislada que muestra actividad celulolítica, caracterizada
por (i) estar libre de impurezas homólogas y (ii) la enzima es
producida por el método anteriormente descrito.
La invención además se refiere a una enzima
aislada que tiene actividad celulolítica, preferiblemente una
endoglucanasa, que es codificada por el constructo de ADN de la
invención.
Además, la presente invención se refiere al uso
de esta enzima o a la preparación enzimática de la invención para
aplicaciones industriales como en la industria textil para mejorar
las propiedades de las fibras o tejidos celulósicos o para
proporcionar un aspecto lavado a la piedra en la tela vaquera; o en
procesos de limpieza industrial; o material polimérico extrudido
caliente; o en la conversión de biomasa en azúcares; o en la
producción de alcoholes; o para la predigestión de p. ej. granos
usados en la producción de alimentos; o en la producción de café
instantáneo o procesos de extracción similares.
La invención también se refiere a un cultivo
biológico substancialmente puro aislado de la cepa DSM 11201 de
Escherichia coli que comprende una secuencia de ADN de
codificación de celulasa, o cualquier mutante de dicha cepa de
E.coli.
En este contexto la frase "los 20 residuos
aminoácidos de origen natural" se refiere a los 20 residuos
aminoácidos normalmente encontrados en las proteínas y conocidos de
forma convencional como alanina (Ala o A), valina (Val o V),
leucina (Leu o L), isoleucina (Ile o 1), prolina (Pro o P),
fenilalanina (Phe o F), triptófano (Trp o W), metionina (Met o M),
glicina (Gly o G), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), cisteína
(Cys o C), tirosina (Tyr o Y), asparraguina (Asn o N), glutamina
(Gln o Q), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E),
lisina (Lys o K), arginina (Arg o R), y histidina (His o H). La
enzima y la preparación enzimática de la invención es activa en un
margen de pH amplio, preferiblemente activa a un pH entre
aproximadamente 4 y aproximadamente 11, preferiblemente entre
aproximadamente 5.5 y aproximadamente 10.
En una forma de realización preferida, la enzima
o la preparación enzimática de la invención es obtenible de o
endógena a una cepa perteneciente a las filum Bacterias Gram
Positivas, más preferiblemente la cepa perteneciente a la
subdivisión Clostridia, incluso más preferiblemente perteneciente al
género Dictyoglomus.
En este contexto la expresión "una secuencia
de ADN clonada", bien parcial o completa, se refiere a una
secuencia de ADN clonada por el procedimiento de clonación estándar
usado en ingeniería genética para recolocar un segmento de ADN
desde su ubicación natural a un sitio diferente donde será
reproducido. El proceso de donación implica la escisión y
aislamiento del segmento de ADN deseado, inserción del trozo de ADN
en la molécula del vector e incorporación del vector recombinante
en una célula donde se replicarán múltiples copias o clones del
segmento de ADN.
La "secuencia de ADN clonada" de la
invención puede de forma alternativa ser denominada "constructo
de ADN" o "secuencia de ADN aislada".
La secuencia de ADN puede ser de origen
genómico, ADNc, o sintético o cualquier combinación de éstos.
La parte de codificación de celulasa de la
secuencia de ADN donada en el plásmido pSJ1678 presente en DSM
11201 de Escherichia coli y/o una secuencia de ADN análoga
de la invención puede ser clonada de una cepa del género bacteriano
Dictyoglomus, preferiblemente la cepa de Dictyoglomus,
DSM 6262, que produce la enzima con actividad celulasa,
preferiblemente endoglucanasa, u otro organismo o un organismo
relacionado como se describe más abajo.
De forma alternativa, la secuencia análoga puede
ser construida basándose en la secuencia de ADN que se puede
obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia
coli, p. ej. puede ser una secuencia sustituta de ésta, y/o por
introducción de sustituciones de nucleótidos que no den lugar a otra
secuencia de aminoácidos de la celulasa codificada por la secuencia
de ADN, pero que se corresponda con el uso del codón del organismo
huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción
de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una
secuencia de aminoácidos diferente (es decir una variante de la
celulasa de la invención).
Cuando se realizan sustituciones de nucleótidos,
los cambios en los aminoácidos son preferiblemente de una
naturaleza inferior, es decir sustituciones de aminoácidos
conservadoras que no influyen significativamente en el pliegue o la
actividad enzimática de la proteína, eliminaciones pequeñas,
normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas
extensiones amino- o carboxilo terminales, tales como un residuo de
metionina aminoterminal, un péptido de enlace pequeño de hasta
aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión
pequeña que facilita la purificación, tal como un tracto de
polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están
dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina,
lisina, histidina), aminoácidos acídicos (tales como ácido
glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como
glutamina y asparraguina), aminoácidos hidrofóbicos (tales como
leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como
fenilalanina, triptófano, tirosina) y pequeños aminoácidos (tales
como glicina, alanina, serina, treonina, metionina). Para una
descripción general de la sustitución de nucleótidos, ver p. ej.
Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2,
95-107.
Será evidente para los expertos en la técnica
que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones
fundamentales para la función de la molécula y además resultarán en
un polipéptido activo. Los aminoácidos esenciales para la actividad
del polipéptido codificada por la secuencia de ADN clonada de la
invención, y en consecuencia preferiblemente no sometida a
sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos
en la técnica, tales como la mutagénesis sito dirigida o mutagénesis
de barrido de alanina (ver. p. ej. Cunningham and Wells, (1989),
Science 244, 1081-1085). En esta técnica las
mutaciones son introducidas en cada residuo en la molécula, y las
moléculas mutantes resultantes son evaluadas por su actividad
biológica (es decir celulolítica) para identificar residuos
aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula.
Los sitios de interacción enzima-sustrato pueden
también ser determinados por análisis de la estructura cristalina
como está determinado por tales técnicas como el análisis de
resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por
fotoafinidad (ver p. ej. de Vos et al., (1992), Science 255,
306-312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol.
224, 899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS
Lett. 309, 59-64).
La endoglucanasa codificada por la secuencia de
ADN del constructo de ADN de la invención puede comprender un
dominio de unión a celulosa (CBD) existente como una parte íntegra
de la enzima codificada, o se puede introducir un CBD de otro
origen en la endoglucanasa creando así un híbrido enzimático. En
este contexto, el término "dominio de unión a celulolosa" se
destina a ser entendido tal y como está definido por Peter Tomme
et al. "Cellulose-Binding Domains:
Classification and Properties" en "Enzymatic Degradation of
Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner
(Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición
clasifica más de 120 dominios de enlace de celulosa en 10 familias
(I-X), y demuestra que los CBDs se encuentran en
varias enzimas tales como las celulasas, xilanasas, mananasas,
arabinofuranosidasas, acetil esterasas y quitinasas. Los CBDs
también han sido encontrados en algas, p. ej. el alga rojo
Porphyra purpurea como una proteína de unión a polisacáridos
no hidrolítica, ver Tomme et al., op.cit. No obstante, la
mayor parte de los CBDs son de celulasas y xilanasas, los CBDs se
encuentran en los terminales N y C de las proteínas o son internos.
Los híbridos enzimáticos son conocidos en la técnica, ver p. ej. WO
90/00609 y WO 95/16782, y pueden ser preparados mediante la
transformación en una célula huésped de un constructo de ADN que
comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio de
unión a celulosa ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de
ADN que codifica la endoglucanasa y haciendo crecer la célula
huésped para expresar el gen fundido. Los híbridos enzimáticos
pueden ser descritos por la fórmula
siguiente:
siguiente:
CBD-MR-X
donde CBD es la región
N-terminal o C-terminal de una
secuencia de aminoácidos correspondiente al menos al dominio de
unión a celulosa; MR es la región media (el enlazador), y puede ser
un enlace, o un grupo de unión corto preferiblemente de
aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, más
preferiblemente de 2 a 40 átomos de carbono; o es preferiblemente
de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 aminoácidos, más
preferiblemente de 2 a 40 aminoácidos; y X es una región
N-terminal o C-terminal de un
polipéptido codificado por la secuencia de ADN de la
invención.
La secuencia de ADN de la presente invención
puede ser clonada de la cepa DSM 11201 de Escherichia coli
usando métodos estándar p. ej. como se describe por Sambrook et
al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY.
La secuencia de ADN de la invención puede
también ser clonada por cualquier método general que implique
- -
- donación, en vectores adecuados, un banco de ADN de cualquier organismo, p. ej. Dictyoglomus, supuesto para producir la endoglucanasa de interés,
- -
- transformación de células huéspedes adecuadas con dichos vectores,
- -
- cultivo de las células huéspedes bajo condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés codificado por un clon en el banco de ADN,
- -
- selección de clones positivos determinando cualquier actividad celulolítica de la enzima producida por tales clones, y
- -
- aislamiento del ADN que codifica la enzima de tales clones.
De forma alternativa, el ADN que codifica una
celulasa de la invención puede, conforme a procedimientos bien
conocidos, convenientemente ser donado a partir de una fuente
adecuada, tal como cualquiera de los organismos abajo mencionados,
usando sondas de oligonucleótidos sintéticas preparadas basándose
en la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente
en DSM 11201 de Escherichia coli,
La homología de la secuencia de ADN a la que se
ha hecho referencia arriba está determinada como el grado de
identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la
primera secuencia desde la segunda. La homología puede de manera
adecuada ser determinada mediante programas informáticos conocidos
en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete del
programa GCG (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of
Molecular Biology, 48, 443-453). El uso de GAP con
los ajustes siguientes para la comparación de la secuencia de ADN:
penalización de creación de espacios de 5.0 y penalización de
extensión de espacios de 0.3, la secuencia de ADN (parcial) muestra
un grado de identidad de al menos el 60%, preferiblemente de al
menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más
preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el
95%, más preferiblemente al menos el 97% con la secuencia de ADN
correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de
la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en
DSM 11201 de Escherichia coli.
La hibridación a la que se ha hecho referencia
arriba se destina a indicar que la secuencia de ADN (parcial)
análoga se hibridiza a una sonda de oligonucleótidos
correspondiente a la parte de codificación de la endoglucanasa de
la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en
DSM 11201 de Escherichia coli bajo condiciones específicas
determinadas que están descritas con detalle abajo.
Las condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o
ARN homóloga implica el prerremojo del filtro conteniendo los
fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 x SSC (citrato de
solución salina estándar) durante 10 min, y la prehibridación del
filtro en una solución de 5 X SSC (Sambrook et al. 1989), 5
x solución de Denhardt's (Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS
y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido
a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989), seguido de
hibridación en la misma solución conteniendo una sonda cebada
aleatoriamente (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal.
Biochem. 132:6-13), marcada en
^{32}P-DCTP (actividad específica > 1 x
10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es
luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% de SDS a
preferiblemente no más de 55ºC, más preferiblemente no más de 60ºC,
más preferiblemente no más de 65ºC, incluso más preferiblemente no
más de 70ºC, especialmente no más de 75ºC.
Las moléculas a las que la sonda de
oligonucleótidos hibridiza bajo estas condiciones son detectadas
usando una película de rayos x.
La homología del polipéptido al que se ha hecho
referencia arriba está determinada como el grado de identidad entre
las dos secuencias que indican una derivación de la primera
secuencia desde la segunda. La homología puede de manera adecuada
ser determinada mediante programas informáticos conocidos en la
técnica tales como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG
(Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular
Biology, 48, 443- 453 Usando GAP con los ajustes siguientes para la
comparación de la secuencia polipeptídica: penalización de creación
de espacios de 3.0 y penalización de extensión de espacios de 0.1,
el polipéptido codificado por una secuencia de ADN (parcial)
análoga muestra un grado de identidad de al menos el 60%,
preferiblemente de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el
80%, preferiblemente de al menos el 85%, más preferiblemente al
menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, especialmente al
menos el 97% con el polipéptido codificado por la parte de
codificación de la endoglucanasa de la secuencia de ADN que se
puede obtener del plásmido presente en DSM 11201 de Escherichia
coli.
Los anticuerpos para ser usados para determinar
la reactividad cruzada inmunológica pueden ser preparados usando
una enzima celulolítica purificada. Más específicamente, el
antisuero contra la endoglucanasa de la invención puede ser
aumentado inmunizando conejos (u otros roedores) según el
procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: A Manual of
Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific
Publications, 1973, Chapter 23, o A. Johnstone y R. Thorpe,
Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications,
1982 (más específicamente págs. 27-31). Las
inmunoglobulinas purificadas pueden ser obtenidas de los
antisueros, por ejemplo por precipitación de sales
((NH_{4})_{2} SO_{4}), seguido de diálisis y
cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en
DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de
las proteínas puede hacerse bien por análisis de doble difusión de
Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology
(D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, págs.
655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N.
Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por
inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., Capítulo
2).
La taxonomía aplicada a continuación es conforme
a Maidak et al. 1996 (The Ribosomal Database Project. Nucl.
Acids Res. 24:82-85).
Para el objetivo de la presente invención los
términos "obtenido de" u "obtenible de" como se utiliza
en este caso en relación con una fuente específica, significa que
la enzima es producida o puede ser producida por la fuente
específica, o por una célula donde un gen de la fuente ha sido
insertado.
Está actualmente contemplado que la celulasa de
la invención puede ser obtenida de una bacteria, en particular unas
Bacterias gram positivas, preferiblemente de la subdivisión
Clostridia, en particular una cepa del género Dictyoglomus.
Está actualmente contemplado que una secuencia de ADN que codifica
unos homólogos enzimáticos a la enzima de la invención puede ser
obtenida a partir de otras cepas bacterianas, especialmente cepas
del género Dictyoglomus.
Un aislamiento de una cepa de
Dictyoglomus sp. del cual puede derivar una celulasa de la
invención está públicamente disponible por Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen, DSM 6262.
Además, el plásmido pSJ1678 que comprende la
secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa de la invención ha
sido transformado en una cepa de la Escherichia coli que fue
depositada por los inventores según el Tratado de Budapest en la
Reconocimiento Internacional del Depósito de microorganismos a los
fines del procedimiento en materia de patentes en el Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg
1 b, D-38124 Braunschweig, República federal de
Alemania, el 11 Octubre 1996 bajo el número de deposición DSM
11201.
Un vector recombinante que comprende un
constructo de ADN que codifica la enzima de la invención puede ser
cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector a
menudo dependerá de la célula huésped en la que se debe introducir.
Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir
un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya
replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej.
un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, al
introducirse en una célula huésped, se integra en el genoma de la
célula huésped en parte o en su totalidad y se replica con
el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido
integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención está operativamente enlazada a segmentos adicionales
requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de
expresión está derivado del ADN plásmido o vírico, o puede contener
elementos de ambos. Los términos, "enlazado operativamente"
indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionen en
concierto para sus objetivos previstos, p. ej. la transcripción se
inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que
codifica para la enzima.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN
que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de
elección y puede derivar de proteínas que codifican genes bien
homólogos o heterólogos a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes bacterianas incluyen el promotor del gen de
amilasa maltogénica de Bacillus Stearothermophilus, el gen
de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el
gen de alfa-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens, el gen de proteasa alcalina de Bacillus
subtilis, o el gen de xilosidasa de Bacillus pumilus, o
los promotores P_{R} o P_{L} del fago Lambda o los promotores
lac, trp o tac de E. coli.
La secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención puede también, en caso de necesidad, estar operativamente
conectado a un terminador adecuado.
El vector recombinante de la invención puede
además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se
replique en la célula huésped en cuestión.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto
en la célula huésped, o un gen que codifica la resistencia a p. ej.
antibióticos tipo canamicina, cloranfenicol, eritromicina,
tetraciclina, espectinomicina, o similares, o resistencia a metales
pesados o herbicidas.
Para dirigir una enzima de la presente invención
en la vía secretora de las células huéspedes, una secuencia señal
secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia
prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en el vector
recombinante. La secuencia señal secretora está unida a la secuencia
de ADN que codifica la enzima en el marco de lectura correcto. Las
secuencias señal secretoras están normalmente situadas en 5' de la
secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia señal
secretora puede ser aquella normalmente asociada con la enzima o
puede ser de un gen que codifica otra proteína segregada.
Los procedimientos usados para ligar las
secuencias de ADN que codifican para la presente enzima, el
promotor y opcionalmente el terminador y/o secuencia señal
secretora, respectivamente, o para ensamblar estas secuencias por
esquemas de amplificación por PCR adecuados, y para insertarlas en
vectores adecuados conteniendo la información necesaria para la
replicación o integración, son conocidos por los expertos en la
técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al.,
op.cit.).
La secuencia de ADN que codifica la presente
enzima introducida en la célula huésped puede ser bien homóloga o
heteróloga al huésped en cuestión. Si fuera homóloga a la célula
huésped, es decir producida por la célula huésped de forma natural,
normalmente será conectada de forma operativa a otra secuencia del
promotor o, en su caso, otra secuencia señal secretora y/o secuencia
de terminación distinta de su entorno natural. El término
"heteróloga" se destina a incluir una secuencia de ADN que
codifica una enzima nativa al organismo huésped en cuestión. El
término "heteróloga" se destina a incluir una secuencia de ADN
no expresada por la célula huésped en la naturaleza. Así, la
secuencia de ADN puede ser de otro organismo, o puede ser una
secuencia sintética.
La célula huésped en la cual el constructo de
ADN o el vector recombinante de la invención es introducido puede
ser cualquier célula que sea capaz de producir la presente enzima e
incluye bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas más
grandes. Una célula huésped preferida incluye células fúngicas
procariotas, arqueales y filamentosas.
Ejemplos de células huéspedes fúngicas que, en
cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son
células de hongos filamentosos tales como como cepas de cualquiera
de los géneros Aspergillus, Fusarium y
Trichoderma, más específicamente las cepas de las especies
Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae, Fusarium
graminerarum y Trichoderma reesei.
Ejemplos de células huéspedes bacterianas que,
en cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son
bacterias gram-positivas tales como cepas de
Bacillus, tales como cepas de B. subtilis, B.
licheniformis, B. lentus, B. brevis, B.
stearothermophilus, B. alkalophilus, B.
amyloliquefaciens, B. liquefaciens, B. coagulans,
B. circulans, B. lautus, B. megatherium o B.
thuringiensis, o cepas de Streptomyces, tales como S.
lividans o S. murinus, o bacterias
gram-negativas tales como Escherichia coli.
La transformación de las bacterias puede ser efectuada por
transformación de los protoplastos, electroporación, conjugación, o
usando células competentes de modo conocido per se (ver
Sambrook et al., supra).
Al expresar la enzima en bacterias tales como
E. coli, la enzima puede ser retenida en el citoplasma,
normalmente como gránulos insolubles (conocidos como cuerpos de
inclusión), o pueden ser dirigidos al espacio periplásmico por una
secuencia de secreción bacteriana. En ése caso, las células son
lisadas y los gránulos son recuperados y desnaturalizados tras lo
cual la enzima es replegada diluyendo el agente desnaturalizante.
En este caso, la enzima puede ser recuperada del espacio
periplásmico interrumpiendo las células, p. ej. por sonicación o
impacto osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico
y recuperando la enzima.
Al expresar la enzima en bacterias
gram-positivas tales como cepas de Bacillus
o Streptomyces, la enzima puede ser retenida en el
citoplasma, o puede ser dirigida al medio extracelular por una
secuencia de secreción bacteriana. En este caso, la enzima puede
ser recuperada del medio como se describe abajo.
La presente invención proporciona un método para
producir una enzima aislada según la invención, donde una célula
huésped adecuada, que ha sido transformada con una secuencia de ADN
que codifica la enzima, está cultivada bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es
recuperada del cultivo.
Tal y como se define aquí, un polipéptido
aislado (p. ej. una enzima) es un polipéptido que está
esencialmente libre de otros polipéptidos, p. ej., al menos
aproximadamente el 20% de pureza, preferiblemente al menos
aproximadamente el 40% de pureza, más preferiblemente
aproximadamente el 60%, incluso más preferiblemente aproximadamente
el 80% de pureza, más preferiblemente aproximadamente el 90% de
pureza, e incluso más preferiblemente aproximadamente el 95% de
pureza, según se determina por SDS-PAGE.
Los términos "polipéptido aislado" puede de
forma alternativa ser denominado "polipéptido purificado".
Cuando un vector de expresión que comprende una
secuencia de ADN que codifica la enzima es transformado en una
célula huésped heteróloga es posible permitir la producción
recombinante heteróloga de la enzima de la invención.
De ese modo es posible hacer una composición
celulolítica altamente purificada o monocomponente, caracterizada
por estar libre de impurezas homólogas.
En este contexto impurezas homólogas significa
cualquier impureza (p. ej. otros polipéptidos distintos de la
enzima de la invención) que se originan a partir de la célula
homóloga donde se origina la enzima de la invención.
En la presente invención la célula huésped
homóloga puede ser una cepa de Dictyoglomus sp.
El medio cultivo o las células huéspedes
transformadas pueden ser cualquier medio convencional adecuado para
hacer crecer las células huéspedes en cuestión. La enzima
celulolítica expresada puede convenientemente ser segregada en el
medio de cultivo y puede ser recuperada de éste por procedimientos
bien conocidos que incluyen la separación de las células del medio
por centrifugado o filtración, precipitación de los componentes
proteínicos del medio mediante una sal tal como el sulfato de
amonio, seguido de procedimientos cromatográficos tales como la
cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad,
o similares.
En otro aspecto ulterior, la presente invención
se refiere a una composición enzimática que comprende una enzima
que muestra actividad celulolítica según el modo descrito
anteriormente.
La composición enzimática de la invención puede,
además de la celulasa de la invención, comprender uno o más tipos
de enzimas, por ejemplo la hemicelulasa tal como la xilanasa y la
mananasa, otros componentes de celulasa o de endoglucanasa,
quitinasa, lipasa, esterasa, pectinasa, cutinasa, fitasa,
oxidorreductasa, proteasa, o amilasa.
La composición enzimática puede ser preparada
conforme a los métodos conocidos en la técnica y pueden estar en
forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la
composición enzimática puede estar en forma de un granulado o un
microgranulado. La enzima para ser incluida en la composición puede
ser estabilizada conforme a los métodos conocidos en la técnica.
Las celulasas termoestables tienen usos
potenciales en muchas industrias diferentes y aplicaciones. Se dan
a continuación ejemplos de usos preferidos de la composición
enzimática de la invención. La dosificación de la composición
enzimática de la invención y otras condiciones bajo las cuales se
usa la composición pueden ser determinadas en base a los métodos
conocidos en la técnica.
La composición enzimática según la invención
puede ser útil para al menos uno de los objetivos siguientes.
En la industria textil las celulasas son usadas
para el tratamiento del algodón y otros materiales celulósicos para
obtener un tratamiento de superficie de las fibras que resultan en
tejidos con propiedades alteradas tales como una tendencia al
frisado reducida, la eliminación de pelusa, un tejido más suave,
mejores efectos para el tacto o visuales. Especialmente las
celulasas se utilizan para producir un aspecto "lavado a la
piedra" de la tela vaquera. El uso de celulasas a altas
temperaturas permite crear nuevos aspectos tanto de tejidos de
algodón/celulósicos vaqueros y no vaqueros. Las celulasas
termoestables pueden ser incluidas en tratamientos a altas
temperaturas de tejidos que no habían sido posibles antes, el
lavado de la celulasa a 80ºC o bajo condiciones de vapor con una
proporción de lejía muy baja es posible y da el potencial de crear
aspectos nuevos.
El uso de celulasas termoestables en procesos de
limpieza industrial permite hacer un proceso de limpieza más fácil
cuando el material indeseado por extraer se basa en materia
celulósica. Ejemplos son la limpieza de membranas de ultra
filtración, tuberías y similares en la industria de
alimentos/piensos.
La incorporación de celulasa en materiales de
plástico y poliméricos termoestables extrudidos por calor con
relleno de celulosa, resultará en una degradabilidad más alta de
estos materiales en la naturaleza.
Materiales lignocelulósicos componen una gran
parte de los residuos agrícolas y forestales y del papel que es muy
dominante en los residuos municipales. Estos residuos son
normalmente quemados, lo cual desde el punto de vista de la energía
es un desperdicio enorme de recursos. Se ha dedicado mucho trabajo
a la tarea de desarrollar un proceso eficaz y económico para la
conversión de esta biomasa en azúcares que puedan ser fermentados
para producir p. ej. alcohol para el uso como combustible. Los
procesos propuestos para la conversión de lignocelulósicos en
azúcares incluyen el uso de celulasas pero se necesitan
dosificaciones muy altas que las hacen irreales en una gran escala
industrial desde un punto de vista económico. El uso de celulasas
termoestables con propiedades liquefactantes hace este proceso de
bioconversión más real. El tratamiento a altas temperaturas abre la
estructura de la pared celular en una cantidad de materiales
vegetales y hace la celulosa más accesible para el ataque
enzimático.
En la producción industrial de alcohol de
distintos tipos de granos, el proceso tradicional incluye la
licuefacción con alfa amilasa a temperaturas alrededor de
80-100ºC. La inclusión de celulasa en esta fase
aumentará el rendimiento de los azúcares fermentables. Esta
prelicuefacción de celulosa también hace real la inclusión de
celulasas tradicionales en el siguiente proceso, debido a un nivel
de hidrólisis más alto que sin prelicuefacción.
La predigestión de granos; centeno, cebada,
maíz, etc para la producción de piensos es otro uso potencial de la
celulasa termoestable, para aumentar la digestibilidad del pienso
en el animal.
La extracción de café para la producción de café
instantáneo se realiza a temperaturas entre
85-150ºC en una batería de columnas de filtración.
El agua pasa a contracorriente de la célula más extraída hasta la
recién llenada con café fresco. La temperatura de operación para
las células con el café fresco es de aprox. 100ºC. La inclusión de
celulasas termófilas en este punto aumentará la capacidad de las
columnas puesto que la materia soluble es liberada más fácilmente
cuando la estructura de la pared celular está abierta.
La inclusión de celulasas en otros procesos a
altas temperaturas tradicionales para la extracción de compuestos
de aceite o de aroma/sabor de fuentes vegetales naturales aumentará
la capacidad o rendimiento de la misma manera que para la
extracción de café. Un ejemplo es la extracción de aceite de palma
o aceite de avellana de palma que es un proceso acuoso a alta
temperatura.
\newpage
DSM 11201 de Escherichia coli conteniendo
el plásmido que comprende la secuencia de ADN que codifica la
enzima celulolítica de la invención, en el vector de donación
pSJ1678.
Una cepa de E. coli: Células de SJ2 de
E. coli (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L.,
Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes
alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from
Bacillus brevis J. Bacteriol.,
172;4315-4321), fueron preparadas para y
transformadas por electroporación usando un electroporador Gene
Pulser^{TM} de BIO-RAD según está descrito por el
proveedor.
pSJ1678 como se describe en la solicitud
internacional publicada como WO 94/19454.
Las manipulaciones de ADN y transformaciones
fueron realizadas usando métodos estándares de biología molecular
(Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel,
F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular
Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and
Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for
Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Las enzimas para las manipulaciones del ADN
fueron usadas según las especificaciones de los proveedores.
La secuencia de ADN que codifica la
endoglucanasa de la invención, puede ser obtenida del organismo de
E. coli, DSM 11201, depositado, por extracción del ADN
plásmido por métodos conocidos en la técnica (Sambrook et
al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY).
Una cepa DSM 6262 de Dictyoglomus sp.,
fue propagada en un 1 matraz de vidrio de 1 l durante 2 días a 70ºC
en el medio como se describe abajo.
1.0 g de NH_{4}Cl, 0.1 g de NaCl, 0.1 g de
MgCl_{2}, 0.05 g de CaCl_{2}, 0.4 g de
K_{2}HPO_{4}.3H_{2}O, 0.75 g de extracto de levadura, 4.0 g de
xilano de haya (Lenzing), 0.5 mg de Resazurina, 1.0 ml de metal
traza^{#},
^{#}solución de metal traza: 1.0
ml de solución de vitamina, 3.0 g de NaHCO_{3}, H_{2}O a 1
L.
2.0 g de FeCl_{2}.4H_{2}O, 0.05 g de
ZnCl_{2}, 0.05 g de MnCl_{2}, 0.05 g de AlCl_{3}, 0.05 g de
NiCl_{2}, 0.1 g de Na_{2}SeO_{3}.5H_{2}O, 0.05 g de
H_{3}BO_{3}, 0.03 g de CuCl_{2}, 0.05 g de
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}.4H_{2}O, 0.05 g de
CoCl_{2}.6H_{2}O, 0.5 g de EDTA, 1.0 ml de HCl Conc., H_{2}O
hasta 1 l.
Se enjuaga y dispensan 10 ml por botella bajo
N_{2}/CO_{2} (4:1). Se hace un tope con topes de caucho
impermeables al O_{2} y autoclave a 140ºC durante 20 min. Se
añaden 0.1 ml de solución de vitamina DSM #141 de una solución
anaeróbica filtroesterilizada y 0.2 ml de 2.5 g/l de
Na_{2}S.9H_{2}O de solución madre sometida a autoclave justo
antes de la inoculación con la técnica de la jeringa anaeróbica
estéril.
Las células fueron cosechadas, y el ADN genómico
aislado por el método descrito por Pitcher et al. (Pitcher,
D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid extraction of
bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl.
Microbiol. 8:151-156).
ADN genómico fue parcialmente digerido con la
enzima de restricción Sau3A, y dividido por tamaño por
electroforesis en un gel de agarosa al 0.7%. Los fragmentos entre 2
y 7 kb de tamaño fueron aislados por electroforesis en papel de
DEAE-celulosa (Dretzen, G., Bellard, M.,
Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable
method for the recovery of DNA fragments from agarose and
acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295-298).
\newpage
Los fragmentos de ADN aislados fueron ligados a
ADN del plásmido pSJ1678 digerido con BamHI, y la mezcla de
ligadura fue usada para transformar SJ2 de E. coli.
Las células fueron puestas en placas de LB agar
que contenían 0.1% de CMC
(Sodio-carboxi-metil-celulosa,
Aqualon, Francia) y 9 \mug/ml de Cloranfenicol para dar
500-1000 C.F.U./placa y se incubaron durante toda la
noche a 37ºC.
Después de la incubación las colonias fueron
réplicas puestas en placas sobre un grupo de placas de agar LB+CAM
y luego fueron incubadas adicionalmente a 37ºC durante aprox. 20
horas. Una capa que contenía un 0.1% de CMC, 1% de HSB agarosa en
un tampón apropiado con pH 7 fue vertida sobre las placas de las
réplicas e incubadas durante aprox. 20 horas a 65ºC. Las colonias
positivas de endoglucanasas fueron identificadas por coloración con
una solución acuosa al 0.1% de Rojo Congo (Sigma, EEUU) seguido del
lavado en 2 M de NaCl. Aparecieron unos halos en las posiciones
donde había clones positivos de endoglucanasa.
Las células de colonias de enzimas positivas
fueron extendidas para el aislamiento de las colonias individuales
en agar, y una colonia individual productora de enzimas fue
seleccionada para cada una de las colonias productoras de
endoglucanasas identificadas.
Se obtuvieron los los clones positivos de
endoglucanasa de las placas de realineación como colonias
individuales, y los plásmidos fueron extraídos. Los fenotipos
fueron confirmados por retransformación de SJ2 de E.coli, y
los plásmidos caracterizados por digestiones de restricción.
TY y LB agar (como se describe en Ausubel, F. M.
et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology".
John Wiley and Sons, 1995).
(Para su uso en la propiedad ii) de
evaluación del constructo de ADN de la
invención)
Las condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o
ARN homóloga implican el preremojo del filtro conteniendo los
fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 X SSC (citrato de
solución salina estándar) durante 10 min, y la prehibridación del
filtro en una solución de 5 X SSC (Sambrook et al. 1989), 5
x solución de Denhardt's (Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS
y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y
sometido a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989),
seguido de la hibridación en la misma solución que contiene una
sonda cebada aleatoriamente (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B.
(1983) Anal. Chem. 132:6-13), marcada en
^{32}P-dCTP (actividad específica > 1 X
10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es
luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% SDS
preferiblemente a no más de 55ºC, más preferiblemente no más de
60ºC, más preferiblemente no más de 65ºC, incluso más
preferiblemente no más de 70ºC, especialmente no más de 75ºC.
La sonda de nucleótidos para usar en la
hibridación es la parte de codificación de endoglucanasa de la
secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido presente en DSM
11201 de Escherichia coli.
Los anticuerpos para ser usados para determinar
la reacción cruzada inmunológica pueden ser preparados usando una
endoglucanasa purificada. Más específicamente, el antisuero contra
la endoglucanasa de la invención puede ser aumentado inmunizando
conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por N.
Axelsen et al. en: Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973,
capítulo 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in
Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más
específicamente págs. 27-31). Las inmunoglobulinas
purificadas pueden ser obtenidas de los antisueros, por ejemplo por
precipitación de sal ((NH_{4})_{2}
SO_{4}), seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en DEAE- Sephadex. La caracterización inmunoquímica de las proteínas puede hacerse bien por análisis de doble difusión de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., Capítulo 2).
SO_{4}), seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en DEAE- Sephadex. La caracterización inmunoquímica de las proteínas puede hacerse bien por análisis de doble difusión de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., Capítulo 2).
Los ejemplos no limitativos siguientes ilustran
la invención.
Un banco de Dictyoglomus sp., DSM 6262,
fue construido en E. coli y seleccionado como se describe en
Materiales y Métodos. Un transformante positivo aislado fue DSM
11201 conteniendo el plásmido pSJ1678 que comprende la secuencia de
ADN que codifica la enzima celulolítica de la invención.
El clon de E. coli aislado fue
simultáneamente evaluado en placas de LB+CAM agar conteniendo 0.1%
de AZCL Beta-glucano, AZCL xiloglucano, AZCL HE
celulosa, AZCL xilano, AZCL curdlano o AZCL galactomanano. Las
placas fueron incubadas durante aprox. 48 horas a 37ºC seguido de
la incubación a 65ºC. La actividad enzimática fue identificada por
halos azules alrededor de las colonias. El clon fue encontrado
positivo en AZCL Beta-glucano, AZCL xiloglucano y
AZCL HE celulosa.
DSM 11201 fue inoculado como un precultivo en un
frasco de agitación conteniendo 200 ml de medio
Super-Broth con la composición siguiente (por
litro): Triptona 32 g, extracto de levadura 20 g, NaCl 5 g, CMC 5
g, pH 7.2-7.3 ajustado con 1 M de NaOH. Se sometió
a autoclave 121ºC, 20 minutos.
Después de la esterilización se añadió
cloranfenicol a una concentración final de 6 mg/ml. El frasco de
agitación fue incubado en un agitador giratorio a 280 rpm, 37ºC,
durante 16 horas. 1 ml del cultivo fue inoculado a 100 frascos de
agitación con 200 ml del medio Super-Broth y se
incubó a 37ºC, 280 rpm entre 16 y 18 horas. Se centrifugó a 3000
rpm el cultivo de 20 litros de E. coli, se resuspendió el
granulado en 800 ml de tampón Tris-maleato 50 mM, pH
7.0. Las células se rompieron a 800 bar con un Homogenizador de
laboratorio de alta presión Rannie. Se centrifugó durante 1 hora,
10.000 rpm y se recogió el sobrenadante claro.
600 ml de extracto celular de E. coli
fueron tratados en primer lugar por calor a 70ºC durante 5 min
seguido de centrifugado a 5000 rpm durante 20 min. El sobrenadante
fue filtrado a través de un filtro D de Whatman y en total se
obtuvieron 200 ml con una actividad de 11 CMCU por ml (determinación
de CMCU, ver abajo).
La solución fue pasada por una columna de
S-Sepharose equilibrada con un tampón de acetato de
sodio 0.05 M con pH 5.0. La endoglucanasa unida fue eluida con 0.5
M de cloruro sódico y en total un volumen de 300 ml se obtuvo con 2
CMCU/ml. Esta solución fue ajustada a pH 9.0 y equilibrada con 20 mM
de tampón de etanolamina con pH 9.0 en una célula de
ultrafiltración Amicon con una membrana con un corte de 10 kD.
Después, cuando la conductividad está alrededor de 250 micro S/cm
la solución es aplicada a una Columna de Q-sepharose
equilibrada con el mismo tampón. La endoglucanasa se enlazará y
puede ser eluida usando un gradiente de cloruro sódico. Debido a la
conductividad demasiado alta en la primera prueba obtuvimos sólo 2
ml con 65 CMCU/ml.
Finalmente, la solución fue concentrada y
aplicada a una columna de tamaño Superdex 200 en 0.1 M de acetato
sódico pH 6.0 y la endoglucanasa pura eluida en un volumen de 22 ml
que fue concentrada usando una célula de ultrafiltración Amicon con
una membrana con un corte de 6 kD. Se obtuvo 1 ml con 40 CMCU por
ml. Esta muestra mostró una única banda en SDS-PAGE
con un PM de 30 kD y un pl de 6.5. La proteína fue
electrotransferida y aplicada para la secuenciación
N-terminal usando un secuenciador de Applied
Biosystems modelo 473A. El secuenciador de proteínas fue accionado
según las instrucciones del fabricante y se obtuvo la secuencia
siguiente:
QTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFFNIAAY-
La endoglucanasa pura tiene actividad en
p-nitrofenil-beta-D-celobiosida
(Sigma), CMC, HE celulosa (Megazime) y celulosa ácida inflada.
Una unidad CMCU está definida como la cantidad
de enzima que libera el equivalente a 1 mmol de glucosa por min
bajo condiciones estándar.
La enzima es incubada durante 20 min. en una
solución CMC al 0.75% (7L de Hércules) en un tampón de barbiturato
de sodio 0.1 M pH 8.5. Tras la incubación se determina el aumento
de los grupos terminales de reducción usando PHBAH (SIGMA
H-988253H7704 (HIDRACIDA DE ÁCIDO
p-HIDROXI BENZOICO)) y con una glucosa estándar se
calcula la formación de grupos terminales de glucosa equivalentes
por min. (Lever, M. (1972) A new reaction for colorimetric
determination of carbohydrates. Anal. Biochem. vol 47, página
273-279).
La endoglucanasa mostró 137 CMCU/mg de proteína
a 70ºC y pH 8.5 (50 CMCU por A_{280}).
La endoglucanasa fue incubada en el ensayo CMCU
a pH 8.5 a temperaturas diferentes y la actividad después de 20
min. de incubación fue determinada según el modo descrito
anteriormente. no se realizaron incubaciones por encima de 90ºC. La
cantidad de azúcar de reducción obtenida a esta temperatura fue la
máxima y se usó para el cálculo de la actividad relativa a
temperaturas inferiores.
Temp. | Actividad rel. |
90ºC | 100% |
80ºC | 76% |
70ºC | 40% |
60ºC | 26% |
50ºC | 14% |
40ºC | 7% |
La endoglucanasa fue incubada en el ensayo de
CMCU a 70ºC usando tampones diferentes en el intervalo de pH entre
4.5 y 11 y la actividad después de 20 min. de incubación fue
determinada según el modo descrito anteriormente.
- Tampones:
- pH 4.5, 5.0 y 5.5; 0.1 M de Na-acetato
- \quad
- pH 6.0; 0.1 M de Na-MES
- \quad
- pH 6.5, 7.0 y 7.5; 0.1 M de Na-MOPS
- \quad
- pH 8.0 y 8.5; 0.1 M de EPPS
- \quad
- pH 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 y 11.0; 0.1 M de Na-glicina
Se obtuvo más del 50% de la actividad relativa
en el intervalo de pH 5.5 a 11.
Una unidad de PNPU está definida como la
cantidad de enzima que libera un mmol de
p-nitrofenol por minuto de
p-nitrofenil-beta-D-celobiosida
(Sigma) bajo condiciones estándar.
Método: Cinética del estado estacionario,
detección directa del producto p-nitrofenol, da un
color amarillo, que es detectado a 405 nm. La actividad es medida
como el aumento de la absorbancia, la parte lineal de la curva se
utiliza para determinar la pendiente (AU/seg). La actividad se
calcula usando una absorbencia de p-nitrofenol en
un tampón fosfato con pH 7.5: Absorbencia en una cubeta de 1 cm, 1
mM de 0.018 a 405 nm (0.014 a 420 nm).
475 ml de 10 mM de
p-NP-beta-d-celobiosido
en 0.1 M de tampón Na-fosfato , pH 7.5
25 ml de solución enzimática
La medición se hace en un Espectrofotómetro HP
8452A Diode Array controlado termostáticamente a 70ºC en una cubeta
de 0.75 ml, 1 cm de ancho.
Se mide la absorbencia a 405 nm en 300 seg con
una medición cada 20 seg.
La endoglucanasa mostró 170 PNPU por A_{280} a
70ºC y pH 7.5.
Se preparó una solución madre de PASC de la
siguiente manera usando acetona helada y ácido fosfórico. 5 gramos
de celulosa (Avicel®) fueron humedecidos con agua, y se añadieron
150 ml de ácido orto-fosfórico al 85%. La mezcla
fue colocada en un baño de hielo bajo agitación lenta durante 1 hr.
Luego se añadieron 100 ml acetona helada con agitación. La pasta
fue transferida a un filtro Buchner con el disco pyrex sinterizado
número 3 y luego lavada tres veces con 100 ml de acetona helada, y
aspirada hasta secarse en la mayor medida posible después de cada
lavado. Finalmente, la torta de filtración fue lavada dos veces con
500 ml de agua, aspirada hasta secarse en la mayor medida posible
después de cada lavado. El PASC fue mezclado con agua desionizada a
un volumen total de 300 ml, mezclado hasta su homogeneidad (usando
el Homogenizador Ultra Turrax) y almacenado en el frigorífico
(hasta un mes).
Equilibrado del sustrato con tampón: 20 gramos
de solución madre de celulosa inflada por ácido fosfórico PASC
fueron centrifugados durante 20 min a 5000 rpm., el sobrenadante
fue colado; el sedimento fue resuspendido en 30 ml de tampón y
centrifugado durante 20 min. a 5000 rpm., el sobrenadante fue
colado, y el sedimento fue resuspendido en el tampón hasta un total
de 60 g correspondiente a una concentración de sustrato de 5 g de
celulosa/litro.
Tampón para la determinación del pH 8.5 : 0.1 M
Barbital.
La solución enzimática está diluida en el mismo
tampón que el sustrato.
El sustrato en la solución del tampón es
precalentado durante 5 min. a 80ºC (2 ml).
Luego se añade la solución enzimática (diluida)
0.5 ml y se mezcla durante 5 seg. Se obtienen blancos enzimáticos
añadiendo el reactivo de parada antes de la solución enzimática. Se
incuba durante 20 min. a 80ºC. La reacción es detenida añadiendo
0.5 ml de solución de NaOH al 2% y se mezcla durante 5 seg.
Las muestras son centrifugadas durante 20 min. a
5000 rpm. 1 ml de sobrenadante es mezclado con 0.5 ml de reactivo
PHBAH y se hierve durante 10 min. Los tubos de ensayo son enfriados
en un baño de agua helada.
La absorbancia a 410 nm es medida usando un
espectrofotómetro. Se obtuvo una curva de glucosa estándar usando
concentraciones de glucosa de 5, 10, 15 y 25 mg/l en el mismo
tampón y añadiendo el reactivo PHBAH antes de la ebullición. La
liberación del equivalente de la glucosa de reducción se calcula
usando esta curva estándar.
Actividad catalítica en la celulosa inflada por
ácido fue determinada usando el ensayo según el modo descrito
anteriormente bajo condiciones estándar a pH 8.5 y 80ºC con
concentraciones de sustrato diferentes. Las constantes cinéticas
fueron calculadas usando el programa informático cinético Grafit de
Michaëlis-Menten. En base a la composición de los
aminoácidos de la endoglucanasa, se determinó que el coeficiente de
extinción molar era 85630. En consecuencia, los datos siguientes
fueron obtenidos:
K_{cat} = 77 por seg.
K_{m} = 2.5 gramo celulosa hinchada por ácido
por litro.
La cepa de Bacillus subtilis descrita
abajo, que comprende el plásmido de expresión que codifica la
endoglucanasa termoestable clonada de DSM 6262 de
Dictyoglomus sp., fue depositada por los inventores según el
Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito
de Microorganismos a los fines del procedimiento en materia de
patentes en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124
Braunschweig, República federal de Alemania, el 16 Diciembre 1997
bajo el número de deposición DSM 11903.
SJ2 de E. coli (Diderichsen, B.,
Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sj\diameterholm, C.
(1990) Cloning of aldB, which encodes
alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from
Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172,
4315-4321) Se prepararon y transformaron las
células electrocompetentes usando un Bio-rad
GenePulser^{TM} según lo recomendado por el fabricante.
A164 de B.subtilis. Esta cepa es un
derivado de ATCC 6051a de B.subtilis, teniendo una
esporulación deficiente y habiendo tenido los genes apr y
npr interrumpidos. Las interrupciones fueron realizadas
esencialmente como se describe en (Eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch
and Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other
Gram-Positive Bacteria, American Society for
microbiology, pág.618). Las células competentes fueron preparadas y
transformadas como se describe por Yasbin, R.E., Wilson, G.A. and
Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic
strains of Bacillus subtilis: evidence for selective
induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol,
121:296-304.
pUB110. plásmido descrito en
(McKenzie,T., Hoshino,T., Tanaka,T. and Sueoka, N. The nucleotide
sequence of pUB110: some salient features in relation to
replication and its regulation Plasmid 15 (2),
93-103 (1986)) y (McKenzie,T., Hoshino,T.,
Tanaka,T. and Sueoka,N. Correction. A revision of the nucleotide
sequence and functional map of pUB110 Plasmid 17 (1),
83-85 (1987)).
pMUTIN-4-MCS:
El plásmido puede ser obtenido por Laboratoire de Genetique
Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique, 78352
Jouy en Josas - CEDEX, Francia.
LB agar (como se describe en Ausubel, F.
M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular
Biology". John Wiley and Sons, 1995).
LBPG es LB agar suplementado con 0.5% de
Glucosa y 0.05 M de fosfato potásico, pH 7.0.
AZCL-HE-celulosa se añade
a LBPG-agar al 1%.
AZCL-HE-celulosa es de Megazyme,
Australia.
El medio BPX está descrito en la
solicitud internacional publicada como WO 91/09129.
El plásmido fue construido y el clon fue
esencialmente establecido como sigue:
El pMUTIN4MCS es un plásmido de E. coli
que tiene un promotor híbrido SPAC (Yansura et al. (1984)
Use of E. coli lac repressor and operator to control gene
expression in Bacillus subtilis, PNAS, Vo181, pp.
439-443) y un gen lacZ bajo control transcripcional
de este promotor. Además el plásmido contiene el gen lacl bajo
control de un promotor penP de Bacillus spe. Así cuando esté
en B.subtilis el lacl será expresado y enlazado con el
operador del promotor-operador SPAC, luego esto
inhibirá la transcripción de la secuencia descendente. El Promotor
es el mismo que en Yansura et al., no obstante el operador
fue modificado en un palíndromo perfecto. Un sitio HindIII justo
debajo de la región del promotor- operador permitió disgregar el gen
lacZ por inserción de otro gen, es decir el gen de endoglucanasa de
esta invención, dejando así la expresión de la endoglucansa bajo el
control del promotor-operador SPAC.
En el plásmido pMUTIN4MCS de E.coli un
centro de unión del ribosoma (RBS) y un péptido señal con un sitio
SacII para los fines de clonación, fueron clonados como un
fragmento hindIII-SacI. Estableciendo así el centro
de unión del siguiente ribosoma y la secuencia de ADN que codifica
el péptido señal:
La secuencia de ADN que codifica un péptido
señal de Bacillus sp. está escrita en itálico, la cual al
ser fundida en otra secuencia de ADN que codifica la parte madura
de una proteína la dirigirá al exterior de una célula de
Bacillus sp.
Bacillus sp.
La secuencia anterior codifica el sitio HindIII
de pMUTIN4MCS directamente seguido de un RBS de Bacillus
subtilis y una secuencia de ADN que codifica un péptido señal
de Bacillus spe. que termina con un sitio SacII introducido
artificialmente seguido de un sitio de restricción NotI y SacI. El
plásmido fue establecido en SJ2 de E.coli por electroporación
y se dispuso en placas de LB-agar con 100 pg/ml de
ampicilina y se incubaron las células durante toda la noche a 37ºC.
El plásmido resultante fue denominado pMUTIN4-señal
SacII-NotI.
El gen de endoglucanasa termoestable fue clonado
como un fragmento de PCR digerido por
SacII-EagI.
El fragmento de PCR se obtuvo usando el kit HiFi
Expand PCR de Boehringer Mannheim y se realizó la reacción según lo
recomendado por el fabricante. El fragmento de ADN fue amplificado
a partir del plásmido pDSM11201. El gen de endoglucanasa
termoestable fue originalmente clonado de DSM6262 de
Dictyoglomus spe. y depositado como un clon (DSM 11201) de
E.coli que comprende un plásmido con el gen de endoglucanasa.
Los dos cebadores de la PCR usados fueron los siguientes:
El fragmento de PCR y el
pMUTIN4-señal SacII-NotI fueron
digeridos con SacII-EagI, ligados juntos y usados
para transformar SJ2 de E.coli por electroporación y fueron
dispuestos en placas de LB-agar con 100 pg/ml de
ampicilina y se incubaron las células durante toda la noche a 37ºC.
El plásmido resultante en SJ2 fue denominado
pMB447A.
pMB447A.
Después de haber clonado el gen de endoglucanasa
en fusión con el péptido señal anterior (en el sitio de
SacII-No/EagI) resultó el marco de lectura abierto
siguiente bajo el control transcripcional del
promotor-operador SPAC:
\newpage
y la proteína
derivada:
Con el objetivo de poder propagar el pMB447A en
Bacillus subtilis el plásmido de E.coli fue fundido
en un derivado de pUB110 (un plásmido propagable en
B.subtilis): En el sitio NciI de pUB110 un sitio SacI y NotI
fueron introducidos usando un poliligador, el inserto resultante
tuvo la secuencia siguiente:
CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG
Los dos sitios de NciI que resaltan entre estos
son los sitios SacI y EagI (NotI).
Este plásmido fue luego digerido con SacI y EagI
y ligados a pMB447A digerido con SacI-EagI, la
ligadura fue usada para transformar A164 de Bacillus
subtilis. Los clones fueron establecidos y crecidos durante toda
la noche en placas de LBPG-10 Kana
AZCL-HE-celulosa. Al día siguiente
estas placas fueron incubadas a 70ºC durante 5 horas y la aparición
de halos azules indicó la expresión positiva de la endoglucanasa
termoestable.
Al analizar el ADN del plásmido aislado del clon
MB505 (DSM 11903) fue evidente que el plásmido había sufrido la
recombinación y el plásmido resultante fue más pequeño que el
tamaño esperado del plásmido de 12.5 kb. Así resultó que el
plásmido había perdido la mayor parte del plásmido de E.coli
pMUTIN 4 Señal SacII-NotI, dando como resultado un
plásmido del tamaño aproximado de 5.5 kb.
El plásmido resultante tiene las características
esenciales siguientes:
La endoglucanasa codificada en el plásmido de
DSM 11903 fue positivamente expresada sin tener que añadir IPTG y
el plásmido confirió resistencia a 10 pg/ml de Canamicina.
El MB505 fue cultivado 5 días en frascos de
agitación de 500 ml con dos deflectores y 100 ml de medio BPX a
37ºC a 300 rpm.
5000 ml de fluido del cultivo del frasco de
agitación de Bacillus con el clon MB 505 fueron recibidos, y
el fluido del cultivo fue tratado con calor calentándolo a 70ºC y
manteniéndose a esta temperatura durante 5 min bajo agitación. Luego
se enfrió y centrifugó a 9000 rpm durante 20 min. Se obtuvieron
4000 ml de sobrenadante claro que contenían 2.4 CMCU por ml.
El CMCU fue determinado a 70ºC y pH 8.5.
6000 CMCU fue aplicado a 3000 ml de DEAE
A-50 Sephadex equilibrados en un tampón de Mes 50
mM pH 6.2. El material no ligado contenía un total de 5700 CMCU.
El material no ligado fue aplicado a una columna
Q-Spharose de 1000 ml equilibrada con 20 mM de
tampón de etanolamina pH 9.5. La enzima ligada fue eluida usando un
gradiente de NaCl.
El producto parcialmente purificado fue
concentrado usando una célula de ultrafiltración de amicon con una
membrana con un límite de corte de 6 kDa.
La fracción concentrada fue formulada con el 40%
de nonopropilenglicol.
Se obtuvo un total de 250 ml con una
concentración de 9.7 CMCU por ml (2425 CMCU en total) y se usó para
ensayos de aplicación.
La celulasa altamente purificada de
Dictyoglomus (del Ejemplo 2) fue usada para la producción de
antisuero.
El procedimiento de inmunización fue conducido
en DAKO usando conejos. Cada conejo fue inmunizado con 100 \mul
de celulasa (0.4 mg de proteína por ml) mezclada con 100 \mul de
adyuvante. Cada conejo fue inmunizado 15 veces con un intervalo de
una semana. El suero de conejo fue recogido y la gammaglobulina fue
purificada del suero.
Placas Mancini, por ejemplo 25 ml de gel de
agarosa al 1% (15*10 cm), con 50 \mul de gammaglobulina (A280
=106.5) y con pocillo de 4 mm donde 10 pl de muestra fueron
aplicados y se incubó durante 1 día a la temperatura ambiente en
una cámara húmeda.
La placa fue lavada en 0.95 de agua de NaCl
varias veces y coloreada con azul Coomassie según el procedimiento
estándar.
Los diámetros siguientes fueron obtenidos de la
celulasa de Dictyoglomus altamente purificada o del MB505
parcialmente purificado formulados, respectivamente:
40 CMCU dieron 11.5 mm de diámetro.
20 CMCU dieron 9.5 mm de diámetro.
10 CMCU dieron 7 mm de diámetro
10 CMCU 8 mm de diámetro.
Otra familia de 12 celulasas (p. ej. de los
géneros fúngicos de Trichoderma, Humicola,
Aspergillus) no formaron ningún inmunoprecipitado bajo estas
condiciones.
- Aparato:
- Mathis Pad-steam Range, tipo: PSA-HTF
- Tejido:
- Tejido de algodón entrelazado blanqueado (Test fabrics Inc.): N.O. blanco, 100% algodón, estilo 460. El tejido fue cortado en trozos de un tamaño 20x30 cm (aprox. 12.5 g cada uno).
- Enzima:
- Dictyoglomus, lote MB505;9.7 CMC U/ml
- Tampón:
- 15 mM tampón de fosfato pH 6.0
- \quad
- 15 mM tampón de fosfato pH 8.1
Muestras de tejido fueron acondicionadas en una
habitación climatizada (65\pm2% humedad relativa y 70\pm3ºF
temperatura) estándar AATCC (Asociación Americana de Químicos y
Coloristas) durante al menos 24 horas. Se obtuvo su peso.
Se hicieron soluciones enzimáticas mezclando la
enzima con el tampón. El pH fue ajustado y la actividad enzimática
en las soluciones fue mostrada en la tabla 1 abajo. Las muestras
fueron sumergidas en soluciones enzimáticas durante menos de 45
segundos y luego rellenas. Después del relleno, las muestras fueron
pesadas y colgadas en el vaporizador de Mathis inmediatamente. El
porcentaje de solución en el tejido mostrado como detección de
humedad de las muestras de tejido fue también presentado en la
tabla 1:
Tejido (#) | Solución enzimática | pH de la solución | Detección de humedad |
(CMCU/ml) | (% p/p) | ||
1 | 0 | 6 | 125 |
2 | 0 | 8.1 | 128 |
3 | 4.8 | 6 | 130 |
4 | 4.8 | 8.1 | 131 |
5 | 9.7 | 6 | 137 |
6 | 9.7 | 8.1 | 137 |
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de tejido fueron tratadas en un
vaporizador con las condiciones siguientes:
Temperatura: | 90ºC |
Tiempo: | 90 min |
Humedad relativa: | 100% |
Todas las muestras son transferidas y enjuagadas
en agua desionizada durante al menos 5 minutos. Se secaron al aire
y luego se acondicionaron en la habitación climatizada AATCC
durante al menos 24 horas antes de la
evaluación.
evaluación.
\vskip1.000000\baselineskip
- Pérdida de resistencia:
- la resistencia del tejido fue medida en el modelo C de probador de Mullen Burst según ASTM D3786-87. Los datos son un promedio de al menos 8 medidas.
- Nota de frisado:
- Medido según ASTM D 4970-89 usando un Probador Matindale Pilling a 500 revoluciones. El frisado en el tejido es evaluado visualmente desde la escala 1 a 5, donde 1 es un frisado muy severo y 5 no está frisado. Los datos son un promedio de al menos 2 medidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados están resumidos abajo y los datos
están mostrados en la Tabla 2 y 3.
- 1.
- Cuando la concentración enzimática aumenta, aumenta la nota de frisado (en la tabla 3),
- 2.
- La celulasa de Dictyoglomus da mejor nota de frisado a pH 8.1 que a pH 6.0 (Tabla 3),
- 3.
- Con estas condiciones, el Biopulido da una pequeña pérdida de resistencia del tejido a pH 6.0 (menos del 5%), pero no se detectó pérdida de resistencia a pH 8.1.
Se puede concluir que el biopulido del tejido de
algodón con celulasa de Dictyoglomus mejora la resistencia
de frisado del tejido significativamente con las condiciones de
este estudio. Con condiciones preferidas tales como pH de
aproximadamente 8, se obtuvo buena resistencia de frisado sin
pérdida de resistencia detectable.
Tejido (#) | Pérdida de resistencia (%) | Nota de frisado (500 rev) |
1 | 0 | 1.5 |
2 | 0 | 2 |
3 | 2.4 | 2 |
4 | 0 | 2.75 |
5 | 3.5 | 2.5 |
6 | 0 | 3 |
\vskip1.000000\baselineskip
Celulasa (CMCU/g) | Nota de frisado 500 rev, pH 6 | Nota de frisado 500 rev, pH 8.1 |
0 | 1.5 | 2.0 |
4.8 | 2.0 | 2.8 |
9.7 | 2.5 | 3.0 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 45 4449 3256
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Una endoglucanasa nueva
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 867 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 288 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
Claims (29)
1. Preparación enzimática con actividad
endo-1,4-\beta-glucanasa,
preparación que comprende
a) un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID NO:2 o
b) un polipéptido que muestra al menos el 70% de
identidad con la SEC ID NO:2, donde el polipéptido de a) o b) tiene
actividad óptima por encima de 85ºC y más del 50% de la actividad
relativa en el intervalo de pH 5.5 a 11.
2. Preparación enzimática según la
reivindicación 1 donde dicho polipéptido está codificado por
a) un polinucleótido que tiene la secuencia de
la SEC ID NO:1 o
b) un polinucleótido que tiene al menos el 70%
de identidad con la secuencia SEC ID NO:1.
3. Preparación enzimática según la
reivindicación 1 o 2 que tiene actividad óptima a una temperatura
superior a 85ºC.
4. Preparación según la reivindicación 1, 2 o 3,
donde la preparación enzimática es obtenible de o es endógena a una
cepa de las filum Bacterias Gram Positivas.
5. Preparación según la reivindicación 4, donde
la cepa pertenece a la subdivisión Clostridia, preferiblemente al
género Dictyoglomus.
6. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 que es activa a un pH entre
aproximadamente 4 y aproximadamente 11, preferiblemente entre
aproximadamente 5.5 y aproximadamente 10.
7. Preparación enzimática según la
reivindicación 1 o 2, donde la actividad hacia la
carboximetilcelulosa (ensayo de CMC) a 70ºC y pH 10 es superior al
50% con respecto a la actividad a 70ºC y pH óptimo.
8. Preparación según la reivindicación 7, donde
la actividad relativa es superior al 55%, preferiblemente superior
al 60%, más preferiblemente superior al 65%, especialmente superior
al 70%.
9. Preparación según la reivindicación 7 u 8,
donde la preparación enzimática es obtenible de o endógena a una
cepa de las filum Bacterias Gram Positivas.
10. Preparación según la reivindicación 9, donde
la cepa pertenece a la subdivisión Clostridia, preferiblemente al
género Dictyoglomus.
11. Constructo de ADN que codifica una
endoglucanasa con actividad óptima por encima de 85ºC y más del 50%
de actividad con respecto al intervalo de pH 5.5 a 11, cuyo
constructo comprende
a) la secuencia de polinucleótidos de la SEC ID
NO:1 o
b) un polinucleótido que tiene al menos el 70%
de identidad con la secuencia de a).
12. Constructo de ADN según la reivindicación
11, donde la secuencia de ADN es aislada de o producida en base a
un banco de ADN de un procariota o un arqueal, preferiblemente de
una bacteria.
13. Constructo de ADN según la reivindicación
12, donde la secuencia de ADN es aislada de o producida en base a
un banco de ADN de una cepa de las filum Bacterias Gram Positivas,
preferiblemente a la subdivisión Clostridia, en particular una cepa
de Dictyoglomus.
14. Constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 11-13, donde la secuencia de ADN
está aislada de DSM 11201 de Escherichia coli.
15. Constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 11-14 que además comprende una
secuencia de ADN que codifica un dominio de unión a celulosa
(CBD).
16. Constructo de ADN según la reivindicación 15
que además comprende una secuencia de ADN que codifica un dominio
de unión a celulosa (CBD), el dominio de unión a celulosa y el
núcleo de la enzima (dominio catalíticamente activo) de la enzima
codificada por la secuencia de ADN del constructo de ADN estando
operativamente
enlazado.
enlazado.
17. Vector de expresión recombinante que
comprende un constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 11-16.
18. Célula que comprende un constructo de ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 11-16 o un
vector de expresión recombinante según la reivindicación 17.
19. Célula según la reivindicación 18, que es
una célula procariótica, en particular una célula bacteriana, o una
célula endógena de la cual se origina la secuencia de ADN, que
codifica una enzima que muestra actividad endoglucanasa.
20. Célula según la reivindicación 19, donde la
célula pertenece a una cepa de Bacillus, preferiblemente a
una cepa del grupo que compuesto por Bacillus subtilis,
Bacillus lentus, Bacillus liquefaciens y Bacillus
licheniformis.
21. Célula según la reivindicación 19, donde la
célula pertenece a una cepa de un hongo filamentoso,
preferiblemente a una cepa del grupo compuesto por los géneros
Aspergillus, Fusarium y Trichoderma, más
preferiblemente a una cepa del grupo compuesto por las especies
Aspergillus Níger, Aspergillus oryzae, Fusarium
graminerarum y Trichoderma reesei.
22. Célula según la reivindicación 19, donde la
célula pertenece a una cepa de Dictyoglomus.
23. Célula según la reivindicación 18, donde la
célula pertenece a una cepa de Saccharomyces,
preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
24. Método para producir una enzima que tiene
actividad endoglucanasa y actividad óptima por encima de 85ºC, el
método comprendiendo el cultivo de una célula según cualquiera de
las reivindicaciones 18-23 bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima
del cultivo.
25. Enzima que tiene actividad endoglucanasa
termoestable y actividad óptima por encima de 85ºC y más del 50% de
la actividad relativa en el intervalo de pH 5.5 a 11, enzima que
está codificada por un constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 11-16.
26. Preparación enzimática que está enriquecida
con la enzima según la reivindicación 25.
27. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10 y 26, que adicionalmente
comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo compuesto por
mananasas, galactanasas, xilanasas, arabinanasas, pectina acetil
esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectin liasas,
pectato liasas, pectina metil-esterasas,
endoglucanasas, proteasas, lipasas, amilasas, cutinasas,
peroxidasas, lacasas, celobiohidrolasas y transglutaminasas.
28. Cultivo biológico substancialmente puro
aislado de la cepa DSM 11201 de Escherichia coli.
29. Uso de la enzima según la reivindicación 25
o de la preparación enzimática según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, 26 y 27 en la industria
textil para mejorar las propiedades de las fibras o tejidos
celulósicos o para porporcionar un aspecto lavado a la piedra de la
tela vaquera; o en procesos de limpieza industrial; o material
polimérico extrudido por calor; o en la conversión de biomasa en
azúcares; o en la producción de alcohol; o para la predigestión de
p. ej. granos usados en la producción de piensos; o en la
producción de café instantáneo o en procesos de extracción
similares.
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2545161A1 (es) * | 2014-03-07 | 2015-09-08 | Abengoa Research, S.L. | Polipéptidos con actividad celulasa |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2315528C (en) † | 1997-12-19 | 2009-04-21 | Novo Nordisk Biochem North America, Inc. | Continuous biopolishing of cellulose-containing fabrics |
DE19845207A1 (de) * | 1998-10-01 | 2000-04-20 | Karoly Kery | Enzympräparation für die Verbesserung der Bioabbaubarkeit von Biomasse |
AU2002346709A1 (en) * | 2002-01-04 | 2003-07-30 | The Procter And Gamble Company | Cellulose-active microorganisms |
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DE602005010568D1 (de) * | 2005-07-18 | 2008-12-04 | Kraft Foods Global Brands Llc | Enzymunterstützte Herstellung löslichen Kaffees |
US8198068B2 (en) | 2008-02-19 | 2012-06-12 | Novozymes A/S | Method for stonewashing fabrics using cellulase |
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US8771993B1 (en) * | 2013-02-12 | 2014-07-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having endoglucanse activity and polynucleotides encoding same |
WO2015035914A1 (en) * | 2013-09-11 | 2015-03-19 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
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CN114958809A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-08-30 | 中农华威生物制药(湖北)有限公司 | 一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5275944A (en) * | 1989-09-26 | 1994-01-04 | Midwest Research Institute | Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068 |
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- 1997-12-19 WO PCT/DK1997/000583 patent/WO1998028410A1/en active IP Right Grant
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2545161A1 (es) * | 2014-03-07 | 2015-09-08 | Abengoa Research, S.L. | Polipéptidos con actividad celulasa |
WO2015132442A1 (es) * | 2014-03-07 | 2015-09-11 | Abengoa Research, S.L. | Polipéptidos con actividad celulasa |
Also Published As
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DE69735677T2 (de) | 2006-12-14 |
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BR9713780A (pt) | 2000-03-21 |
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