ES2343227T3 - Endo-beta-1,4-glucanasa termoestable. - Google Patents
Endo-beta-1,4-glucanasa termoestable. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2343227T3 ES2343227T3 ES98900849T ES98900849T ES2343227T3 ES 2343227 T3 ES2343227 T3 ES 2343227T3 ES 98900849 T ES98900849 T ES 98900849T ES 98900849 T ES98900849 T ES 98900849T ES 2343227 T3 ES2343227 T3 ES 2343227T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- enzyme
- endo
- dna sequence
- glucanase
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
- C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
- C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
- D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
- D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
- D06P5/02—After-treatment
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima que tiene actividad endo-β-1,4-glucanasa y actividad óptima a una temperatura de al menos 90ºC, preferiblemente al menos 95ºC, más preferiblemente al menos 100ºC, la secuencia de ADN comprende a) la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-β-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, o b) un análogo de la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-β-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, que i) es al menos idéntica en un 80%, con la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-β-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, o ii) codifica un polipéptido que es al menos idéntico en un 50%, con el polipéptido de SEC ID NO:2 o el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-β-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203.
Description
Endo-beta-1,4-glucanasa
termoestable.
La presente invención se refiere a una enzima
con actividad celulolítica a alta temperatura, especialmente una
endo-beta-1,4-glucanasa;
una secuencia de ADN clonada codificando la enzima con actividad
celulolítica; un método para proporcionar un gen que codifica tal
enzima; un método para producir la enzima; una composición
enzimática que comprende la enzima con actividad celulolítica; y el
uso de dicha enzima y composición enzimática para varias
aplicaciones industriales.
Celulasas o enzimas celulolíticas son enzimas
implicadas en hidrólisis de celulosa. En la hidrólisis de celulosa
nativa, es conocido que hay tres tipos más importantes de enzimas de
celulasa implicadas, a saber celobiohidrolasa
(1,4-beta-D-glucano
celobiohidrolasa, EC 3,2,1,91),
endo-beta-1,4-glucanasa
(endo-1,4-beta-D-glucano
4-glucanohidrolasa, EC 3,2,1,4) y
beta-glucosidasa (EC 3,2,1,21).
Especialmente las
endo-beta-1,4-glucanasas
(EC nº. 3,2,1,4) constituyen un grupo interesante de hidrolasas para
los usos industriales mencionados.
Endo-beta-1,4-glucanasas
catalizan la endohidrólisis de enlaces
1,4-beta-D-glicosídícos
en celulosa, derivados de celulosa (tal como carboxi metil celulosa
e hidroxi etil celulosa), liquenina, enlaces
beta-1,4 en glucanos beta-1,3
mezclados tales como beta-D-glucanos
de cereal o xiloglucanos y otro material vegetal que contiene partes
celulósicas. El nombre autorizado es
endo-1,4-beta-D-glucan
4-glucano hidrolasa, pero el término abreviado
endo-beta-1,4-glucanasa
se usa en la presente descripción. Cabe hacer referencia a T.-M.
Enveri, "Microbial Cellulases" en W.M. Fogarty, Microbial
Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, p.
183-224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Vol.
160, p. 200-391 (editado por Wood, W.A. and Kellogg,
S.T.); Béguin, P., "Molecular Biology of Cellulose
Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Vol. 44, pp.
219-248; Béguin, P. and Aubert,
J-P., "The biological degradation of
cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994)
p.25-58; Henrissat, B., "Cellulases and their
interaction with cellulose", Cellulose (1994), Vol. 1, pp.
169-196.
Las celulasas se sintetizan por un gran número
de microorganismos que incluyen hongos, actinomicetos, mixobacterias
y bacterias reales pero también por plantas. Especialmente
endo-beta-1,4-glucanasas
de una amplia variedad de especificidades han sido identificadas.
Muchas
endo-beta-1,4-glucanasas
bacterianas han sido descritas (Henrissat, B. and Bairoch, A. (1993)
Biochem J. 293:781-788; Gilbert, H.J. and Hazlewood,
G.P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139:187-194).
El grupo taxonómico Archaea superior se divide
en dos divisiones Euryarchaeota y Crenarchaeota. El grupo
Thermococcales en la división Euryarchaeota de Archaea
comprende los géneros Pyrococcus y Thermococcus
(Maidak et al. (1996)). Estos organismos se aislan de
situaciones sulfatáricas marinas o terrestres, y son hipertermófilos
anaeróbicos. Pyrococcus furiosus muestra crecimiento óptimo a
100ºC, y la temperatura máxima de crecimiento está a 103ºC. El
crecimiento óptimo se obtiene en presencia de 15-35
g/l de NaCl. Como fuentes de carbono P. furiosus se describe para
utilizar péptidos, proteínas, almidón al igual que maltosa (Zillig
(1992)).
Diferentes enzimas extracelulares han sido
descritas de especies de Archaeon. Por ejemplo, de P.
furiosus, DSM 3638, una amilasa con temperatura óptima a aprox.
100ºC ha sido clonada y expresada en E. coli y B.
subtilis (solicitud de patente Internacional PCT/DK/90/00074).
También otras enzimas hidrolíticas tales como xilanasas
extracelulares, beta-manosidasas y
beta-galactosidasas y una proteasa intracelular ha
sido descrita de diferentes especies de Archaeon (Halio et
al. (1996)).
Una beta-glucosidasa ha sido
descrita, caracterizada y clonada de Pyrococcus furiosus, DSM
3638, (Kengen (1993)). La caracterización de
beta-glucosidasa de P. furiosus reveló que
esta enzima no tiene actividad en celulosa u otros polímeros de la
glucosa beta-enlazados (Bauer et al. (1996)).
En WO 97/44361 (página 115-117) está descrita una
secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene
actividad
endo-beta-1,4-glucanasa
que se deriva de Pyrococcus furiosus. Thermophilum
pendens, una especie relacionada con Pyrobaculum en la
división de Crenarchaeota de Archaea ha sido mostrada para producir
cantidades pequeñas de una glucanasa con actividad contra
carboximetilcelulosa a 88ºC. No obstante, ninguna otra
caracterización de ninguna enzima o aislados está descrita (Bragger
et al. (1989)).
La actividad xiloglucanasa no está incluida en
la clasificación de enzimas proporcionada por la Nomenclatura
Enzimática (1992). Hasta ahora, esta actividad enzimática ha sido
clasificada simplemente como actividad de glucanasa y ha sido
frecuentemente considerada idéntica a la actividad celulolítica (EC
3,2,1,4), es decir actividad contra enlaces
\beta-1,4-glicosídicos en celulosa
o sustratos derivados de celulosa, o al menos como una actividad
secundaria en enzimas que tienen actividad celulolítica. No
obstante, una xiloglucanasa real es una enzima específica para
xiloglucano real capaz de catalizar la solubilización de xiloglucano
para oligosacáridos de xiloglucano pero que no presentan actividad
sustancial celulolítica, p. ej. actividad contra los sustratos
usados de forma convencional tipo celulosa CMC
(carboximetilcelulosa), celulosa HE y Avicel (celulosa
microcristalina). Una xiloglucanasa corta los enlaces
beta-1,4-glicosídicos en el
esqueleto de xiloglucano.
La atividad de xiloglucanasa es descrita por
Vincken et al. (1997) que caracteriza tres diferentes
endo-beta-1,4-glucanasas
de Trichoderma viride (similar a T. reesei) que tienen
todas alta actividad contra celulosa o CMC y muestran que la EndoI
(perteneciente a la familia 5 de glicosil hidrolasas, véase
Henrissat, B. et al. (1991, 1993)) no tiene esencialmente (es
decir, muy poca) actividad contra xiloglucano, y que EndoV
(perteneciente a la familia 7 de glicosil hidrolasas) y EndoIV
(perteneciente a la familia 12 de glicosil hidrolasas) ambas tienen
actividad contra xiloglucano y CMC, respectivamente, del mismo orden
de magnitud. Por consiguiente, es conocido que la familia 12 de
endo-beta-1,4-glucanasas
puede también presentar actividad xiloglucanasa.
Un uso industrial muy importante de enzimas
celulolíticas es el uso para tratamiento de fibras celulósicas,
textil o tejido, p. ej. como ingredientes en composiciones de
detergente o composiciones de suavizante, para lavado enzimático de
material celulósico para la industria textil, para desencolado de
tejidos tejidos, para biopulido de tejidos nuevos (acabado de
prendas de vestir), y para obtener un aspecto "lavado a la
piedra" de tejidos conteniendo celulosa, especialmente tela
vaquera, y diferentes métodos para este tipo de tratamiento han sido
sugeridos, p. ej. en GB-A-1 368 599,
EP-A-0 307 564 y
EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO
91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/000108 y PCT/DK95/00132. Otro uso
industrial importante de enzimas celuliticas es el uso para
tratamiento de pasta de papel, p. ej. para mejorar el drenaje o para
desentintar el papel reciclado.
Es también conocido que las celulasas pueden o
pueden no tener un dominio de enlace de celulosa (un CBD). El CBD
mejora la unión de la enzima a una fibra conteniendo celulosa y
aumenta la eficacia de la parte catalítica activa de la enzima.
Siempre existe una necesidad de suministrar
preparaciones enzimáticas de celulasa nuevas que se pueden usar para
aplicaciones donde es deseable una actividad celulasa,
preferiblemente una actividad
endo-beta-1,4-glucanasa.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar composiciones enzimáticas nuevas con actividad
celulítica sustancial a condiciones de alta temperatura y un
rendimiento mejorado en el procesamiento de la pasta de papel,
tratamiento textil, procesos de lavandería, procesos de extracción o
en pienso; preferiblemente celulasas nuevas, más preferiblemente
endo beta-1,4- glucanasas de buen funcionamiento,
contempladas para ser producibles o producidas por técnicas
recombinantes.
Los inventores han tenido éxito ahora en la
clonación y caracterización de una secuencia de ADN de especies
arquéales de Pyrococcus furiosus que codifica una actividad
celulolítica que presenta actividad enzimática a temperatura
extremadamente alta en un margen de pH muy amplio, de ese modo
permitiendo preparar una composición enzimática monocomponente
celulolítica con las propiedades deseadas.
Por consiguiente, en un primer aspecto la
invención se refiere a una enzima con actividad
endo-\beta-1,4-glucanasa
que tiene actividad óptima a una temperatura de al menos 90ºC,
preferiblemente de al menos 95ºC, más preferiblemente de al menos
100ºC.
En su segundo aspecto, la invención se refiere a
un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica
una enzima con actividad
endo-beta-1,4-glucanasa
y actividad óptima encima de 90ºC, preferiblemente encima de 95ºC,
más preferiblemente encima de 100ºC, dicha secuencia de ADN
comprende
a) la secuencia de ADN correspondiente a la
endo-beta-1,4-glucanasa
que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en
Escherichia coli DSM 11203, o
b) un análogo de la secuencia de ADN
correspondiente a la
endo-beta-1,4-glucanasa
que codifica parte de la secuencia de ADN de la SEC ID NO:1 o la
secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli
DSM 11203, que
i) es homóloga, preferiblemente al menos 80%
idéntico, con la secuencia de ADN correspondiente a la
endo-beta-1,4-glucanasa
que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en
Escherichia coli DSM 11203, o
ii) codifica un polipéptido que es al menos un
50% idéntico al polipéptido de SEC ID nº: 2, o el polipéptido
codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de
ADN correspondiente a la
endo-beta-1,4-glucanasa
que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en
Escherichia coli DSM 11203, o
En su tercer, cuarto y quinto aspecto la
invención proporciona un vector de expresión que alberga la
secuencia de ADN clonada de la invención, una célula que comprende
el vector de expresión y un método para producir una enzima que
presenta actividad celulolítica, dicho método comprende el cultivo
de la célula bajo condiciones que permitien la producción de la
enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.
En otro aspecto la invención proporciona una
enzima aislada que presenta actividad celulolítica, caracterizado
porque (i) está libre de impurezas homologas y (ii) la enzima se
produce por el método anteriormente descrito.
\newpage
La invención además se refiere a una enzima
aislada con actividad celulolítica, preferiblemente una
endo-beta-1,4-glucanasa,
que es codificada por el constructo de ADN de la invención. Además,
la presente invención se refiere al uso de tal enzima o de la
preparación enzimática de la invención para aplicaciones
industriales tal como en la industria textil para mejorar las
propiedades de las fibras celulósicas o tejido o para proporcionar
un aspecto de lavado a la piedra de tela vaquera; o en la industria
del tratamiento de fibras celulósicas, especialmente para el enriado
de cáñamo, yute, tejido de lino o lino; o en limpieza industrial
procesada; o material polimérico extruido por calor; o en la
conversión de biomasa en azúcares; o en la producción de alcohol; o
para predigestión de p. ej. granos usados en la producción de
pienso; o en la producción de café instáneo o procesos de extracción
similares; o en la industria de perforación petrolífera; o en la
recuperación de petróleo mejorada por inundación polimérica.
La invención también se refiere a un cultivo
biológico puro substancialmente aislado de la cepa de Escherichia
coli DSM 11203 que alberga una celulasa, que codifica una
secuencia de ADN (la parte codificante de la celulasa de la
secuencia de ADN se clona en el plásmido pSJ1678 presente en
Escherichia coli ISM 11203 derivada de una cepa de la especie
arqueal de Pyrococcus furiosus, o cualquier muíante de dicha
cepa de E. coli).
En el contexto presente, el término "los 20
residuos de aminoácidos de origen natural" se refiere a que los
20 residuos de aminoácidos normalmente encontrados en proteínas y
conocidos de forma convencional como alanina (Ala o A), valina (Val
o V), leucina (Leu o L), isoleucina (Ile o I), prolina (Pro o P),
fenilalanina (Phe o F), triptófano (Trp o W), metionina (Met o M),
glicina (Gly o G), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), cisteína
(Cys o C), tirosina (Tyr o T), asparagina (Asn o N), glutamina (Gln
o Q), ácido aspártico (Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), lisina
(Lys o K), arginina (Arg o R), e histidina (His o H).
La enzima y la preparación enzimática de la
invención es activa sobre un margen de pH amplio, preferiblemente
activo a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11,
preferiblemente entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 10.
En una forma de realización preferida, la enzima
o la preparación enzimática de la invención es obtenible de o
endógena a una cepa de Archaea, más preferiblemente a una cepa de la
división Euryarchaeota, incluso más preferiblemente del género
Pyrococcus, especialmente siendo las especies de
Pyrococcus furiosus, tales como Pyrococcus furiosus,
DSM 3638. Además, se cree que la enzima de la invención es cubierta
por la definición de familia 12 de glicosil hidrolasas, es decir la
enzima de la presente invención es preferiblemente una familia 12 de
endo-\beta-1,4-glucanasa.
La enzima de la invención puede tener un peso molecular de
aproximadamente 34 kDa. No obstante, se cree que la enzima de la
invención puede también tener un peso molecular aparente de
aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 35 kDa (es decir, 30, 31,
32, 33, 34 o 35 kDa) dependiendo de la posible actividad
proteolítica en la secuencia del residuo de aminoácido
N-terminal de la enzima durante los procesos de
fermentación y/o de purificación. En otras palabras, la enzima se
puede truncar en el N-terminal mientras todavía se
mantiene la actividad
endo-beta-1,4-glucanasa
por completo.
En el contexto presente la expresión "una
secuencia de ADN clonada", bien parcial o completa, se refiere a
una secuencia de ADN clonada por el procedimiento de clonación
estándar usada en ingeniería genética para recolocar un segmento de
ADN de su ubicación natural a un sitio diferente donde será
reproducido. El proceso de clonación implica escisión y aislamiento
del segmento de ADN deseado, inserción del pedazo de ADN en la
molécula del vector e incorporación del vector recombinante en una
célula donde se replicarán copias múltiples o clones del segmento de
ADN.
La "secuencia de ADN clonada" de la
invención puede de forma alternativa ser denominada "constructo de
ADN" o "secuencia aislada de ADN".
La secuencia de ADN puede ser de origen
genómico, de ADNc, o sintético o cualquier combinación de los
mismos. La parte codificante de la endoglucanasa o celulasa de la
secuencia de ADN clonada en el plásmido pSJ1678 presentes en
Escherichia coli DSM 11203 y/o una secuencia de ADN análoga
de la invención se puede clonar de una cepa de la especie arqueal
Pyrococcus furiosus, preferiblemente la cepa DSM 3638, que
produce la enzima con actividad celulasa, preferiblemente
endo-beta-1 glucanasa, u otro
organismo o uno relacionado como se describe adicionalmente más
abajo.
De forma alternativa, la secuencia análoga puede
ser construida basándose en la secuencia de ADN de la SEC ID nº: 1 o
la secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en
Escherichia coli DSM 11203, p. ej ser una subsecuencia de la
misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no
dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la celulasa codificada
por la secuencia de ADN, pero que corresponden al uso del codón del
organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por
introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a
una secuencia de aminoácidos diferente (es decir, una variante de la
celulasa de la invención).
Se cree que la secuencia de ADN de la SEC ID
NO:1 corresponde a la secuencia de ADN obtenible del plásmido
presente en Escherichia coli DSM 11203.
\newpage
En el momento de realizar sustituciones de
nucleótidos, los cambios de aminoácidos son preferiblemente de una
naturaleza menor, es decir sustituciones de aminoácido conservadoras
que significativamente no afectan al pliegue o a la actividad
enzimática de la proteína, deleciones pequeñas, típicamente de uno a
aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o
carboxilo-terminales, tales como un residuo de
metionina aminoterminal, un pequeño péptido de enlace de hasta
aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña
extensión que facilita la purificación, tal como un tracto de
polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están
dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina,
lisina, histidina), aminoácidos acídicos (tales como ácido glutámico
y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina y
asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (tales como leucina,
isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como
fenilalanina, triptófano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales
como glicina, alanina, serina, treonina, metionina). Para una
descripción general de sustitución de nucleótidos, véase p. ej. Ford
et al., (1991), Protein Expression and Purification 2,
95-107.
Será aparente para los expertos en la técnica
que sustituciones de este tipo pueden ser hechas fuera de las
regiones fundamentales para la función de la molécula y todavía
suponen un polipéptido activo. Aminoácidos esenciales para la
actividad del polipéptido codificado por la secuencia de ADN clonada
de la invención, y por lo tanto preferiblemente no sujetos a
sustitución, se pueden identificar según procedimientos conocidos en
la técnica, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido
de alanina (ver p. ej. Cunningham and Wells, (1989), Science 244,
1081-1085). En esta última técnica las mutaciones se
introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes
resultantes se evalúan para actividad biológica (es decir,
celulolítica) para identificar residuos de aminoácidos que son
fundamentales para la actividad de la molécula. Sitios de
interacción de enzima-sustrato pueden también ser
determinados por análisis de estructura cristalina según es
determinado por técnicas tales como análisis de resonancia magnética
nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (cf. p. ej. de
Vos et al., (1992), Science 255, 306-312;
Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224,
899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett.
309, 59-64).
La
endo-beta-1,4-glucanasa
codificada por la secuencia de ADN del constructo de ADN de la
invención puede comprender un dominio de enlace de celulosa (CBD)
existente como una parte integral de la enzima codificada, o un CBD
de otro origen se puede introducir en la
endo-beta-1,4-glucanasa
creando así un híbrido enzimático. En este contexto, el término
"dominio de unión de celulosa" se destina a ser entendido tal y
como se define por Peter Tomme et al.
"Cellulose-Binding Domains: Classification and
Properties" en "Enzymatic Degradation of Insoluble
Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS
Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición clasifica más de
120 dominios de unión a la celulosa en 10 familias
(l-X), y demuestra que CBDs se encuentran en
diferentes enzimas tales como celulasas, xilanasas, mananasas,
arabinofuranosidasas, acetil esterasas y quitinasas. CBDs también
han sido encontrados en algas, p. ej. el alga roja Porphyra
purpurea como una proteína de la proteína de unión a
polisacáridos no hidrolítica, ver Tomme et al., op.cit. No
obstante, la mayor parte de los CBDs son de celulasas y xilanasas,
CBDs se encuentran en los términos N y C de proteínas o son
internos. Híbridos enzimáticos son conocidos en la técnica, véase p.
ej. WO 90/00609 y WO 95/16782, y se pueden preparar transfomando en
una célula huésped un constructo de ADN que comprende al menos un
fragmento de ADN que codifica el dominio de unión a la celulosa
ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica
la endo-beta-1,4- glucanasa y
cultivando la célula huésped para expresar el gen fusionado.
Híbridos enzimáticos pueden ser descritos por la siguiente
fórmula:
fórmula:
CBD - MR -
X
donde CBD es la región
N-terminal o C-terminal de una
secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos el dominio de
unión a la celulosa; MR es la región intermedia (el enlazador), y
puede ser un enlace, o un grupo de enlace corto preferiblemente de
aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, más
preferiblemente de 2 a 40 átomos de carbono; o es preferiblemente de
aproximadamente 2 a aproximadamente 100 aminoácidos, más
preferiblemente de 2 a 40 aminoácidos; y X es una región
N-terminal o C-terminal de un
polipéptido codificado por la secuencia de ADN de la
invención.
La secuencia de ADN de la presente invención se
puede clonar de la cepa de Escherichia coli DSM 11203 usando
métodos estándar p. ej. como se describe por Sambrook et al.,
(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Lab.; Cold Spring Harbor, NY.
La secuencia de ADN de la invención puede
también ser clonada por cualquier método general que incluya
- clonación, en vectores adecuados, de un banco
de ADN de cualquier organismo, p. ej. Pyrococcus furiosus,
previsto para producir la
endo-beta-1,4-glucanasa
de interés,
- transformación de células huéspedes adecuadas
con dichos vectores,
- cultivo de las células huéspedes bajo
condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés
codificada por un clon en el banco de ADN,
\newpage
- selección de clones positivos para determinar
cualquier actividad celulolítica de la enzima producida por estos
clones, y
- aislamiento del ADN que codifica la enzima de
estos clones.
De forma alternativa, el ADN que codifica una
celulasa de la invención puede, conforme a procedimientos bien
conocidos, ser clonado convenientemente de una fuente adecuada, tal
como cualquiera de los organismos mencionados más abajo, usando
sondas de oligonucleótidos sintéticas preparadas basándose en la
secuencia de ADN de la SEC ID NO:1 o la secuencia de ADN obtenible
del plásmido presente en Escherichia coli DSM 11203.
La búsqueda de homología fue realizada usando la
secuencia de ADN de la SEC ID No: 1. La búsqueda de homología mostró
que la secuencia de ADN más relacionada fue un gen que codificaba
una
endo-beta-1,4-glucanasa
de Thermotoga neapolitana (GenBank núm. de acc. U93354, Bok,
J.D. y Eveleigh, D.E. Direct Submission to database Submitted
(13-MAR-1997) Biochemistry and
Microbiology, Cook College, Rutgers University, Lipman Drive, New
Brunswick, NJ 08903, USA), a cuyo gen de la secuencia de ADN
mostrada en SEC ID nº 1 muestra una identidad del 34%.
La baja homología identificada usando la
búsqueda de homología en lo anterior demuestra que la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención es distante de cualquier
endo-beta-1,4-glucanasa
conocida.
La homología de la secuencia de ADN a la que se
hace referencia arriba es determinada como el grado de identidad
entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera
secuencia de la segunda. La homología puede adecuadamente ser
determinada mediante programas informáticos conocidos en la técnica
tal como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG
(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular
Biology, 48, 443-433. Usando GAP con los siguientes
ajustes para comparar la secuencia de ADN: penalización por creación
de GAP de 5.0 y penalización por extensión de GAP de 0.3,
proporcionado en el paquete del programa GCG (Needleman, S.B. and
Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-453). Usando GAP con los ajustes anteriores para
comparación de la secuencia de ADN, el constructo de ADN de la
presente invención comprende una secuencia de ADN que presenta un
grado de identidad preferiblemente de al menos un 40%, más
preferiblemente al menos un 45%, más preferiblemente al menos un
50%, más preferible al menos un 60%, incluso más preferiblemente al
menos un 70%, especialmente al menos un 80%, en particular al menos
un 95%, con la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID nº: 1 o la
secuencia de ARN obtenible del plásmido presente en Escherichia
coli DSM 11203.
La hibridación se destina a indicar que la
secuencia de ADN análoga (parcial) se híbrida a una sonda de
nucleótidos correspondiente a la parte codificante de
endo-beta-1,4-glucanasa
de la secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en
Escherichia coli DSM 11203 bajo condiciones específicas
determinadas que son descritas en detalle más abajo.
Condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN
homologa o ARN implican preremojo del filtro que contiene los
fragmentos de ADN o ARN para hibridar en 5 X SSC (citrato de
solución salina estándar) durante 10 min, y prehibridación del
filtro en una solución de 5 x SSC Sambrook et al. 1989), 5 x
solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0,5% de SDS y
100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido
a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989), seguido de
hibridación en la misma solución que contiene una sonda cebada de
forma aleatoria (Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal.
Biochem. 132:6-13), marcada en
^{32}P-dCTP (actividad específica > 1 x
10^{3} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es
luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0,5% SDS a una
temperatura de al menos 55ºC, más preferiblemente al menos 60ºC, más
preferiblemente al menos 65ºC, incluso más preferiblemente al menos
70ºC, especialmente al menos 75ºC.
Las moléculas a las que la sonda de
oligonucleótidos se hibridiza bajo estas condiciones son detectadas
usando una película radiográfica.
La búsqueda de homología fue realizada usando la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 2. La búsqueda de
la homología mostró que la proteína más relacionada fue una
endo-beta-1,4-glucanasa
de Thermotoga neapolitana (Núm. de acc. U93354, Bok,J.D. y
Eveleigh.D.E. Direct Submission to database Submitted
(13-MAR-1997) Biochemistry and
Microbiology, Cook College, Rutgers University, Lipman Drive, New
Brunswick, NJ 08903, EEUU), a la que la secuencia de aminoácidos
(SEC ID nº. 2) muestra identidad del 39%.
El análisis del cluster hidrofóbico fue
realizado usando la secuencia de la proteína de la celulasa de
Erwinia carotovora (de la familia 12 de las glicosil
hidrolasas) de número de aceso SWISSPROT P16630, con la
anteriormente mencionada secuencia de la proteína de la celulasa de
la Thermotoga neapolitana y con la secuencia de proteínas de
la SEC ID NO:2 (la invención). Este análisis mostró que la proteína
que tiene la secuencia de la proteína de SEC ID NO:2 al igual que la
celulasa de la Thermotoga neapolitana pertenece a la familia
12 de las glicosil hidrolasas (Lemesle-Varloot L,
Henrissat B, Gaboriaud C, Bissery V, Morgat A, and Mornon Jp
Hydrophobic cluster analysis: Biochimie
72(8):555-574, 1990).
La baja homología identificada usando la
búsqueda de homología en lo anterior demuestra que la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención es distante de cualquier
endo-beta-1,4-glucanasa
conocida.
La homología de la secuencia de aminoácidos a la
que se hace referencia arriba es determinada como el grado de
identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la
primera secuencia de la segunda. La homología puede adecuadamente
ser determinada mediante programas informáticos conocidos en la
técnica tal como usando FASTA del paquete GCG usando los ajustes
siguientes: matriz de marcado: GenRunData:blosum50.cmp, pamfactor
variable usó penalización por creación de GAP: 12, penalización por
extensión de GAP: 2. proporcionados en el paquete del programa GCG
(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular
Biology, 48, 443-453). Usando FASTA con los ajustes
anteriores para comparación de secuencias de aminoácidos, la
secuencia de aminoácidos muestra un grado de identidad
preferiblemente de al menos 450, más preferiblemente al menos un
50%, más preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al
menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, especialmente al
menos un 95%, con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID
nº: 2 o la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificada por
la
endo-beta-1,4-glucanasa
que codifica parte de la secuencia de ADN de la SEC ID NO:1 o la
secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en Escherichia
coli
DSM 11203.
DSM 11203.
Los anticuerpos para ser usados para determinar
reacción cruzada inmunológica pueden ser preparados usando una
enzima purificada celulolítica. Más especificamente, antisuero
contra la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención se puede aumentar inmunizando conejos (u otros
roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et
al. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, capítulo 23, o A. Johnstone
and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific
Publications, 1982 (más específicamente p. 27-31).
Inmunoglobulinas purificadas se pueden obtener de los antisueros,
por ejemplo por precipitación de sal
((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de proteínas puede ser hecha bien por análisis de difusión doble de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 e 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., capítulo 2).
((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido de diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de proteínas puede ser hecha bien por análisis de difusión doble de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 e 4), o por inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., capítulo 2).
La taxonomía aplicada más abajo es conforme a
Maidak et al. (1996).
Para el objetivo de la presente invención el
término "obtenido de" o "obtenible de" como se utiliza en
este caso en relación con una fuente específica, significa que la
enzima se produce o se puede producir por la fuente específica, o
por una célula en la que un gen de la fuente ha sido insertado.
Es actualmente contemplado que el ADN que
codifica una celulasa de la invención se puede obtener de una
Archaea, en particular una cepa del tipo Euryarchaeota,
preferiblemente a la subdivisión Thermococcoales, en particular una
cepa del género Pyrococcus, en particular una cepa de
Pyrococcus furiosus.
En una forma de realización preferida, la
celulasa de la invención se obtiene de la cepa Pyrococcus
furiosus DSM 3638. Es actualmente contemplado que una secuencia
de ADN que codifica un homólogo enzimático a la enzima de la
invención se puede obtener de otras cepas arquéales, especialmente
cepas del género Pyrococcus.
Un aislado de una cepa de Pyrococcus
furious donde una celulasa de la invención puede ser derivada
está disponible al público de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen,
DSM 3638.
Además, el plásmido pSJ1678 comprendiendo la
secuencia de ADN que codifica la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención ha sido transformada en una cepa de Escherichia
coli que fue depositada por los inventores según el tratado de
Budapest en el Reconocimiento Internacional del depósito de
microorganismos para los fines del procedimiento en materia de
patentes en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, República federal de Alemania, el 11 de Octubre de
1996 bajo el número de depósito DSM 11203.
Un vector recombinante que comprende un
constructo de ADN que codifica la enzima de la invención puede ser
cualquier vector que puede ser convenientemente sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que deba ser
introducido. De esta manera, el vector puede ser un vector de
replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una
entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula
huésped, se integra en el genoma de la célula huésped en parte o en
su totalidad y se replica con el(los) cromosoma(s) en
que ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión en el que la secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención está operablemente vinculado a segmentos adicionales
requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de
expresión se deriva de ADN plásmido o vírico, o puede contener
elementos de ambos. El término, "operablemente unido" indica
que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan en
concierto para sus objetivos previstos, p. ej. la transcripción se
inicia en un promotor y prosigue a través de la secuencia de ADN que
codifica para la enzima.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN
que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de
elección y se puede derivar de genes que codifican proteínas bien
homologas o heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes bacterianas incluyen el promotor del gen de la
amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, el gen de
la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis, el
gen de la alfa-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens, el gen de la proteasa alcalina de Bacillus
subtilis, o el gen de la xilosidasa de Bacillus pumilus,
o los promotores del fago lambda P_{R} o P_{L} o los promotores
lac, trp o tac de E. coli.
La secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención puede también, si es necesario, ser operablemente
conectada a un terminador adecuado.
El vector recombinante de la invención puede
además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se
replique en la célula huésped en cuestión.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto en
la célula huésped, o un gen que codifica resistencia a p. ej.
antibióticos como canamicina, cloranfenicol, eritromicina,
tetraciclina, espectinomicina, o similar, o resistencia a metales
pesados o herbicidas.
Para dirigir una enzima de la presente invención
en la vía secretora de las células huéspedes, una secuencia señal
secretora (también conocida como una secuencia guía, secuencia
prepro o secuencia pre) se puede proporcionar en el vector
recombinante. La secuencia señal secretora se une a la secuencia de
ADN que codifica la enzima en el marco de lectura correcto. Las
secuencias señal secretoras son comúnmente situadas en 5' en la
secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia señal
secretora puede ser aquella normalmente asociada a la enzima o puede
ser de un gen que codifica otra proteína segregada.
Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifican para la presente enzima, la
secuencia del promotor y opcionalmente el terminador y/o señal
secretora, respectivamente, o para ensamblar estas secuencias por
esquemas de amplificación de PCR adecuados, y para insertarlas en
vectores adecuados conteniendo la información necesaria para
replicación o integración, son bien conocidos por los expertos en la
técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et al.,
op.cit.).
La secuencia de ADN que codifica la enzima
presente introducida en la célula huésped puede ser bien homologa o
heteróloga al huésped en cuestión. Si es homologa a la célula
huésped, es decir producida por la célula huésped en la naturaleza,
típicamente será operablemente conectada a otra secuencia del
promotor o, en caso de ser aplicable, una secuencia señal secretora
y/o secuencia del terminador distinta de aquella en su medio
ambiente natural. El término "homologa" se destina a incluir
una secuencia de ADN que codifica una enzima nativa al organismo
huésped en cuestión. El término "heteróloga" se destina a
incluir una secuencia de ADN no expresada por la célula huésped en
la naturaleza. Por lo tanto, la secuencia de ADN puede ser de otro
organismo, o puede ser una secuencia sintética.
La célula huésped en la que el constructo de ADN
o el vector recombinante de la invención es introducido puede ser
cualquier célula que es capaz de producir la enzima presente e
incluye bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas
superiores.
Ejemplos de células huéspedes bacterianas que,
en cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son
bacterias gram-positivas tales como cepas de
Bacillus, tales como cepas de B. subtilis, B.
licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B.
alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B.
lautus, B. megatherium o B. turingiensis, o cepas de
Streptomyces, tales como S. lividans o S.
muririus, o bacterias gram-negativas tales como
Escherichia coli. La transformación de las bacterias se
pueden efectuar por transformación de protoplasto, electroporación,
conjugación, o usando en cierto modo células competentes conocidas
per se (cf. Sambrook et al., supra).
Cuando se expresa la enzima en bacterias tales
como E. coli, la enzima se puede retener en el citoplasma,
típicamente como gránulos insolubles (conocidos como cuerpos de
inclusión), o se pueden dirigir al espacio periplásmico por una
secuencia de secreción bacteriana. En el caso anterior, las células
se lisan y los gránulos se recuperan y desnaturalizan después de lo
cual la enzima se repliega diluyendo el agente desnaturalizante. En
éste caso, la enzima puede ser recuperada del espacio periplásmico
interrumpiendo las células, p. ej. por sonicación o choque osmótico,
para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la
enzima.
Cuando se expresa la enzima en bacterias
gram-positivas tales como cepas de Bacillus o
Streptomyces, la enzima se puede retener en el citoplasma, o
se puede dirigir al medio extracelular por una secuencia de
secreción bacteriana. En este caso, la enzima puede ser recuperada
del medio como se describe abajo.
La célula de levadura puede ser una cepa de
Saccharomyces, particularmente S. cerevisiae. La
célula huésped fúngica puede ser una cepa del género Aspergillus,
Fusarium o Tríchoderma.
La presente invención proporciona un método para
producir una enzima aislada según la invención, donde una célula
huésped adecuada, que ha sido transformada con una secuencia de ADN
que codifica la enzima, es cultivada bajo condiciones que permiten
la producción de la enzima, y la enzima resultante es recuperada del
cultivo.
Tal y como se define aquí, un polipéptido
aislado (p. ej. una enzima) es un polipéptido que está esencialmente
libre de otros polipéptidos, p. ej., al menos aproximadamente un 20%
de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% de
pureza, más preferiblemente aproximadamente un 60% de pureza,
incluso más preferiblemente aproximadamente un 80% de pureza, de la
forma más preferible aproximadamente un 90% de pureza, e incluso de
la forma más preferible aproximadamente un 95% de pureza, como se
determina por SDS-PAGE.
El término "polipéptido aislado" puede de
forma alternativa ser denominado "polipéptido purificado".
Cuando un vector de expresión que comprende una
secuencia de ADN que codifica la enzima se transforma en una célula
huésped heteróloga es posible permitir una producción heteróloga
recombinante de la enzima de la invención.
De ese modo es posible hacer una composición
celulolítica altamente purificada o monocomponente, caracterizada
por estar libre de impurezas homologas.
En este contexto, las impurezas homologas
significa cualquier impureza (p. ej. otros polipéptidos aparte de la
enzima de la invención) que se origina de la célula homologa de la
cual se obtiene la enzima de la invención originalmente.
En la presente invención la célula huésped
homologa puede ser una cepa de Pyrococcus furiosus.
El medio usado para cultivar las células
huéspedes transformadas pueden ser cualquier medio convencional
adecuado para crecer las células huéspedes en cuestión. La enzima
celulolítica expresada puede convenientemente ser segregada en el
medio de cultivo y puede ser recuperada de la misma por
procedimientos bien conocidos incluyendo separación de las células
del medio por centrifugado o filtración, componentes proteínicos de
precipitación del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio,
seguido de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similar.
En otro aspecto ulterior, la presente invención
se refiere a una composición enzimática con una enzima que presenta
actividad celulolítica como se ha descrito anteriormente.
La composición enzimática de la invención puede,
además de la celulasa de la invención, comprender uno o más tipos de
enzimas, por ejemplo hemicelulasa tal como xilanasa y mananasa,
otros componentes de celulasa o
endo-beta-1,4-glucanasa,
quitinasa, lipasa, esterasa, pectinasa, cutinasa, fitasa,
oxidorreductasa, proteasa, o amilasa.
La composición enzimática se puede preparar
conforme a métodos conocidos en la técnica y puede estar en forma de
una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición
enzimática puede estar en forma de un granulado o un microgranulado.
La enzima para ser incluida en la composición se puede estabilizar
conforme a métodos conocidos en la técnica.
Celulasas termoestables tienen usos potenciales
en una cantidad de diferentes industrias y aplicaciones. Más abajo,
se dan ejemplos de usos preferidos de la composición enzimática de
la invención. La dosificación de la composición enzimática de la
invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición
pueden ser determinadas basándose en métodos conocidos en la
técnica.
La composición enzimática según la invención
puede ser útil para al menos uno de los siguientes objetivos.
En el contexto presente, el término "material
celulósico" se destina a significar fibras, tejidos cosidos y
tejidos no cosidos, incluyendo, géneros de punto, tejidos, telas
vaqueras, hilados, y toalla, hechos de algodón, mezclas de algodón o
derivados celulósicos naturales o artificiales (p. ej. originados de
fibras celulósicas con xilano tales como de pulpa de madera) o
mezclas de los mismos. Ejemplos de mezclas son mezclas de algodón o
rayón/viscosa con uno o varios materiales acompañantes tales como
lana, fibras sintéticas (p. ej. fibras de poliamida, fibras
acrílicas, fibras de poliéster, fibras de polivinil alcohol, fibras
de polivinil cloruro, fibras de cloruro de polivinilideno, fibras de
poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida), y fibras con
celulosa (p. ej. rayón/viscosa, ramio, cáñamo, lino/tela de lino,
yute, fibras de acetato de celulosa, liocel).
En la industria textil, las celulasas se usan
para tratamiento del algodón y otros materiales celulósicos para
obtener un tratamiento de la superficie de las fibras que resultan
en telas con propiedades alteradas tales como tendencia al frisado
reducida, elimiNaClón de pelusas, tela más suave, mejores efectos
manuales o visuales. Especialmente, se utilizan celulasas para
producir un aspecto "lavado a la piedra" de la tela vaquera. El
uso de celulasas a temperaturas altas hace posible crear nuevos
aspectos de tejidos tanto de tela vaquera como de tela no vaquera de
algodón/celulósica. Las celulasas termoestables se pueden incluir en
tratamientos a alta temperatura del tejido que no han sido posibles
antes, el lavado de celulasa a más de 80ºC o bajo condiciones de
vapor con una proporción de solución muy baja es posible dando la
posibilidad de crear nuevas apariencias.
El procesamiento de material celulósico para la
industria textil, como por ejemplo fibra de algodón, en un material
preparado para la producción de prendas de vestir implica diferentes
fases: hilatura de la fibra en un hilo; construcción de tejido
tejido o de punto hecho a partir del hilado y preparación posterior,
operaciones de tinte y de acabado. Los productos tejidos se
construyen tejiendo un hilo de trama entre una serie de hilos de
urdimbre; los hilos podrían ser de dos tipos diferentes. Productos
de punto son construidos formando una red de bucles entrecruzados de
una longitud continua de hilo. Las fibras celulósicas pueden también
ser usadas para tejido no tejido.
El proceso de la preparación prepara el textil
para la respuesta apropiada en operaciones de coloración. Las
sub-fases implicadas en la preparación son
desencolado (para productos tejidos), descrudado y blanqueo. Un
proceso combinado para descrudar/blanquear en una fase es también
usado en la industria. Aunque los procesos de preparación son
empleados más frecuentemente en el estado del tejido; las
operaciones de descrudado, blanqueo y tinte pueden también ser
hechas en la fase de la fibra o del hilo.
El régimen del procesamiento puede ser bien
discontinuo (batch) o continuo con el tejido siendo contactado por
la corriente del procesamiento líquido en forma de anchura abierta o
de cuerda. Las operaciones continuas generalmente usan un saturador
por lo cual un peso aproximadamente igual de baño químico por peso
de tejido se aplica al tejido, seguido de una cámara de reposo
calentada donde se desarrolla la reacción química. Una sección de
lavado luego prepara el tejido para la siguiente fase de
tratamiento. El procesamiento discontinuo (batch) generalmente se
desarrolla en un baño de procesamiento por el cual el tejido
contacta con aproximadamente 8-15 veces su peso en
baño químico. Después de un periodo de reacción, los productos
químicos son drenados, el tejido enjuagado y el siguiente químico es
aplicado. El procesamiento pad-batch (tintura
semi-continua) implica un saturador por el cual un
peso aproximadamente igual de baño químico por peso de tejido se
aplica al tejido, seguido de un periodo de reposo que en el caso de
pad-batch frío puede ser uno o más días.
Productos tejidos son la forma predominante de
construcción de tejidos textiles. El proceso de tejedura requiere un
"encolado" del hilo de urdimbre para protegerlo de la abrasión.
Almidón, alcohol polivinílico (PVA), carboximetilcelulosa, ceras y
ligantes acrílicos son ejemplos de productos químicos de encolado
típicos usados debido a su disponibilidad y coste. La cola debe ser
eliminada después del proceso de tejedura como la primera etapa de
la preparación de los productos tejidos. El tejido encolado bien en
forma de cuerda o de anchura abierta se pone en contacto con el
líquido del procesamiento que contiene los agentes de desencolado.
El agente de desencolado empleado depende del tipo de cola que debe
ser eliminada. Para colas de PVA, se usa frecuentemente agua
caliente o procesos oxidantes. El agente de encolado más común para
tejido de algodón se basa en almidón. Por lo tanto muy a menudo, los
tejidos de algodón tejidos se desencolan por una combinación de agua
caliente, la enzima \alpha-amilasa para hidrolizar
el almidón y un agente humectante o surfactante. El material
celulósico se deja reposar con los productos químicos del
desencolado durante un "periodo de permanencia" suficientemente
largo para realizar el desencolado. El periodo de permanencia es
dependiente del tipo de régimen de procesamiento y la temperatura y
puede variar de 15 minutos a 2 horas, o en algunos casos, varios
días. Típicamente, los productos químicos de desencolado se aplican
en un baño saturador que generalmente varía de aproximadamente 15ºC
a aproximadamente 55ºC. El tejido es luego mantenido en un
equipamiento tal como un "J-box" que
proporciona calor suficiente, normalmente entre aproximadamente 55ºC
y aproximadamente 100ºC, para aumentar la actividad de los agentes
de desencolado. Los productos químicos, incluyendo los agentes del
encolado eliminados, son lavados del tejido después de la
finalización del periodo de permanencia.
Para asegurar una blancura elevada o una buena
humectabilidad y teñibilidad resultante, los productos químicos de
la cola y otros productos químicos aplicados deben ser íntegramente
eliminados. Es generalmente creído que un desencolado eficaz es de
importancia crucial para los procesos de preparación siguientes:
descrudado y blanqueo.
El proceso del descrudado elimina muchos de los
compuestos no celulósicos encontrados en el algodón de forma
natural. Además de las impurezas naturales no celulósicas, el
descrudado puede eliminar la suciedad, manchas y materiales
residuales introducidos en la fabricación tales como lubricantes de
hilatura, enconado o corte. El proceso de descrudado emplea
hidróxido sódico o agentes de causticación relacionados tales como
carbonato de sodio, hidróxido potásico o mezclas derivadas.
Generalmente un surfactante alcali estable se añade al proceso para
mejorar la solubilización de compuestos hidrofóbicos y/o prevenir su
redeposición en el tejido. El tratamiento está generalmente a una
alta temperatura, 80ºC-100ºC, utilzando soluciones
fuertemente alcalinas, pH 13-14, del agente de
descrudado. Debido a la naturaleza no específica de los procesos
químicos no sólo las impurezas sino la celulosa misma es atacada,
conduciendo a daños en la resistencia u otras propiedades del tejido
deseables. La suavidad del tejido celulósico es una función de ceras
de algodón naturales residuales. La naturaleza no específica del
proceso de descrudado fuertemente alcalino de alta temperatura no
puede discriminar entre los lubricantes de algodón naturales
deseables y los lubricantes introducidos en la fabricación. Además,
el proceso de descrudado convencional puede causar problemas
medioambientales debido al efluente altamente alcalino de estos
procesos. La fase del descrudado prepara el tejido para la respuesta
óptima en el blanqueo. Un tejido descrudado de forma poco adecuada
necesitará un nivel más alto de blanqueador químico en las fases de
blanqueo posteriores.
La fase de blanqueo decolora los pigmentos
naturales del algodón y elimina cualquier componente impuro del
algodón fibroso residual natural no eliminado completamente durante
el desmotado, cardado o descrudado. El principal proceso en uso
actualmente es un blanqueador de peróxido de hidrógeno alcalino. En
muchos casos, especialmente cuando no es necesitada una blancura
altísima, el blanqueo se puede combinar con el descrudado.
Está contemplado que la fase de descrudado puede
llevarse a cabo usando la
endo-beta-1,4-glucanasa
o la preparación de
endo-beta-1,4-glucanasa
de la presente invención en combiNaClón con otras actividades
enzimáticas a una temperatura de aproximadamente
90ºC-100ºC y un pH de aproximadamente
7-9, así substituyendo o suplementando los agentes
altamente caustificantes.
El uso de celulasas termoestables en procesos de
limpieza industrial permite hacer un proceso de limpieza más fácil
cuando el material indeseado que debe ser eliminado se basa en
materia celulósica. Ejemplos son la limpieza de membranas de
ultrafiltración, tuberías y similares en la industria de
alimentos/piensos.
La incorporación de celulasa termoestable en
materiales plásticos y poliméricos extruidos por calor con relleno
de celulosa, resultará en degradabilidad más alta de estos
materiales en la naturaleza.
Materiales lignocelulósicos componen una parte
grande de residuos agrícolas y forestales y en papel que es muy
dominante en los residuos municipales. Estos residuos son
típicamente quemados, lo cual desde un punto de vista energético es
un desperdicio enorme de recursos. Se ha asignado mucho trabajo a la
tarea de desarrollar un proceso eficaz y económico para convertir
esta biomasa en azúcares que se pueden fermentar para producir p.
ej. alcohol para el uso como combustible. Los procesos propuestos
para la conversión de lignocelulósicos en azúcares incluyen el uso
de celulasas pero se necesitan dosificaciones muy altas que las
vuelven irreales a gran escala industrial desde un punto de vista
económico. El uso de celulasas termoestables con propiedades
licuefactantes hace tal proceso de bioconversión más realístico. El
procesamiento a alta temperatura abre la estructura de la pared
celular en una cantidad de materias vegetales y hace la celulosa más
accesible para el ataque enzimático.
En la producción industrial de alcohol a partir
de distintos tipos de granos, el proceso tradicional incluye
licuefacción con alfa amilasa a temperaturas alrededor de
80-100ºC. La inclusión de celulasa en esta fase
aumentará el rendimiento de azúcares fermentables. Esta
prelicuefacción de celulosa también hará la inclusión de celulasas
tradicionales en el siguiente proceso realístico, debido a un nivel
de hidrólisis más alto que sin prelicuefacción.
Predigestión de granos; centeno, cebada, maíz
etc para la producción de pienso es otro uso potencial de la
celulasa termoestable, para aumentar la digestibilidad del pienso en
el animal.
La extracción de café para la producción de café
instáneo se realiza a temperaturas de 85-150ºC en
una batería de columnas de percolación. El agua pasa a
contracorriente desde la célula más extraída hasta la recién
rellenada de café fresco. La temperatura de operación para las
células con el café fresco es aprox. 100ºC. La inclusión de
celulasas termófilas en este punto aumentará la capacidad de las
columnas ya que la materia soluble se libera más fácilmente cuando
la estructura de la pared celular está abierta.
La inclusión de celulasas en otros procesos de
alta temperatura tradicionales para extracción de aceite o
compuestos de aroma/sabor de fuentes vegetales naturales de la misma
manera que para la extracción de café aumenta la capacidad o
rendimiento. Un ejemplo es la extracción de aceite de palma o aceite
de semilla de palma que es un proceso acuoso a alta temperatura.
Las celulasas de la invención son también útiles
para la degradación, es decir reducción de viscosidad, de soluciones
acuosas de derivados de celulosa hidrocoloide (CMC, HEC, HPC y otros
derivados de la celulosa usados de forma convencional) usadas en la
industria petrolífera en perforación y en recuperación mejorada de
petróleo (EOR) por inundación polimérica.
\newpage
Pyrococcus furiosus DSM 3638, comprende
la secuencia de ADN codificante de la celulasa de la invención.
Escherichia coli DSM 11203 conteniendo el
plásmido que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima
celulolítica de la invención, en el vector de clonación pSJ1678.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa de E. coli: células
electrocompetentes de E. coli SJ2 (Diderichsen et al.,
1990) preparadas y transformadas usando un Bio-Rad
GenePulser^{TM} según está recomendado por el fabricante.
B. subtilis A164. Esta cepa es una
derivada de la B. subtilis ATCC 6051a, siendo deficitaria de
esporulación y habiendo tenido los genes apr y npr
interrumpidos. Las interrupciones fueron realizadas esencialmente
como se describe en Sonenshein et al. (1993). Las células
competentes fueron preparadas y transformadas como se describe por
Yasbin et al. (1975).
\vskip1.000000\baselineskip
PBluescript II KS-(Stratagene; E.E.U.U..), y
pSJ1678 (véase WO 94/19454).
pUB110: plásmido descrito en McKenzie et
al. (1986) y McKenzie et al. (1987).
pMUTIN-4-MCS: el
plásmido se puede obtener de Laboratoire de Genetique Microbienne,
Institut National de la Recherche Agronomique, 78352 Jouy en
Josas-CEDEX, Francia.
\vskip1.000000\baselineskip
Manipulaciones de ADN y transformaciones fueron
realizadas usando métodos estándares de biología molecular (Sambrook
et al. (1989); Ausubel, F. M. et al., 1995; Harwood,
C. R. et al., 1990).
Enzimas para manipulaciones de ADN fueron usadas
según las especificaciones de los proveedores.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN que codifica la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención, puede ser obtenida del organismo depositado E.
coli, DSM 11203, por extracción de ADN plásmido por métodos
conocidos en la técnica (Sambrook et al. (1989)).
\vskip1.000000\baselineskip
Una cepa de Pyrococcus furiosus, DSM
3638, fue propagada en un fermentador durante 14-24
horas a 90ºC en el medio según se describe abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
1.3 g (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0.25 g
MgSO_{4} 7H_{2} O, 30 g NaCl, 1.4 g KH_{2}PO_{4}, 50 mg
CaCl_{2}, 38 mg FeSO_{4} 7H_{2}O, 5 \mumol Na_{2}
SeO_{3} 5H_{2}O, 10 ml elementos traza^{#}, 1 g triptona, 1 g
extracto de levadura, 1 g almidón, 1 mg Resazurina, 0.5 g cisteína
HCl, H_{2}O a 1 1.
\vskip1.000000\baselineskip
0.1 g MnCl_{2} 4H_{2} O, 0.2 g COCl_{2}
6H_{2}O, 0.1 g NiCl_{2} 6H_{2}O, 0.1 g ZnCl_{2}, 50 mg
CaCl_{2} 2H_{2}O, 50 mg CuSO_{4} 2H_{2}O, 50 mg
Na_{2}MoO_{4} 2H_{2}O, H_{2}O a 1 1. Ajustar a pH
6.2-6.5, gasificar con N_{2}/CO_{2} (4:1).
Las células fueron cosechadas, y el ADN genómico
aislado por el método descrito por Pitcher et al., 1989.
\vskip1.000000\baselineskip
ADN genómico fue parcialmente digerido con
enzima de restricción Sau3A, y dividido por tamaños por
electroforesis en un gel de agarosa al 0.7%. Fragmentos entre 2 y 7
kb de tamaño fueron aislados por electroforesis sobre papel de
DEAE-celulosa (Dretzen, G., et al.,
1981).
Fragmentos de ADN aislados fueron ligados a ADN
del plásmido pSJ1678 digerido con BamHI, y la mezcla de
ligadura fue usada para transformar E. coli SJ2.
Las células fueron colocadas en placas de LB
agar que contienen 0.1% CMC (Carboxi metil celulosa de sodio,
Aqualon, Francia) y 9 \mug/ml cloranfenicol para dar
500-1000 c.f.u./placa y se incubaron durante toda la
noche
a 37ºC.
a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la incubación las colonias fueron
colocadas en placas en réplicas sobre un conjunto de placas de agar
LB+CAM y luego incubadas adicionalmente a 37ºC durante aprox. 20
horas. Un recubrimiento que contiene 0.1% CMC, 1% agarosa HSB en un
tampón apropiado pH 7 fue vertido sobre las placas con réplicas e
incubado durante aprox. 20 horas a 65ºC. Colonias positivas en
endo-beta-1,4-glucanasa
fueron identificadas por coloración con una solución acuosa de rojo
Congo al 0,1% (Sigma; EEUU) seguido de lavado en 2 M de NaCl. Halos
amarillentos aparecieron en posiciones donde había clones positivos
en
endo-beta-1,4-glucanasa.
Células de colonias positivas en enzimas fueron
esparcidas para aislamiento de colonias individuales en agar, y una
colonia individual productora de la enzima fue seleccionada para
cada una de las colonias productoras de
endo-beta-1,4-glucanasa
identificadas.
\vskip1.000000\baselineskip
De las placas con reestriación los clones
positivos en
endo-beta-1,4-glucanasa
fueron obtenidos como colonias individuales, y los plásmidos fueron
extraídos. Fenotipos fueron confirmados por retransformación de
E. coli SJ2, y los plásmidos caracterizados por los digeridos
de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la
endo-beta-1,4-glucanasa
fue caracterizado por secuenciación del ADN por secuenciación por
paseo, usando el equipo de secuenciación de ciclo Taq desoxiterminal
(PerkinElmer; EEUU), terminadores marcados en fluorescente y
oligonucleótidos apropiados como cebadores. Análisis de los datos de
las secuencias fueron realizados según Devereux et al.(1984)
Nucleic Acids Res. 12, 387-395. La secuencia
corresponde a la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID nº: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
TY y LB agar (como descrito en Ausubel et
al., 1995).
Condiciones de hibridación (para ser
usadas en la evaluación de la propiedad ii) del constructo de ADN de
la invención)
Condiciones adecuadas para determinar la
hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN
homologa o ARN implica preremojo del filtro que contiene los
fragmentos de ADN o ARN para hibridar en 5 x SSC (citrato de
solución salina estándar) durante 10 min, y prehibridación del
filtro en una solución de 5 x SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x
Solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0.5% SDS y 100
\mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a
un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989), seguido de
hibridación en la misma solución que contiene una sonda cebada
aleatoria (Feinberg et al. (1983)), marcada en
^{32}P-DCTP-(actividad específica > 1 x
10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro es
luego lavado dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% SDS a una
temperatura preferiblemente de al menos 55ºC, más preferiblemente al
menos 60ºC, más preferiblemente al menos 65ºC, incluso más
preferiblemente al menos 70ºC, especialmente al menos 75ºC.
La sonda de nucleótidos para ser usada en la
hibridación es la parte codificante de la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en
Escherichia coli DSM 11203.
\newpage
Los anticuerpos que deben ser usados para
determinar la reactividad cruzada inmunológica pueden ser preparados
usando una
endo-beta-1,4-glucanasa
purificada. Más específicamente, antisuero contra la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención se puede aumentar inmunizando conejos (u otros
roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et
al., 1973, o A. Johnstone et al., 1982. Inmunoglobulinas
purificadas se pueden obtener de los antisueros, por ejemplo por
precipitación de sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguida de
diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en
DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de
proteínas puede ser hecha bien por análisis de difusión doble de
Ouchterlony (Ouchterlony; 1967), por inmunoelectroforesis cruzada
(N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 e 4), o por
inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., capítulo
2).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe la construcción de un
vector de expresión. El vector de expresión usado en el ejemplo 1
para expresar la secuencia de ADN que codifica la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención se construye de una manera similar.
La siguiente descripción (escrita en Itálico) ha
sido incluida para describir la construcción del vector de expresión
usado adicionalmente más abajo para expresar la secuencia de ADN que
codifica la enzima celulolítica de la invención, es decir la SEC ID
NO:1:
El pMUTIN4MCS es un plásmido de E. coli
con un promotor híbrido SPAC (Yansura et al.(1984)) y un gen
lacZ bajo control transcripcional de este promotor. Además el
plásmido contiene el gen lacl bajo control de un promotor penP de
Bacillus spe.. De este modo, cuando esté en B. subtilis el
gen lacI será expresado y se enlazará con el operador del
promotor-operador SPAC y esto inhibirá la
transcripción de la secuencia corriente abajo. El promotor es el
mismo que en Yansura et al. no obstante el operador fue
modificado en un palíndromo perfecto. Un sitio HindIII justo abajo
de la región del promotor- operador hace posible disgregar el gen
lacZ por inserción de otro gen, a saber el gen de
endo-beta-1,4-glucanasa
de esta invención. Dejando así la expresión de la endoglucansa bajo
el control del promotor-operador SPAC.
En el plásmido pMUTIN4MCS de E. coli un
sitio de unión al ribosoma (RBS) y un péptido señal con un sitio
SacII para objetivos de clonación, fueron clonados como un fragmento
HindIII-SacI. De este modo estableciendo el
siguiente sitio de unión al ribosoma y la secuencia de ADN
codificante del péptido señal:
En cursiva está escrita la secuencia de ADN que
codifica un péptido señal de Bacillus spe. que cuando se fusiona con
otra secuencia de ADN que codifica la parte madura de una proteína
la dirigirá hacia al exterior de una célula de Bacillus spe..
La secuencia anterior codifica el sitio HindIII
de pMUTIN4MCS directamente seguido de un RBS de Bacillus
subtilis y una secuencia de ADN que codifica un péptido señal de
Bacillus spe. que termnina con un sitio SacII introducido
artificialmente que es seguido de un sitio de restricción NotI y uno
SacI. El plásmido fue establecido en E. coli SJ2 por
electroporación y dispuesto en placas de LB-agar con
100 \mug/ml de ampicilina y se incubaron las células durante toda
la noche a 37ºC. El plásmido resultante fue denominado
pMUTIN4-Señal SacII-NotI.
El gen termoestable de
endo-beta-1,4-glucanasa
fue clonado como un fragmento de PCR digerido con
SacII-EagI.
El fragmento de PCR se obtuvo usando el equipo
de PCR HIFI Expand de Boehringer Mannheim y la reacción fue
realizada según está recomendado por el fabricante. El fragmento de
ADN fue amplificado del plásmido pDSM11201. El gen termoestable de
endo-beta-1,4-glucanasa
fue originalmente clonado de Dictyoglomus spe. DSM6262 y depositado
como un clon de E. coli (DSM 11201) albergando un plásmido
con el gen de
endo-beta-1,4-glucanasa.
Los dos cebadores de la PCR usados fueron de la siguiente
manera:
El fragmento de PCR y el
pMUTIN4-Señal SacII-NotI fueron
digeridos con SacII-EagI, enlazados entre sí y
usados para transformar E. coli SJ2 por electroporación y
disponer en placas de LB-agar con 100 \mug/ml de
ampicilina e incubar las células durante toda la noche a 37ºC. El
plásmido resultante en SJ2 fue denominado pMB447A.
Después de haber clonado el gen de
endo-beta-1,4-glucanasa
en fusión con el péptido señal anterior (en el sitio
SacII-Not/EagI) el siguiente marco de lectura
abierto resultó bajo el control transcripcional del
promotor-operador SPAC:
\newpage
y la proteína
derivada:
Con el objetivo de poder propagar el pMB447A en
Bacillus subtilis el plásmido de E. coli fue fusionado
a un derivado de pUB110 (un plásmido propagable en B.
subtilis): en el Sitio NciI de pUB110 un sitio SacI y NotI
fueron introducidos usando un poliligador el resultante inserto tuvo
la siguiente secuencia:
- CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG
Los dos Sitios NciI son subrayados entremedias
de estos están los sitios SacI y EagI (NotI).
Este plásmido fue luego digerido con SacI y EagI
y ligado a pMB447A digerido con EagI SacI, la ligadura fue usada
para transformar Bacillus subtilis A164. Los clones fueron
establecidos y crecidos durante toda la noche en placas de celulosa
LBPG-10 Kana AZCL-HE. Al día
siguiente estas placas fueron incubadas a 70ºC durante 5 horas y la
aparición de halos azules indicaron expresión positiva de la
endo-beta-1,4-glucanasa
termoestable.
Al analizar el ADN plásmido aislado del clon
MB505 (DSM 11903) fue aparente que el plásmido había sido sometido a
recombinación y el resultante plásmido fue más pequeño que el tamaño
del plásmido previsto de 12.5 kb. De este modo resultó que el
plásmido había perdido la mayor parte del plásmido pMUTIN 4 Señal
SacII-NotI de E. coli, dando como resultado
un plásmido del tamaño aproximado de 5.5 kb.
El resultante plásmido tenía las siguientes
características esenciales: la
endo-beta-1,4-glucanasa
codificada en el plásmido de DSM 11903 fue positivamente expresada
sin tener que añadir IPTG y el plásmido confirió resistencia a 10
\mug/ml de canamicina.
Una unidad CMCU es definida como la cantidad de
enzima que libera el equivalente a 1 mmol de glucosa por min bajo
las siguientes condiciones estándares (ensayo de CMC a 90ºC): la
enzima se incuba durante 20 min. en una solución de CMC al 0.75% (7L
de Hércules) en un tampón de barbiturato de sodio 0.1 M pH 8.5. Tras
la incubación el aumento en grupos terminales reductores es
determinado usando PHBAH (SIGMA H-988253H7704
(p-Hidroxi hidracida de ácido benzoico)); y con un
estándar de glucosa se calcula la formación de grupos terminales
equivalentes de glucosa por min. (Lever, M. (1972) A new reaction
for colometric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. vol
47, página 273-279).
Una unidad PNPU es definida como la cantidad de
enzima que libera un mmol de p-nitrofenol por minuto
de
p-nitrofenil-beta-D-celobiosido
(Sigma) bajo de condiciones de ensayo estándares (cf. más
abajo).
Detección cinética directa en estado de
equilibrio del p-nitrofenol del producto, da un
color amarillo, que se detecta a 405 nm. La actividad es medida como
el aumento de absorbencia, la parte lineal de la curva se utiliza
para determinar la pendiente (AU/sec). La actividad es calculada
usando una absorbencia de p-nitrofenol en tampón
fosfato pH 7.5: absorbencia en una cubeta de 1 cm, 1 mM de 0.018 a
405 nm (0.014 a 420 nm).
475 ml en
p-NP-beta-D-celobiosido
10 mM en tampón de Na-fosfato 0.1 M, pH 7.5, 25 ml
de solución enzimática.
La medición se hace en un espectrofotómetro de
red de diodos HP 8452A controlado termostáticamente a 70ºC en una
cubeta de 0.75 ml, 1 cm de anchura.
La absorbencia a 405 nm se mide en 300 seg con
una medición cada 20 seg.
Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Una biblioteca de Pyrococcus furiosus DSM
3638 fue construida en E. coli y seleccionada como se
describe en materiales y métodos. Un transformante positivo aislado
fue DSM 11203 conteniendo el plásmido pSJ1678 comprendiendo la
secuencia de ADN que codifica la enzima celulolítica de la
invención, es decir la SEC ID NO:1.
De la SEC ID NO:1 de ADN un conjunto de
cebadores de la PCR fueron diseñados. Estos cebadores fueron
diseñados para obtener un fragmento que codifica la secuencia de ADN
correspondiente a la forma muy probablemente madura de la
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención. El fragmento fue clonado como un fragmento de
SacII-EagI en el vector pMB505 anteriormente
descrito.
La PCR fue realizada usando el Expand High
Fidelity PCR System (#1732650, Boehringer Manheim, Gmbh). Las
reacciones fueron configuradas usando el sistema del tampón 2 junto
con 200 \muM de cada uno de los cuatro dNTP (dATP, dCTP, dGTP y
dTTP), 0.75 \mul de mezcla enzimática y 250 nM de cada uno de los
siguientes cebadores de la PCR:
La reacción de la PCR fue realizada en volúmenes
de 50 \mul y usando 100-200 ng de plásmido
obtenido del clon DSM 11203 de E. coli. Reacciones de la PCR
fueron cicladas en temperatura en un termociclador Landgraf (Hans
Landgraf, Gmbh). El siguiente perfil de variación cíclica de la
temperatura fue usado:
* 1 ciclo a 94ºC durante 60 seg.
* 10 ciclos de (94ºC durante 15 seg, 60ºC
durante 60 seg, 72ºC durante 60 seg)
* 20 ciclos de (94ºC durante 15 seg, 60ºC
durante 30 seg, 72ºC durante 60 seg añadir 20 seg por ciclo a la
fase de alargamiento).
* 1 ciclo a 72ºC durante 300 seg.
El tiempo usado para ir de una temperatura a
otra fue ajustado a 1 seg (para este termociclador significa lo más
rápido posible (aproximadamente 10 seg).
Después de finalizar el ciclo las reacciones de
50 \mul fueron purificadas usando el equipo de purificación Qiagen
PCR según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Gmbh).
Después de la purificación, el fragmento de PCR
y el plásmido pMB505 (obtenido del clon de Bacillus subtilis
DSM 11903 usando el kit plasmid prep de Qiagen #27106) fueron ambos
cortados con las enzimas de restricción SacII y EagI. El ADN
digerido fluyó en un 0.7% gel de agarosa manchado con EtBr y los
fragmentos de ADN de interés fueron cortados del gel y purificados
usando el kit de Qiagen #28706 según las instrucciones del
fabricante;
Después de la elución del ADN de las columnas de
purificación parte del fragmento de PCR (aproximadamente 100 ng) y
parte del vector (aproximadamente 400 ng) fueron ligados en un
volumen de 20 ul usando 1 unidad de la T4-ADN ligasa
en su tampón apropiado de Boehringer Mannheim (Gmbh), e incubando la
mezcla de ligadura a 16ºC durante toda la noche. La mitad de esta
ligadura fue usada para transformar Bacillus subtilis A164.
Después de la transformación las células fueron colocadas en placas
de
LBPG-AZCL-HE-celulosa
con 10 \mug/ml de canamicina e incubadas durante toda la noche a
37ºC. Colonias individuales, fueron elegidas, reestriadas en placas
frescas para incubación durante toda la noche a 37ºC. Después las
colonias individuales de diferentes clones fueron crecidas en 10 ml
de TY a 37ºC durante toda la noche y los plásmidos fueron aislados y
analizados por digestión de la enzima de restricción usando
diferentes enzimas específicas.
40 \mul del caldo de cultivo de los cultivos
dejados durante toda la noche en líquido fueron transferidos a
orificios perforados en placas de
LBPG-AZCL-HE-celulosa.
Esta placa fue luego incubada a 80ºC durante 6 horas y halos de de
color azul claro alrededor de los orificios indicaron que la
endo-beta-1,4-glucanasa
de Pyrococcus furiosus de DSM 3638 y el gen subclonado de DSM
11203 fue positivamente expresado en Bacillus subtilis.
Un tal clon expresado positivamente fue
denominado MB544. MB544 fue cultivado durante 5 días en frascos de
agitación de 500 ml con dos deflectores y 100 ml de medios de BPX a
37ºC a 300 r.p.m. Este caldo de cultivo fue usado para purificar la
endo-beta-1,4-glucanasa
expresada.
LB agar (como se describe en Ausubel, F.
M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular
Biology". John Wiley and Sons, 1995). LBPG es LB agar
suplementado con 0.5% de glucosa y 0.05 M de fosfato potásico, pH
7.0. AZCL-HE-celulosa se
añade a LBPG-agar al 1%.
AZCL-HE-celulosa es de Megazyme,
Australia. Medio BPX está descrito en US 5,695,976 y la
correspondiente EP-B-0 506 780.
3600 ml de fluido de cultivo del matraz vibrante
de Bacillus con el clon descrito en el ejemplo (1) fue
recibido y 3200 ml del caldo de cultivo fue ajustado a pH 5.5 con
HCl seguido de tratamiento con 150mlde un agente de floculación
catiónica bajo agitación a temperatura ambiente y posteriormente 300
ml de una solución al 0.1% de un agente de floculación amónica. El
material floculado fue separado por centrifugado usando un Sorval RC
3B 10.000 r.p.m. durante 30 min. El sobrenadante fue clarificado
usando un filtro de vidrio Whatman número F. Se obtuvo un total de
3400 ml con una actividad de 8 CMCU por ml (determinación de
actividad a 90ºC y pH 8.5).
El líquido fue aplicado a 3000 ml de DEAE
A-50 Sephadex equilibrado en tampón acetato 50 mM pH
5.5. El material no unido contenía un total de 18000 CMCU.
El material no unido fue concentrado a 1.4
litros en un filtron con un corte a 10 kDa. Después se aplicó dos
veces 400 ml de líquido ajustado con acetato amónico a 1 M a una
columna Butyl Toyopearl de 400 ml equilibrada con un tampón de
acetato amónico 1 M pH 6.5. La enzima unida fue eluida usando agua
desionizada. Se obtuvo un total de 17000 unidades de CMCU.
4000 unidades de CMCU fueron formuladas con
glicerol a una concentración final del 40% y se usaron para ensayos
de aplicaciones.
La
endo-beta-1,4-glucanasa
de la invención tiene un coeficiente de extinción molar de 84350 a
280 nm, un peso molecular (PM) aparente de 34 kDa, y pl 4,8.
La
endo-beta-1,4-glucanasa
pura tiene actividad en
p-nitrofenil-beta-D-celobiosido
(Sigma), CMC, celulosa HE (de Megazyme) y celulosa ácida
hinchada.
La
endo-beta-1,4-glucanasa
fue incubada en el ensayo de CMCU a pH 7,5 en un tampón de Mops 0,1
M a temperaturas diferentes y la actividad después de una incubación
de 20 min. fue determinada como se ha descrito anteriormente.
Incubaciones por encima de 100ºC no fueron realizadas. La cantidad
de azúcar de reducción obtenida a esta temperatura fue la máxima y
se usó para calcular la actividad relativa a temperaturas
inferiores.
La
endo-beta-1,4-glucanasa
fue incubada en el ensayo de CMCU a 90ºC usando diferentes tampones
en el intervalo de pH de 4,5 a 11 y la actividad después de 20 min.
de incubación fue determinada como se ha descrito anteriormente.
Tampones; pH 4.5, 5.0 y 5.5, 0.1 M acetato de
sodio
pH 6.0, 0.1 M Na-MES
pH 6.5, 7.0 y 7.5, 0.1 M
Na-MOPS
pH 8.0 y 8.5, 0.1 M EPPS
pH 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 y 11.0, 0.1 M
Na-glicina.
Más del 50% de la actividad relativa se obtuvo
en el intervalo de pH 5.0 a 9.5.
Preparación del tejido y de la solución:
tejido de prueba #460, tela de algodón entrelazado (de Test Fabrics,
Inc., Middlesex, NJ), fue cortado hasta muestras de aproximadamente
20x30 cm y acondicionado en un espacio climatizado (65 \pm 2%
humedad relativa; 70 \pm 3ºF/21 \pm 2ºC temperatura) durante al
menos 24 horas. Las muestras todas pesaron entre 11.8 y 12.6 g. Las
soluciones fueron hechas para que tuvieran 0, 2 CMCU/ml con tampones
y enzima. Los tampones han sido hechos disolviendo 1.5 g de
Tris(Hidroximetil) aminometano en 500 ml de agua desionizada,
pH ajustado a 8.9 y 7.3 con HCl. La
endo-beta-1,4-glucanasa
producida según se describe en el Ejemplo 1 y 2 fue usada (lote
MB473; #9730).
Fulardado: las muestras fueron fulardadas
con soluciones enzimáticas con la gama de
Pad-steamer de Mathis (Werner Mathis USA Inc.
Concord, NC). La recogida en húmedo fue calculada a partir de pesos
de tejido antes y después del fulardado, y se obtuvo una recogida en
húmedo de 100 \pm 5%. Dos muestras fueron fulardadas para cada pH
de la solución. A cada pH, las concentraciones de celulasa son 0 y 2
CMCU/ml.
Incubación: la gama de
Pad-Steamer de Mathis fue precalentada a temperatura
de 90ºC y humedad relativa (RH) del 100%. Después del fulardado con
la solución, una muestra fue colgada en la cámara vaporizadora
manualmente. La apertura de la puerta de la gama de pad steamer
reduce la temperatura y RH. No obstante, la temperatura original y
RH pueden ser alcanzadas en 2 minutos. Todas las muestras fueron
tratadas al mismo tiempo durante 90 minutos.
Aclarado: después de que las muestras
fueran eliminadas de la cámara vaporizadora, éstas fueron enjuagadas
en agua desionizada durante 5 minutos. Luego fueron secadas al aire
y equilibradas en una cámara climatizada durante al menos 24 horas
antes de la evaluación.
Evaluación: la resistencia al frisado
medida por nota de frisado según ASTM D 4970-89. Se
usa Nu-Martindale Abrasión and Pilling Tester (James
H. Heal & Co. Ltd., UK). La nota de frisado después de 125
revoluciones fue registrada. Una gama de nota de frisado
1-5 fue dada comparando con fotografías estándares
donde 1 tiene muchas bolitas y 5 no tiene bolitas.
La pérdida de resistencia al reventamiento fue
medida según el método ASTM D3786-87. Se usa Mullen
Burst Tester (modelo C) (de B.F. Perkins, Chicopee, MA).
La nota de frisado fue medida dos veces y la
resistencia al reventamiento fue medida al menos siete veces. Los
datos se muestran en la tabla 1. No se detectó una pérdida de
resistencia significante estadísticamente en todas las muestras
tratadas con
endo-beta-1,4-glucanasa
al ser comparadas con un control sin enzimas al mismo pH. A pH 7.3,
las muestras tratadas con 0 y 2 CMCU/g de tejido muestran una nota
de frisado de 3 y 4 después de 125 revoluciones, respectivamente. A
pH 8.9, las muestras tratadas con 0 y 2 CMCU/g de tejido muestran
una nota de frisado de 2.5 y 4 después de 125 revoluciones,
respectivamente. Estos resultados muestran una diferencia
significante. En comparación con 0 CMCU/g de tejido tratado, el
tejido tratado con
endo-beta-1,4-glucanasa
tiene mejor tacto y apariencia.
Se puede concluir que las
endo-beta-1,4-glucanasas
de la familia 12 de la presente invención son capaces de mostrar
buenos efectos de biopulido con poca pérdida de resistencia del
tejido en una gama de Pad Steamer de pH 7,3 a 8,9, 90ºC. La cantidad
de
endo-beta-1,4-glucanasa
para dar nota de frisado mejorada puede ser tan pequeña como 2
CMCU/g de tejido. Una mejor apariencia y tacto del tejido son
también conseguidos.
\sqbullet N. Axelsen et al. in:
A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell
Scientific Publications, 1973, Chapter 23.
\sqbullet A. Johnstone and R.
Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific
Publications, 1982 (more specifically pp.
27-31).
\sqbulletDiderichsen, B.,
Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R.,
Sjoholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes
alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from
Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172,
4315-4321.
\sqbulletDretzen, G., Bellard,
M., Sassone-Corsi, P., Chambón, P.
(1981) A reliable method for the recovery of DNA fragments
from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112,
295-298.
\sqbulletFeinberg, A. P. and
Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132:6-13.
\sqbulletMaidak et al.
(1996) The Ribosomal Database Project. Nucl. Acids
Res. 24:82-85.
\sqbulletZillig (1992) The
order Thermococcales. In: The Procaryotes, Albert Barlows et
al. (Ed.); Huber and Stetter (1992) The order Thermoproteales.
In: The Procaryotes, Albert Barlows et al. (Ed.)
\sqbulletHalio et al.
(1996) Sequence, expression in E. coli, and analysis
of the gene encoding a novel intracellular protease (pfpi) from the
hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. J. Bacteriol.
178:2605-2612; Kengen et al. (1996) Sugar
metabolism in hyperthermophiles. FEMS Microbiology Reviews
18:119-137.
\sqbulletHenrissat, B. 1991. A
classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence
similaritites. Biochem. J., 280: 309-316.
\sqbulletHenrissat, B., and A.
Bairoch. 1993. New families in the classification of
glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similaritites.
Biochem. J., 293:781-788.
\sqbulletKengen (1993)
Purification and characterization of an extremely thermostable
beta-glucosidase from the hyper-
thermophilic archaeon P. furiosus. Eur. J. Biochem. 213:305-312.
thermophilic archaeon P. furiosus. Eur. J. Biochem. 213:305-312.
\sqbulletBauer et al.
(1996) Comparison of a beta-glucosidase and a
beta-mannosidase from the hyperthermophilic archaeon
P. furiosus. J. Biol. Chem.
271:23749-23755.
\sqbulletBragger et al.
(1989) Very stable enzymes from extremely thermophilic
archaebacteria and eubacteria. Appl. Environ. Microbiol.
31:556-561.
\sqbulletVincken, J.P.,
Beldman, G., and Voragen, A.G.J.
Substrate-specificity of
endo-beta-1,4-glucanases-what
determines xyloglucanase activity. Carbohydrate Research
298(4):299-310, 1997.
\sqbulletSambrook et al.
(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY.
\sqbullet Ausubel, F. M. et al. (eds.)
"Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and
Sons, 1995.
\sqbullet Harwood, C. R., and Cutting, S. M.
(eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John
Wiley and Sons, 1990.
\sqbullet O. Ouchterlony in: Handbook of
Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific
Publications, 1967, pp. 655-706.
\sqbulletPitcher, D. G.,
Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid
extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate.
Lett. Appl. Microbiol. 8:151-156.
\sqbullet Eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch and
Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other
Gram-Positive Bacteria, American Society for
microbiology, p.618.
\sqbulletYasbin, R.E., Wilson,
G.A. and Young, F.E. (1975) Transformation and
transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis:
evidence for selective induction of prophage in competent cells.
J. Bacteriol, 121:296-304.
\sqbulletMcKenzie, T., Hoshino,
T., Tanaka, T. and Sueoka. N. The nucleotide sequence
of pUB110: some salient features in relation to replication and its
regulation Plasmid 15 (2), 93-103
(1986)).
\sqbulletMcKenzie. T., Hoshino.
T., Tanaka. T. and Sueoka, N. Correction. A revisión
of the nucleotide sequence and functional map of pUB110 Plasmid 17
(1), 83-85 (1987).
\sqbulletYansura et al.
(1984) Use of E. coli lac repressor and operator to
control gene expression in Bacillus subtilis, PNAS, Vol 81,
pp. 439-443.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\sqbullet DK 9000074 W [0006]
\sqbullet WO 9744361 A [0007]
\sqbullet GB 1368599 A [0010]
\sqbullet EP 0307564 A [0010]
\sqbullet EP 0435876 A [0010]
\sqbullet WO 9117243 A [0010]
\sqbullet WO 9110732 A [0010]
\sqbullet WO 9117244 A [0010]
\sqbullet DK 95000108 W [0010]
\sqbullet DK 9500132 W [0010]
\sqbullet WO 9000609 A [0032]
\sqbullet WO 9516782 A [0032]
\sqbullet WO 9419454 A [0103]
\sqbullet US 5695976 A [0154]
\sqbullet EP 0506780 B [0154].
\newpage
\sqbullet Microbial Cellulases T.-M.
Enveri Microbial Enzymes and Biotechnology Applied Science
Publishers 1983. 183-224 [0003]
\sqbulletMethods in Enzymology 1988. vol. 160, 200-391 [0003]
\sqbulletBéguin, P. Molecular Biology
of Cellulose Degradation Annu. Rev. Microbiol., 1990,
vol. 44, 219-248 [0003]
\sqbulletBéguin, P. Aubert,
J-P. The biological degradation of cellulose FEMS
Microbiology Reviews, 1994, vol. 13,
25-58 [0003]
\sqbulletHenrissat, B. Cellulases and
their interaction with cellulose Cellulose, 1994, vol.
1, 169-196 [0003]
\sqbulletHenrissat, B. Bairoch,
A. Biochem J., 1993, vol. 293, 781-788
[0004]
\sqbulletGilbert, H. J.
Hazlewood, G.P. J. Gen. Microbiol., 1993, vol.
139, 187-194 [0004]
\sqbulletFord et al. Protein
Expression and Purification, 1991, vol. 2,
95-107 [0030]
\sqbulletCunningham Wells Science,
1989, vol. 244, 1081-1085 [0031]
\sqbulletVos et al. Science,
1992, vol. 255, 306-312 [0031]
\sqbulletSmith et al. J.
Mol. Biol., 1992, vol. 224, 899-904
[0031]
\sqbulletWlodaver et al.
FEBS Lett., 1992, vol. 309, 59-64
[0031]
\sqbullet Cellulose-Binding
Domains: Classification and Properties Peter Tomme et
al. Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates ACS
Symposium Series, No. 6181996. [0032]
\sqbulletSambrook et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor
Lab. 1989. [0033]
\sqbulletNeedleman, S.B.
Wunsch, C.D. Journal of Molecular Biology,
1970, vol. 48,443-433 [0038]
\sqbulletNeedleman, S.B.
Wunsch, C.D. Journal of Molecular Biology,
1970, vol. 48, 443-453 [0038] [0045]
\sqbulletFeinberg, A. P.
Vogelstein, B. Anal. Biochem., 1983, vol. 132,
6-13 [0040] [0172]
\sqbulletLemesle-Varloot L Henrissat B
Gaboriaud C Bissery V Morgat A Mornon Jp
Hydrophobic cluster analysis: Biochimie, 1990, vol.
72, no. 8. 555-574 [0043]
\sqbullet N. Axelsen et al. A
Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis Blackwell Scientific
Publications 1973. [0046] [0172]
\sqbullet A. Johnstone R. Thorpe
Immunochemistry in Practice Blackwell Scientific Publications
1982. 27-31 [0046] [0172]
\sqbullet O. Ouchterlony Handbook of
Experimental Immunology Blackwell Scientific Publications
1967. 655-706 [0046] [0172]
\sqbulletDevereux et al.
Nucleic Acids Res., 1984, vol. 12,
387-395 [0117]
\sqbulletLever, M. A new reaction for
colometric determination of carbohydrates Anal. Biochem.,
1972, vol. 47, 273-279 [0137]
\sqbullet Current protocols in Molecular
Biology John Wiley and Sons 1995. [0154] [0172]
\sqbulletDiderichsen, B.
Wedsted, U. Hedegaard, L. Jensen, B. R.
Sjoholm, C. Cloning of aldB, which encodes
alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from
Bacillus brevis J. Bacteriol., 1990, vol. 172,
4315-4321 [0172]
\sqbulletDretzen, G. Bellard,
M. Sassone-Corsi, P. Chambon, P. A
reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and
acrylamide gels Anal. Biochem., 1981, vol. 112,
295-298 [0172]
\sqbulletMaidak et al. The
Ribosomal Database Project Nucl. Acids Res., 1996,
vol. 24, 82-85 [0172]
\sqbullet The order Thermococcales
Zillig et al. The Procaryotes 1992. [0172]
\sqbullet The order Thermoproteales Huber
Stetter et al. The Procaryotes 1992. [0172]
\sqbulletHalio et al. Sequence,
expression in E. coli, and analysis of the gene encoding a
novel intracellular protease (pfpi) from the hyperthermophilic
archaeon Pyrococcus furiosus J. Bacteriol.,
1996, vol. 178, 2605-2612 [0172]
\sqbulletKengen et al. Sugar
metabolism in hyperthermophiles FEMS Microbiology Reviews,
1996, vol. 18, 119-137 [0172]
\sqbulletHenrissat, B. A
classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence
similaritites Biochem. J., 1991, vol. 280,
309-316 [0172]
\sqbulletHenrissat, B. A.
Bairoch. New families in the classification of glycosyl
hydrolases based on amino acid sequence similaritites Biochem.
J., 1993, vol. 293, 781-788 [0172]
\sqbulletKengen Purification and
characterization of an extremely thermostable
beta-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon
P. furiosus Eur. J. Biochem., 1993, vol. 213,
305-312 [0172]
\sqbulletBauer et al.
Comparison of a beta-glucosidase and a
beta-mannosidase from the hyperthermophilic archaeon
P. furiosus J. Biol. Chem., 1996, vol. 271,
23749-23755 [0172]
\sqbulletBragger et al. Very
stable enzymes from extremely thermophilic archaebacteria and
eubacteria Appl. Environ. Microbiol., 1989, vol. 31,
556-561 [0172]
\sqbulletVincken, J.P. Beldman,
G. Voragen, A.G.J. Substrate-specificity of
endo-beta-1,4-glucanases-what
determines xyloglucanase activity Carbohydrate Research,
1997, vol. 298, no. 4. 299-310 [0172]
\sqbulletSambrook et al.
Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor
lab. 1989. [0172]
\sqbullet Molecular Biological Methods for
Bacillus John Wiley and Sons 1990. [0172]
\sqbulletPitcher, D. G.
Saunders, N. A. Owen, R. J. Rapid extraction of
bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate Lett. Appl.
Microbiol., 1989, vol. 8, 151-156
[0172]
\sqbulletBacillus subtilis and other
Gram-Positive Bacteria American Society for
microbiology 1993. 618-[0172]
\sqbulletYasbin, R.E. Wilson, G.A.
Young, F.E. Transformation and transfection in lysogenic strains of
Bacillus subtilis: evidence for selective induction of
prophage in competent cells J. Bacteriol, 1975, vol.
121, 296-304 [0172]
\sqbulletMcKenzie, T. Hoshino.
T. Tanaka, T. Sueoka, N. The nucleotide sequence of
pUB110: some salient features in relation to replication and its
regulation Plasmid, 1986, vol. 15, no. 2.
93-103 [0172]
\sqbulletMcKenzie, T. Hoshino,
T. Tanaka, T. Sueoka, N. Correction. A revisión of the
nucleotide sequence and functional map of pUB110 Plasmid,
1987, vol. 17, no. 1. 83-85 [0172]
\sqbulletYansura et al. Use of
E. coli lac repressor and operator to control gene expression
in Bacillus subtilis PNAS, 1984, vol. 81,
439-443 [0172].
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: NOVO NORDISK A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: + 45 44 44 88 88
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: +45 44 49 32 56
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA ENDOGLUCANASA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 960 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 319 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Constructo de ADN que comprende una secuencia
de ADN que codifica una enzima que tiene actividad
endo-\beta-1,4-glucanasa
y actividad óptima a una temperatura de al menos 90ºC,
preferiblemente al menos 95ºC, más preferiblemente al menos 100ºC,
la secuencia de ADN comprende
a) la secuencia de ADN correspondiente a la
parte codificante de la
endo-\beta-1,4-glucanasa
de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia
coli DSM 11203, o
b) un análogo de la secuencia de ADN
correspondiente a la parte codificante de la
endo-\beta-1,4-glucanasa
de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia
coli DSM 11203, que
i) es al menos idéntica en un 80%, con la
secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la
endo-\beta-1,4-glucanasa
de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia
coli DSM 11203, o
ii) codifica un polipéptido que es al menos
idéntico en un 50%, con el polipéptido de SEC ID NO:2 o el
polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la
secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la
endo-\beta-1,4-glucanasa
de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia
coli DSM 11203.
2. El constructo de ADN según la reivindicación
1, en el que la secuencia de ADN se aisla de o es producida
basándose en una biblioteca de ADN de una cepa del género
Pyrococcus, incluso más preferiblemente de la especie
Pyrococcus furiosus, especialmente Pyrococcus
furiosus, DSM 3638.
3. Constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuencia de ADN se aisla de
Escherichia coli, DSM 11203.
4. Constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 que además comprende una
secuencia de ADN que codifica un dominio de unión a celulosa
(CBD).
5. El constructo de ADN según la reivindicación
4 que además comprende una secuencia de ADN que codifica el dominio
de unión a la celulosa (CBD), el dominio de unión a la celulosa y el
núcleo enzimático (dominio catalíticamente activo) de la enzima
codificada por la secuencia de ADN del constructo de ADN que está
enlazada operablemente.
6. Vector de expresión recombinante que
comprende un constructo de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5.
7. Célula huésped en la que un constructo de ADN
según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o un
vector de expresión recombinante según la reivindicación 6 ha sido
introducido.
8. Célula según la reivindicación 7, que es una
célula procariótica, en particular una célula bacteriana; o una
célula eucariótica, en particular una célula micótica filamentosa; o
una célula endógena a partir de la cual se origina la secuencia de
ADN, que codifica una muestra enzimática que presenta actividad
endo-\beta-1,4-glucanasa.
9. Célula según la reivindicación 8, donde la
célula bacteriana pertenece a una cepa de Bacillus,
preferiblemente una cepa de Bacillus subtilis o Bacillus
lentus; y la célula fúngica pertenece a una cepa seleccionada de
Aspergillus ssp. y Fusarium ssp.
10. Célula según la reivindicación 7 u 8, donde
la célula pertenece a una cepa de Pyrococcus, preferiblemente
Pyrococcus furiosus, DSM 3638.
11. Célula según la reivindicación 7 u 8, donde
la célula pertenece a una cepa de Saccharomyces,
preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
12. Método para producir una enzima que tiene
actividad
endo-\beta-1,4-glucanasa
y actividad óptima por encima de 90ºC, preferiblemente por encima de
95ºC, más preferiblemente por encima de 100ºC, el método
comprendiendo el cultivo de una célula según cualquiera de las
reivindicaciones 7-11 bajo condiciones que permiten
la producción de la enzima, y recuperación de la enzima del
cultivo.
13. Método según la reivindicación 12, donde la
enzima recuperada tiene al menos un 20% de pureza.
14. Enzima aislada que tiene actividad
endo-\beta-1,4-glucanasa,
en la que la enzima está (i) libre de impurezas homologas, y (ii)
producida por el método según la reivindicación 12 o 13.
15. Enzima con actividad
endo-\beta-1,4-glucanasa
y actividad óptima por encima de 90ºC, preferiblemente por encima de
95ºC, más preferiblemente por encima de 100ºC, la enzima
a) es codificada por un constructo de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o
b) es al menos un 60% idéntica a la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2, o
c) es producida por el método según la
reivindicación 13, o
d) es un polipéptido producido por Pyrococcus
furiosus, DSM 3638, que es codificable por la
endo-\beta-1,4-glucanasa
que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en
Escherichia coli DSM 11203.
16. Enzima según la reivindicación 14 o 15, que
pertenece a la familia 12 de glicosil hidrolasas.
17. Preparación enzimática que es enriquecida
con la enzima según cualquiera de las reivindicaciones
14-16.
18. Preparación según la reivindicación 17, que
adicionalmente comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo
que consiste en mananasas, galactanasas, xilanasas, arabinanasas,
pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas,
pectina liasas, pectato liasas, pectina
metil-esterasas,
endo-\beta-1,4-glucanasas,
proteasas, lipasas, amilasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas,
celobiohidrolasas y transglutaminasas.
19. Cultivo biológico aislado sustancialmente
puro de la cepa de Escherichia coli, DSM 11203.
20. Uso de la enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 14-16 o la preparación enzimática
según las reivindicaciones 17 o 18 en la industria textil para
mejorar las propiedades de las fibras celulósicas o tejido o para
proporcionar un aspecto de lavado a la piedra de la tela vaquera; o
en la industria del procesamiento de fibras celulósicas; o en
procesos de limpieza industrial; o material polimérico extruido por
calor; o en la conversión de biomasa en azúcares; o en la producción
de alcohol; o para predigestión de p. ej. granos usados en la
producción de pienso; o en la producción de café instáneo o procesos
de extracción similares; o en la industria petrolera para la
degradación de soluciones acuosas de derivados de celulosa del
hidrocoloide usados en perforación o en recuperación del petróleo
mejorada por inundación polimérica.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK11497 | 1997-01-31 | ||
| DK114/97 | 1997-01-31 | ||
| DK85397 | 1997-07-11 | ||
| DK853/97 | 1997-07-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2343227T3 true ES2343227T3 (es) | 2010-07-26 |
Family
ID=26063338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98900849T Expired - Lifetime ES2343227T3 (es) | 1997-01-31 | 1998-01-30 | Endo-beta-1,4-glucanasa termoestable. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0972016B1 (es) |
| JP (1) | JP3532577B2 (es) |
| CN (1) | CN1198923C (es) |
| AT (1) | ATE462784T1 (es) |
| AU (1) | AU5652198A (es) |
| DE (1) | DE69841586D1 (es) |
| ES (1) | ES2343227T3 (es) |
| WO (1) | WO1998033895A1 (es) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7465571B1 (en) | 1996-05-22 | 2008-12-16 | Verenium Corporation | Endoglucanases |
| US5789228A (en) | 1996-05-22 | 1998-08-04 | Diversa Corporation | Endoglucanases |
| TR200001925T2 (tr) * | 1997-12-19 | 2000-11-21 | Novo Nordisk Biochem North America, Inc. | Selüloz içeren kumaşların sürekli biyo parlatılması. |
| WO2000039288A1 (fr) * | 1998-12-24 | 2000-07-06 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Polypeptides |
| WO2001096382A2 (en) * | 2000-06-15 | 2001-12-20 | Prokaria Ehf. | Thermostable cellulase |
| NL1021820C2 (nl) * | 2002-11-01 | 2004-05-06 | Tno | Werkwijze voor het behandelen van cellulose bevattend ruw textieldoek, textieldoek dat wordt verkregen met de werkwijze, het gebruik van het behandelde textieldoek voor het vervaardigen van textielproducten, en textielproducten die vervaardigd zijn van het behandelde textieldoek. |
| FI20085055A0 (fi) * | 2008-01-23 | 2008-01-23 | Tiina Haerkaesalmi | Menetelmä runkokuitujen liottamiseksi, pehmentämiseksi ja cottonisoimiseksi sekä kasvipohjaisten ligniinien poistamiseksi |
| JP2011157680A (ja) * | 2011-04-28 | 2011-08-18 | Rakuto Kasei Industrial Co Ltd | 好熱性エンドグルカナーゼを用いた繊維処理剤及び繊維の処理方法 |
| CN102816750B (zh) * | 2012-08-17 | 2014-06-11 | 武汉新华扬生物股份有限公司 | 一种来源于嗜酸耐热菌的第113家族的新β-甘露聚糖酶、基因和及其应用 |
| CN103215836B (zh) * | 2013-03-15 | 2015-09-02 | 深圳职业技术学院 | 一种表达糖苷酶的微生物菌种和其用于生物酶法造纸的技术 |
| CN109527640B (zh) * | 2018-10-29 | 2021-11-19 | 河南中烟工业有限责任公司 | Smxp-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用 |
| CN109602070B (zh) * | 2018-10-29 | 2021-11-19 | 河南中烟工业有限责任公司 | Smxp-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用 |
| US20220251616A1 (en) * | 2019-07-23 | 2022-08-11 | Ozeki Corporation | Endoglucanase and use thereof |
| JPWO2021015158A1 (es) * | 2019-07-23 | 2021-01-28 | ||
| CN114958809A (zh) * | 2022-06-14 | 2022-08-30 | 中农华威生物制药(湖北)有限公司 | 一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5275944A (en) * | 1989-09-26 | 1994-01-04 | Midwest Research Institute | Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068 |
-
1998
- 1998-01-30 ES ES98900849T patent/ES2343227T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-30 AT AT98900849T patent/ATE462784T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-01-30 CN CN98802186.2A patent/CN1198923C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-30 EP EP98900849A patent/EP0972016B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-30 JP JP53246898A patent/JP3532577B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-30 DE DE69841586T patent/DE69841586D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-30 AU AU56521/98A patent/AU5652198A/en not_active Abandoned
- 1998-01-30 WO PCT/DK1998/000039 patent/WO1998033895A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1198923C (zh) | 2005-04-27 |
| WO1998033895A1 (en) | 1998-08-06 |
| EP0972016B1 (en) | 2010-03-31 |
| AU5652198A (en) | 1998-08-25 |
| DE69841586D1 (en) | 2010-05-12 |
| EP0972016A1 (en) | 2000-01-19 |
| JP2001504352A (ja) | 2001-04-03 |
| ATE462784T1 (de) | 2010-04-15 |
| JP3532577B2 (ja) | 2004-05-31 |
| CN1246149A (zh) | 2000-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2521615T3 (es) | Endo-beta-1,4-glucanasa | |
| JP4246386B2 (ja) | 新規なペクチン酸リアーゼ | |
| US5916796A (en) | Enzyme exhibiting cellulase activity | |
| ES2458301T3 (es) | Celulasas mejoradas | |
| US7041488B2 (en) | Endo-beta-1,4-glucanase from bacillus | |
| ES2343227T3 (es) | Endo-beta-1,4-glucanasa termoestable. | |
| ES2322690T3 (es) | Xiloglucanasas de la familia 44. | |
| US7144722B2 (en) | Pectate lyases | |
| BRPI0620318A2 (pt) | enzimas | |
| BRPI9607646B1 (pt) | vetor de expressão recombinante, célula fúngica, método para produzir uma enzima apresentando atividade de endoglucanase e para prover clarificação da cor nas roupas de lavagem, composição de lavanderia , uso da enzima, e, composição de enzima | |
| Endo et al. | A novel alkaline endoglucanase from an alkaliphilic Bacillus isolate: enzymatic properties, and nucleotide and deduced amino acid sequences | |
| CN107109385A (zh) | 真菌内切葡聚糖酶变体、它们的生产和用途 | |
| Liu et al. | Properties of exgS, a gene for a major subunit of the Clostridium cellulovorans cellulosome | |
| EP1002059A1 (en) | ENDO-$g(b)-1,4-GLUCANASES FROM $i(SACCHAROTHRIX) | |
| ES2262197T3 (es) | Endoglucanasa. | |
| JP4837855B2 (ja) | 新規エンド−β−１，４−グルカナーゼ | |
| JPH11221086A (ja) | トランケートされたセルラーゼ組成物 | |
| PL198507B1 (pl) | Liaza pektynianowa, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, wektor ekspresyjny, hodowana komórka, sposób wytwarzania polipeptydu, preparat enzymu, kompozycja detergentowa, sposób prania tkanin, sposób polepszania właściwości celulozowych włókien, przędzy, tkaniny lub włókniny, sposób degradacji lub modyfikowania materiału roślinnego, sposób wytwarzania paszy dla zwierząt i sposób obróbki wina lub soku | |
| Ibrahim et al. | CLONING AND SEQUENCING OF CELLULASE-ENCODING GENE (cel 2) FROM LOCALLY ISOLATED BACILLUS SP. STRAIN A4 | |
| MXPA00005108A (es) | Nuevas pactato liasas |