CN109527640B - Smxp-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于卷烟原料生产加工技术领域，具体涉及一株特定的枯草芽孢杆菌SMXP‑58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用专利申请。应用时，将枯草芽孢杆菌SMXP‑58菌株制备成含有活菌的微生物菌剂，与烟叶混合后通过发酵处理，用于降解烟叶中的纤维素。本申请属于现有已知菌株的新用途开发。该菌株不仅能够较好降低烟梗中果胶含量，还能在较短时间内较好降低烟叶中的纤维素含量，纤维素的降解率可达30%左右，表现出较好地降低烟叶中纤维素含量的技术效果。进一步检测结果表明，纤维素被最终降解成糖类成分，降解处理后烟叶中总糖与还原糖含量均有明显提高，较好稳定甚至提升了烟叶感官质量，确保了最终烟支产品质量的稳定。

Description

SMXP-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用

技术领域

本发明属于卷烟原料生产加工技术领域，具体涉及一株特定的枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用专利申请。

背景技术

纤维素是烟叶的主要结构成分，与半纤维素、木质素等物质共同组成了烟草细胞壁，决定着烟叶完整性，其含量与烟草品质息息相关。

研究表明，纤维素对烟叶的燃烧性有正向作用，可使烟叶持火力增加；但纤维素含量过高时对烟叶品质则有较多负面影响，主要表现为：纤维素含量过高易造成烟叶组织破碎，影响加工可塑性；另一方面，过高纤维素含量会影响烟叶吸食品质，导致刺激性大，杂气重，香气掩盖等；而更为重要的是，纤维素在超过600℃的温度下会热裂解生成稠环芳烃（PAH），进而影响烟叶吸食安全性。因此，为确保烟支产品质量的稳定和安全可靠，需要对烟叶中的纤维素含量进行适当控制，以平衡其助燃性和安全性。

现有技术中，烟叶在实际用于制备烟支产品前，一般需要经过1~3年左右的自然醇化处理，在此过程中，烟叶中的纤维素成分会发生一定程度的降解。但是由于这种自然醇化方式缺乏针对性，因此纤维素的实际降解效果较为有限。另一方面，利用特定的纤维素酶对烟叶进行酶解处理，则是一种较为快速的降解纤维素的处理方法。但实际使用过程中，由于烟支产品品质要求的特殊性，利用纤维素酶降解纤维素后，最终烟支产品品质也常会受到不可逆影响。因此，探索新的、适应于烟叶的纤维素降解处理方法，对于确保最终烟支产品的质量稳定仍然是具有十分重要的应用意义的。

发明内容

在现有微生物菌株筛选基础上，发明人以前期筛选SMXP-58菌株为基础，发现将其用于新的烟草原料——烟叶后，不仅具有较好的降解纤维素的技术效果，而且能够明显提升烟叶的整体品质，表现出较好的应用前景。

本申请所采取的技术方案详述如下。

枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用，应用时，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株制备成含有活菌的微生物菌剂，与烟叶混合后通过发酵处理，用于降解烟叶中的纤维素，进而降低烟叶中纤维素含量。

进一步而言，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株制备成活菌数为（9~10）×10⁷个/mL的液态微生物菌剂，按烟叶1~3%的质量比例，均匀喷洒于烟叶（或加工后叶丝）表面，在35℃~40℃、湿度60~80%的条件下，发酵处理48~72h（优选处理工艺条件为：在37℃、湿度75%的条件下，发酵处理72h）；然后将烟叶（或加工后叶丝）加热处理（例如80℃条件下保温10~20min）后使细菌及其产生的纤维素酶失活后即可；失活处理后烟叶（或加工后叶丝）即可按现有技术用于制备卷烟。

所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株，属芽孢杆菌属（Bacillus），最初由2013年河南三门峡C2F烟叶中分离而来，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌 SMXP-58，分类学名称为Bacillus subtilis SMXP-58，现保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：M 2016083，保藏地址为：武汉市武汉大学。

利用所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株所制备的液态微生物菌剂，具体可通过如下步骤制备而成：

（1）活化菌种，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下活化培养1~2d；

（2）制备种子液，刮取收集步骤（1）中活化培养后菌体，接种于液体LB培养基中，30℃、150 rpm条件于摇床培养过夜；

（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液按1%的体积比转接液体LB培养基，30℃、150rpm条件于培养至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水进行充分悬浮，调整活菌数至适当数量后，即为用于降解烟叶中纤维素的微生物菌剂。

就本申请所采用的枯草芽孢杆菌SMXP-58这一特定菌株而言，现有研究中发现，该菌株对烟梗中果胶具有较好的降解效果，同时与其他生物酶复合后可较好用于烟草薄片中果胶降解。但是关于该特定菌株在其他方面的用途，尚未见到较好报道。而由于微生物发酵过程中代谢产物的多样性，以及烟草物料（主要是烟叶和烟梗）成分调节的重要性，如果能够基于一种微生物菌株发挥多种成分调节作用，无论对于最终烟草产品的安全性、还是对于烟草物料的实际处理工艺都是具有重要影响的。

总体而言，本申请属于现有已知菌株的新用途开发。初步研究结果表明，枯草芽孢杆菌SMXP-58不仅能够较好降低烟梗中果胶含量，还能在较短时间内较好降低烟叶中的纤维素含量，而且烟叶中纤维素的降解率可达30%左右，表现出较好地降低烟叶中纤维素含量的技术效果。而进一步检测结果表明，纤维素被最终降解成糖类成分，降解处理后烟叶中总糖与还原糖含量均有明显提高，较好稳定甚至提升了烟叶感官质量，确保了最终烟支产品质量的稳定。而结合本申请的新用途开发，在采用枯草芽孢杆菌SMXP-58降解处理烟草物料（烟梗或烟叶）时，只需通过部分工艺调整，即可同时实现降低果胶含量和降低纤维素含量的目的，无论对于确保最终烟支产品的安全性，还是对于简化生产加工处理工艺都具有较好的实用价值，同时也为新的微生物菌株筛选、或者对现有微生物菌株新用途开发都提供了较好借鉴和应用示范，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。

总之，在采用本申请所提供特定菌株处理烟叶时，相关加工处理工艺流程较为简便，处理成本较低、处理条件温和、处理周期较短，并且具有较好的降解纤维素含量效果，促使纤维素转化为水溶性还原糖等对烟草品质有利的小分子物质，进一步促进卷烟原料品质的提升，因此在卷烟制造技术领域具有较好的应用价值和推广应用意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前就下述实施例中涉及部分物料、实验设备等情况简要介绍如下。

烟草物料：烟叶为2015年河南许昌C3F，由河南中烟工业有限责任公司提供；

微生物菌株：枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株，属芽孢杆菌属（Bacillus），最初由2013年河南三门峡C2F烟叶中分离而来，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌 SMXP-58，分类学名称为Bacillus subtilis SMXP-58，现保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2016083，保藏地址为：武汉市武汉大学；该菌株属于一种可公开获得性菌株，发明人保藏有该菌株的原始备份材料。

实施例1

为将SMXP-58菌株用于降解烟叶中纤维素，需首先将该菌株制备成易于使用的菌剂，具体制备过程如下。

（1）活化菌种：将SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下于生化气候箱中活化培养1d；

（2）制备种子液：在超净工作台中刮取步骤（1）中所培养的菌体，接种于含有5mL液体LB培养基的18×180的试管中，30℃、150 rpm条件于摇床过夜培养；

（3）扩大培养：将步骤（2）中种子液按1 mL菌悬液/100 ml LB培养基（1%的体积比）转接于含100mL液体LB培养基的灭菌的250mL锥形瓶中，30℃、150 rpm条件于培养至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制备菌剂：将步骤（3）中菌液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水充分悬浮，调整活菌数为9.6×10⁷个/mL左右后，即为用于降解烟叶中纤维素的菌剂。

实施例2

利用实施例1中所制备菌剂处理烟叶时，具体步骤为：

取抽取烟梗后的烟叶，分割成片状，然后均匀分成多份，每份100 g；

按照2%的烟叶质量比，用喷雾器将实施例1所制备微生物菌剂均匀喷洒于处理后烟叶表面，然后调整烟叶水分含量为25%；置于特定温湿度条件下发酵一定时间后，80℃处理20 min，使细菌及其产生的纤维素酶失活。

为确定菌剂的最佳作用温湿度条件及时间，发明人分别以发酵时间、发酵温度、发酵湿度为影响因素，进了3因素水平设计，具体设计如下：

表1 因素水平表L₉（3³）

注：A为发酵时间；B为发酵温度；C为发酵湿度。

依据表1，进行了三因素三水平正交实验设计：

表2正交设计表L₉（3³）

注：A为发酵时间；B为发酵温度；C为发酵湿度；同时设置空白对照CK。

烟叶处理完成后，采用流动分析法测定烟叶纤维素含量以及常规化学成分含量。

烟叶感官质量评价时，具体方法为：将烟叶切丝，制成烟支规格（20+64）mm×24.5mm的烟支样品，在（22±1 ）℃、相对湿度（60±2）%的恒温恒湿箱中平衡48 h后，由11名专业评吸员对香气质（A）、香气量（B）、浓度（C）、柔细度（D）、余味（E）、杂气（F）、刺激性（G）等指标进行评定，每项指标均按9分制打分，结果取其平均值，最后计算总分（T）。

具体结果：

根据烟叶纤维素含量测定结果，进一步进行极差分析，结果如表3：

表3极差分析表

注：A为发酵时间；B为发酵温度；C为发酵湿度。

对上表进行分析可以看出：最优水平组合为A3B3C1，即作用时间为72 h、作用温度为37℃、作用湿度为75%。通过R值比较可知：RA>RC>RB，即作用时间对整个作用条件的影响最大，其次是作用湿度，而作用温度的影响最小。

由于最优化组合并不在9组正交处理方案中，因此对A3B3C1方案进行了验证实验。结果表明，发酵后烟叶纤维素含量为86.1 g•kg^-1，与对照（纤维素含量为120.3 g•kg^-1）相比，降解率达28.4%（表5）。

表4 验证试验分析

。

进一步地，对上述最优方案处理烟叶，之后测定其常规化学成分，结果见表6所示。

表5烟叶常规化学成分（g·kg^-1）

由表5可知，烟叶经过SMXP-58菌液处理后，总糖与还原糖含量均有所上升，说明菌株发酵处理后，烟叶中的纤维素等多糖类物质能有效的降解生成可溶性糖等小分子物质，有利于烟叶整体品质的提升。

更进一步地，对上述最优方案处理烟叶，之后评价烟叶感官质量，结果见表6所示。

表6 烟叶感官质量评价（单位：分）

由表6可知，烟叶经过菌液处理后，香气质、香气量、烟气浓度等明显提高，杂气、刺激性等明显减轻，余味、柔细度等改善明显，烟叶整体质量明显提高。

综上所述，将菌液均匀喷洒于烟叶表面进行发酵，在温度为37℃、湿度为75%的条件下发酵72 h，烟叶中的纤维素降解率可达28.4%；总糖与还原糖含量均有明显提高；烟叶整体感官质量也得到较为明显的提升，因而本发明在降低烟叶中纤维素含量，从而提升烟叶品质方面具有较好地应用前景。

总体而言，本申请中所采用的SMXP-58菌株，其来源于烟草原料中的原有菌株，当利用其所制备菌剂处理烟叶时，在确保对于烟叶中纤维素降解同时，不具有明显的副作用，可较为有效的促进烟草中大分子物质降解形成各类有利于提高烟草品质的小分子物质，进而达到降低卷烟烟气中的有害成分，改善烟叶的内在品质的目的。此外，在前期研究中已经发现，SMXP-58菌株对烟叶中的果胶质也有较为明显的降解作用，因此本发明也进一步扩展了该菌株的应用范围。

Claims (3)

1.枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株制备成含有活菌的微生物菌剂，与烟叶混合后通过发酵处理，用于降解烟叶中的纤维素；

应用时，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株制备成活菌数为（9~10）×10⁷个/mL的液态微生物菌剂，按烟叶1~3%的质量比例，均匀喷洒于烟叶表面，在35℃~40℃、湿度60~80%的条件下，发酵处理48~72h。

2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用，其特征在于，处理工艺条件为：在37℃、湿度75%的条件下，发酵处理72h。

3.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降解烟叶中纤维素方面的应用，其特征在于，利用所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株所制备的液态微生物菌剂，具体通过如下步骤制备而成：

（1）活化菌种，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下活化培养1~2d；

（2）制备种子液，刮取收集步骤（1）中活化培养后菌体，接种于液体LB培养基中，30℃、150 rpm条件于摇床培养过夜；

（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液按1%的体积比转接液体LB培养基，30℃、150 rpm条件于培养至OD₆₀₀=2.0；

（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水进行充分悬浮，调整活菌数至适当数量后，即为用于降解烟叶中纤维素的微生物菌剂。