CN114958809A

CN114958809A - 一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法

Info

Publication number: CN114958809A
Application number: CN202210671819.5A
Authority: CN
Inventors: 游锡火; 王玉万; 胡燕; 梁大明; 曾徐浩; 夏胜; 薛栋升; 蒋慧; 田美华; 姜本荣; 齐义清; 沈力
Original assignee: Zhongnong Huawei Biopharmaceutical Hubei Co ltd
Current assignee: Zhongnong Huawei Biopharmaceutical Hubei Co ltd
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明公开了一种适合饲料高温制粒的内切β‑葡聚糖酶的构建方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种适合饲料高温制粒的内切β‑葡聚糖酶的构建方法，包括目的基因扩增；酶切、连接和转化；利用IPTG诱导目的基因的表达，经超声破碎获得蛋白粗酶液；采用Ni‑NTA纯化介质对蛋白粗酶液进行纯化。本发明通过定向进化，得到一个具有高度热稳定性的β‑葡聚糖酶，比酶活为91.6U/mg，在90℃半衰期为1.5h，该酶在饲料领域应用具有巨大潜力。

Description

一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法。

背景技术

β-葡聚糖属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，以右旋葡萄糖为基本单位，属于多糖类中的同多糖类，具有线型的空间结构，存在于禾谷类(大麦、燕麦、黑麦和小麦)的糊粉层和胚乳细胞壁中。β-葡聚糖酶对β-葡聚糖具有重要的水解作用，能使其降解为低分子量片段。按作用方式不同，β-葡聚糖酶可分为内切和外切两类；包括纤维素酶、昆布多糖酶、β-葡聚糖昔酶、内切β-1，3-葡聚糖酶、外切β-1，3-葡聚糖酶、内切β-1，2-葡聚糖酶、内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，6-葡聚糖酶。在所有这些酶中以β-1，3-1，4-葡聚糖酶最为活跃。

内切型β-葡聚糖酶是纤维素酶类的重要成分之一，主要降解纤维素长链分子中的β-1，4-糖苷键。通过促进饲料中的纤维素降解，增加饲料中营养的吸收效率。

在非瘟流行的时候，选用高温制粒的饲料，可以大幅度地降低非瘟对猪养殖的影响。高温制粒对养殖猪用的酶提出了要求，要求饲喂的酶在经过高温制粒以后，仍然具有较高的酶活性。这就要求，适合饲喂的酶为具有高度热稳定性的酶。

因此，提供一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法，具体步骤如下：

(1)目的基因扩增

以Primer-F和Primer-R为引物，以合成的β-葡聚糖酶基因序列SEQ ID NO.1为模板进行PCR扩增，获得目的基因；

(2)酶切、连接和转化

将步骤(1)获得的目的基因和pRSFduet-1表达载体分别进行双酶切，经连接，获得质粒pRSFduet-1-SQ，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞；

(3)利用IPTG诱导目的基因的表达，经超声破碎获得蛋白粗酶液；

(4)采用Ni-NTA纯化介质对蛋白粗酶液进行纯化，分析酶活性。

进一步，步骤(1)所述Primer-F和Primer-R的引物序列如下：

Primer-F：5’-GGGATCCATGCGTTCTCTGCC-3’；SEQ ID NO.3；

Primer-R：5’-CGAATTCTTAATGATGGTGGT-3’；SEQ ID NO.4。

进一步，步骤(2)所述双酶切所用的酶为BamH I和EcoR I。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法，本发明通过定向进化，得到一个具有高度热稳定性的β-葡聚糖酶，比酶活为91.6U/mg，在90℃半衰期为1.5h，该酶在饲料领域应用具有巨大潜力。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

E.coli DH5α，市售途径采购，实验室保藏；限制性内切酶，TakaRa公司；质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；超强高保真PCR试剂盒，北京天恩泽科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，福州奥研实验器材有限责任公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；质粒pRSFduet-1购自科雷生物科技有限公司；序列由擎科生物有限公司合成。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母浸粉。

洗涤缓冲液：10mM咪唑，50mM K₂HPO₄-KH₂PO₄，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0。

洗脱缓冲液：200mM咪唑，50mM K₂HPO₄-KH₂PO₄，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0。

保存缓冲液：50mM K₂HPO₄-KH₂PO₄，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0。

实施例1

(1)目的基因扩增

以合成的Primer-F和Primer-R为引物，以合成的β-葡聚糖酶基因序列SEQ IDNO.1(包括限制性内切酶的酶切位点和终止子TAA以及His标签)为模板进行PCR扩增，获得目的基因。

GGGATCCATGCGTTCTCTGCCTATTCTGTTCGCAGGTCTGCTGGCTCAACTGGCATCTGCTTACCAGCTGGTTGACGACTATGGTTCTGGTAACGGTTTCTTTGACAAATTCAACTTCTTCACTGGTGACGATCCGACCCACGGCTACGTTGACTATGTCAGCCGTGATGTTGCGGCGGGTGCAGGTCTGATTGGCGAACGTGACGGCGGTACCTACATCGGCGTTGATACTACTAACGCTGGTTCTGGTCGCGGTCGTAAATCCGTGCGTCTGGAATCCAAAAACACGTACGAACACGGTCTGATCGTAATCGATCTGGCGCACATGCCGGGTTCTGTTTGCGGCACCTGGCCTGCATTCTGGACTCTGGGTTCTGGTGATTGGCCGAACGGCGGCGAAATCGATATCATCGAAGGTGTTAACGAAGATCGTTTCGATCATATGGTACTGCATACTTCCGACGGTTGTGTTACCGACAATACTGGTTTCACCGGCACCCTGCGTACCTCCAATTGCTATGTGAACGCTCCTGGTCAGGACGCTAACGCGGGTTGCGGTATCGAGTCTACCGACCCGAACTCTTATGGCTCTGGTTTCAACTCCATCGGTGGCGGTATCTACGCTACCGAAATCACCTCCTCTGGTATTAACATCTGGTTTTTCCCGCGTGGTACTGAGCCGGGCGATGTTCTGGGTGATAACCCAAATCCGGCGGGTTGGGGCACTCCAGCAGCTAAATTCAGCGGCTCCGGTTGCGACTGGGAAGGCAAGTTCAACGCGCAGCGCCTGATCTTCGATATCACCTTCTGCGGCGATTGGGCCGGTAACGTTTGGTCCTCTGGCTCCTGTGGTTCCCGTGCGGCAAATTGTGTTGACTTCGTTCGTGATAACCCTTCTGCTTTCGGTGAATCTTACTGGCTGGTGAAGGCCCTGCGTGTTTATGCACCGTCTCTGGATGAAGCCTCTGTAGCTGGTTCTGGTTCTCTGATGGCCTACCGTAGCCTGTCTCACCATCACCACCATCATTAAGAATTCG；SEQ ID NO.1。

β-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

mrslpilfagllaqlasayqlvddygsgngffdkfnfftgddpthgyvdyvsrdvaagagligerdggtyigvdttnagsgrgrksvrleskntyehglividlahmpgsvcgtwpafwtlgsgdwpnggeidiiegvnedrfdhmvlhtsdgcvtdntgftgtlrtsncyvnapgqdanagcgiestdpnsygsgfnsigggiyateitssginiwffprgtepgdvlgdnpnpagwgtpaakfsgsgcdwegkfnaqrlifditfcgdwagnvwssgscgsraancvdfvrdnpsafgesywlvkalrvyapsldeasvagsgslmayrslshhhhhh；SEQ ID NO.2。

Primer-F和Primer-R的引物序列如下：

Primer-F：5’-GGGATCCATGCGTTCTCTGCC-3’；SEQ ID NO.3；

Primer-R：5’-CGAATTCTTAATGATGGTGGT-3’；SEQ ID NO.4。

PCR扩增的反应体系如下：PCR Mix 3.0μL，10μg/μL DNA模板1μL，10μM PCR上下游引物各1μL，灭菌双蒸水24μL。

PCR反应程序如下：预变性95℃3min；变性94℃1min，退火52℃1min，延伸72℃4min，共32个循环；72℃延伸10min。

(2)酶切、连接和转化

①将获得的目的基因和pRSFduet-1表达载体分别在PCR小管中加入双蒸水、内切酶缓冲液、酶切底物、限制性内切酶，进行双酶切反应，加入顺序从多到少。目的基因和pRSFduet-1置于37℃下进行双酶切，反应体系如下：

目的基因双酶切体系：

超纯水11μL，BamH I 1μL，EcoR I 1μL，Buffer 3μL，目的基因14μL。

pRSFduet-1双酶切体系：

pRSFduet-1质粒43μL，BamH I 1μL，EcoR I 1μL，Buffer 5μL。

使用BamH I和EcoR I限制性内切酶在37℃下进行双酶切反应3h后，加入LoadingBuffer终止反应，并根据照凝胶回收试剂盒说明书纯化、回收双酶切产物。

②经过相同的限制性内切酶切割后，双酶切产物具有相同的粘性末端，可以通过DNA连接酶连接成完整的质粒。将含有相同粘性末端的目的基因序列和pRSFduet-1双酶切产物置于同一个PCR小管中，连接反应采用10μL体系，将目的基因和质粒酶切产物按3：1比例加入，和1μL T4 DNA连接酶混匀，在16℃下连接过夜。将连接的质粒命名为pRSFduet-1-SQ。

③转化步骤：

将连接产物转化到大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，转化步骤如下：

1)首先调节恒温水浴的温度，将其调至42℃。

2)将一管(100μl)感受态菌由-80℃的超低温冰柜中取出，立刻使用手指将其加温融化，然后插入冰中，对其进行10min冰浴。

3)将10μl连接产物pRSFduet-1-SQ加入，轻轻震荡后放置冰上20min。

4)将其轻轻摇匀后插入42℃水浴中，进行90s的热休克，然后迅速放回冰中，静置5min。

5)将900μL不含抗菌素的LB培养基加入到上述管中轻轻混匀，之后在摇床的弹簧架上固定，将其在37℃下震荡50min。

6)往含30μg/mL卡那霉素的固体LB平板培养皿中分别滴加从超净工作台中取出的300μl上述转化混合液，使用经过酒精灯灼烧并且冷却后的玻璃涂布棒进行均匀的涂布。

7)标记涂好的培养皿，先放置在37℃恒温培养箱中30～60min，待表面的液体都渗透到培养基里后，再倒过来放置于37℃恒温培养箱过夜。

④诱导表达：

A、挑取上述LB固体培养基上长出的单菌落，接种于5mL含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、200r/min条件下培养过夜，取部分菌液用甘油管保存菌种，作为转化的菌株，依次编号。

B、将转化菌株接种于6mL LB培养基(含50mg/L硫酸卡那霉素)，37℃220rpm过夜培养14h；

C、按1：100将种子转接至500mL LB培养基，37℃150rpm培养至OD₆₀₀＝0.5；用0.7mM的IPTG诱导基因的表达；诱导后18℃150rpm过夜培养24h；

D、4000g 4℃离心5min收集菌体，用30mL保存缓冲液重悬菌体，然后用超声破碎机(工作3s，间隔7s，时间为10min，超声功率约200W)破碎菌体；

E、破碎后的细胞悬浮液12,000rpm 4℃离心30min，所得上清即为蛋白粗酶液。

实施例2纯化

采用上海生工的Ni-NTA纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司)对蛋白进行纯化：

第1步，将6mL Ni-NTA纯化介质加入到50mL空的层析柱中，让介质自由沉降，并放干储存液。

第2步，加入4倍柱体积的洗涤缓冲液平衡层析介质。

第3步，将蛋白粗酶液上样至柱中，流速控制为0.5mL/min。

第4步，以流速为1mL/min的洗涤缓冲液洗涤柱子，10倍柱体积的流量以去除杂蛋白。

第5步，用5倍柱体积洗脱缓冲液以0.5～1mL/min的流速洗脱，收集洗脱液。

第6步，收集目的蛋白洗脱液，用Millipore超滤管(15mL 100kDa)对纯化后的蛋白进行脱盐浓缩，用保存缓冲液置换含咪唑的洗脱缓冲液。

实施例3酶活性分析

半衰期和比酶活的测定同文献(Barkat，Ali，Zhuolin，Yi，Yang，Fang，Lanchai，Chen，Kaize，He，Characterization of a fungal thermostable endoglucanase fromChinese Nong-flavor daqu by metatranscriptomic method，internationaljournalofbiological macromolecules,2019)。

纯化的蛋白浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。

测定得到酶的比酶活为91.6U/mg，在90℃半衰期为1.5h。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中农华威生物制药（湖北）有限公司

<120> 一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1037

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gggatccatg cgttctctgc ctattctgtt cgcaggtctg ctggctcaac tggcatctgc 60

ttaccagctg gttgacgact atggttctgg taacggtttc tttgacaaat tcaacttctt 120

cactggtgac gatccgaccc acggctacgt tgactatgtc agccgtgatg ttgcggcggg 180

tgcaggtctg attggcgaac gtgacggcgg tacctacatc ggcgttgata ctactaacgc 240

tggttctggt cgcggtcgta aatccgtgcg tctggaatcc aaaaacacgt acgaacacgg 300

tctgatcgta atcgatctgg cgcacatgcc gggttctgtt tgcggcacct ggcctgcatt 360

ctggactctg ggttctggtg attggccgaa cggcggcgaa atcgatatca tcgaaggtgt 420

taacgaagat cgtttcgatc atatggtact gcatacttcc gacggttgtg ttaccgacaa 480

tactggtttc accggcaccc tgcgtacctc caattgctat gtgaacgctc ctggtcagga 540

cgctaacgcg ggttgcggta tcgagtctac cgacccgaac tcttatggct ctggtttcaa 600

ctccatcggt ggcggtatct acgctaccga aatcacctcc tctggtatta acatctggtt 660

tttcccgcgt ggtactgagc cgggcgatgt tctgggtgat aacccaaatc cggcgggttg 720

gggcactcca gcagctaaat tcagcggctc cggttgcgac tgggaaggca agttcaacgc 780

gcagcgcctg atcttcgata tcaccttctg cggcgattgg gccggtaacg tttggtcctc 840

tggctcctgt ggttcccgtg cggcaaattg tgttgacttc gttcgtgata acccttctgc 900

tttcggtgaa tcttactggc tggtgaaggc cctgcgtgtt tatgcaccgt ctctggatga 960

agcctctgta gctggttctg gttctctgat ggcctaccgt agcctgtctc accatcacca 1020

ccatcattaa gaattcg 1037

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Arg Ser Leu Pro Ile Leu Phe Ala Gly Leu Leu Ala Gln Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ala Tyr Gln Leu Val Asp Asp Tyr Gly Ser Gly Asn Gly Phe Phe

20 25 30

Asp Lys Phe Asn Phe Phe Thr Gly Asp Asp Pro Thr His Gly Tyr Val

35 40 45

Asp Tyr Val Ser Arg Asp Val Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ile Gly Glu

50 55 60

Arg Asp Gly Gly Thr Tyr Ile Gly Val Asp Thr Thr Asn Ala Gly Ser

65 70 75 80

Gly Arg Gly Arg Lys Ser Val Arg Leu Glu Ser Lys Asn Thr Tyr Glu

85 90 95

His Gly Leu Ile Val Ile Asp Leu Ala His Met Pro Gly Ser Val Cys

100 105 110

Gly Thr Trp Pro Ala Phe Trp Thr Leu Gly Ser Gly Asp Trp Pro Asn

115 120 125

Gly Gly Glu Ile Asp Ile Ile Glu Gly Val Asn Glu Asp Arg Phe Asp

130 135 140

His Met Val Leu His Thr Ser Asp Gly Cys Val Thr Asp Asn Thr Gly

145 150 155 160

Phe Thr Gly Thr Leu Arg Thr Ser Asn Cys Tyr Val Asn Ala Pro Gly

165 170 175

Gln Asp Ala Asn Ala Gly Cys Gly Ile Glu Ser Thr Asp Pro Asn Ser

180 185 190

Tyr Gly Ser Gly Phe Asn Ser Ile Gly Gly Gly Ile Tyr Ala Thr Glu

195 200 205

Ile Thr Ser Ser Gly Ile Asn Ile Trp Phe Phe Pro Arg Gly Thr Glu

210 215 220

Pro Gly Asp Val Leu Gly Asp Asn Pro Asn Pro Ala Gly Trp Gly Thr

225 230 235 240

Pro Ala Ala Lys Phe Ser Gly Ser Gly Cys Asp Trp Glu Gly Lys Phe

245 250 255

Asn Ala Gln Arg Leu Ile Phe Asp Ile Thr Phe Cys Gly Asp Trp Ala

260 265 270

Gly Asn Val Trp Ser Ser Gly Ser Cys Gly Ser Arg Ala Ala Asn Cys

275 280 285

Val Asp Phe Val Arg Asp Asn Pro Ser Ala Phe Gly Glu Ser Tyr Trp

290 295 300

Leu Val Lys Ala Leu Arg Val Tyr Ala Pro Ser Leu Asp Glu Ala Ser

305 310 315 320

Val Ala Gly Ser Gly Ser Leu Met Ala Tyr Arg Ser Leu Ser His His

325 330 335

His His His His

340

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gggatccatg cgttctctgc c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cgaattctta atgatggtgg t 21

Claims

1.一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)目的基因扩增

(2)酶切、连接和转化

(4)采用Ni-NTA纯化介质对蛋白粗酶液进行纯化，分析酶活性。

2.根据权利要求1所述的一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述Primer-F和Primer-R的引物序列如下：

Primer-F：5’-GGGATCCATGCGTTCTCTGCC-3’；SEQ ID NO.3；

Primer-R：5’-CGAATTCTTAATGATGGTGGT-3’；SEQ ID NO.4。

3.根据权利要求1所述的一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述双酶切所用的酶为BamH I和EcoR I。