CN105154415A - pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶及其编码基因和应用 - Google Patents

pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶EG5AP1及其编码基因和应用。内切葡聚糖酶EG5AP1第177、261、288、333位谷氨酰胺突变为谷氨酸。内切葡聚糖酶EG5AP1具有最适温度为75℃，最适pH为5.0的性质，但不具备胃蛋白酶抗性，在饲料行业中的应用受到限制。而本发明中设计的突变体在酸性条件下(pH2.0)能保持稳定，具有胃蛋白酶抗性，且具有更好的耐热性，因此更适于应用在饲料行业。

Description

pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶EG5AP1及其编码基因和应用。
背景技术
β-葡聚糖广泛存在于大麦、小麦、黑麦，燕麦，水稻和高粱等谷类经济作物的糊粉层和胚乳细胞壁中，属于植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，具有线型的空间结构。β-葡聚糖是由D型葡萄糖以不同比例的β-1,3和β-1,4糖苷键连接而形成的长链多糖聚合物。β-葡聚糖链通过分子内和分子间氢键的紧密排列形成不可溶的纤维素微丝。
β-内切葡聚糖酶是纤维素酶系中的一个重要组成部分，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子降解产生小分子葡聚糖或葡萄糖。β-葡聚糖酶在工业中的应用十分广泛，如啤酒酿造、动物饲料添加及食品加工等。其中酸性葡聚糖酶主要应用于饲料行业，β-葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内吸收较多的水分后，具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜充分接触，从而影响营养物质的吸收，成为一种抗营养因子。动物饲料中添加β-葡聚糖酶可以帮助动物分解麦类成份(大麦、小麦及燕麦)，提高饲料中营养物质的利用率，促进动物的消化吸收和生长发育。
在饲料工业中，动物胃肠道是酸性环境，而且在饲料的加工过程中，有一个短时的高温过程，因此研究挖掘耐高温、耐酸碱及高比活的酶将具有更高的商业价值及竞争性。而自然界分离得到的酶很难满足工业需求，因此通过分子改良的方法，理性设计提高酶的稳定性是目前学术及产业界持续努力的目标。5家族内切葡聚糖酶EG5AP1是一种高温酸性酶，最适温度75℃，最适pH5.0，不具备胃蛋白酶抗性，但其应用于饲料行业中时需要在酸性(pH2.0)条件下具有高酶活且能保持稳定，具有胃蛋白酶抗性。为了使其更好地应用于饲料行业，需要对该酶进行分子工程改造，以提高其嗜酸、耐酸性质，从而具备胃蛋白酶抗性。本发明通过定点突变的方法设计突变体来改良EG5AP1的pH稳定性及热稳定性，进而有效地提高其在工业上的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供pH稳定性和热稳定性提高的突变体内切葡聚糖酶EG5AP1。
本发明的再一目的是提供编码上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的应用。
本发明对内切葡聚糖酶EG5AP1(其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)进行定点突变，分别将177、261、288、333位谷氨酰胺突变为谷氨酸。
内切葡聚糖酶EG5AP1氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：
MKASTIICALLPLALAVPNARRASGFVCMFPFLLFIAEADGEIGFGSNESGAEFGETKLPGVLGTDYIWPDASTIKTLHDAGMNIFRVAFRMERLIPDKMTGTPDATYMNDLKATVNAITSLGAYAVIDPHNYGRYYGNIISSTDDFAAFWKTVAAQFASNDHVIFDTNNEYHDMDETLVLNLNQAAINAIRAAGATSQYIFVEGNSWSGAWTWTNVNDNLKALTDPQDKIVYEMHQYLDSDGSGTSATCVSSTIGQERVQSATQWLKTNGKKGIIGEFAGGPNSVCQSAVTGMLDYLSANSDVWMGAAWWAAGPWWADYMFSMEPPSGTGYQNYLSLLKPYFVGGSGGNPPTTTTTTTSKPTTTTTTAGNPGGTGVAQHWGQCGGIGWKGPTACATPYTCQKLNDYYSQCL
内切葡聚糖酶EG5AP1的基因序列如SEQIDNO.2所示：
atgaaggcttcgactattatctgtgcacttctcccccttgctttggcggtgccgaatgcgaggcgggcttctgggtttgtttgtatgtttccctttcttctcttcatcgcagaagctgacggtgagatagggtttggaagtaacgagtctggcgccgagtttggagagaccaagctcccgggcgtgctggggacggattatatctggcccgatgcgtcgactatcaagactctgcatgatgccgggatgaacatcttccgtgttgcgttccggatggagaggctcatcccggataagatgacggggactccagatgcgacgtacatgaatgatctcaaggcgactgtcaatgcgattacgagtctgggggcgtatgcggtgattgatccccataactatggaagatactacgggaacatcatctcgtcgactgacgactttgctgcgttctggaagaccgtggctgcccagtttgcgtccaatgaccatgtcatttttgacaccaacaatgagtaccatgatatggaccagacgctcgttctcaacctcaaccaggctgccatcaacgccatccgtgctgcaggcgccacctcgcagtacatttttgtcgagggcaactcgtggtccggcgcgtggacctggaccaacgtcaacgacaacctcaaggccctcaccgaccctcaggataagatcgtctacgagatgcaccagtatctcgactcagacgggtccggcacgtcggccacctgcgtgagctccaccatcggccaggagcgcgtgcagtccgccacacagtggttgaagaccaatggtaagaaaggtatcataggcgagttcgctggaggccccaacagcgtgtgccagtccgctgtcacaggcatgcttgactacttgtctgccaactcggatgtgtggatgggcgcagcatggtgggccgctggtccctggtgggcagattatatgttcagcatggagccgccgtctggcactggctatcagaactatctctcgttgttgaagccgtatttcgtcggtggttcgggtggtaaccctccaacgaccaccacgacaactaccagcaagcctactacgaccactaccacggctgggaaccctggcggcaccggagtcgcacagcactggggccagtgtggtggaattggatggaagggtccgactgcctgcgccacgccatatacctgccagaagctgaacgactactactctcaatgcctgtag
所述构建方法为，设计各突变引物，以编码内切葡聚糖酶EG5AP1基因的野生型质粒pPIC9γ-eg5AP1为模板依次进行两轮PCR扩增。纯化得到含有突变密码子的质粒，并将其转化进毕赤酵母感受态细胞GS115中进行表达，得到重组突变体蛋白。
所述的pPIC9γ-eg5AP1的构建方法为，以NeosartoryafischeriP1的cDNA为模板，以引物EG5-F和EG5-R对EG5AP1基因进行扩增。电泳纯化PCR产物中的目的条带，用EorRI和NotI将PCR产物和pPIC9γ质粒进行双酶切，T4连接酶连接后得到pPIC9γ-eg5AP1重组质粒，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控。
所述构建pPIC9γ-eg5AP1的引物是：
EG5-F：5'-GCCGAATTCATGAAGGCTTCGACTATTAT-3'(SEQNO.3)
EG5-R：5'-GCCGCGGCCGCCTACAGGCATTGAGAGTAGTA-3'(SEQNO.4)
所设计的用于定点突变的引物为：
Q177E-F：5'-CATGATATGGACGAGACGCTCGTTCTC-3'(SEQNO.5)
Q177E-R：5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'(SEQNO.6)
Q261E-F：5'-CAGGAGCGCGTGGAGTCCGCCACACAG-3'(SEQNO.7)
Q261E-R：5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(SEQNO.8)
Q288E-F：5'-CATGATATGGACCAGACGCTCGTTCTC-3'(SEQNO.9)
Q288E-R：5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'(SEQNO.10)
Q333E-F：5'-CAGGAGCGCGTGCAGTCCGCCACACAG-3'(SEQNO.11)
Q333E-R：5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(SEQNO.12)
本发明通过PCR的方式引入突变，获得突变体内切葡聚糖酶EG5AP1以及编码基因。本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶EG5AP1基因的重组载体，命名为pPIC9γ-eg5AP1。将本发明的内切葡聚糖酶基因eg5AP1插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的内切葡聚糖酶EG5AP1插入到质粒pPIC9γ上的EorRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组质粒pPIC9γ-eg5AP1。
本发明还提供了包含上述pPIC9γ-eg5AP1基因的重组菌株，优选重组菌株为GS115/eg5AP1。
本发明还提供了一种制备内切葡聚糖酶EG5AP1的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；
3)回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶EG5AP1。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组质粒转化毕赤酵母细胞(Pichiapastoris)GS115，得到重组菌株GS115/eg5AP1。
本发明还提供了上述内切葡聚糖酶EG5AP1的应用。
内切葡聚糖酶EG5AP1具有最适温度为75℃，最适pH为5.0的性质，但不具备胃蛋白酶抗性，在饲料行业中的应用受到限制。而本发明中设计的突变体在酸性条件下(pH2.0)能保持稳定，具有胃蛋白酶抗性，且具有更好的耐热性，因此更适于应用在饲料行业。
附图说明
图1-1～图1-4显示突变前后的内切葡聚糖酶的基本性质测定结果；
图2显示野生酶及突变酶胃蛋白酶抗性实验测定；
图3显示野生酶与突变酶的酶活及Tm测定。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)NeosartoryafischeriP1.培养基为马铃薯培养基(1000ml)：200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。
(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(W/V)。
(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同，pH6.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1
1、克隆
以NeosartoryafischeriP1的cDNA为模板，以引物EG5-F(5'-GCCGAATTCATGAAGGCTTCGACTATTAT-3')和EG5-R(5'-GCCGCGGCCGCCTACAGGCATTGAGAGTAGTA-3')对eg5AP1基因进行扩增。
电泳纯化PCR产物中的目的条带，用EorRI和NotI将PCR产物和pPIC9γ质粒进行双酶切，将酶切后的PCR产物和质粒用T4连接酶连接后得到pPIC9γ-eg5AP1重组质粒。
将eg5AP1基因与克隆载体pPIC9γ分别进行限制性内切酶EcoRI/NotI双酶切，37℃酶切2h，电泳纯化两个目的片段，用T4DNA连接酶连接，16℃过夜连接，电泳检测结果显示有大约10kb的片段，说明连接成功，构建得到pPIC9γ-eg5重组载体。
2、突变
以pPIC9γ-eg5AP1质粒为模板，分别以Q177E-F/-R，Q261E-F/-R，Q288E-F/-R，Q333E-F/-R为引物进行第一轮PCR，电泳回收第一轮PCR产物。再以第一轮PCR产物为引物，pPIC9γ-eg5AP1原质粒为模板进行第二轮PCR以获得各突变体(Q177E/Q261E/Q288E/Q333E)重组质粒。
将第二轮PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，切下PCR产物中的目的条带并纯化，溶25ulddH2O，用DMT酶于37℃处理2h后转化DMT感受态细胞，在含有100ug/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上筛选获得阳性转化子。挑单克隆至600ul含有100ug/ml的氨苄青霉素的液体LB培养基上过夜培养，测序验证获得编码各突变体的基因。
突变引物如下：：
Q177E-F：5'-CATGATATGGACGAGACGCTCGTTCTC-3'(SEQNO.5)
Q177E-R：5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'(SEQNO.6)
Q261E-F：5'-CAGGAGCGCGTGGAGTCCGCCACACAG-3'(SEQNO.7)
Q261E-R：5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(SEQNO.8)
Q288E-F：5'-CATGATATGGACCAGACGCTCGTTCTC-3'(SEQNO.9)
Q288E-R：5'-TGTGACAGCGGACTGGCACACGCTGTT-3'(SEQNO.10)
Q333E-F：5'-CAGGAGCGCGTGCAGTCCGCCACACAG-3'(SEQNO.11)
Q333E-R：5'-CGAGAGATAGTTCTGATAGCCAGTGCC-3'(SEQNO.12)突变质粒的构建是通过2个PCR反应来完成的。
PCR反应体系如下：
PCR1
PCR2：
3、各突变体载体转化毕赤酵母GS115及工程菌的筛选
制备受体感受态细胞，并保存在-70℃，备用。将线性化的质粒溶于10μL无菌水，取80μL已制备好的GS115感受态细胞与之混匀，电击转化，涂布于MD平板上，倒置于30℃培养箱中培养2天，从中筛选出具有多聚半乳糖醛酸酶活性的转化子。
4、目的基因在毕赤酵母中摇瓶水平的表达
接种将含有较高的内切葡聚糖酶酶活菌株，并培养，取上清用于酶活性检测。
本发明所述的突变内切葡糖酶活力的测定
(1)内切葡聚糖酶的活性单位(U)定义：在给定的条件下，每分钟分解葡聚糖生成1μmolD-(+)-葡萄糖所需的酶量。
(2)重组酶反应最适pH和pH稳定性的测定：
将纯化好的重组内切葡聚糖酶在75℃下，不同pH的底物中进行酶学反应，以测定其最适pH。所用缓冲液为：pH2.0–8.0的McIlvaine缓冲液(0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸)，pH8.0–9.0的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，以及pH10.0–12.0的Gly-NaOH缓冲液。
pH稳定性测定：将浓缩后的纯酶液在不同pH值的缓冲液中置于37℃下处理1h，再用最适pH的缓冲液作适当稀释，在最适pH和最适温度的条件下测定剩余酶活性。
(3)重组酶反应最适温度和温度稳定性的测定：
葡聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系(pH5.0)及不同温度下进行酶促反应。耐热性测定为葡聚糖酶在不同温度下分别处理0.5h、1h、2h、4h、6h、8h后，于最适温度下进行酶活性测定。
(4)重组酶比活、Km值及Vmax的测定重组酶
测定反应的一级反应时间，确定测定Km及Vmax的反应时间为3min。用不同浓度的葡萄糖(0.5，0.4，0.25，0.2，0.2，0.175，0.15、0.1、0.05％)为底物，在最适条件下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraphPadPrism5软件计算Km值及Vmax。
按照Bio-Rad试剂盒的方法，绘制标准曲线。测定方法：首先通过标准曲线计算目的蛋白的含量，其次是在最适条件下测得重组酶的酶活，用酶活数除以蛋白的浓度可得酶的比活。比活力的定义为：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。
突变前后的内切葡聚糖酶的基本性质测定结果如图1-1～1-4所示，从结果可以看出，突变酶的最适温度与最适pH均没有改变，但突变酶在酸性条件(pH＝3.0)时的酶活提高了。
在pH稳定性方面，野生酶的稳定范围在pH3～9，而单点突变酶的稳定范围扩大为pH2.2～10，且在pH2时还剩余不同程度的相对酶活力，其中Q261E、Q288E、Q333E要优于Q177E；组合突变酶Q261/288E在pH2.2～9保持稳定，在pH10和11两点仍保持60％和40％的活性。由此可以看出所有的突变体pH稳定范围均较野生酶扩大，pH稳定性的效果为Q333E＝Q288E>Q261＝Q261/288E>Q177E>WT，而且Q177E、Q261E、Q288E、Q333E、Q261/288E在pH2时能保持一定的酶活力将有利于其在饲料行业中的应用。
在热稳定性方面，野生酶在70℃处理4h已丧失酶活力，而突变体Q177E、Q261E、Q288E、Q261/288E处理4h还剩余80％左右的相对酶活力，Q333E剩余50％的相对酶活力。从处理6h、8h的数据来看，热稳定性方面的效果为Q261E＝Q288E＝Q261/288E>Q177E>Q333E>WT。
5、野生酶及突变酶胃蛋白酶抗性实验测定
从图2中可以看出，野生酶在pH2.0下酶活完全丧失，而Q261E、Q288E、Q333E、Q261/288E在pH2.0下处理1h时剩余80％左右的相对酶活力，Q177E剩余40％左右的相对酶活力，由此可见胃蛋白酶对酶活的影响很小，突变酶具有一定的抗胃蛋白酶的性质；在处理2h后，Q261E、Q288E、Q333E、Q261/288E剩余60％左右的酶活力，Q177E剩余20％的酶活力，同时胃蛋白酶对其影响不明显，以上数据说明突变后的EG5AP1具备了一定的胃蛋白酶抗性。
6、野生酶与突变酶的酶活及Tm测定
利用差式扫描量热仪(DSC)对野生酶及突变酶进行Tm值测定
表1
从图3和表1所示结果可以看出，突变体Q177E、Q261E、Q288E、Q333E、Q261/288E的Tm值较野生酶有2～5℃的提高，同时表现为这些突变体的热稳定性比野生酶提高。

Claims (8)

1.突变的内切葡聚糖酶EG5AP1，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的内切葡聚糖酶EG5AP1第177、261、288、333位谷氨酰胺突变为谷氨酸。
2.突变的内切葡聚糖酶EG5AP1基因，其特征在于，编码权利要求1所述的突变的内切葡聚糖酶EG5AP1。
3.包含权利要求2所述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1基因的重组载体。
4.包含权利要求2所述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1基因的重组载体pPIC9γ-eg5AP1。
5.包含权利要求2所述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1基因的重组菌株。
6.包含权利要求2所述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1基因的重组毕赤酵母菌株。
7.一种制备权利要求1所述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的方法，其特征在于，所述方法包括在宿主菌株中表达权利要求3所述重组载体的步骤。
8.权利要求1所述突变的内切葡聚糖酶EG5AP1的应用。
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