CN102559718B - 嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建及其酶的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建及其酶的应用。嗜热羧酸酯酶(DtEstA)基因来源于嗜热圆锥网团菌DSM6724(Dictyoglomus turgidumDSM6724)；本发明采用生物工程技术，通过细菌的培养、目的基因钓取、构建表达载体、及将载体转化到宿主细胞中等步骤构建成嗜热羧酸酯酶基因工程菌，再经细胞培养、收集沉淀、超声破碎、热处理、亲和层析等步骤纯化获得嗜热羧酸酯酶DtEstA。本发明的嗜热羧酸酯酶DtEstA具有很好的热稳定性，及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性，可用作化学合成和食品加工过程中很好的生物催化剂。

Description

嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建及其酶的应用

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建、利用该工程菌制备的嗜热羧酸酯酶及该酶在工业中的应用。

背景技术

嗜热酶(thermophilic enzyme，55-80℃)由于在高温下仍然具有很好的催化活性及热稳定性，所以与常温酶和中温酶相比在工业中有更广泛的应用。最早开发的嗜热酶是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的Taq DNA聚合酶，圆锥网团菌DSM6724(Dictyoglomus turgidum DSM6724)是一种嗜热细菌，能在70～75℃生长。从此，嗜热酶开始引起人们的重视，开始成为研究的焦点，许多具有水解酶活性的嗜热酶相继得到开发，并在许多领域发挥了重要作用。今年来，从来源于海底热流及温泉的嗜热细菌和古菌中分离出很多嗜热酶和超嗜热酶(hyperthermophilic enzyme，80-113℃)，为现在分子酶学技术展现了新的应用前景(王柏婧等，微生物学报，2002，42：259-262；Fujiware S，et al.J.Biosci.Bioeng.2002，94(6)：518-525；蔡锦刚等，Appl Microbiol Biotechnol (2011)89：1463-1473)。

嗜热酶作为生物催化剂，与常温酶及中温酶相比有很多优点：(1)酶制剂制备的成本低。因为嗜热酶一般有很好的热稳定性，可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持活力；(2)动力学反应快。反应温度的升高可以加快分子运动速度，加快催化反应；(3)减少了能耗。高温反应对反应器冷却系统的要求标准降低；(4)提高了产物的纯度。在高于70℃的催化温度下，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对最终产物的污染。嗜热酶由于其很好的高温反应活性，近年来已经在食品酿造工业、医药工业、环境保护、遗传工程等领域得到应用，其良好前景备受关注。

酯解的酶主要分为两大类：羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1，羧酸酯水解酶)，是指能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯类，在结构上与脂肪酶均属于α/β水解酶家族，，在氨基酸序列上按丝氨酸-天冬氨酸-组氨酸(Ser-Asp-His)排列，称为SAH三联体结构，丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)构成了典型的酶的活性区域。另一类是脂肪酶(EC 3.1.1.3，三酰基甘油水解酶)，催化三酰基甘油的水解。它们在动物，植物，微生物中广泛存在。

微生物羧酸酯酶作为重要的工业酶类，可以催化酯水解、酯合成、酯交换等具有重要应用价值的反应，并具有良好的区域选择性和立体选择性。由于在食品工业，生物去污剂，医药和亲酯化学来源酶的生产方面有多样的应用，羧酸酯酶在生物技术领域扮演着极其重要的角色。

来源于嗜热微生物的热稳定的酶类由于遗传的稳定性和高温下催化的高效性，使它们有很好的潜在商业应用价值，已越来越受到关注。嗜热菌来源的羧酸酯酶由于在高温和有机溶剂中很好的稳定性，不仅可以延长酯酶的使用时间，还能扩大其应用范围，已成为生物技术应用领域关注的焦点。总之，羧酸酯酶表现出很好的区域和立体选择性，其催化反应不需要辅因子，有很好的有机溶剂稳定性和激活作用，这使它成为化学合成和食品加工过程中很好的生物催化剂。一般的羧酸酯酶稳定性差、易失活，与理想的生物催化剂有很大差距，这样嗜热酶就表现出很多的优势。最近博恩朔伊尔(Bornscheuer)和耶格(Jaeger)等总结了羧酸酯酶和脂肪酶的性质和应用。

因此，开发在高温环境下具有较高催化活力的羧酸酯酶应用于工业领域，有很好的前景和价值，也有利于研究羧酸酯酶的催化机制。

发明内容

本发明的目的之一是在嗜热细菌中提取一种嗜热羧酸酯酶的基因；

本发明的目的之二是利用上述嗜热羧酸酯酶基因通过生物化学及分子生物学技术构建一种嗜热羧酸酯酶基因工程菌；

本发明的目的之三是利用上述嗜热羧酸酯酶基因工程菌制备一种热稳定性好、催化效率高的嗜热羧酸酯酶；

本发明的目的之四是通过对嗜热羧酸酯酶的理化性质的研究，提供嗜热羧酸酯酶在工业生产中的多种用途。

圆锥网团菌DSM 6724是一株极度嗜热的细菌，分离于堪察加半岛的一个火山口，可以降解纤维素，果胶，淀粉，但是只在固体多糖和纤维素的培养基中生长是很微弱的，其最适生长温度为75℃。菌种购买于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，通过NCBI对Dictyoglomus turgidum DSM6724的全基因组进行预测，发现其全基因组的243301-244539区域的1239bp的核苷酸可以编码一种羧酸酯酶，可以将其DNA分子中表达嗜热羧酸酯酶活性的基因序列称为嗜热羧酸酯酶基因DtEstA。由于嗜热的圆锥网团菌DSM 6724是一株厌氧细菌，培养条件复杂，人工培养比较困难，因此直接用培养厌氧菌来生产嗜热羧酸酯酶成本比较高且周期比较长。将嗜热羧酸酯酶基因转入培养条件简单的常温宿主如大肠杆菌内，能够有效地解决上述问题。

本发明的嗜热羧酸酯酶基因工程菌已于2011年10月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.5386。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli。

本发明的技术方案是：一种嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建，包括以下步骤：

A、嗜热圆锥网团菌DSM 6724的培养

按照DSMZ的配方配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积份圆锥网团菌DSM 6724的比例将圆锥网团菌DSM 6724接种到厌氧培养基中进行培养；

B、基因组DNA的提取

将步骤A培养的嗜热圆锥网团菌DSM 6724用细菌基因组DNA提取试剂盒提取嗜热圆锥网团菌DSM 6724的基因组，得到基因组DNA溶液；

C、引物设计及用PCR法钓取嗜热羧酸酯酶目的基因

引物设计如下：

上游引物：5’GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；

下游引物：5’CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3’，划线部分为BamH I的酶切位点；

以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶Nco I和BamH I进行双酶切，得到含有粘性末端的嗜热羧酸酯酶目的基因；

D、构建重组表达载体

以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶Nco I和BamH I进行双酶切，然后用连接试剂盒与步骤C所得含有粘性末端的嗜热羧酸酯酶目的基因进行连接，得到重组表达载体；

E、将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤D所得重组表达载体转化到大肠杆菌BLP感受态细胞中进行培养，得到嗜热羧酸酯酶基因工程菌。

所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer star)1μl，DNA聚合酶缓冲液(Primer star buffer)20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；然后98℃变性15s，退火10s，72℃延伸90s，再72℃延伸20min，共30个循环；然后进行PCR扩增，PCR扩增时设置5个退火温度梯度，分别是50.2℃、52.5℃、56.2℃、60.2℃和63.5℃。

步骤C所述的用限制性内切酶Nco I和BamH I进行双酶切的酶切体系包括：40μl纯化的PCR产物，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)4.9μl。

所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物。

步骤D所述的用限制性内切酶Nco I和BamH I进行双酶切的酶切体系包括：pET28a空载体45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)6μl，加超纯水5μl至总体积60μl。

用上述嗜热羧酸酯酶基因工程菌制备的嗜热羧酸酯酶，其氨基酸序列如SEQID No.2所示，该嗜热羧酸酯酶具有以下特性：

(1)最适反应温度

在30-95℃表现催化活力，最适反应温度为80℃；

(2)最适反应pH

在pH 6.8-9范围内稳定性较高，最适反应pH为8.0；

(3)底物特异性

能够有效地催化对硝基苯酚酯及三丁酸甘油酯的水解，其中水解的最适底物为对硝基苯酚辛酸酯；

(4)热稳定性

将嗜热羧酸酯酶在不同温度孵育，表现出很好的热稳定性，其中50℃、65℃孵育120h仍然保持约90％的活力，75℃孵育100h以上仍有50％的活力；

(5)金属离子、有机溶剂及表面活性剂对嗜热羧酸酯酶活力的影响

对各种金属离子、有机溶剂及表面活性剂都有很好的抗性。

上述嗜热羧酸酯酶的制备方法，是将构建在大肠杆菌宿主中的含嗜热羧酸酯酶的工程菌进行放大培养，然后通过细胞超声破碎、热失活大肠杆菌自主表达的杂蛋白、分离纯化得到嗜热羧酸酯酶。

上述嗜热羧酸酯酶用于食品工业、生物去污剂和工业酶的生产领域中。

本发明的嗜热羧酸酯酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，嗜热羧酸酯酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。羧酸酯酶可以催化酯水解、酯合成、酯交换等具有重要应用价值的反应，并具有良好的区域选择性和立体选择性，在食品工业，生物去污剂，医药和亲酯化学来源酶的生产方面有多样的应用，它在生物技术领域扮演着极其重要的角色。

本发明的嗜热羧酸酯酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，但是不限于特定的表达载体，优选的表达载体为原核表达载体，进一步优先选择的为pET28a。将重组表达载体按常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。本发明不限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体，本发明使用BLP-E.coli BL(DE3)codon plus菌株。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。

本发明的嗜热羧酸酯酶催化反应所利用的底物范围为能参与水解、合成、转酯反应发生的化学物质，在优选的方案中，本发明使用对硝基苯酚脂肪酸酯作为底物。

附图说明

图1为纯化得到的嗜热羧酸酯酶DtEstA的电泳图；

图2为嗜热羧酸酯酶DtEstA的温度-活力曲线；

图3为嗜热羧酸酯酶DtEstA的pH-活力曲线；

图4为嗜热羧酸酯酶DtEstA的底物特异性；

图5为嗜热羧酸酯酶DtEstA的热稳定性。

具体实施方式

实施例1：嗜热酶工程菌的构建及其酶的表达

(1)嗜热圆锥网团菌DSM 6724的培养及其基因组DNA的提取

按照DSMZ的配方，配置厌氧培养基(anaerocellum medium)，分装于厌氧试管中，每管5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体(80％N₂和20％CO₂)，在厌氧箱中用培养基1ml溶解购买于DSMZ的圆锥网团菌DSM 6724，按照1％的接菌量接种于5ml试管中，混匀，75℃静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中75℃培养数天，-80℃保存菌体备用。

取5ml小试管培养的嗜热圆锥网团菌DSM 6724，用北京普博欣生物技术有限责任公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒(Bacteria Genomic Mini PreparationKit)提取细菌的基因组，所得染色体DNA溶液放4℃冰箱备用。

(2)引物设计及用PCR法钓取羧酸酯酶目的基因及重组载体的制备

嗜热细菌Dictyoglomus turgidum DSM 6724基因组中含有几段预测的可能的羧酸酯酶基因。选择核苷酸序列如表SEQ ID No.1所示的基因作为研究对象，命名为DtEstA。该酶基因通过PCR方法从步骤(1)所得的基因组DNA中扩增而得到。两个引物是根据基因的序列及载体的限制性内切酶位点而设计的，委托上海生工生物工程公司合成。

上游引物：5’GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；

下游引物：5’CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3’，划线部分为BamH I的酶切位点；

两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET28a的Nco I和BamH I相匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。

PCR反应：在100μl反应体系中含有1μl DNA聚合酶(Primer star)，DNA聚合酶缓冲液(Primer star buffer)20μl，模板DNA(基因组DNA)2μl，2.5mMdNTP混合物(脱氧核苷酸混合物，由脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸混合而成，每种核苷酸浓度25nmol/L)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水(ddH2O)至总体积100μl。PCR反应程序为：94℃预变性3min；循环程序为98℃变性15s，退火10s，72℃延伸90s；最后再72℃延伸20min，共30个循环，PCR扩增时设置了5个退火温度梯度，分别是50.2℃52.5℃56.2℃60.2℃63.5℃。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量大小为1240bp，与预测的结果一致。使用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。

将纯化的PCR产物用限制性内切酶Nco I和BamH I行双酶切，酶切体系包括：40μl的目的基因PCR回收产物，Nco I和BamH I各2μl，FD-buffer4.9μl，37℃下保温2小时。酶切完毕后用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。

用同样的限制性内切酶Nco I和BamH I来酶切pET28a载体，反应体系为60μl，体系包括：pET28a空载体45μl，Nco I和BamH I各2μl，FD-buffer 6μl，加ddH₂O 5μl至总体积60μl。37℃下保温2小时，然后再用磷酸酶(FastAP)处理去磷酸化，反应二十分钟左右，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，再用胶回收试剂盒回收。

在16℃用连接试剂盒来连接羧酸酯酶基因和载体。将连接载体转入大肠杆菌DH5α中，用含卡那霉素的琼脂平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。挑取一个阳性的单克隆，加入到含卡那霉素的试管中，37℃180rpm/min培养过夜，取菌液进行PCR验证，得到一条大小为1240bp的条带即为目的基因，证明目的基因已经与载体连接并转化到宿主中。测序正确后，提取重组质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlus中进行表达pET28a-dtuestA-his。测序工作由上海华大基因完成。

(3)重组载体在宿主细菌中的表达

重组的DNA质粒，pET28a-dtuestA-his转化到Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlus感受态细胞中。大肠杆菌感受态细胞制备及其载体转化方法参照《分子克隆实验指南》。挑取阳性转化菌，置5ml含卡那霉素的培养液中37℃振荡培养过夜，次日接种到100ml新鲜的含卡那霉素的2YT培养基中，37℃继续培养4h。将初步放大的种子液以1％的比例接入1L的2YT培养基中培养(37℃120rpm/min)，其中加入了100mg/ml的卡那霉素，当OD600达到0.8左右时加入200mg/ml的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，降低培养温度至22℃，诱导菌体表达目的蛋白。诱导表达过夜后4℃，得到本发明所述工程菌，10000rpm，10min离心搜集菌体。然后用50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声破碎(1s×1s，30min)后的溶液在70℃下热失活30min，然后4℃，13000rpm离心30min，取上清即为粗酶液。

因为重组嗜热酶N-末端含有His-Tag，应用镍亲和层析(Ni-Chelating Column)对重组蛋白质进行分离，用200mM咪唑洗脱与层析柱结合得到嗜热酶。应用SDS-PAGE(12％)电泳检测重组蛋白的纯度，可见45KDa附近可见一条电泳条带，如图1所示。

实施例2：重组嗜热羧酸酯酶DtEstA的特性

(1)最适反应温度

反应温度是影响酶催化活力的重要因素。一般而言，嗜热酶在高温下有更高的活力，考虑到底物的稳定性，本发明的羧酸酯酶催化的反应检测的最高温度为95℃。以对硝基苯酚辛酸酯作为底物，在30-95℃温度范围内测定DtEstA的的羧酸酯酶活力。由图2可见，其活力在30-80℃温度范围内随温度的升高而升高，在80℃以上，活力开始下降，所以DtEstA的最适温度为80℃。

酯酶活力的检测：以对硝基苯酚辛酸酯作为羧酸酯酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mMTris-HCl(pH8.0)，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度为0.2mM，加入10μl的酶液，在不同的温度下用浸岛UV-2550型紫外-可见分光光度计在405nm下测定对硝基苯酚的吸光度值得变化。一个羧酸酯酶活力单位被定义为最适温度下一分钟内从对硝基苯酯中释放1微摩尔对硝基苯酚(ε＝0.016μM-1.cm-1)所需的酶量。

(2)最适反应的pH

酶所处的环境的pH值会影响酶分子中带电氨基酸的解离状态机酶的构象，这样就会影响酶的催化活力。以对硝基苯酚辛酸酯作为底物，反应体系为1ml，底物浓度为0.2mM。在75℃下测定嗜热酶在pH4.0-10.0范围内的酶活力的变化，每个pH下测定3组平行数据，取平均值为酶活力值。所使用的缓冲液为宽范围pHbuffer：以乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-环已胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES))为基础，分别在75℃精确配制100mM不同pH的缓冲液。实验结果如图3可以看出嗜热酯酶DtEstA的最适pH为8.0。

(3)底物特异性

以不同的对硝基苯酚酯为底物，包括pNPC4，pNPC8，pNPC10，pNPC12，pNPC14，在75℃，pH8.0的条件下测定DtuestA的底物特异性。反应体系为1ml，底物浓度为0.2mM。每种底物测定3组平行数据，取平均值为酶活力值。以底物对相对酶活力作图即得DtuestA底物选择性的曲线。同时也测定了DtuestA对于脂肪酶底物的活力，包括三甘油丁酸酯，三甘油辛酸酯。其中对于三甘油丁酸酯的为80U/mg，对于三甘油辛酸酯的活力几乎为零，可以看出DtuestA确实是一个酯酶，结果如图4。

(4)热稳定性

以对硝基苯酚辛酸酯作为底物来测定嗜热酯酶DtuestA的热稳定性，将酶(0.663mg/ml)在50-80℃温度范围内保温，观测酶在不同保温时间的活力变化。选择的保温温度为50℃，65℃，75℃，80℃，85℃和90℃。以残余活力对保温温度作图，如图5所示。

(5)金属离子、有机溶剂及表面活性剂对酶活力的影响

选择一系列一价、二价、三价金属离子，主要包括K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和Ca²⁺。观测在不同浓度条件下它们对酶活力的影响，结果如表1所示。

表1金属离子对嗜热羧酸酯酶DtEstA活力的影响

选择若干极性的与水互溶的有机溶剂，包括甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)异丙醇、DMF、丙酮和乙腈，探讨它们对酶活力影响，结果如表2所示。

表2有机溶剂对嗜热羧酸酯酶DtEstA活力的影响

测定了不同浓度表面活性剂，包括吐温-20(Tween-20)、吐温-60(Tween-60)、吐温-80(Tween-80)、曲拉通(TritonX-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)和脱氧胆酸钠(Doc)对酶活力影响，结果如表3所示。

表3表面活性剂对嗜热羧酸酯酶DtEstA活力的影响

本发明所涉及的嗜热羧酸酯酶DtuestA基因的核苷酸序列和嗜热羧酸酯酶DtuestA的氨基酸序列如下：

(1)SEQ ID No.1嗜热羧酸酯酶DtuestA基因核苷酸序列表

<110>上海交通大学

<120>嗜热酯酶基因、工程菌、酶的性质

<160>2

<210>1236

<212>DNA

<213>细菌(Anaerobic thermophilic bacterium，Dictyoglomus turgidum DSM6724)

<220>

<221>CDS

<222>(1)-(1236)

<400>1

1 M  L  P  A  L  F  F  L  T  L  F  C  G  G  I  I  F  T  N  Y

1 ATGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTTACTCTCTTTTGTGGTGGTATAATATTCACAAATTAT

21 A  V   F  V  E  G  K  M  S  E  V  L  T  P  H   N  I  P  R  A

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41 T  I   V  T  R  V  M  P  E  G  E  R  V  V  A  V   V  L  E  Y

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181 GATGCGGAGATAAATGCTGGAAATTTAAATCTAAACATGTTTTCAGTAAAGACAAAACTT

81 E  G   K  F  V  E  R  S  I  K  K  V  Y  A  N  N   N  G  E  L

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101 L  P  A  P  F  T  N  Q  G  R  F  L  V  L  E   L  N  P  K  E

301 TTACCTGCTCCCTTTACTAATCAAGGAAGGTTTTTAGTTTTAGAATTAAATCCTAAGGAA

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241 Q  A  E  H  P  C  F  V  L  A  P  Q  C  P  A  D  S  S  W  T

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281 L  I  R  K  I  I  S  E  E  N  I  D  S  N  R  I  V  L  T  G

841 TTGATTAGGAAGATTATAAGTGAGGAAAATATTGATTCTAATAGGATTTATTTAACAGGA

301 L  S  M  G  G  F  G  T  F  A  L  L  I  E  H  P  E  L  F  A

901 CTTTCTATGGGGGGTTTTGGTACCTTTGCTCTTCTTATAGAACATCCAGAGCTCTTTGCA

321 G  A  I  P  I  C  G  G  A  D  I  N  N  L  E  R  I  R  D  I

961 GGAGCGATCCCCATATGTGGGGGAGCAGACATAAATAATCTTGAAAGGATAAGAGACATT

341 P  L  W  I  F  H  A  E  D  D  N  L  V  S  V  E  F  S  R  S

1021 CCTCTTTGGATCTTTCATGCCGAAGACGACAATTTGGTAAGTGTGGAATTTTCAAGATCG

361 V  V  K  R  L  V  E  I  G  G  K  V  K  Y  T  E  F  L  W  G

1081 GTAGTAAAAAGGCTTGTAGAAATAGGGGGAAAGGTAAAGTATACGGAGTTTTTGTGGGGA

381 E  M  E  R  M  G  Y  H  P  H  A  S  W  I  P  V  Y  D  N  E

1141 GAGATGGAGAGAATGGGTTATCACCCCCATGCCTCTTGGATACCAGTCTATGACAATAA

401 E  V  I  D  W  L  F  E  Q  R  K  R  *

1201 GAAGTTATAGACTGGTTATTTGAGCAAAGGAAAAGATAA(2)SEQ ID No.2嗜热羧酸酯酶DtuestA氨基酸序列表

<210>2

<211>412

<212>PRT

<213>细菌(Anaerobic thermophilic bacterium，Dictyoglomus turgidum DSM6724)

<400>2

Met Leu Pro Ala Leu Phe Phe Leu Thr Leu Phe Cys Gly Gly Lle Ile Phe Thr Asn Tyr

                                   10                                      20

Ala Val Phe Val Glu Gly Lys Met Ser Glu Val Leu Thr Pro His Asn Ile Pro Arg Ala

                                   30                                      40

Thr Ile Val Thr Arg Val Met Pro Glu Gly Glu Arg Val Val Ala Val Val Leu Glu Tyr

                                   50                                      60

Asp Ala Glu Ile Asn Ala Gly Asn Leu Asn Leu Asn Met Phe Ser Val Lys Thr Lys Leu

                                   70                                      80

Glu Gly Lys Phe Val Glu Arg Ser Ile Lys Lys Val Tyr Ala Asn Asn Asn Gly Glu Leu

                                   90                                      100

Leu Pro Ala Pro Phe Thr Asn Gln Gly Arg Phe Leu Val Leu Glu Leu Asn Pro Lys Glu

                                   110                                     120

Pro Ser Ala Val Thr Ala Thr Phe Asp Pro Gln Arg Phe Leu Ser Lys Arg Leu Lys Leu

                                   130                                     140

Glu Tyr Glu Ile Glu Gln Lys Val Ser Ile Lys Ser Val Asp Gly Lys Glu Ile Met Pro

                                   150                                     160

Phe Ser Leu Ile Thr Ser Glu Glu Arg His Leu Ile Ile Asp Glu Phe Lys Ala Leu Ile

                                   170                                     180

Tyr Glu Asp Lys Asp Leu Gly Val Ile Leu Pro Tyr Arg Phe Tyr Val Pro Lys Asn Ile

                                   190                                     200

Asp Lys Asn Lys Lys Tyr Pro Leu Val Val Phe Leu His Gly Ala Gly Glu Arg Gly Asn

                                   210                                     220

Asp Asn Phe Leu His Ile Ala Trp Tyr Arg Gly Ala Val Thr Phe Ala Glu Pro Gly Gln

                                   230                                     240

Gln Ala Glu His Pro Cys Phe Val Leu Ala Pro Gln Cys Pro Ala Asp Ser Ser Trp Thr

                                   250                                     260

Glu Leu Leu Met Arg Gly Asn Pro Phe Lys Pro Thr Lys Thr Leu Leu Ala Val Ala Asn

                                   270                                     280

Leu Lle Arg Lys Ile Ile Ser Glu Glu Asn Ile Asp Ser Asn Arg Ile Tyr Leu Thr Gly

                                   290                                     300

Leu Ser Met Gly Gly Phe Gly Thr Phe Ala Leu Leu Ile Glu His Pro Glu Leu Phe Ala

                                   310                                     320

Gly Ala Ile Pro Ile Cys Gly Gly Ala Asp Lle Asn Asn Leu Glu Arg Ile Arg Asp Ile

                                   330                                     340

Pro Leu Trp Ile Phe His Ala Glu Asp Asp Asn Leu Val Ser Val Glu Phe Ser Arg Ser

                                   350                                     360

Val Val Lys Arg Leu Val Glu Ile Gly Gly Lys Val Lys Tyr Thr Glu Phe Leu Trp Gly

                                   370                                     380

Glu Met Glu Arg Met Gly Tyr His Pro His Ala Ser Trp Ile Pro Val Tyr Asp Asn Glu

                                   390                                     400

Glu Val Ile Asp Trp Leu Phe Glu Gln Arg Lys Arg

                                   410

Claims (7)

1.一种嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建方法，所述的嗜热羧酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于：包括以下步骤：

A、嗜热圆锥网团菌DSM 6724的培养

按照DSMZ的配方配制厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积份圆锥网团菌DSM 6724的比例将圆锥网团菌DSM 6724接种到厌氧培养基中进行培养；

B、基因组DNA的提取

将步骤Ａ培养的嗜热圆锥网团菌DSM 6724用细菌基因组DNA提取试剂盒提取嗜热圆锥网团菌DSM 6724的基因组，得到基因组DNA溶液；

C、引物设计及用PCR法钓取嗜热羧酸酯酶目的基因

引物设计如下：

上游引物：5’ GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT 3’，划线部分为NcoⅠ的酶切位点；

下游引物：5’ CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3’，划线部分为BamHⅠ的酶切位点；

以步骤Ｂ所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶Nco Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切，得到含有粘性末端的嗜热羧酸酯酶目的基因；

Ｄ、构建重组表达载体

以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶Nco Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切，然后用连接试剂盒与步骤Ｃ所得含有粘性末端的嗜热羧酸酯酶目的基因进行连接，得到重组表达载体；

Ｅ、将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤Ｄ所得重组表达载体转化到大肠杆菌BLP感受态细胞中进行培养，得到嗜热羧酸酯酶基因工程菌。

2.如权利要求1所述的嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：Primer star DNA聚合酶1μl，Primer star buffer DNA聚合酶缓冲液20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；然后98℃变性15s，退火10s，72℃延伸90s，再72℃延伸20min，共30个循环；然后进行PCR扩增，PCR扩增时设置5个退火温度梯度，分别是50.2℃、52.5 ℃、56.2 ℃、 60.2 ℃和63.5℃。

3.如权利要求1所述的嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤Ｃ所述的用限制性内切酶Nco Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切的酶切体系包括：40μl纯化的PCR产物，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液4.9μl。

4.如权利要求2所述的嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物。

5.如权利要求1所述的嗜热羧酸酯酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤Ｄ所述的用限制性内切酶Nco Ⅰ和BamHⅠ进行双酶切的酶切体系包括： pET28a空载体45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液6μl，加超纯水5μl至总体积60μl。

6.一种嗜热羧酸酯酶，其特征在于：所述的嗜热羧酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.一种权利要求6所述的嗜热羧酸酯酶的应用，其特征在于：所述的嗜热羧酸酯酶用于食品工业﹑生物去污剂和工业酶的生产领域中。

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