CN102559567A - 嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建及其酶的应用。嗜热内切木聚糖酶基因来源于热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)；本发明采用生物工程技术，通过细菌的培养、目的基因钓取、构建表达载体、及将载体转化到宿主细胞中等步骤构建成嗜热内切木聚糖酶基因工程菌，再经细胞培养、收集沉淀、超声破碎、热处理、亲和层析等步骤纯化获得嗜热内切木聚糖酶。本发明的嗜热内切木聚糖酶具有很好的热稳定性，及对金属离子、有机溶剂及表面活性剂的抗性，可用于造纸、食品、饲料、纺织、酿酒和医药的生产中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建、利用该工程菌制备的嗜热内切木聚糖酶及该酶在工业中的应用。
背景技术
木聚糖是植物细胞壁半纤维素的重要组成部分，它是仅次于纤维素、自然界中含量第二丰富的多聚糖，几乎占地球可再生碳源的三分之一(Collins et.al.FEMSMicrobiology Reviews.2005，29：3-23)。木聚糖来源广泛，可由林业、农业、木材加工以及造纸等工业的副产品获得，其主链主要是由木聚糖残基以β-1，4-糖苷键构成。而根据来源的不同，木聚糖的侧链可以被阿拉伯糖、葡聚糖醛酸、乙酰基等残基取代，由于成份复杂，木聚糖需要在包括木聚糖酶、D-木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等的共同作用下才能够被彻底降解。
β-1，4-内切木聚糖酶(Endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8)主要从主链内部作用于木糖苷键，能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一(Kulkami N，Shendye A，Rao M.Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J].FEMS Microbiol.Rev.1999，23(4)：411-456)。能够产生木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。微生物中木聚糖酶由于来源菌株不同而导致其理化性质和分子量不尽相同，其分子量从7.7到150kDa都有分布，绝大多数在20-40kDa之间，最适pH值在2-11都有分布。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中糖苷水解酶以第10家族和第11家族居多(Kulkami N，Shendye A，Rao M.Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J].FEMS Microbiol.Rev.1999，23(4)：441-456)。在过去20年中，有大量的木聚糖酶被分离纯化出来，它们的基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等系统中进行了表达。当前，木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织和能源等工业领域都有着广泛的应用前景，但能够应用于工业生产的天然木聚糖酶却很 少，工业用酶要求有较高的酶活性，良好的pH稳定性及热稳定性。如在食品加工过程中，高温易造成酶失活，因此耐高温的酶有更好的应用前景(Beg QK，Kapoor M，Mahajan L，et al.Microbial xylanases and their industrial applications：a review[J].Appl Microbiol.Biotechnol.2001，56(3-4)：326-338)。到目前为止，国内有关木聚糖酶产生菌的报道较多，其中以真菌(如黑曲霉)的研究居多，而细菌类研究偏少。但较真菌所产木聚糖酶而言，细菌木聚糖酶有更好的热稳定性，具有更广泛的工业应用前景，并受到学术界的普遍关注(Badal C.Hemicellulose bioconversion[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30：279-291)。
木聚糖酶产生菌株热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)在70-75℃的高温下可以正常生长，所以我们推断它所产生的木聚糖酶具有良好的热稳定性，非常适合工业化生产以及食品应用，通过序列比对发现，它与其它已研究的木聚糖酶基因序列具有较低的同源性，我们希望通过此研究来发掘性质优良的新型木聚糖酶源。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能高效应用的高比活嗜热内切木聚糖酶；
本发明的目的之二是提供编码上述高比活嗜热内切木聚糖酶的基因；
本发明的目的之三是提供包含上述嗜热内切木聚糖酶的基因的重组载体；
本发明的目的之四是提供包含上述嗜热内切木聚糖酶的基因的重组菌株；
本发明的目的之五是提供一种嗜热内切木聚糖酶的基因工程菌的构建方法。
本发明的目的之六是提供上述高比活嗜热内切木聚糖酶的应用。
本发明的嗜热内切木聚糖酶的基因工程菌已于2011年10月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.5420。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，所述的嗜热内切木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括以下步骤：
A、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培养按照DSMZ的配方配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体 积热解纤维素菌的比例，将热解纤维素菌接种到厌氧培养基中进行培养；
B、基因组DNA的提取
将步骤A培养的热解纤维素菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取热解纤维素菌的基因组，得到基因组DNA溶液；
C、引物设计及用PCR法钓取嗜热内切木聚糖酶目的基因
引物设计如下：
上游引物：5’CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；
下游引物：5’CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3’，划线部分为Xho I的酶切位点；
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，得到嗜热内切木聚糖酶目的基因；
D、构建重组表达载体
以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，然后用连接试剂盒与步骤C所得嗜热内切木聚糖酶目的基因进行连接，得到重组表达载体；
E、将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到大肠杆菌B L 21感受态细胞中进行培养，得到嗜热内切木聚糖酶基因工程菌。
所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer star)1μl，DNA聚合酶缓冲液(Primer star buffer)20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；然后98℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸20min，共32个循环。
步骤C所述的用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切的酶切体系包括：40μl纯化的PCR产物，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FD buffer)4.9μl。
所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核 苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每种核苷酸的浓度均为25nmol/L。
步骤D所述的用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切的酶切体系包括：pET28a空载体45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)6μl，加超纯水5μl至总体积60μl。
用上述嗜热内切木聚糖酶基因工程菌制备的嗜热内切木聚糖酶，所述的嗜热内切木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该嗜热内切木聚糖酶具有以下特性：
(1)最适反应温度
在45-85℃表现催化活力，最适反应温度为70℃；
(2)最适反应pH
在pH 4.2-12.0范围内表现催化活力，最适pH为7.2；
(3)底物特异性
能够有效地催化桦木木聚糖(Birchwood)，山毛榉木聚糖(Beechhood)，燕麦木聚糖(Oat Spelts)，高粘度羟甲基纤维素(高粘度CMC)，低粘度羟甲基纤维素(低粘度CMC)的水解，其中水解的最适底物为山毛榉木聚糖；
(4)热稳定性
将嗜热内切木聚糖酶在不同温度孵育，表现出很好的热稳定性，其中60℃下保温240min仍然保持65％的活力，65℃下保温150min仍然保持45％的活力；
(5)对一价金属离子有很好的抗性。
上述嗜热内切木聚糖酶的制备方法是，将构建在大肠杆菌宿主中的含嗜热内切木聚糖酶的工程菌进行放大培养，然后通过细胞超声破碎、热失活大肠杆菌自主表达的杂蛋白、分离纯化得到嗜热内切木聚糖酶。
所述的嗜热内切木聚糖酶用于造纸、食品、饲料、纺织、酿酒和医药的生产领域中。
热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)是一株极度嗜热的细菌，可以降解纤维素，半纤维素，其最适生长温度为75℃。菌种购买于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，通过NCBI对热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的全基因组进行预测，发现其全基因组的233136-234149区域的1014bp的核苷酸可以编码一种嗜热内切木聚糖酶，可以将其DNA分子中表达嗜热内切木聚糖酶活性的基因序列称 为嗜热内切木聚糖酶基因Cb Xyn10B。由于嗜热的热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)是一株厌氧细菌，培养条件复杂，人工培养比较困难，因此直接用培养厌氧菌来生产嗜热内切木聚糖酶成本比较高且周期比较长。将嗜热内切木聚糖酶基因转入易培养、可快速繁殖的常温宿主如大肠杆菌内，能够有效地解决上述问题。
对厌氧的热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)通过培养、目的基因的提取，得到本发明所述嗜热内切木聚糖酶基因，我们委托上海华大基因有限公司进行基因测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
将嗜热内切木聚糖酶基因装载在pET系统载体上，然后转入到大肠杆菌宿主中，得到一株含目的基因的大肠杆菌工程菌。表达的产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎、热失活大肠杆菌杂蛋白和亲和层析，即可进行分离纯化得到嗜热蛋白。
工程菌表达的嗜热蛋白为嗜热内切木聚糖酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。该嗜热内切木聚糖酶的最适催化温度为70℃，最适pH为7.2，可以催化木聚糖水解，有广泛的应用前景。如在造纸领域，在化学漂白之前用木聚糖酶对纸浆进行预处理，可增加纤维的分离度，使氯气等化学漂白剂更好地渗透到纸浆里，从而大大减少化学漂白剂的用量，同时可以降低成纸的透气度，提高紧度；在食品领域，可用于从棉壳、甘蔗渣、玉米芯等天然食物半纤维中制备低聚木糖；在饲料领域，可作为添加剂增进饲料营养成分的消化、吸收；在纺织领域，可用于苎麻脱胶等过程改善了劳动条件，减少环境污染，减轻对纤维的损伤；在酿酒领域，木聚糖酶有助于提高发酵效率，增加酒精的产率；另外，木聚糖酶在去污洗涤、医药等行业中也有应用。
本发明的嗜热内切木聚糖酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，但是不限于特定的表达载体，优选的表达载体为原核表达载体，进一步优先选择的为pET28a，将重组表达载体按常规方法导入适宜的宿主细胞，包括原核细胞和真核细胞。本发明不限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体，本发明使用大肠杆菌(E.coli BL21codon plus(DE3)-RIL)菌株。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
附图说明
图1是纯化得到的嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的电泳图；
图2是嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的pH-活力曲线；
图3是嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的温度-活力曲线；
图4是嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的热稳定性-活力曲线；
图5是嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的底物特异性。
具体实施方式
实施例1：嗜热内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的表达
1、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培养及其基因组DNA的提取。
按照DSMZ的配方，配置厌氧培养基(anaerocellum medium)，分装于厌氧试管中，每管5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体(80％N2和20％CO2)，在厌氧箱中用培养基1ml溶解购买于DSMZ的热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，按照1％的接菌量接种于5ml试管中，混匀，75℃静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中75℃培养数天，-80℃保存菌体备用。
取5ml小试管培养的热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，用北京普博欣生物技术有限责任公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒(Bacteria Genomic Mini Preparation Kit)提取细菌的基因组，所得染色体DNA溶液放4℃冰箱备用。
2、引物设计及用PCR法提取嗜热内切木聚糖酶目的基因及重组载体的制备
嗜热细菌热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)基因组中含有几段预测的可能的嗜热内切木聚糖酶基因。选择核苷酸序列如表SEQ ID No.1所示的基因作为研究对象，命名为Xyn10B。该酶基因通过PCR方法从步骤1所得的基因组DNA中扩增而得到。两个引物是根据基因的序列及载体的限制性内切酶位点而设计的，委托上海生工生物工程公司合成。上游引物：5’CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；下游引物：5’CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3’，划线部分为Xho I的酶切位点；两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET28a的Nco I和Xho I相 匹配，适合于在大肠杆菌中高效表达。
PCR反应：在100μl反应体系中含有1μl Primer star DNA聚合酶，Primer star buffer20μl，模板DNA(基因组DNA)2μl，2.5mM dNTP混合物(每种核苷酸浓度25nmol/L)8μl，上下游引物各加40pmol，，加ddH2O至总体积100μl。PCR反应程序为：94℃预变性3min；循环程序为98℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸90s；最后再72℃延伸20min，共32个循环。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量大小为1014bp，与预测的结果一致。使用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。
将纯化的PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，酶切体系包括：40μl的目的基因PCR回收产物，Nco I和Xho I各2μl，FD-buffer4.9μl，37℃下保温2小时。酶切完毕后用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。
用同样的限制性内切酶Nco I和Xho I来酶切pET28a载体，反应体系为60μl，体系包括：pET28a空载体45μl，Nco I和Xho I各2μl，FD-buffer 6μl，加ddH2O 5μl至总体积60μl。37℃下保温2小时，然后再用磷酸酶(FastAP)处理去磷酸化，反应二十分钟左右，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，再用胶回收试剂盒回收。
在16℃用连接试剂盒来连接木聚糖酶基因和载体。将连接载体转入大肠杆菌DH5α中，用含卡那霉素的琼脂平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。挑取一个阳性的单克隆，加入到含卡那霉素的试管中，37℃180rpm/min培养过夜，取菌液进行PCR验证，得到一条大小为1240bp的条带即为目的基因，证明目的基因已经与载体连接并转化到宿主中。测序正确后，提取重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli BL21codon plus(DE3)-RIL)中进行表达pET28a-cbxyn10B-his。测序工作由上海华大基因完成。
3、重组载体在宿主细菌中的表达
将重组的DNA质粒、pET28a-cbxyn10B-his转化到大肠杆菌(E.coli BL21codon plus(DE3)-RIL)感受态细胞中。大肠杆菌感受态细胞制备及其载体转化方法参照《分子克隆实验指南》。挑取阳性转化菌，置5ml含卡那霉素的培养液中37℃振荡培养过夜，次日接种到100ml新鲜的含卡那霉素的2YT培养基中，37℃继续培养4h。将初步放大的种子液以1％的比例接入1L的2YT培养基中培养(37℃，120rpm/min)，其中加入了100mg/ml的卡那霉素，当OD600达到0.8左右时加入 200mg/ml的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，降低培养温度至22℃，诱导菌体表达目的蛋白。诱导表达过夜后4℃，得到本发明所述工程菌，10000rpm，10min离心搜集菌体。然后用50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声破碎(1s×1s，30min)后的溶液在70℃下热失活30min，然后4℃，13000rpm离心30min，取上清即为粗酶液。
利用重组嗜热酶N-末端含有His-Tag，通过60℃热失活、镍亲和层析(Ni-Chelating Column)对重组蛋白质进行分离，用150mM咪唑洗脱与层析柱结合得到目的酶，然后在pH7.2、温度56℃条件下，以山毛榉木聚糖为底物测定不同处理后的酶活力以及相应的蛋白浓度，得到不同处理后的蛋白纯化表，如表1所示。
表1 嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的蛋白纯化表
应用SDS-PAGE(12％)电泳检测重组蛋白的纯度，可见40.2KDa附近可见一条电泳条带，如图1所示。
实施例2：重组嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的活性分析
重组嗜热内切木聚糖酶活性使用DNS法进行分析：在pH7.2，70℃条件下，300μl的反应体系包括5μl适当稀释的酶液，150μl 2％的底物(g/100mL)，60μl缓冲液(20mM)和85μl ddH2O，反应5min，加入600μl DNS终止反应，沸水煮5min，冷却后540nm测定OD值，以葡萄糖为标准曲线，计算酶活力。1个酶活单位(U)定义为在给定条件每分钟降解1％的木聚糖溶液释放1umol还原糖所需要的酶量。
实施例3：重组嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的性质测定
1、重组嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：将实施例1纯化的重组嗜热内切木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。以山毛榉木聚糖作为底物，利用实施例2中的反应体系，用20mmol不同pH的缓冲液在60℃下进行木聚糖酶活力测定。结果如图2所示，表明CbXyn10B的最适pH为7.2，在pH5.5-8.5的范围内，酶活性可以维持最大酶活性的 60％以上。嗜热内切木聚糖酶于上述不同pH缓冲液中室温条件处理240min，再在60℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果表明嗜热内切木聚糖酶在pH4-11之间均很稳定，在此pH范围内处理240min后剩余酶活性在90％以上，这说明此酶具有非常好的pH稳定性。所使用的缓冲液为宽范围pH buffer：以乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-环己胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES))为基础，分别在70℃下精确配制100mM不同pH的缓冲液。
2、重组嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B的最适反应温度和热稳定性的测定方法
嗜热内切木聚糖酶的最适温度的测定为以山毛榉木聚糖作为底物，在宽范围缓冲液(pH7.2)体系及40-85℃温度范围内测定Cb Xyn10B的嗜热内切木聚糖酶活力。热稳定性测定为嗜热内切木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活测定。酶反应最适温度测定结果如图3所示，表明最适温度为40℃。酶的热稳定性试验结果如图4所示，表明嗜热内切木聚糖酶在60℃下稳定性非常好，在60℃下保温240min仍然可以保持65％的酶活力，65℃下保温150min仍然可以保持45％的酶活力。
3、底物特异性
以不同的木聚糖为底物，包括Birchwood(桦木木聚糖)，Beechhood(山毛榉木聚糖)，Oat Spelts(燕麦木聚糖)，高粘度CMC(高粘度羟甲基纤维素)，低粘度CMC(低粘度羟甲基纤维素)在70℃，pH7.2的条件下测定Cb Xyn10B的底物特异性，用实施例2中的反应体系，每种底物测定3组平行数据，取平均值为酶活力值，以底物对相对酶活力作图即得Cb Xyn10B底物特异性曲线，如图5所示。木聚糖酶对不同底物的动力学参数比较如表2所示。
表2 嗜热内切木聚糖酶对不同底物的动力学参数比较表
4、嗜热内切木聚糖酶的Kcat和Km值测定方法如下：
以Birchwood(桦木木聚糖)，Beechhood(山毛榉木聚糖)，Oat Spelts(燕麦木聚糖)(from Sigma)作为底物，用不同浓度的木聚糖底物，在宽范围缓冲液(pH7.2)缓冲体系中，70℃下测定酶活性，计算出其在70℃下的Km和Kcat值。经测定，Birchwood的Km为2.16mg/ml，Kcat为321.6s-1，最大反应速度为0.003402umol/s；Beechhood的Km为1.90mg/ml，Kcat为378.4s-1，最大反应速度为0.004umol/s；Oat Spelts的Km为1.94mg/ml，Kcat为355.8s-1，最大反应速度为0.003762umol/s。
5、金属离子、有机溶剂及表面活性剂对嗜热内切木聚糖酶活力的影响
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，在70℃、pH7.2测定酶活性。结果表明：一价离子在浓度10mM的条件下对其几乎没有任何影响，二价金属离子在10mM条件下对其有较大的抑制作用，EDTA、SDS在10mM条件下对其有较大抑制作用。选择一系列一价、二价、三价金属离子，主要包括K+、Na+、NH4+、Mg2+、Ni2+、Zn2+和Ca2+。观测在不同浓度条件下它们对酶活力的影响，结果如表3所示。
表3 金属离子、有机溶剂等对Cb Xyn10B酶活力的影响
附：本发明所涉及嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B基因的核苷酸序列和嗜热木聚糖酶Cb Xyn10B氨基酸序列如下：
(1)SEQ ID No.1嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B基因核苷酸序列表
<110>上海交通大学
<120>嗜热内切木聚糖酶基因、工程菌、酶的性质
<160>2
<210>1
<211>1014
<212>DNA
<213>细菌(Anaerobic thermophilic bacterium，Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)
<220>
<221>CDS
<222>(1)-(1014)
<400>1
ATGAGCGAAG ATTATTATGA AAAGTCTACT GTATCACTTA CGGAAAAATA TAAAGAGTTC 60
TTTAAAATTG GTGCAGCTGT TACAGTGAAA GATTTTGAAG GAATACACGG AAGAATTCTT 120
ACAAAGCATT TTAACAGTTT AACACCTGAG AATGATATGA AATTTGAAAG AATTCATCCG 181
AAAGAAGATT TTTACAACTT TGAAGCTACT GATAAGATTA AAGATTTTGC ACTTAAACAT 240
AATATGCAAC TGAGAGGACA TACACTTGTA TGGCACAACC AAACACCTGA ATGGGTTTTT 300
CGTGACAATG ACAAAGAAGC ACCAAAAGAG CTTGTAATAG AAAGACTGAG GGAACACATA 360
AAGACAATTT GCACAAGATA CCGCGATGTG GTTTATTCGT GGGATGTTGT GAATGAAGCT 420
GTTGAGGATA AAACAGATGT TCTGCTCAGA GATTCAAAGT GGAGAAGAAT CATAGGTGAT 480
GATTATATTA AGATTGCCTT TGAAATAGCT AAAAAGTATA CAGGAAATGG GAAACTATTT 540
TATAACGACT ATAACAATGA AATGCCATAC AAGTTAGAAA AGACATACAA GGTCTTAAAA 600
AGTCTTTTAG AAGAAGGAAC TCCGATTGAT GGTGTTGGCA TACAAGCACA CTGGAATATT 660
TGGGATAAGA ATTTAATAGA CAACCTTAAG AGAGCTATTG AAACATATGC ATCCTTGGGG 720
CTTGAAATAC AAATAACAGA GCTTGATATA TCAGTATTTG AATTTGAAGA CAGAAGAACT 780
GACCTATTAG AGCCCACTGA AGAGATGGTG GAGTTGCAAG CTAAGGTTTA TGAGGATGTG 840
TTTAGAGTAT TTAGGGAGTA TAGAGATGTT ATAACGTCAG TTACATTATG GGGGATTAGC 900
GATAGACATA CATGGAAAGA CAATTTTCCG GTAATAGGCA GAAAAGACTG GCCATTGCTG 960
TTTGACATTG ATGGAAAGCC AAAAAAGGCA TTTTTCAGAA TAATTGACTT TTGA 1014
(2)SEQ ID No.2嗜热内切木聚糖酶Cb Xyn10B氨基酸序列表
<210>2
<211>338
<212>PRT
<213>细菌(Anaerobic thermophilic bacterium，Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)
<400>2
MSEDY YEKST VSLTE KYKEF FKIGA AVTVK DFEGI HGRIL TKHFN SLTPE NDMKF ERIHP 60
KEDFY NFEAT DKIKD FALKH NMQLR GHTLV WHNQT PEWVF RDNDK EAPKE LVIER LREHI 120
KTICT RYRDV VYSWD VVNEA VEDKT DVLLR DSKWR RIIGD DYIKI AFEIA KKYTG NGKLF 180
YNDYN NEMPY KLEKT YKVLK SLLEE GTPID GVGIQ AHWNI WDKNL IDNLK RAIET YASLG 240
LEIQI TELDI SVFEF EDRRT DLLEP TEEMV ELQAK VYEDV FRVFR EYRDV ITSVT LWGIS 300
DRHTW KDNFP VIGRK DWPLL FDIDG KPKKA FFRII DF 338
Claims (11)
1.一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌，含有嗜热内切木聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID NO：1。
2.如权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于所述嗜热内切木聚糖酶基因来源于热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)。
3.如权利要求1所述的一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于对所述的嗜热内切木聚糖酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO：1之上进行突变、改造或修饰。
4.如权利要求1所述的一种嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培养
按照DSMZ的配方配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的比例，将热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)接种到厌氧培养基中进行培养；
B、基因组DNA的提取
将步骤A培养的热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的基因组，得到基因组DNA溶液；
C、引物设计及用PCR法钓取嗜热内切木聚糖酶目的基因
引物设计如下：
上游引物：5’CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3’，划线部分为Nco I的酶切位点；
下游引物：5’CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3’，划线部分为Xho I的酶切位点；
以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物，再对扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，得到嗜热内切木聚糖酶目的基因；
D、构建重组表达载体
以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，然后用连接试剂盒与步骤C所得嗜热内切木聚糖酶目的基因进行连接，得到重组表达载体；
E、将重组表达载体转化到宿主细胞中
将步骤D所得重组表达载体转化到大肠杆菌B L 21感受态细胞中进行培养，得到嗜热内切木聚糖酶基因工程菌。
5.如权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，其特征在于：所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer star)1μl，DNA聚合酶缓冲液(Primer star buffer)20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；然后98℃变性15s，60℃退火10s，72℃延伸90s，再72℃延伸20min，共30个循环；所述的PCR反应的反应程序为：94℃预变性3min；然后98℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸20min，共32个循环。
6.如权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，其特征在于：步骤C所述的用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切的酶切体系包括：40μl纯化的PCR产物，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FD buffer)4.9μl。
7.如权利要求2所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，其特征在于：所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每种核苷酸的浓度均为25nmol/L。
8.如权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌的构建，其特征在于：步骤D所述的用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切的酶切体系包括：pET28a空载体45μl，上游引物和下游引物各2μl，限制性内切酶缓冲液(FDbuffer)6μl，加超纯水5μl至总体积60μl。
9.一种用权利要求1所述的嗜热内切木聚糖酶基因工程菌制备的嗜热内切木聚糖酶，其特征在于：所述的嗜热内切木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该嗜热内切木聚糖酶具有以下特性：
(1)最适反应温度
在45-85℃表现催化活力，最适反应温度为70℃；
(2)最适反应pH
在pH 4.2-12.0范围内表现催化活力，最适pH为7.2；
(3)底物特异性
能够有效地催化Birchwood(桦木木聚糖)，Beechhood(山毛榉木聚糖)，Oat Spelts(燕麦木聚糖)，高粘度CMC(高粘度羟甲基纤维素)，低粘度CMC(低粘度羟甲基纤维素)的水解，其中水解的最适底物为Beechhood(山毛榉木聚糖)；
(4)热稳定性
将嗜热内切木聚糖酶在不同温度孵育，表现出很好的热稳定性，其中60℃下保温240min仍然保持65％的活力，65℃下保温150min仍然保持45％的活力；
(5)对一价金属离子有很好的抗性。
10.一种如权利要求6所述的嗜热内切木聚糖酶的制备方法，其特征在于：将构建在大肠杆菌宿主中的含嗜热内切木聚糖酶的工程菌进行放大培养，然后通过细胞超声破碎、热失活大肠杆菌自主表达的杂蛋白、分离纯化得到嗜热内切木聚糖酶。
11.一种如权利要求6所述的嗜热内切木聚糖酶的应用，其特征在于：所述的嗜热内切木聚糖酶用于造纸、食品、饲料、纺织、酿酒和医药的生产领域中。
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- 2011-12-08 CN CN2011104068387A patent/CN102559567A/zh active Pending
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