CN105861528A

CN105861528A - 一种高温胞外木聚糖内切酶基因及其蛋白表达与应用

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Publication number: CN105861528A
Application number: CN201510035924.XA
Authority: CN
Inventors: 韩业君; 乔玮博; 贾晓静
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2016-08-17

Abstract

本发明涉及了一种高温胞外木聚糖内切酶基因xyn10A及其蛋白Xyn10A的表达与应用。xyn10A来源于热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor kronotskyensis)。Xyn10A具有反应温度高、pH适应性广、热稳定性好等优点。其最适反应温度与pH分别为70℃和5.5，在pH5.0-7.0范围内酶活力能达到最高比活力的73％以上，Xyn10A在70℃条件下孵育6h，仍能维持100％的酶活力。Xyn10A与商业纤维素酶协同水解天然玉米芯，葡萄糖产量提高24.7％，木糖产量提高62.6％。高温木聚糖内切酶Xyn10A能够应用于食品、饲料、生物能源等领域。

Description

一种高温胞外木聚糖内切酶基因及其蛋白表达与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物质利用领域，具体地，本发明涉及了一种高温胞外木聚糖内切酶基因xyn10A及其蛋白的表达及应用。

背景技术：

半纤维素是除了纤维素外植物细胞壁中含量最丰富多糖，是生物燃料生产的重要资源。作为仅次于纤维素的第二大可再生物质，半纤维素提供的生物能源原料主要成分是木聚糖。木聚糖是由吡喃木糖以β-1,4-苷键连接而成的主链，并且通常都不同程度的连接取代基，如乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等(Biely,1985)。木聚糖完全降解可以产生多种形式的纤维素类物质，从而提高玉米芯、麦秸、甘蔗渣等低成本原料的工业利用率和饲料转化效率。β-1,4-内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是降解木聚糖的最关键的酶，能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖或带有不同分支侧链的木寡糖。木聚内切酶存在于GH5,GH8,GH10,GH11,GH30和GH43六个不同的糖苷水解酶家族(Collins et al.,2005)，其中GH10木聚糖内切酶分布最为广泛。在一些木聚糖酶中除了催化结构域GHs之外还含有非催化结构域，这些结构域能促进酶与底物的结合，被称为碳水化合物结合结构域(CBM)。它们在木聚糖的水解过程中起着关键性的作用，研究表明CBM对木聚糖酶的酶活力和热稳定性有一定的影响(Wassenberg et al.,1997)。目前许多研究致力于开发高效率、高产量、耐高温、耐酸碱等更适合工业应用的木聚糖内切酶。高温木聚糖内切酶在高温下具有较好的热稳定性以及高水解活性，因而在造纸、饲料、食品、医药和能源等领域均有广泛的应用潜力。

热解纤维素杆菌Caldicellulosiruptorkronotskyensis2002是从俄罗斯堪察加半岛热泉中分离得到的严格厌氧能一步利用生物质的革兰氏阳性菌，能够在45-82℃的环境下生长，其生长最适温度为70℃(Margarita L.et al.,2008)。C.kronotskyensis分泌的高温酶类能分解和利用纤维素、果胶、淀粉和木聚糖等，具有相当可观的工业应用前景。本发明构建了C.kronotskyensis中携带有CBM的GH10家族的木聚糖内切酶基因xyn10A重组工程菌，成功实现了木聚糖酶Xyn10A的高效表达。该木聚糖内切酶在高温下具有较高水解活性和优良的耐高温性能，并且与纤维素酶协同作用能显著提高天然植物细胞壁类生物质的水解率，具有潜在的工业应用价值。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是弥补现有天然木聚糖酶解工艺效率低，以及木聚糖酶制剂活性低、产量少、稳定性差等问题，提供一种高温胞外木聚糖内切酶基因xyn10A及其重组载体和重组工程菌，以及这种酶的表达方法和应用。包括：

本发明的目的之一是提供一种来源于热解纤维素杆菌Caldicellulosiruptorkronotskyensis的高温木聚糖内切酶，其基因序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的目的之二是提供包含上述高温木聚糖内切酶的重组载体及重组工程菌。

本发明的目的之三是提供一种制备上述高温木聚糖内切酶的方法。

本发明的目的之四是提供上述高温木聚糖内切酶的应用。

本发明的技术方案:

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

(1)上述高温木聚糖酶基因xyn10A工程菌的构建

提取热解纤维素菌Caldicellulosiruptorkronotskyensis2002的基因组，设计引物扩增xyn10A。得到的目的基因片段和载体经处理后，连接转化宿主细胞中。筛选阳性克隆测序，并对测序正确的工程菌提取重组质粒，获得重组表达载体。所述表达载体，是指大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、枯草杆菌表达载体、酵母菌表达载体、丝状真菌表达载体等，优选为将本发明的高温木聚糖酶基因xyn10A与线性质粒pET-28b相连接，得到的重组表达质粒pET-28b-xyn10A。将重组表达载体转化宿主细胞，获得高温木聚糖酶基因xyn10A重组菌。所述菌株为大肠杆菌(如Escherichia coli BL 21(DE3)、E.coli Top10、E.coli Rosetta(DE3)等)、乳酸菌(如Lactococcuslactis等)、酵母菌(如Pichiapastoris、Saccharomyces cerevisiae等)、枯草杆菌(如Bacillus subtilis BS168等)和丝状真菌(如Trichodermareesei、Aspergillusniger等)，优选为大肠杆菌E.coli BL 21(DE3)。

(2)制备高温木聚糖内切酶Xyn10A

培养上述重组菌株，进行诱导表达。收集菌体，超声破碎，65℃热失活，收集上清利用亲和层析以及凝胶层析纯化重组蛋白。最后进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达和纯化情况。

(3)高温木聚糖内切酶Xyn10A酶学性质测定

测定木聚糖内切酶Xyn10A的最适pH、最适温度及热稳定性。对高温木聚糖内切酶Xyn10A水解榉木木聚糖和燕麦木聚糖后的产物进行分析。

(4)高温木聚糖内切酶Xyn10A在酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的应用。

称取一定量预处理天然木聚糖和木质纤维素原料，加入一定量的重组木聚糖酶Xyn10A酶液，于65℃、pH5.5条件下80rpm振荡水解，每隔一段时间取样，离心取上清液用对羟基苯甲酸酰肼(p-hydroxybenzoic acid hydrazide，PHBAH)法测定还原糖含量，用薄层层析法定性分析天然木聚糖和木质纤维素原料水解液的成分。

(5)高温木聚糖内切酶Xyn10A与纤维素酶协同水解天然底物。

称取一定量粉碎的天然底物原料，分别单独加入一定量的重组木聚糖酶Xyn10A酶液、纤维素酶液和Xyn10A与纤维素酶混合液。于50℃、pH5.5条件下80rpm振荡水解，每隔一段时间取样，离心取上清液用高效液相色谱法定量分析天然原料水解液的成分。

附图说明

图1：A.高温木聚糖内切酶Xyn10A凝胶层析图谱；B.Superdex 200凝胶层析纯化后高温木聚糖内切酶Xyn10A的SDS-PAGE分析。

图2：A.不同pH对高温木聚糖内切酶Xyn10A活性的影响；B.不同温度对高温木聚糖内切酶Xyn10A活性的影响。

图3：高温木聚糖内切酶Xyn10A的热稳定性。

图4：高温木聚糖内切酶Xyn10A水解榉木聚糖和燕麦木聚糖。

图5：Xyn10A与纤维素酶协同水解玉米芯产物分析。

具体的实施方式

实施例1：高温木聚糖内切酶Xyn10A基因工程菌的构建

1.1 基因组DNA的提取

取5ml高温无氧条件下培养的C.kronotskyensis2002菌液，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取C.kronotskyensis2002细菌基因组，得到基因组DNA，-20℃冻存备用。

1.2 引物设计

根据已发表C.kronotskyensis2002基因组信息，预测木聚糖内切酶基因，设计如下引物：

用于扩增耐高温木聚糖内切酶基因xyn10A的引物如下：

xyn10A-F:5'-GCCGCGCGGCAGCATGACCTTAATTGGTATAG-3'

xyn10A-R:5'-GCGGCCGCAAGCGTTTATTCTTCTGGCACAAC-3'

1.3 PCR反应体系

以基因组DNA为模板，进行基因PCR扩增。反应结束后反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。

1.4 高温木聚糖内切酶基因xyn10A处理与连接

xyn10A基因片段和质粒pET-28b EK/LIC用T4DNA Polymerase处理后，室温连接15min，获得重组表达载体pET-28b-xyn10A。

1.5 重组载体的转化与鉴定

将1μl连接产物加入到100μl Top10感受态细胞中，冰浴30min。然后42℃热激60s，冰浴2min。加入200μl LB液体培养基，于37℃下200rpm培养1h。将菌液全部涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，于37℃培养12-16h。

挑选单菌落过夜培养进行菌液PCR鉴定，将琼脂糖凝胶电泳检测为阳性的克隆进行测序并用质粒小提试剂盒提取质粒。

实施例2：重组高温木聚糖内切酶Xyn10A的诱导表达

将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在LB(50μg/ml卡那霉素)琼脂平板上37℃培养过夜获得单菌落。挑取单菌落于5ml含有50μg/ml卡那霉素LB液体培养基中37℃ 220rpm培养过夜，用20％甘油保存菌种，获得以pET-28b为载体，以E.coli BL21(DE3)为宿主菌构建的高温木聚糖内切酶Xyn10A工程菌。重组菌按1％的接种量转接到100ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养至OD600达到0.6左右时，加入0.1mM IPTG继续培养5h。收集菌体并用超声破碎仪超声破碎后，12000rpm离心30min所得上清即为粗酶液。

实施例3：重组高温木聚糖内切酶Xyn10A的纯化

重组酶C，N-末端含有组氨酸标签，用Ni-NAT亲和层析对重组蛋白进行纯化。用含有500mM咪唑的Elution Buffer(50mMTris-HCl pH 7.5，300mMNaCl)洗脱与重组蛋白结合的Ni-NAT，收集洗脱液。收集到的洗脱液加入处理过的透析袋，在柠檬酸缓冲液(pH6.0)中透析去除咪唑，期间换三次缓冲液。用柠檬酸缓冲液(50mM柠檬酸盐pH 6.0，150mMNaCl)预先平衡30ml Superdex 200葡聚糖凝胶柱，然后将洗脱样品液过柱，在出现波峰时检测并收集蛋白，凝胶层析图谱如图1A所示。将分离得到的样品放入透析袋，用聚乙二醇浓缩样品，然后进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度，如图1B所示。

实施例4：重组高温木聚糖内切酶Xyn10A的酶学性质测定

4.1 最适反应pH

将5μl适当稀释的酶液加到95μl 1％BWX(榉木木聚糖)的柠檬酸或磷酸缓冲液(pH4.0-8.5，每个pH间隔0.5)中，在70℃反应条件下测定重组高温木聚糖内切酶Xyn10A的活力，反应时间2min。用PHBAH法测定各个反应pH下的还原糖含量。测得最适反应pH为5.5，如图2A所示。

4.2 最适反应温度

将5μl适当稀释的酶液加到95μl 1％BWX的pH5.5的柠檬酸缓冲液中，在40-100℃反应条件下测定重组Xyn10A的活力，反应时间2min。用PHBAH法测定各个反应温度下的还原糖含量。测其最适反应温度为70℃，如图2B所示。

4.3 热稳定性

重组酶Xyn10A在65、70、75℃下，处理0、0.5、1、2、3、4和6小时，在70℃，pH5.5的条件下测定其剩余酶活。结果如图3所示，重组酶在65和70℃下孵育6小时能维持稳定，在75℃孵育6小时后保留17％以上的活性。

4.4 Xyn10A特异性酶活测定

重组酶Xyn10A在最适反应条件下，加入到70℃预热5min的榉木木聚糖或燕麦木聚糖溶液中反应2min，用PHBAH法测定还原糖含量。木聚糖酶活力单位定义：在特定条件下(最适反应温度和pH)，每分钟产生1umol木糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

以毛山榉木木聚糖为底物时Xyn10A比活力为330.6±3.5IU/mg；以燕麦木聚糖为底物时Xyn10A比活力为353.7±8.0IU/mg。

实施例5：重组高温木聚糖内切酶Xyn10A水解榉木木聚糖和燕麦木聚糖。

25μg/ml的Xyn10A酶液，分别加入到50μl 1％的榉木木聚糖和燕麦木聚糖的底物溶液中，在70℃，pH5.5下进行水解反应4h，水解产物进行薄层层析检测。如图4所示，重组高温木聚糖内切酶Xyn10A水榉木木聚糖的主要产物为木四糖，木二糖和少量的木糖；重组高温木聚糖内切酶Xyn10A水解燕麦木聚糖的主要产物为木二糖和少量的木糖。

实施例6：利用重组高温木聚糖酶Xyn10A降解预处理玉米芯

称取0.1g经高温蒸煮的玉米芯渣，加5ml pH6.0的柠檬酸缓冲液溶解，配制成2％的悬浮液。加入一定量的重组高温木聚糖酶Xyn10A，于70℃、pH6.0条件下300rpm振荡水解，每隔一段时间(1，3，6，12，24，48h)取样50μl，样品经100℃沸水浴10min灭活。冷却后12000rpm离心15min，上清置于4℃保存。取水解样品用PHBAH法测定还原糖含量，用薄层层析法定性分析玉米芯水解液中低聚木糖的成分。实验结果表明，随水解时间的增加，水解产物中木糖和木二糖的含量都随之增加，木三糖、木四糖和木五糖却是先增加随后逐渐减少。最终水解产物中木寡糖含量约为89.3％，木糖含量为6.9％，木聚糖降解率达到83.4％。

实施例7：利用重组木聚糖酶Xyn10A与纤维素酶协同水解玉米芯

用粉碎机将玉米芯粉碎，玉米芯渣用自来水反复冲洗直至浸出液体变为无色。然后用蒸馏水冲洗3次，放入干燥箱烘干。称取一定量的玉米芯配制反应溶液，实验组1加入2μg重组木聚糖酶粗酶液；实验组2终浓度150μg/ml的商业纤维素酶Cellic CTec2(诺维信)；实验组3加入2μg重组木聚糖酶和终浓度150μg/ml的Cellic CTec2；实验组4加入终浓度150μg/ml的商业纤维素酶(苏柯汉)；实验组5加入2μg重组木聚糖酶和终浓度150μg/ml的纤维素酶(苏柯汉)。在80℃下振荡酶解48h后分别抽取反应液，离心取上清液用PHBAH法测定还原糖含量，用高效液相色谱法分析玉米芯水解液中单糖的成分。结果显示，重组木聚糖酶Xyn10A与Cellic CTec2协同水解玉米芯效果更好。如图5所示，酶解48h后，实验组3中酶解液葡萄糖产量增加26.7％；葡萄糖产量增加62.6％。

Claims

1.一种来源于热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptorkronotskyensis)的高温胞外木聚糖内切酶基因xyn10A，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的高温木聚糖内切酶基因表达的高温木聚糖内切酶Xyn10A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求2所述的高温木聚糖内切酶Xyn10A，其氨基酸序列SEQ ID NO:2中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。

4.一种用于扩增如权利要求1所述的耐高温木聚糖内切酶基因xyn10A的方法，其特征在于：所使用引物对为：

xyn10A-F:5'-GCCGCGCGGCAGCATGACCTTAATTGGTATAG-3'

xyn10A-R:5'-GCGGCCGCAAGCGTTTATTCTTCTGGCACAAC-3'。

5.一种高温木聚糖内切酶重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的木聚糖酶基因xyn10A。上述高温木聚糖内切酶基因的重组表达载体，包括大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、枯草杆菌表达载体、酵母菌表达载体、丝状真菌表达载体等。

6.一种高温木聚糖内切酶重组工程菌，其特征在于含有权利要求1所述的木聚糖酶基因xyn10A；所述重组工程菌株为大肠杆菌(如Escherichia coliBL 21(DE3)、E.coli Top10、E.coliRosetta(DE3)等)、乳酸菌(如Lactococcuslactis等)、酵母菌(如Pichiapastoris、Saccharomyces cerevisiae等)、枯草杆菌(如Bacillus subtilisBS168等)和丝状真菌(如Trichodermareesei、Aspergillusniger等)。

7.权利要求2所述的高温木聚糖内切酶Xyn10A在酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的应用，其酶解的最佳温度和pH分别为70℃和5.5。

8.权利要求2所述的高温木聚糖内切酶Xyn10A与纤维素酶协同酶解作用在酶解天然木质纤维素原料上的应用，其酶解效果提高20-70％。