WO2013176205A1 - キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法 - Google Patents

キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法 Download PDF

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WO2013176205A1
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amino acid
acid sequence
protein
seq
gene
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望 柴田
一暁 五十嵐
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花王株式会社
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    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
    • C13K13/002—Xylose

Definitions

  • the present invention relates to a novel xylanase and a method for producing sugar from biomass using the xylanase.
  • biomass a biomass material containing cellulose
  • biomass a biomass material containing cellulose
  • Biomass is composed of cellulose fibers and hemicellulose and lignin mainly containing xylan surrounding them. In order to increase the saccharification efficiency of cellulose and hemicellulose in biomass, it is necessary to develop an enzyme that hydrolyzes cellulose and hemicellulose. It is also necessary to remove lignin from the biomass.
  • the present invention provides a biomass saccharification method comprising the step of saccharifying biomass with the following protein (A) or protein (B) or an enzyme composition containing them.
  • the protein (A) includes the following (a) to (c): (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (B) an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; and (C) an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; A protein having an amino acid sequence selected from the above and having xylanase activity,
  • the protein (B) includes the following (a ′) to (c ′): (A ′) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; (B ′) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; and (C ′) an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids
  • the present invention also provides a method for producing sugar, comprising the step of saccharifying biomass with the protein (A) or protein (B) or an enzyme composition containing them.
  • the present invention also provides use of the protein (A) or protein (B) or an enzyme composition containing them for biomass saccharification.
  • the present invention also provides use of the protein (A) or protein (B) or an enzyme composition containing them for the production of sugar from biomass.
  • Amount of sugar produced from biomass by various enzyme compositions A: Xylanimonas-derived xylanase-containing enzyme composition, B: Cellulomonas-derived xylanase-containing enzyme composition.
  • sequence identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis with unit size to compare (ktup) of 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added is 1 to 50, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, An amino acid sequence in which 1 to 20, even more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5 amino acids are deleted, substituted or added is mentioned.
  • the “base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added” is 1 to 150, preferably 1 to 120, more preferably 1 to 90, and still more preferably. Examples include a base sequence in which 1 to 60, even more preferably 1 to 30, still more preferably 1 to 15, and still more preferably 1 to 10 bases are deleted, substituted or added.
  • biomass refers to cellulosic and / or lignocellulosic biomass containing hemicellulose components produced by plants and algae.
  • biomass include various types of wood obtained from conifers such as larch and cedar, and broad-leaved trees such as oil palm (stems) and cypress; processed or pulverized products of wood such as wood chips; wood pulp produced from wood Pulp such as cotton linter pulp obtained from fibers around cotton seeds; Paper such as newspaper, cardboard, magazines, fine paper; bagasse (sugar cane residue), palm empty fruit bunch (EFB), rice straw Stalks, leaves, fruit bunches, etc.
  • conifers such as larch and cedar, and broad-leaved trees such as oil palm (stems) and cypress
  • processed or pulverized products of wood such as wood chips
  • wood pulp produced from wood Pulp such as cotton linter pulp obtained from fibers around cotton seeds
  • Paper such as newspaper, cardboard, magazines, fine paper
  • bagasse bagasse
  • biomass such as corn stalks or leaves; plant shells such as rice husks, palm husks, coconut husks; one or more selected from the group consisting of algae.
  • plant shells such as rice husks, palm husks, coconut husks
  • one or more selected from the group consisting of algae are preferred, from the viewpoints of availability and raw material costs, wood, processed or pulverized wood, plant stems, leaves, fruit bunches, etc. are preferred, bagasse, EFB, oil palm (stem) are more preferred, and bagasse is further. preferable. You may use the said biomass individually or in mixture of 2 or more types.
  • the biomass may be dried.
  • xylanase activity refers to an activity of hydrolyzing a xylose ⁇ -1,4-glycoside bond in xylan.
  • the xylanase activity of a protein can be determined, for example, by reacting with the protein using xylan as a substrate and measuring the amount of xylan degradation product produced. Specific procedures for measuring xylanase activity are described in detail in the examples below.
  • the present invention relates to a novel xylanase that can saccharify biomass more efficiently and economically, can act in a wide range of pH, and has excellent versatility, and saccharification of biomass using the xylanase and production of sugar from biomass .
  • the present inventors have found a novel xylanase derived from the genus Xylanimonas and the genus Cellulomonas that can exhibit high xylanase activity in a wide pH range. Furthermore, the present inventors have found that saccharification of biomass can be efficiently performed by using the xylanase.
  • the present invention provides a xylanase having high xylanase activity in a wide pH range.
  • a xylanase having high xylanase activity in a wide pH range.
  • it is possible to realize more efficient saccharification of biomass as compared with the case where a known xylanase such as a commercially available xylanase-containing enzyme composition or a composition containing the same is used. . Therefore, according to the xylanase of the present invention or the enzyme composition containing the same, sugar can be produced efficiently and inexpensively from biomass.
  • the xylanase provided by the present invention includes the following (a) to (c): (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (B) an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; and (C) an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; And a protein having an xylanase activity.
  • the above proteins may be collectively referred to as “the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention”.
  • the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 92% or more, and still more preferably from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 from the viewpoint of improving pH stability and improving saccharification efficiency. It consists of an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more, even more preferably 98% or more.
  • a xylanase derived from Xylanimonas of the present invention a xylanase derived from a genus Xylanimonas bacterium (for example, Xylanimonas cellulolytica DSM15894) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is cited from the viewpoint of improving pH stability and improving saccharification efficiency. It is done.
  • a xylanase derived from a genus Xylanimonas bacterium for example, Xylanimonas cellulolytica DSM15894
  • An example of a protein having an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having xylanase activity is one to a plurality of amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Examples include proteins having a deleted, substituted or added amino acid sequence and having xylanase activity.
  • the mutant is, for example, a known gene such as ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis) for a gene encoding a xylanase derived from the genus Xylanimonas consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It can be produced by introducing a mutation by a mutagenesis method, expressing a gene having the mutation, and selecting a protein having a desired xylanase activity. The procedure for producing such a mutant is well known to those skilled in the art.
  • site-directed mutagenesis site-directed mutagenesis
  • the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention has an amino acid sequence different from that of a conventionally isolated or purified xylanase.
  • a known xylanase having the amino acid sequence having the highest sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 2 is xylanase derived from Xylanimirobium pachnodae (App. Environ. Microbiol., 1999, 65 (9): 4099-4107).
  • sequence identity with the xylanase of SEQ ID NO: 2 is 81%.
  • the xylanase provided by the present invention includes the following (a ′) to (c ′): (A ′) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; (B ′) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; (C ′) an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, And a protein having an xylanase activity.
  • the above proteins may be collectively referred to as “Cellulomonas-derived xylanase of the present invention”.
  • the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention has a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 from the viewpoint of improving pH stability and improving saccharification efficiency. It consists of an amino acid sequence having
  • the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention is preferably a xylanase derived from a Cellulomonas genus bacterium (for example, Cellulomonas fimi ATCC484) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 from the viewpoint of improving pH stability and saccharification efficiency. It is done.
  • An example of a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and having xylanase activity is one to a plurality of amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • Examples include proteins having a deleted, substituted or added amino acid sequence and having xylanase activity.
  • the mutant is, for example, a known gene such as ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis for a gene encoding a Cellulomonas genus xylanase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 above. It can be produced by introducing a mutation by a mutagenesis method, expressing a gene having the mutation, and selecting a protein having a desired xylanase activity. The procedure for producing such a mutant is well known to those skilled in the art.
  • the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention has an amino acid sequence different from that of a conventionally isolated or purified xylanase.
  • a known xylanase having an amino acid sequence having the highest sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 12 is a xylanase derived from Cellulomonas fimi (J. Biol. Chem., 2005, 280 (42): 35126-35).
  • the sequence identity with the xylanase of SEQ ID NO: 12 is 88%.
  • the Xylanimonas-derived xylanase and Cellulomonas-derived xylanase of the present invention further have the following enzymatic properties.
  • Optimum reaction pH In the present specification, “optimum reaction pH for xylanase activity” means a pH at which the activity is maximum when xylan is decomposed at 50 ° C., and specifically, measured by the method described in the examples below. Is done.
  • the optimum reaction pH of xylanase activity is preferably in the range of pH 5.5 to 8.5 from the viewpoint of improving pH stability and facilitating cocktail formation with other enzymes,
  • the pH is more preferably 6.0 to 8.0, still more preferably pH 6.0 to 7.5, and even more preferably pH 6.0 to 7.0.
  • the optimum reaction pH for xylanase activity is preferably in the range of pH 5.5 to 9.5 from the viewpoint of improving pH stability and facilitating cocktail formation with other enzymes.
  • the pH is 6.0 to 9.0, still more preferably 6.5 to 8.5, and still more preferably 6.6 to 8.0.
  • the “maximum activity” of xylanase refers to the xylanase activity at the optimum reaction pH at 50 ° C. From the viewpoint of improving saccharification efficiency, the maximum activity of the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention is preferably 1000 U / mg protein or more, more preferably 1100 U / mg protein or more, further preferably 1200 U / mg protein or more, more preferably 1300 U / mg.
  • the maximum activity of the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention is preferably 350 U / mg protein or more, more preferably 400 U / mg protein or more, and further preferably 420 U / mg protein or more from the viewpoint of improving saccharification efficiency.
  • the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention has a maximum activity at a reaction temperature of 50 ° C. and a pH of 7.0 to 9.0 from the viewpoint of improving pH stability and facilitating cocktail formation with other enzymes. Is preferably 70% or more, more preferably 74% or more.
  • the maximum activity is 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more.
  • the xylanase activity of the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention has a maximum activity of 70 at a reaction temperature of 50 ° C. and a pH of 6.0 to 9.0 from the viewpoint of facilitating cocktail stability with other enzymes. % Or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more.
  • “maximum activity” refers to xylanase activity at an optimum reaction pH at a reaction temperature of 50 ° C.
  • optimum reaction temperature in xylanase activity means a temperature at which xylanase activity is maximized, and is specifically measured by the method described in the examples below. .
  • the optimum reaction temperature for xylanase activity is preferably 40 ° C. or higher and lower than 70 ° C., more preferably 45 to 65 ° C., and further preferably 50 to 65 ° C.
  • the optimum reaction temperature for xylanase activity is preferably 40 ° C. or higher and lower than 70 ° C., more preferably 45 to 65 ° C., further preferably 50 to 65 ° C., still more preferably 55 to 65 ° C. is there.
  • the xylanase of the present invention 2. Production method of xylanase
  • the above-mentioned Xylanimonas-derived xylanase and Cellulomonas-derived xylanase of the present invention (hereinafter sometimes collectively referred to as “the xylanase of the present invention”), for example, by introducing a vector containing a gene encoding the xylanase of the present invention into a microorganism. It can be produced by the resulting transformant. Therefore, this invention also provides the production method of a xylanase including the process of culture
  • the gene encoded on the vector contained in the transformant is expressed and the xylanase of the present invention is produced.
  • the xylanase of the present invention can be obtained by isolating or purifying the produced xylanase from the culture.
  • Examples of the gene encoding the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention include a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a gene encoding the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the sequence of 85% or more, preferably 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more
  • Examples thereof include a gene comprising a base sequence having identity, and a gene comprising a base sequence in which one to a plurality of bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention can be isolated from bacteria belonging to the genus Xylanimonas such as Xylanimonas cellulolytica (DSM 15894) using any method used in the art. For example, after extracting the whole genome DNA of a genus Xylanimonas bacterium, the gene is selectively amplified by PCR using a primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the amplified gene is purified. Can be obtained. Alternatively, the gene can be synthesized genetically or chemically based on the amino acid sequence of the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention.
  • Examples of the gene encoding the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention include a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • the gene encoding the xylanase of the present invention comprises, for example, a base sequence having a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • Examples thereof include a gene and a gene comprising a base sequence in which one to a plurality of bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • the gene encoding the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention can be isolated from a Cellulomonas genus bacterium, such as Cellulomonas fimi (ATCC 484), using any method used in the art. For example, after extracting the whole genome DNA of Cellulomonas genus bacteria, the gene is selectively amplified by PCR using a primer designed based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and the amplified gene is purified. Can be obtained. Alternatively, the gene can be synthesized genetically or chemically based on the amino acid sequence of the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention.
  • the gene encoding the xylanase of the present invention may be a known mutagenesis method such as ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis described above with respect to the base sequence of the gene isolated or synthesized by the above procedure. Can be made by introducing mutations.
  • the gene encoding the xylanase of the present invention is mutated to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 11 by a known method, the obtained nucleotide sequence is expressed, the xylanase activity is examined, It can be obtained by selecting a gene encoding a protein having xylanase activity.
  • the type of vector into which the gene encoding the xylanase of the present invention is to be introduced is not particularly limited, and vectors usually used for protein production such as plasmids, cosmids, phages, viruses, YACs, BACs and the like can be mentioned.
  • a plasmid vector is preferable.
  • commercially available plasmid vectors for protein expression such as shuttle vectors pHY300PLK, pUC19, pUC119, and pBR322 (all manufactured by Takara Bio Inc.) can be preferably used.
  • the vector may include a DNA fragment containing a DNA replication initiation region and a DNA region containing a replication origin.
  • a control region such as a promoter region for initiating transcription of the gene and a secretory signal region for secreting the expressed protein outside the cell. May be operably connected.
  • a drug resistance gene such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol
  • control sequences include the S237egl promoter and signal sequence (Biosci. Biotechnol.
  • KSM-S237 strain (FERM BP-7875) and Bacillus sp. Examples thereof include a transcription initiation control region, a translation initiation region, and a secretory signal peptide region of a cellulase gene derived from KSM-64 strain (FERM BP-2886).
  • the xylanase gene can be linked to the regulatory sequence and drug resistance gene by a method such as SOE (splicing by overlap extension) -PCR (Gene, 1989, 77: 61-68).
  • SOE splicing by overlap extension
  • -PCR Gene, 1989, 77: 61-68.
  • the procedure for introducing a gene into a plasmid vector is well known in the art.
  • the expression that the gene and the regulatory sequence are “operably linked” means that the gene is arranged so that it can be expressed under the control of the regulatory region.
  • the constructed vector is introduced into a microorganism to obtain a transformant.
  • the microorganism for introduction include bacteria belonging to the genus Staphylococcus, Enterococcus, Listeria, Bacillus, etc. Among them, Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis or mutants thereof (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-174707). And the protease 9-deficient strain KA8AX, etc., described in Japanese Patent Publication No. H10.
  • the introduction method a method usually used in the art such as a protoplast method and an electroporation method can be used.
  • a target transformant can be obtained by selecting a strain into which introduction is appropriately performed using drug resistance or the like as an index.
  • the gene encoded on the vector contained in the transformant is expressed, and the xylanase of the present invention is synthesized.
  • the medium used for the culture can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of transformant.
  • the protein of the present invention can be obtained by isolating or purifying the produced xylanase from the culture by a conventional method. At this time, when the xylanase gene and the secretory signal sequence are operably linked on the vector, the produced xylanase is secreted outside the cells and can be more easily recovered. The recovered xylanase may be further purified by a known means.
  • the xylanase of the present invention has a remarkably high activity of saccharifying biomass as compared to conventionally known xylanases and xylanase-containing enzyme compositions, as shown in the examples described later. Therefore, the xylanase of the present invention can be suitably used for biomass saccharification. That is, the present invention also provides a biomass saccharifying agent containing the xylanase of the present invention as an active ingredient, and an enzyme composition for biomass saccharification containing the xylanase of the present invention.
  • the enzyme composition of the present invention contains the above-described xylanase of the present invention. Moreover, it is preferable that the enzyme composition of this invention contains a cellulase further from a viewpoint of the improvement of saccharification efficiency.
  • cellulase refers to an enzyme that hydrolyzes the glycosidic bond of ⁇ -1,4-glucan of cellulose, and is a generic term for enzymes called endoglucanase, exoglucanase or cellobiohydrolase, and ⁇ -glucosidase. It is.
  • Cellulases used in the present invention may include commercially available cellulase-containing enzyme compositions and cellulases derived from animals, plants and microorganisms.
  • these cellulases may be used alone or in combination of two or more.
  • the cellulase preferably contains one or more selected from the group consisting of cellobiohydrolase and endoglucanase.
  • cellulase examples include a cellulase derived from Trichoderma reesei; a cellulase derived from Trichoderma viride; Bacillus sp. KSM-N145 (FERM P-19lu s. ) KSM-N252 (FERM P-17474), Bacillus sp. KSM-N115 (FERM P-19726), Bacillus sp. KSM-N440 (FERM P-19728), Bacillus sp.
  • Cellulases derived from various Bacillus strains such as KSM-N659 (FERM P-19730); Pyrococca Examples include thermostable cellulase derived from Pyrococcus horikoshii; cellulase derived from Humicola insolens, and the like.
  • a cellulase derived from Trichoderma reesei, Trichoderma viride, or Humicola insolens is preferable.
  • the enzyme composition containing cellulase examples include Cellcrust (registered trademark) 1.5L (manufactured by Novozymes), TP-60 (manufactured by Meiji Seika Co., Ltd.), Cellic (registered trademark) CTec2 (manufactured by Novozymes) , Accelerase TM DUET (manufactured by Genencor), and Ultraflo (registered trademark) L (manufactured by Novozymes).
  • Cellcrust registered trademark
  • TP-60 manufactured by Meiji Seika Co., Ltd.
  • Cellic registered trademark
  • CTec2 manufactured by Novozymes
  • Accelerase TM DUET manufactured by Genencor
  • Ultraflo registered trademark
  • Cellic (registered trademark) CTec2 and Accelerase TM DUET are preferable, Cellic (registered trademark) CTec2 is more preferable, from the viewpoint of improving the saccharification efficiency, the viewpoint of reducing manufacturing costs, and the viewpoint of availability. .
  • ⁇ -glucosidase which is a kind of cellulase
  • ⁇ -glucosidase include ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus niger (for example, Novozyme 188 from Novozymes, ⁇ -glucosidase from Megazyme), and Trichoderma lyase (Trichoderma). reesei) or ⁇ -glucosidase derived from Penicillium emersonii.
  • Novozyme 188 and ⁇ -glucosidase derived from Trichoderma reease are preferable, and ⁇ -glucosidase derived from Trichoderma lyse is more preferable from the viewpoint of improving saccharification efficiency.
  • endoglucanase which is a kind of cellulase
  • Trichoderma reesei Acremonium cellulolyticus, Humicola insolens, and Clostridium thermocerum cerum cerum cerium.
  • Thermobifida Cellulomonas-derived enzymes, and the like.
  • endoglucanase derived from Trichoderma reeze, Humicola insolens, Bacillus, or Cellulomonas is preferable, and endoglucanase derived from Trichoderma reesei is more preferable.
  • the enzyme composition of the present invention may contain a hemicellulase other than the xylanase of the present invention.
  • hemicellulase refers to an enzyme that hydrolyzes hemicellulose, and is a general term for enzymes called xylanase, xylosidase, galactanase, and the like.
  • Specific examples of hemicellulases other than the xylanase of the present invention include hemicellulase derived from Trichoderma reesei; Bacillus sp.
  • KSM-N546 (FERM P-19729) xynalase; Aspergillus niger luger ), Trichoderma viride, Humicola insolens, or Bacillus alcalophilus xylanase; es), Clostridium, Thermotoga, Thermoscus, Caldocellum, or Thermomonospora genus, Bacillus pumilus p. Examples include ⁇ -xylosidase derived from Selenomonas ruminantium.
  • the enzyme composition of the present invention preferably contains a xylanase derived from Bacillus sp., Aspergillus niger, Trichoderma viride or Streptomyces, or ⁇ -xylosidase derived from Selenomonas luminantium. It is more preferable to contain a xylanase derived from SP or Trichoderma viride or ⁇ -xylosidase derived from Selenomonas luminantium.
  • the content of the xylanase of the present invention in the total protein amount of the enzyme composition of the present invention is preferably 0.5 to 70% by mass, more preferably 1 to 50% by mass from the viewpoint of improving saccharification efficiency. Is 2 to 40% by mass, and more preferably 2 to 30% by mass.
  • the cellulase content in the total protein amount of the enzyme composition of the present invention is preferably 10 to 99% by mass, more preferably 30 to 95% by mass, and still more preferably 50% from the viewpoint of improving saccharification efficiency. ⁇ 95% by mass.
  • the content of the endoglucanase in the total protein amount of the enzyme composition of the present invention is preferably 1 to 70% by mass, more preferably 5 to 50% by mass, and still more preferably, from the viewpoint of improving saccharification efficiency. 10 to 40% by mass.
  • the content of hemicellulase other than the xylanase of the present invention in the total protein amount of the enzyme composition of the present invention is preferably 0.01 to 30% by mass, more preferably from the viewpoint of improving saccharification efficiency. It is 0.1 to 20% by mass, more preferably 0.5 to 20% by mass.
  • the protein amount ratio of the xylanase of the present invention to the above cellulase is preferably 0.01 to 100, more preferably 0.05, from the viewpoint of improving saccharification efficiency. To 5, more preferably 0.05 to 1, and still more preferably 0.05 to 0.5.
  • the protein amount ratio of the xylanase of the present invention to the endoglucanase is preferably 0.05 to 10, more preferably 0, from the viewpoint of improving saccharification efficiency. .1 to 5, more preferably 0.1 to 2, and still more preferably 0.2 to 1.
  • the xylanase and enzyme composition of the present invention are suitably used in the method for producing a sugar of the present invention described later for biomass saccharification.
  • Biomass is as described above.
  • the biomass is preferably wood, a processed or ground product of wood, a plant stem, leaf, fruit bunker, etc., bagasse, EFB, Oil palm (trunk) is more preferred, and bagasse is even more preferred. You may use the said biomass individually or in mixture of 2 or more types.
  • the biomass may be dried.
  • the sugar production method of the present invention includes a step of saccharifying biomass with the xylanase or enzyme composition of the present invention.
  • the saccharification efficiency of biomass is significantly improved.
  • the reason why the saccharification efficiency is improved is not clear, but by using the xylanase or enzyme composition of the present invention, hemicellulose in the biomass is efficiently decomposed so that the enzyme can easily come into contact with the cellulose, and saccharification as a whole is achieved. It is presumed that the efficiency is improved.
  • the biomass in the sugar production method of the present invention is as described above. From the viewpoint of availability, raw material cost, and improvement of saccharification efficiency, the biomass is preferably wood, processed or pulverized wood, plant stems, leaves, fruit bunches, etc., and bagasse, EFB, oil palm (stems). More preferably, bagasse is more preferable. You may use the said biomass individually or in mixture of 2 or more types.
  • the biomass may be dried.
  • the method for producing the sugar of the present invention is performed before the step of saccharifying biomass with the xylanase or the enzyme composition of the present invention. It is preferable to further include a step of pretreating the biomass.
  • the pretreatment include one or more selected from the group consisting of alkali treatment, pulverization treatment, and hydrothermal treatment. Since the xylanase of the present invention has high enzyme activity even in the alkaline region, the pretreatment is preferably alkali treatment from the viewpoint of improving saccharification efficiency, and alkali treatment and pulverization treatment are performed from the viewpoint of further improving saccharification efficiency. It is preferable to perform the alkali treatment and the pulverization treatment at the same time.
  • alkali treatment refers to reacting biomass with a basic compound described later.
  • the alkali treatment method include a method of immersing biomass in an alkali solution containing a basic compound to be described later (hereinafter sometimes referred to as “immersion treatment”), and mixing biomass and a basic compound to be described later.
  • immersion treatment a method of immersing biomass in an alkali solution containing a basic compound to be described later
  • alkali mixed pulverization treatment hereinafter sometimes referred to as “alkali mixed pulverization treatment”.
  • Examples of basic compounds used for alkali treatment include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide, potassium hydroxide and lithium hydroxide, alkaline earth metal hydroxides such as magnesium hydroxide and calcium hydroxide, sodium oxide, Alkaline metal oxides such as potassium oxide, alkaline earth metal oxides such as magnesium oxide and calcium oxide, alkali metal sulfides such as sodium sulfide and potassium sulfide, alkaline earth metal sulfides such as magnesium sulfide and calcium sulfide, etc. Can be mentioned.
  • an alkali metal hydroxide or an alkaline earth metal hydroxide more preferably an alkali metal hydroxide, and sodium hydroxide.
  • an alkali metal hydroxide more preferably an alkali metal hydroxide, and sodium hydroxide.
  • potassium hydroxide it is more preferable to use potassium hydroxide.
  • the concentration of the basic compound in the alkaline solution in the dipping treatment is preferably 0.1 to 60% by mass, more preferably 0.1 to 50% by mass from the viewpoint of increasing saccharification efficiency and increasing the amount of glucose produced. More preferably, the content is 0.1 to 40% by mass.
  • the amount of the alkaline solution used in the dipping treatment is preferably 50 to 99% by mass, more preferably 60 to 99% by mass, and still more preferably 80 to 99% by mass with respect to the dry mass of the biomass.
  • the treatment time of the immersion treatment is preferably 0.5 to 50 hours, more preferably 1 to 24 hours, and further preferably 1.5 to 10 hours.
  • the pulverization process means that the biomass is mechanically pulverized into small particles. By making the biomass into smaller particles, the saccharification efficiency is further improved. In addition, when the crystal structure of cellulose contained in biomass is destroyed by pulverization, saccharification efficiency is still improved.
  • the pulverization treatment can be performed using a known pulverizer. There is no restriction
  • the pulverizer include a roll mill such as a high pressure compression roll mill and a roll rotating mill; a vertical roller mill such as a ring roller mill, a roller race mill or a ball race mill; a rolling ball mill, a vibration ball mill, a vibration rod mill, and a vibration tube.
  • Container driven media mills such as mills, planetary ball mills or centrifugal fluidization mills; medium agitation mills such as tower crushers, stirring tank mills, flow tank mills or annular mills; high speed centrifugal roller mills, ang mills, etc.
  • a container-driven medium mill and a medium stirring mill are preferable, a container-driven medium mill is more preferable, a vibration ball mill, a vibration A vibration mill such as a rod mill or a vibration tube mill is more preferable, and a vibration rod mill is even more preferable.
  • the pulverization method may be either a batch type or a continuous type.
  • the pulverization time may be appropriately adjusted so that the pulverized biomass is reduced to a desired size.
  • the pulverization time may vary depending on the pulverizer used and the amount of energy used, it is usually 1 minute to 12 hours, and is from the viewpoint of reducing the particle size of biomass, reducing the crystallinity of cellulose, and from the viewpoint of energy cost. Therefore, 2 minutes to 6 hours are preferable, 5 minutes to 3 hours are more preferable, and 5 minutes to 2 hours are more preferable.
  • the grinding treatment may be combined with the alkali treatment with the basic compound described above.
  • the pulverization treatment may be performed before or after the alkali treatment, or may be performed in parallel with the pulverization treatment.
  • the biomass immersed in the alkali solution described above may be subjected to a pulverization process (wet pulverization), or may be subjected to a pulverization process together with a solid alkali and biomass (dry pulverization), among which dry pulverization is preferable.
  • dry pulverization dry pulverization
  • the amount of holocellulose in the biomass is all cellulose from the viewpoint of improving the saccharification efficiency, reducing the crystallinity of the cellulose, and removing lignin in the biomass.
  • AGU anhydroglucose unit
  • the average particle size of the biomass obtained after the pulverization treatment is preferably 1 to 150 ⁇ m, more preferably 5 to 100 ⁇ m, from the viewpoints of improving saccharification efficiency and reducing the crystallinity of cellulose.
  • the average particle diameter of biomass can be measured by the method described in Examples.
  • hydrothermal treatment refers to heat treatment of biomass in the presence of moisture.
  • Hydrothermal treatment can be performed using a known reaction apparatus, and the reaction apparatus used is not particularly limited.
  • the coarsely pulverized biomass is made into a water slurry dispersed in water, and this is heat-treated.
  • the content of biomass in the water slurry is preferably 1 to 500 g / L, more preferably 5 to 400 g / L, and still more preferably 8 to 300 g / L from the viewpoint of improving the fluidity of the slurry.
  • Hydrothermal treatment is preferably performed under acidic conditions from the viewpoint of improving production efficiency and saccharification efficiency.
  • the pH condition is preferably pH 3 to 7, more preferably pH 4 to 6, from the viewpoints of improving production efficiency, improving saccharification efficiency, and suppressing denaturation of lignin.
  • the pH condition can be adjusted as appropriate by using an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid, or an organic acid such as acetic acid or citric acid.
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid, or an organic acid such as acetic acid or citric acid.
  • As conditions for the hydrothermal treatment a temperature of 100 to 400 ° C. and a pressure of 0.1 to 4 MPa are preferable, and a temperature of 140 to 200 ° C. and a pressure of 0.5 to 1 MPa are more preferable.
  • the treatment time is preferably from 0.1 to 3 hours.
  • the hydrothermal treatment method may be either a batch type or a continuous type.
  • the biomass obtained by hydrothermal treatment may be in a wet state, or may be further subjected to a drying treatment, but from the viewpoint of improving saccharification efficiency, a biomass in a wet state is preferable.
  • the sugar production method of the present invention includes a step of saccharifying the biomass, preferably the pretreated biomass, with the xylanase or enzyme composition of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “saccharification treatment”).
  • saccharification treatment the xylanase or enzyme composition used for the saccharification treatment is as described above.
  • the conditions for the saccharification treatment are not particularly limited as long as the xylanase of the present invention and other enzymes to be mixed at the same time are not inactivated. Appropriate conditions can be determined by those skilled in the art depending on the type of biomass, the procedure of the pretreatment step, and the type of enzyme used.
  • the xylanase or enzyme composition is preferably added to the suspension containing the biomass.
  • the content of biomass in the suspension is preferably 0.5 to 20% by mass, more preferably 3 to 15% by mass, and still more preferably 5% from the viewpoint of improving saccharification efficiency and productivity (reducing production time). ⁇ 10% by mass.
  • the amount of xylanase or enzyme composition used in the suspension is appropriately determined depending on pretreatment conditions, the type and nature of the enzyme to be blended, and is preferably 0.04 to 600% by mass relative to the biomass mass, More preferably, it is 0.1 to 100% by mass, and further preferably 0.1 to 50% by mass.
  • the reaction pH at the time of saccharification treatment is preferably pH 4 to 9, more preferably pH 5 to 8, more preferably pH 5 to 5, from the viewpoints of improving saccharification efficiency, improving productivity (reducing production time), and reducing production costs. 7.
  • the reaction temperature during the saccharification treatment is preferably 20 to 90 ° C, more preferably 25 to 85 ° C, and still more preferably 30 from the viewpoints of improving saccharification efficiency, improving productivity (shortening production time), and reducing production costs. -80 ° C, even more preferably 40-75 ° C, still more preferably 45-65 ° C, still more preferably 50-65 ° C, still more preferably 50-60 ° C.
  • the reaction time of the saccharification treatment can be appropriately set according to the type or amount of biomass, the amount of enzyme, etc. From the viewpoint of improving saccharification efficiency, improving productivity (shortening production time), and reducing production costs, It is preferably 1 to 5 days, more preferably 1 to 4 days, and further preferably 1 to 3 days.
  • compositions, manufacturing methods, uses, or methods are further disclosed herein.
  • present invention is not limited to these embodiments.
  • An isolated or purified protein comprising an amino acid sequence selected from the following (a) to (c) and having xylanase activity: (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (B) an amino acid sequence having 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; and (C) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to plural, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, An amino acid sequence in which 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted or added.
  • the xylanase activity is preferably 70% or more, more preferably 74% or more with respect to the maximum activity in the range of pH 7.0 to 9.0, and in the range of pH 7.0 to 8.5.
  • the optimum reaction pH is preferably in the range of pH 5.5 to 8.5, more preferably in the range of pH 6.0 to 8.0, still more preferably in the range of pH 6.0 to 7.5, and even more preferably The protein according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, wherein the protein is in a range of pH 6.0 to 7.0.
  • ⁇ 4> The protein according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 3>, preferably encoded by a gene selected from the following (d) to (f): (D) a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; (E) a gene comprising a nucleotide sequence having a sequence identity of 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; (F) 1 to plural, preferably 1 to 150, more preferably 1 to 120, still more preferably 1 to 90, still more preferably 1 to 60, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 A gene comprising a base sequence in which preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, and still more preferably 1 to 10 bases are deleted, substituted or added.
  • a gene selected from the following (d) to (f): (D) a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; (E)
  • ⁇ 5> The protein according to ⁇ 4>, wherein the gene is preferably a gene derived from the genus Xylanimonas.
  • An isolated or purified protein comprising an amino acid sequence selected from the following (a ′) to (c ′) and having xylanase activity: (A ′) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; (B ′) an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; (C ′) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 1 to plural, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, further preferably 1 to 10, even more preferably 1 to 5 An amino acid sequence in which the amino acids are deleted, substituted or added.
  • the xylanase activity in the range of pH 6.0 to 9.0 is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, and still more preferably 90% with respect to the maximum activity.
  • the optimum reaction pH is preferably in the range of pH 5.5 to 9.5, more preferably in the range of pH 6.0 to 9.0, still more preferably in the range of pH 6.5 to 8.5, and even more preferably The protein according to ⁇ 6> or ⁇ 7> above, which has a pH in the range of 6.6 to 8.0.
  • the protein according to any one of the above ⁇ 6> to ⁇ 8> preferably encoded by a gene selected from the following (d ′) to (f ′): (D ′) a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11; (E ′) a gene comprising a base sequence having a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 11; (F ′) 1 to plural, preferably 1 to 90, more preferably 1 to 60, still more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 15 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11,
  • the gene consists of a base sequence in which 1 to 10 bases are deleted, substituted or added.
  • ⁇ 10> The protein according to ⁇ 9>, wherein the gene is preferably a gene derived from the genus Cellulomonas.
  • ⁇ 11> The product according to any one of the above ⁇ 4>, ⁇ 5>, ⁇ 9> and ⁇ 10>, preferably produced by a transformant obtained by introducing a vector containing the gene into a microorganism. protein.
  • An enzyme composition for biomass saccharification comprising the protein according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5> above and the protein according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 10> above.
  • the content of the protein according to ⁇ 1> to ⁇ 11> in the total protein amount of the enzyme composition is preferably 0.5 to 70% by mass, more preferably 1 to 50% by mass,
  • the enzyme composition for biomass saccharification according to the above ⁇ 12> or ⁇ 13> further preferably 2 to 40% by mass, and still more preferably 2 to 30% by mass.
  • the content of the endoglucanase in the total protein amount of the enzyme composition is preferably 1 to 70% by mass, more preferably 5 to 50% by mass, and still more preferably 10 to 40% by mass.
  • the protein amount ratio of the protein according to ⁇ 1> to ⁇ 11> above and the cellulase (the protein / the cellulase) is preferably 0.01 to 100, more preferably 0.05 to 5,
  • the protein amount ratio of the protein according to the above ⁇ 1> to ⁇ 11> and the endoglucanase is preferably 0.05 to 10, more preferably 0.1 to 5,
  • biomass is preferably a processed or pulverized product of wood, pulp, paper, bagasse, rice straw, corn stalk or leaf, palm empty fruit bunch (EFB), plant shells, and algae
  • EFB palm empty fruit bunch
  • plant shells and algae
  • EFB palm empty fruit bunch
  • algae One or more selected from the group consisting of wood, processed or pulverized wood, plant stems, leaves, and fruit bunches, more preferably bagasse, EFB, oil palm (stem)
  • the enzyme composition for biomass saccharification according to any one of the above ⁇ 12> to ⁇ 19>, which is at least one selected from the group consisting of:
  • a biomass saccharification method comprising a step of saccharifying biomass with the protein according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11> above.
  • a method for producing sugar comprising a step of saccharifying biomass with the protein according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11> above.
  • a biomass saccharification method comprising a step of saccharifying biomass with the enzyme composition according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 20> above.
  • a method for producing sugar comprising a step of saccharifying biomass with the enzyme composition according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 20> above.
  • ⁇ 26> Preferably further comprising a step of pretreating the biomass, wherein the pretreatment is preferably one or more selected from the group consisting of alkali treatment, pulverization treatment and hydrothermal treatment, more preferably alkali treatment and pulverization treatment.
  • the pretreatment is preferably one or more selected from the group consisting of alkali treatment, pulverization treatment and hydrothermal treatment, more preferably alkali treatment and pulverization treatment.
  • the pretreatment is preferably one or more selected from the group consisting of the above, more preferably alkali treatment and pulverization treatment, and even more preferably any one of the above ⁇ 21> to ⁇ 25>, which is a treatment in which alkali treatment and pulverization treatment are simultaneously performed The method described.
  • the basic compound used for the alkali treatment is preferably composed of an alkaline earth metal hydroxide, an alkali metal oxide, an alkaline earth metal oxide, an alkali metal sulfide, and an alkaline earth metal sulfide.
  • an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide more preferably an alkali metal hydroxide, and even more preferably sodium hydroxide or potassium hydroxide, 26>.
  • the pulverization time in the pulverization treatment is preferably 1 minute to 12 hours, more preferably 2 minutes to 6 hours, still more preferably 5 minutes to 3 hours, and even more preferably 5 minutes to 2 hours.
  • ⁇ 26> or ⁇ 27> The method of description.
  • ⁇ 29> The method according to any one of ⁇ 26> to ⁇ 28>, wherein the average particle size of the biomass obtained after the pulverization treatment is preferably 1 to 150 ⁇ m, more preferably 5 to 100 ⁇ m.
  • the protein according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 11> or the enzyme composition according to any one of the above ⁇ 12> to ⁇ 19> is added to the suspension containing the biomass.
  • the amount of the protein or the enzyme composition used in the suspension is preferably 0.04 to 600% by mass, more preferably 0.1 to 100% by mass, and more preferably 0.1% to 100% by mass with respect to the mass of the biomass.
  • reaction pH in the saccharification step is preferably pH 4 to 9, more preferably pH 5 to 8, and further preferably pH 5 to 7. .
  • the reaction temperature in the saccharification step is preferably 20 to 90 ° C, more preferably 25 to 85 ° C, still more preferably 30 to 80 ° C, still more preferably 40 to 75 ° C, still more preferably 45 to 65.
  • the above-mentioned biomass is preferably a processed product or pulverized product of wood, pulp, paper, bagasse, rice straw, corn stalk or leaf, palm empty fruit bunch (EFB), plant shells, and algae
  • EFB palm empty fruit bunch
  • plant shells and algae
  • wood processed or pulverized wood, plant stems, leaves, and fruit bunches, more preferably bagasse, EFB, oil palm (stem)
  • the method according to any one of the above items ⁇ 21> to ⁇ 34> which is at least one selected from the group consisting of:
  • the above biomass is preferably a processed or pulverized wood, pulp, paper, bagasse, rice straw, corn stalk or leaf, palm empty fruit bunch (EFB), plant shells, and algae
  • EFB palm empty fruit bunch
  • plant shells and algae
  • wood processed or pulverized wood, plant stems, leaves, and fruit bunches, more preferably bagasse, EFB, oil palm (stem)
  • ⁇ 42> The protein according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 11>, which is used for production of sugar from biomass.
  • the above-mentioned biomass is preferably a processed product or pulverized product of wood, pulp, paper, bagasse, rice straw, corn stalk or leaf, palm empty fruit bunch (EFB), plant shells, and algae
  • EFB palm empty fruit bunch
  • plant shells and algae
  • wood processed or pulverized wood, plant stems, leaves, and fruit bunches, more preferably bagasse, EFB, oil palm (stem)
  • the protein or enzyme composition according to any one of the above ⁇ 41> to ⁇ 44>, which is at least one selected from the group consisting of:
  • PCR Reaction In the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, Applied Biosystems 2720 thermal cycler (Applied Biosystems) is used, and PrimeSTAR Max Premix (Takara Bio) is attached. Amplification of DNA was performed using the above reagents.
  • the PCR reaction solution composition was 1 ⁇ L of appropriately diluted template DNA, 20 pmol each of sense primer and antisense primer, and 25 ⁇ L PrimeStar Max Premix, so that the total reaction solution volume was 50 ⁇ L.
  • PCR reaction conditions were 98 ° C. for 10 seconds, 57 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 10 to 50 seconds (adjusted according to the target amplification product. The standard is 10 seconds per kb). This was done by repeating.
  • a xylanase solution diluted to an appropriate concentration was added to the substrate solution and reacted at 50 ° C. for 10 minutes.
  • a DNS solution sodium hydroxide (Wako Pure Chemical Industries) 1.6% (w / v), dinitrosalicylic acid (Wako Pure Chemical Industries) 0.5% (w / v)), sodium potassium tartrate ( 100 ⁇ L of Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (30.0% (w / v)) was added and reacted at 100 ° C. for 5 minutes to stop the enzyme reaction.
  • a blank was prepared by adding 100 ⁇ L of the DNS solution to 90 ⁇ L of the substrate solution, adding 10 ⁇ L of the above xylanase solution, and performing the same operation. After cooling the reaction solution, the absorbance at 540 nm was measured with an absorption microplate reader VersaMax (Molecular Device Japan).
  • the absorbance at 540 nm was measured with an absorbance microplate reader.
  • the amount of xylooligosaccharide in the reaction solution was calculated based on a calibration curve prepared with a xylose solution having a known concentration.
  • the white residue was filtered through a glass filter (1G-3), washed with cold water and acetone, and then dried at 105 ° C. until a constant weight was obtained to determine the residue mass.
  • the holocellulose content was calculated by the following formula, and this was defined as the cellulose content.
  • Cellulose content (mass%) [residue mass (g) / collection amount of cellulose-containing raw material (g: dry raw material conversion excluding basic compound)] ⁇ 100
  • AGU anhydroglucose unit
  • the average particle size of the pulverized product was measured using a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer “LA-950” (manufactured by Horiba, Ltd.). As a measurement sample, 0.1 g of the pulverized product was added to 5 mL of water, and a sample dispersion treated with ultrasonic waves for 1 minute was used. The volume-based median diameter was measured at a temperature of 25 ° C., and this was defined as the average particle diameter.
  • Xylanimonas cellulolytica DSM15894 strain was inoculated into Trypticase Soy Agar medium (3.0% Trypticase Soy, 2.0% Agar) and cultured at 28 ° C. for 1 day.
  • Genomic DNA was obtained from the cells obtained by culturing using UltraClean TM Microbial DNA Isolation Kit (manufactured by Mo Bio Laboratories, Inc.).
  • the recombinant plasmid pHY-S237 into which the DNA fragment to be encoded was inserted was used as a template, and the S237 alkaline cellulase structural gene was removed using forward primer 2 (SEQ ID NO: 7) and reverse primer 2 (SEQ ID NO: 8) shown in Table 1.
  • SEQ ID NO: 7 forward primer 2
  • SEQ ID NO: 8 reverse primer 2
  • An approximately 5.6 kbp fragment (B) was amplified.
  • the amplified gene fragment was purified with High Pure PCR Product Purification kit (Roche).
  • An LB agar medium containing 50 ppm ampicillin sodium (Wako Pure Chemical Industries) and 2.0% agar (Wako Pure Chemical Industries) was used as the regeneration medium for the transformant. From the transformants obtained as ampicillin resistant strains, a strain carrying the plasmid into which the target gene was inserted was selected by colony PCR. The selected transformants were cultured using the same LB agar medium (37 ° C., 1 day), and the plasmids were collected and purified from the obtained cells using a High Pure Plasmid Isolation kit (Roche).
  • the plasmid was introduced into the host bacterium according to the protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet., 1979, 168: 111-115). At this time, Bacillus subtilis 168 protease 9-deficient strain (KA8AX) (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-174707) was used as the host bacterium.
  • Transformant regeneration media include tetracycline-containing DM3 regeneration agar medium (Sigma-Aldrich) 1.0% (w / v), bactocasamino acid (Difco) 0.5% (w / v), yeast Extract (Difco) 0.5% (w / v), L-tryptophan (Wako Pure Chemical Industries) 0.01% (w / v), Disodium succinate hexahydrate (Wako Pure Chemical Industries) 8.1 % (W / v), dipotassium monohydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries) 0.35% (w / v), monopotassium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries) 0.15% (w / v) , Glucose (Wako Pure Chemical Industries) 0.5% (w / v), magnesium chloride (Wako Pure Chemical Industries) 20 mM, bovine serum albumin (Wako Pure Chemical Industries) 0.01% (w / v), trypan blue
  • the culture supernatant was obtained by centrifugation (11,000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.).
  • 3 mL of the culture supernatant was exchanged with 20 mM Tris-HCl pH 7.5 using a desalting column Econo-Pac 10DG (BioRad), a recombinant Xylanimonas-derived xylanase crude enzyme solution was prepared.
  • Example 2 Cellulomonas preparation of xylanase Cellulomonas fimi ATCC484 strain Growth medium (1.0% Polypeptone, 0.2 % Yeast extract, 0.1% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, pH7.0) was inoculated to And cultured at 30 ° C. for 1 day. Genomic DNA was obtained from the cells obtained by culturing using UltraClean TM Microbiological DNA Isolation Kit (manufactured by Mo Bio Laboratories, Inc.).
  • the forward primer 3 (SEQ ID NO: 9) and reverse primer 3 (SEQ ID NO: 10) shown in Table 1 were used, and the xylanase gene region (SEQ ID NO: 11) on the genome was about 1.4 kbp.
  • Fragment (A ′) was amplified.
  • the DNA fragment (A ′) and the DNA fragment (B) prepared in Example 1 were cloned into a vector in the same procedure as in Example 1, and competent cell E. coli was used using this vector.
  • E. coli HB101 was transformed, and the plasmid with the target gene inserted was recovered from the transformant.
  • the recovered plasmid was B.
  • Subtilis 168 strain protease 9-deficient strain (KA8AX) (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-174707) was introduced and cultured on a tetracycline-containing DM3 regeneration agar medium. The transformant grown on the medium was cultured in the same manner as in Example 1 to prepare a recombinant Cellulomonas-derived xylanase crude enzyme solution.
  • Example 1 (Xylanase activity and optimum reaction pH)
  • the xylanase solution (10 ⁇ L) prepared in Example 1 or Example 2 or the control xylanase Cellic® HTec (Novozymes A / S) diluted to an appropriate concentration was added to the substrate solution, and the above-mentioned Reference Example 3 (1 ) And the xylanase activity was measured.
  • the xylanase activity (unit) of each diluted enzyme solution was calculated from the amount of produced sugar.
  • 1 unit (U) was defined as the activity of an enzyme that liberates a reducing sugar equivalent to 1 ⁇ mol of D-xylose per minute.
  • the results are shown in Table 2 and Table 3.
  • the relative activity (%) relative to the maximum activity is the relative activity when the activity at the pH at which the maximum activity was obtained (Table 2; pH 6.6, Table 3; pH 7.0) is defined as 100%.
  • the relative activity (%) with respect to Cellic (registered trademark) HTec indicates the relative activity when the specific activity of Cellic (registered trademark) HTec at each pH is 100%.
  • the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention prepared in Example 1 showed the maximum activity at pH 6.6, and the specific activity at that time was about 1717 U / mg.
  • the xylanase showed higher specific activity than commercial xylanase at pH 5.0 or higher.
  • the xylanase had a specific activity of 1200 U / mg or more between pH 7.0 and 9.0, and maintained an activity of 70% or more of the maximum activity.
  • the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention prepared in Example 2 showed the maximum activity at pH 7.0, and the specific activity at that time was about 485 U / mg.
  • the xylanase also had a specific activity of 350 U / mg or more between pH 5.6 and 9.0 and maintained an activity of 70% or more of the maximum activity. From these results, it was shown that the xylanase has high xylanase activity in a wide range of pH, and particularly has high activity even in the alkaline region.
  • Example 2 (Optimum reaction temperature) The xylanase solution (10 ⁇ L) prepared in Example 1 or Example 2 diluted to an appropriate concentration was added to the substrate solution, and the xylanase activity was measured under the measurement conditions of Reference Example 3 (2) described above. The amount of xylooligosaccharide in the reaction solution was calculated based on a calibration curve prepared with a xylose solution having a known concentration. The blank value was subtracted from the calculated value to calculate the amount of xylooligosaccharide produced by the enzyme reaction. The amount of sugar produced at each temperature when the sample showing the maximum amount of sugar produced was taken as 100% was determined as the relative activity. The results are shown in Table 4. The xylanase of the present invention had the highest xylan decomposition activity at around 60 ° C., and showed an activity of 60% or more of the activity at 60 ° C. in the range of 45 to 65 ° C.
  • Example 3 Saccharification of biomass with xylanase (Preparation of biomass)
  • the bagasse ground material used as a substrate was prepared as follows. Bagasse (sugarcane pomace, holocellulose content 71.3% by mass, crystallinity 29%, moisture content 7.0% by mass) was placed in a vacuum dryer VO-320 (Advantech Toyo) under nitrogen circulation. It was dried under reduced pressure for 2 hours under the conditions to obtain a dry bagasse having a holocellulose content of 71.3 wt%, a crystallinity of 29%, and a moisture content of 2.0 wt%.
  • the xylanase solution prepared in Example 1 or Example 2 or the control xylanase solution was added to give 50 ⁇ g-protein per sample, and water was added to make the total volume 1 mL. Thereafter, a saccharification reaction was performed for 1 day while reciprocally shaking at 50 ° C. and 150 rpm.
  • a control xylanase Cellic (registered trademark) HTec (Novozymes A / S) or Thermomyces lanuginosus-derived xylanase (Sigma-Aldrich) was used. Thermomyces lanuginosus-derived xylanase was added only to the pH 5.0 substrate solution.
  • the supernatant was collected by centrifugation (15000 rpm, 5 min, 4 ° C.), and the concentrations of xylose, xylobiose and xylotriose in the supernatant were measured with a DX500 chromatography system (manufactured by Nippon Dionex). .
  • the sum of these three free sugar amounts was defined as the amount of sugar produced from bagasse.
  • the results are shown in Table 5.
  • the relative amount of sugar produced in the table is a relative value when the amount of sugar produced by Cellic (registered trademark) HTec at each pH is 100%.
  • the Xylanimonas-derived xylanase of the present invention exhibits higher saccharification activity than Cellic (registered trademark) HTec in all measured pH ranges, and is stable particularly in the alkaline region (pH 7 to 9). High saccharification activity was maintained.
  • the Cellulomonas-derived xylanase of the present invention exhibits higher activity than glycation activity at pH 5 which is the optimum pH of Cellic (registered trademark) HTec in the range of pH 5 to 9, particularly from near neutral to alkaline region (pH 6 to Even in 9), high saccharification activity was stably maintained.
  • Thermomyces langininosus-derived xylanase exhibited a saccharification activity (relatively produced sugar amount 101%) equivalent to Cellic (registered trademark) HTec at pH 5. From these results, it was considered that the xylanase of the present invention can be used for a wide range of pH.
  • Example 4 Saccharification of biomass by enzyme composition (preparation of biomass) The bagasse ground material (average particle diameter of about 16.6 ⁇ m) prepared in Example 3 was used.
  • TrEGI Trichoderma reesei QM6a strain-derived endoglucanase I
  • a DNA sequence (SEQ ID NO: 13) encoding TrEGI was amplified by PCR and introduced into pPTR I DNA (Takara Bio), an expression vector for Aspergillus oryzae, after ligation with a promoter. Then A.
  • TrEGI Trichoderma reesei QM6a-derived endoglucanase I
  • the relative saccharification rate in the figure is a relative value when Cellic (registered trademark) CTec2 is added with 50 ⁇ g-protein per sample and the amount of sugar produced is 100%.
  • an enzyme composition containing the xylanase of the present invention As shown in FIG. 1, by using an enzyme composition containing the xylanase of the present invention, the same protein amount or 1.5 times the amount of Cellic (registered trademark) CTec2 is shown or higher than that, It has been shown that an enzyme composition containing the xylanase of the present invention is suitable for biomass saccharification.

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Abstract

　より効率的且つ経済的にバイオマスを糖化することができる方法の提供。キシラナーゼ活性を有する新規タンパク質又はそれを含む酵素組成物を用いた、バイオマスの糖化方法およびバイオマスからの糖の製造方法。

Description

キシラナーゼおよびそれを用いた糖の製造方法
　本発明は、新規キシラナーゼおよび該キシラナーゼを用いたバイオマスからの糖の製造方法に関する。
　セルロースを含有するバイオマス材料（以下、「バイオマス」ということがある）中のセルロースから糖を製造し、それを発酵法などでエタノールや乳酸などへ変換する技術は以前より知られている。さらに近年、環境問題への取り組みの観点から、バイオマスを資源として効率よく利用する技術の開発が注目されている。
　バイオマスは、セルロース繊維と、それを取り巻くキシランを主に含むヘミセルロースおよびリグニンから構成されている。バイオマスにおけるセルロースやヘミセルロースの糖化効率を高めるためには、セルロースやヘミセルロースを加水分解する酵素の開発が必要である。また、当該バイオマスからリグニンを除去することが必要である。
　バイオマスのセルラーゼによる糖化や、ヘミセルラーゼやリグニナーゼによるバイオマスの酵素分解は、従来から行われている。例えば、セルラーゼにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ由来のキシラナーゼやアラビノフラノシダーゼなどのヘミセルラーゼが添加された酵素組成物が開発されている（特許文献１）。また、バガス堆肥に存在する微生物群由来のキシラナーゼ活性を有するタンパク質、および当該タンパク質とセルラーゼとをバイオマス資源に反応させることによる糖の製造方法が知られている（特許文献２）。さらに、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）が製造販売しているキシラナーゼ含有酵素組成物（Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃなど）も知られている。
特表２０１１－５１５０８９号公報 特開２０１２－０２９６７８号公報
　本発明は、下記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物でバイオマスを糖化する工程を含む、バイオマスの糖化方法を提供する、
ここで、該タンパク質（Ａ）は、下記（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり、
該タンパク質（Ｂ）は、下記（ａ’）～（ｃ’）：
　（ａ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
　（ｂ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
　（ｃ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質である。
　また本発明は、上記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物でバイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法を提供する。
　また本発明は、上記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物の、バイオマス糖化のための使用を提供する。
　また本発明は、上記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物の、バイオマスからの糖の製造のための使用を提供する。
各種酵素組成物によるバイオマスからの生成糖量。Ａ：Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ含有酵素組成物、Ｂ：Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ含有酵素組成物。
　本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の配列同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　また、本明細書において、「１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」としては、１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、さらにより好ましくは１～１０個、なお好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。本明細書において、「１～複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」としては、１～１５０個、好ましくは１～１２０個、より好ましくは１～９０個、さらに好ましくは１～６０個、さらにより好ましくは１～３０個、なお好ましくは１～１５個、さらになお好ましくは１～１０個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列が挙げられる。
　本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するヘミセルロース成分を含むセルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材；ウッドチップなどの木材の加工物または粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉などの植物の茎、葉、果房など；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類；藻類などからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性および原料コストの観点から、木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独でまたは２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。
　本明細書において、「キシラナーゼ活性」とは、キシラン中のキシロースβ－１，４－グリコシド結合を加水分解する活性をいう。タンパク質のキシラナーゼ活性は、例えば、キシランを基質として当該タンパク質と反応させ、キシラン分解産物の生成量を測定することによって決定することができる。キシラナーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
　従来のヘミセルラーゼやキシラナーゼを用いたバイオマスの糖化方法は、糖化効率や単糖の生産性、または酵素コストの面で未だ満足できるものではなかった。さらに、従来のキシラナーゼは、至適ｐＨ領域が比較的狭く、そのため適用用途が制限される場合があった。本発明は、より効率的且つ経済的にバイオマスを糖化することができ、且つ広範囲のｐＨで作用でき汎用性に優れた新規キシラナーゼ、ならびに該キシラナーゼを用いたバイオマス糖化およびバイオマスからの糖の製造に関する。
　本発明者らは、広いｐＨ領域において高いキシラナーゼ活性を発揮し得る、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌およびＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属細菌由来の新規キシラナーゼを見出した。さらに本発明者らは、当該キシラナーゼを用いることによりバイオマスの糖化を効率よく行うことができることを見出した。
　本発明は、広いｐＨ領域において高いキシラナーゼ活性を有するキシラナーゼを提供する。当該キシラナーゼを使用することによって、従来市販されているキシラナーゼ含有酵素組成物などの公知のキシラナーゼまたはそれを含む組成物を使用する場合と比べて、より効率のよいバイオマスの糖化を実現することができる。したがって、本発明のキシラナーゼまたはそれを含む酵素組成物によれば、バイオマスから効率的且つ安価に糖を製造することができる。
（１．キシラナーゼ）
（１－１．Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ）
　本発明により提供されるキシラナーゼは、下記（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり得る。本明細書においては、便宜上、上記タンパク質をまとめて「本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ」と称することがある。
　本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ安定性の向上および糖化効率向上の観点から、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。また、本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼとしては、ｐＨ安定性の向上および糖化効率向上の観点から、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌（例えばＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ　ＤＳＭ１５８９４）由来キシラナーゼが好ましい例として挙げられる。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられ、例えば、上述した配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌由来キシラナーゼの天然または人工的に作製された変異体が挙げられる。当該変異体は、例えば、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌由来キシラナーゼをコードする遺伝子に対して、紫外線照射や部位特異的変異導入（Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のキシラナーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。
　本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、従来単離または精製されているキシラナーゼと異なるアミノ酸配列を有する。例えば、配列番号２で示される配列と最も配列同一性の高いアミノ酸配列を有する既知のキシラナーゼは、Ｘｙｌａｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｐａｃｈｎｏｄａｅ由来のキシラナーゼ（Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，６５（９）：４０９９－４１０７）であるが、配列番号２のキシラナーゼとの配列同一性は８１％である。
（１－２．Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ）
　あるいは、本発明により提供されるキシラナーゼは、下記（ａ’）～（ｃ’）：
　（ａ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
　（ｂ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；
　（ｃ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり得る。本明細書においては、便宜上、上記タンパク質をまとめて「本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ」と称することがある。
　本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ安定性の向上および糖化効率向上の観点から、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる。また、本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼとしては、ｐＨ安定性の向上および糖化効率向上の観点から、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属細菌（例えばＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ　ＡＴＣＣ４８４）由来キシラナーゼが好ましい例として挙げられる。
　配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質の例としては、配列番号１２で示されるアミノ酸配列において１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられ、例えば、上述した配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属細菌由来キシラナーゼの天然または人工的に作製された変異体が挙げられる。当該変異体は、例えば、上記配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属細菌由来キシラナーゼをコードする遺伝子に対して、紫外線照射や部位特異的変異導入（Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のキシラナーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。
　本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、従来単離または精製されているキシラナーゼと異なるアミノ酸配列を有する。例えば、配列番号１２で示される配列と最も配列同一性の高いアミノ酸配列を有する既知のキシラナーゼは、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ由来のキシラナーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０（４２）：３５１２６－３５）であるが、配列番号１２のキシラナーゼとの配列同一性は８８％である。
（１－３．酵素学的性質）
　好ましくは、本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼおよびＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、さらに以下の酵素学的性質を有する。
（i）最適反応ｐＨ
　本明細書において、「キシラナーゼ活性の最適反応ｐＨ」とは、５０℃においてキシランを分解したときの活性が最大となるｐＨを意味し、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定される。本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応ｐＨは、ｐＨ安定性の向上、他酵素とのカクテル化を容易にする観点から、ｐＨ５．５～８．５の範囲であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．０～８．０、さらに好ましくはｐＨ６．０～７．５、さらにより好ましくはｐＨ６．０～７．０である。また本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応ｐＨは、ｐＨ安定性の向上、他酵素とのカクテル化を容易にする観点から、ｐＨ５．５～９．５の範囲であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．０～９．０、さらに好ましくはｐＨ６．５～８．５、なお好ましくはｐＨ６．６～８．０である。
（ii）最大活性
　本明細書において、キシラナーゼの「最大活性」とは、５０℃における最適反応ｐＨにおけるキシラナーゼ活性をいう。本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼの最大活性は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１０００Ｕ／ｍｇタンパク質以上、より好ましくは１１００Ｕ／ｍｇタンパク質以上、さらに好ましくは１２００Ｕ／ｍｇタンパク質以上、さらに好ましくは１３００Ｕ／ｍｇタンパク質以上、さらに好ましくは１４００Ｕ／ｍｇタンパク質以上、さらに好ましくは１５００Ｕ／ｍｇタンパク質以上である。また本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼの最大活性は、糖化効率向上の観点から、好ましくは３５０Ｕ／ｍｇタンパク質以上、より好ましくは４００Ｕ／ｍｇタンパク質以上、さらに好ましくは４２０Ｕ／ｍｇタンパク質以上である。
（iii）ｐＨ依存性
　本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ安定性の向上および他酵素とのカクテル化を容易にする観点から、反応温度５０℃、ｐＨ７．０～９．０の範囲において最大活性の７０％以上であることが好ましく、より好ましくは７４％以上である。また、ｐＨ７．０～８．５の範囲において最大活性の７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上である。また本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼのキシラナーゼ活性は、ｐＨ安定性の向上および他酵素とのカクテル化を容易にする観点から、反応温度５０℃、ｐＨ６．０～９．０の範囲において最大活性の７０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、なお好ましくは９０％以上である。ここで、「最大活性」とは、反応温度５０℃での最適反応ｐＨにおけるキシラナーゼ活性をいう。
（iv）最適反応温度
　本明細書において、「キシラナーゼ活性における最適反応温度」とは、キシラナーゼ活性が最大となる温度を意味し、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定される。本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応温度は、好ましくは４０℃以上７０℃未満、より好ましくは４５～６５℃、さらに好ましくは５０～６５℃である。また本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼにおいて、キシラナーゼ活性の最適反応温度は、好ましくは４０℃以上７０℃未満、より好ましくは４５～６５℃、さらに好ましくは５０～６５℃、なお好ましくは５５～６５℃である。
（２．キシラナーゼの生産方法）
　上記本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼおよびＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ（以下、両者をまとめて「本発明のキシラナーゼ」ということがある）は、例えば、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを微生物に導入して得られた形質転換体により生産され得る。したがって、本発明はまた、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを含有する形質転換体を培養する工程を含む、キシラナーゼの生産方法を提供する。すなわち、当該形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有するベクター上にコードされた遺伝子が発現して、本発明のキシラナーゼが産生される。産生されたキシラナーゼを該培養物から単離または精製することにより、本発明のキシラナーゼを取得することができる。
　本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。あるいは、本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子、ならびに配列番号１で示される塩基配列において１～複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
　本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼをコードする遺伝子は、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌、例えばＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ（ＤＳＭ１５８９４）などから、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、当該遺伝子は、Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属細菌の全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。あるいは、当該遺伝子は、本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的または化学的に合成することができる。
　本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。あるいは、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子、ならびに配列番号１１で示される塩基配列において１～複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
　本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼをコードする遺伝子は、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属細菌、例えばＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ（ＡＴＣＣ４８４）などから、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、当該遺伝子は、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属細菌の全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１１の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。あるいは、当該遺伝子は、本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的または化学的に合成することができる。
　またあるいは、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子は、上記の手順で単離または合成された遺伝子の塩基配列に対して、上述した紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子は、配列番号１または配列番号１１で示される塩基配列に公知の方法で突然変異導入し、得られた塩基配列を発現させてキシラナーゼ活性を調べ、所望のキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択することによって、得ることができる。
　本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子を導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２（いずれもタカラバイオ株式会社製）などを好適に用いることができる。
　上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片、および複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。また上記ベクターにおいては、上記本発明のキシラナーゼをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、発現されたタンパクを細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、本発明のプラスミドが適切に導入された微生物を選択するための薬剤（アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなど）耐性遺伝子がさらに組み込まれていてもよい。上記制御配列の例としては、Ｓ２３７ｅｇｌプロモーターおよびシグナル配列（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，６４（１１）：２２８１－９）、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７８７５）およびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ－６４株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域および分泌シグナルペプチド領域が挙げられる。あるいは、当該制御領域としては、配列番号３で示される塩基配列の塩基番号１～６６２の塩基配列、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１～６９６の塩基配列、またはこれらの塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有し且つ転写開始制御機能、翻訳開始制御機能および分泌シグナルペプチドとしての機能を有する塩基配列が挙げられる。キシラナーゼ遺伝子と上記制御配列、薬剤耐性遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの方法によって行うことができる。プラスミドベクターへの遺伝子の導入手順は、当該分野で周知である。
　本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように当該遺伝子が配置されていることをいう。
　次いで、構築された上記ベクターを微生物に導入し、形質転換体を得る。導入のための微生物としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌などが挙げられるが、このうち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、例えば枯草菌またはその変異株（例えば、特開２００６－１７４７０７号公報に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸなど）が好ましい。導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株を薬剤耐性などを指標に選択することで、目的の形質転換体を得ることができる。
　斯くして得られた形質転換体を適切な培地で培養すれば、形質転換体が含有するベクター上にコードされた遺伝子が発現して、本発明のキシラナーゼが合成される。培養に使用する培地は、形質転換体の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。生成された目的のキシラナーゼを該培養物から通常の方法により単離または精製することにより、本発明のタンパク質を取得することができる。このとき、当該ベクター上でキシラナーゼ遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたキシラナーゼは菌体外に分泌されるため、より容易に回収され得る。回収されたキシラナーゼは、さらに公知の手段で精製されてもよい。
（３．バイオマス糖化用酵素組成物）
　上記本発明のキシラナーゼは、後述の実施例に示す通り、従来公知のキシラナーゼやキシラナーゼ含有酵素組成物と比較して、バイオマスを糖化する活性が顕著に高い。したがって、本発明のキシラナーゼは、バイオマス糖化のために好適に使用することができる。すなわち、本発明はまた、上記本発明のキシラナーゼを有効成分とするバイオマス糖化剤、および上記本発明のキシラナーゼを含むバイオマス糖化用酵素組成物を提供する。
　本発明の酵素組成物は、上述の本発明のキシラナーゼを含む。また、糖化効率の向上の観点から、本発明の酵素組成物は、さらにセルラーゼを含むことが好ましい。ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ－１，４－グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオハイドロラーゼ、およびβ－グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。本発明に使用されるセルラーゼとしては、市販のセルラーゼ含有酵素組成物や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼが挙げられ得る。本発明において、これらのセルラーゼは、単独で使用されても２種以上の組み合わせで使用されてもよい。糖化効率の向上の観点から、セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましい。
　セルラーゼの具体例としては、トリコデルマ　リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ；トリコデルマ　ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼ；バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－Ｎ１４５（ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７２７）、バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－Ｎ２５２（ＦＥＲＭ　Ｐ－１７４７４）、バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－Ｎ１１５（ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７２６）、バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－Ｎ４４０（ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７２８）、バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－Ｎ６５９（ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７３０）などの各種バチルス株由来のセルラーゼ；パイロコッカス　ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の耐熱性セルラーゼ；フミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼ、などが挙げられる。これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ　リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ　ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、またはフミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼが好ましい。上記セルラーゼを含む酵素組成物の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ－６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＴＭＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、およびウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）が挙げられる。このうち、糖化効率の向上の観点、製造コスト低減の観点、入手性の観点などから、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅＴＭＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）が好ましく、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２がより好ましい。
　また、セルラーゼの１種であるβ－グルコシダーゼの具体例としては、アスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のβ－グルコシダーゼ（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８やメガザイム社製β－グルコシダーゼ）、およびトリコデルマ　リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム　エメルソニイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のβ－グルコシダーゼなどが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、ノボザイム１８８、トリコデルマ　リーゼ由来のβ－グルコシダーゼが好ましく、トリコデルマ　リーゼ由来のβ－グルコシダーゼがより好ましい。
　また、セルラーゼの１種であるエンドグルカナーゼの具体例としては、トリコデルマ　リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、アクレモニウム　セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｒｉｔｉｃｕｓ）、フミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、クロストリジウム　サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）由来の酵素などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、トリコデルマ　リーゼ、フミコーラ　インソレンス、バチルス、またはセルロモナス由来のエンドグルカナーゼが好ましく、トリコデルマ　リーゼ由来のエンドグルカナーゼがより好ましい。
　また、本発明の酵素組成物は、上記本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼを含有していてもよい。ここで、ヘミセルラーゼとは、へミセルロースを加水分解する酵素を指し、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼなどと称される酵素の総称である。本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの具体例としては、トリコデルマ　リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）由来のヘミセルラーゼ；バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－Ｎ５４６（ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７２９）由来のキシナラーゼ；アスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ　ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、フミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、またはバチルス　アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）由来のキシラナーゼ；サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、カルドセラム（Ｃａｌｄｏｃｅｌｌｕｍ）、またはサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属由来のキシラナーゼ、バチルス　プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）由来のβ―キシロシダーゼ、セレノモナス　ルミナンティウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）由来β―キシロシダーゼが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、本発明の酵素組成物は、バチルス　エスピー、アスペルギルス　ニガー、トリコデルマ　ビリデもしくはストレプトマイセス由来のキシラナーゼ、またはセレノモナス　ルミナンティウム由来のβ－キシロシダーゼを含有することが好ましく、バチルス　エスピーもしくはトリコデルマ　ビリデ由来のキシナラーゼ、またはセレノモナス　ルミナンティウム由来のβ－キシロシダーゼを含有することがより好ましい。
　本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記本発明のキシラナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．５～７０質量％、より好ましくは１～５０質量％さらに好ましくは２～４０質量％、さらにより好ましくは２～３０質量％である。
　また、本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記セルラーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１０～９９質量％、より好ましくは３０～９５質量％、さらに好ましくは５０～９５質量％である。
　また、本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記エンドグルカナーゼの含有量は、糖化効率向上の観点から、好ましくは１～７０質量％、より好ましくは５～５０質量％、さらに好ましくは１０～４０質量％である。また、本発明の酵素組成物の総タンパク質量中における、上記本発明のキシラナーゼ以外のヘミセルラーゼの含有量としては、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０１～３０質量％、より好ましくは０．１～２０質量％、さらに好ましくは０．５～２０質量％である。
　本発明の酵素組成物における、本発明のキシラナーゼと上記セルラーゼのタンパク質量比（本発明のキシラナーゼ／セルラーゼ）は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０１～１００、より好ましくは０．０５～５、さらに好ましくは０．０５～１、よりさらに好ましくは０．０５～０．５である。
　本発明の酵素組成物における、本発明のキシラナーゼと上記エンドグルカナーゼのタンパク質量比（本発明のキシラナーゼ／エンドグルカナーゼ）は、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．０５～１０、より好ましくは０．１～５、さらに好ましくは０．１～２、よりさらに好ましくは０．２～１である。
　本発明のキシラナーゼおよび酵素組成物は、バイオマス糖化用として、後述する本発明の糖の製造方法に好適に用いられる。バイオマスについては、前述したとおりである。本発明のキシラナーゼおよび酵素組成物の糖化効果をより効果的に発現させる観点から、バイオマスは、木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独でまたは２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。
（４．糖の製造方法）
　本発明の糖の製造方法は、バイオマスを、上記本発明のキシラナーゼまたは酵素組成物で糖化する工程を含む。本発明の糖の製造方法により、バイオマスの糖化効率が顕著に向上する。糖化効率が向上する理由は明らかではないが、本発明のキシラナーゼまたは酵素組成物を用いることにより、バイオマス中のヘミセルロースが効率的に分解されて、酵素がセルロースに接触しやすい状態となり、全体として糖化効率が向上するためであると推測される。
　本発明の糖の製造方法におけるバイオマスについては、前述したとおりである。入手容易性および原料コストの観点、糖化効率向上の観点から、バイオマスは、木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。上記バイオマスは、単独でまたは２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。
　本発明の糖の製造方法は、粉砕効率向上、糖化効率向上、および生産効率向上（生産時間の短縮）の観点から、バイオマスを本発明のキシラナーゼまたは酵素組成物で糖化する工程の前に、当該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。
　前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理および水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。本発明のキシラナーゼはアルカリ領域においても高い酵素活性を有するため、当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行うことがより好ましい。
　本発明の糖の製造方法において、アルカリ処理とは、バイオマスを、後述する塩基性化合物と反応させることをいう。アルカリ処理の方法としては、バイオマスを、後述する塩基性化合物を含むアルカリ溶液に浸漬する方法（以下、「浸漬処理」ということがある）や、バイオマスと塩基性化合物とを混合して、後述する粉砕処理にかける方法（以下、「アルカリ混合粉砕処理」ということがある）などが挙げられる。
　アルカリ処理に用いられる塩基性化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属水酸化物、酸化ナトリウム、酸化カリウムなどのアルカリ金属酸化物、酸化マグネシウム、酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属酸化物、硫化ナトリウム、硫化カリウムなどのアルカリ金属硫化物、硫化マグネシウム、硫化カルシウムなどのアルカリ土類金属硫化物などが挙げられる。これらのうち、製造コストの低減、糖化効率向上の観点から、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物を用いることが好ましく、アルカリ金属水酸化物を用いることがより好ましく、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを用いることがさらに好ましい。これらの塩基性化合物は、単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　浸漬処理におけるアルカリ溶液中の塩基性化合物の濃度は、糖化効率を高める観点、およびグルコースの生成量を高める観点から、好ましくは０．１～６０質量％、より好ましくは０．１～５０質量％、さらに好ましくは０．１～４０質量％である。浸漬処理におけるアルカリ溶液の使用量は、バイオマスの乾燥質量に対して、好ましくは５０～９９質量％、より好ましくは６０～９９質量％、さらに好ましくは８０～９９質量％である。浸漬処理の処理時間としては、好ましくは０．５～５０時間、より好ましくは１～２４時間、さらに好ましくは１．５～１０時間である。
　本発明の糖の製造方法において、粉砕処理とは、バイオマスを機械的に粉砕して小粒子化することをいう。バイオマスを小粒子化することにより、糖化効率がより向上する。また、粉砕処理により、バイオマスに含まれるセルロースの結晶構造が破壊されると、糖化効率がなお向上する。粉砕処理は公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、バイオマスを小粒子化することができる装置であればよい。
　粉砕機の具体例としては、高圧圧縮ロールミルや、ロール回転ミルなどのロールミル；リングローラーミル、ローラーレースミルまたはボールレースミルなどの竪型ローラーミル；転動ボールミル、振動ボールミル、振動ロッドミル、振動チューブミル、遊星ボールミルまたは遠心流動化ミルなどの容器駆動式媒体ミル；塔式粉砕機、攪拌槽式ミル、流通槽式ミルまたはアニュラー式ミルなどの媒体攪拌式ミル；高速遠心ローラーミルやオングミルなどの圧密せん断ミル；乳鉢；石臼；マスコロイダー；フレットミル；エッジランナーミル；ナイフミル；ピンミル；カッターミル、などが挙げられる。これらの中では、バイオマスの粉砕効率向上、セルロースの結晶化度低減および生産性の観点から、容器駆動式媒体ミルおよび媒体攪拌式ミルが好ましく、容器駆動式媒体ミルがより好ましく、振動ボールミル、振動ロッドミルまたは振動チューブミルなどの振動ミルがさらに好ましく、振動ロッドミルがさらにより好ましい。粉砕方法としては、バッチ式および連続式のどちらでもよい。
　粉砕時間は、粉砕後のバイオマスが所望のサイズにサイズ低減されるよう適宜調整すればよい。粉砕時間は、用いる粉砕機や使用するエネルギー量などによって変わり得るが、通常１分～１２時間であり、バイオマスの粒子径の低下の観点、セルロースの結晶化度低減の観点、およびエネルギーコストの観点から、２分間～６時間が好ましく、５分間～３時間がより好ましく、５分間～２時間がさらに好ましい。
　粉砕処理は、上述した塩基性化合物によるアルカリ処理と組み合わせてもよい。粉砕処理は、アルカリ処理の前または後に行ってもよく、あるいは、粉砕処理と並行してアルカリ処理を行ってもよい。例えば、上述したアルカリ溶液に浸漬したバイオマスを粉砕処理にかけてもよく（湿式粉砕）、または固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけてもよいが（乾式粉砕）、このうち、乾式粉砕が好ましい。粉砕処理において塩基性化合物を用いる場合、その量は、糖化効率を向上する観点、セルロースの結晶化度を低減する観点、およびバイオマス中のリグニンを除去する観点から、バイオマス中のホロセルロースをすべてセルロースとして仮定した場合に、該セルロースを構成するアンヒドログルコース単位（以下「ＡＧＵ」と称する場合がある）１モルあたり０．０１～１０倍モルであることが好ましく、０．０５～８倍モルであることがより好ましく、０．１～５倍モルであることがさらに好ましく、０．１～１．５倍モルであることがなお好ましい。
　粉砕処理後に得られるバイオマスの平均粒子径は、糖化効率向上、およびセルロースの結晶化度低減の観点から、好ましくは１～１５０μｍ、より好ましくは５～１００μｍである。ここで、バイオマスの平均粒子径は、実施例に記載の方法により測定することができる。
　本発明の糖の製造方法において、水熱処理とは、バイオマスを、水分の存在下で加熱処理することをいう。水熱処理は、公知の反応装置を用いて行うことができ、用いられる反応装置に特に制限はない。好ましくは、水熱処理では、バイオマスの粗粉砕物を、水に分散した水スラリーの状態とし、これを加熱処理する。水スラリー中のバイオマスの含有量は、スラリーの流動性向上の観点から、好ましくは１～５００ｇ／Ｌ、より好ましくは５～４００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは８～３００ｇ／Ｌである。
　水熱処理は、生産効率の向上および糖化効率の向上の観点から、酸性条件下で行うことが好ましい。ｐＨ条件は、生産効率の向上、糖化効率の向上およびリグニンの変性抑制の観点から、ｐＨ３～７が好ましく、ｐＨ４～６がより好ましい。ｐＨ条件は、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸などの有機酸を用いることにより適宜調整することができる。水熱処理の条件としては、温度１００～４００℃および圧力０．１～４ＭＰａが好ましく、温度１４０～２００℃および圧力０．５～１ＭＰａがより好ましい。処理時間は、０．１～３時間が好ましい。水熱処理方法としては、バッチ式および連続式のどちらでもよい。なお、水熱処理で得られたバイオマスは、湿潤状態のものでもよく、またはさらに乾燥処理にかけられてもよいが、糖化効率向上の観点から、湿潤状態のものが好ましい。
　本発明の糖の製造方法は、バイオマス、好ましくは上記前処理されたバイオマスを、本発明のキシラナーゼまたは酵素組成物で糖化する工程（以下、「糖化処理」ということがある）を含む。糖化処理に用いるキシラナーゼまたは酵素組成物については、前述したとおりである。
　糖化処理の条件は、本発明のキシラナーゼおよび同時に配合するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が決定できる。
　糖化処理においては、上記バイオマスを含む懸濁液に上記キシラナーゼまたは酵素組成物を添加することが好ましい。懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率向上および生産性（生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５～２０質量％、より好ましくは３～１５質量％、さらに好ましくは５～１０質量％である。
　上記懸濁液に対するキシラナーゼまたは酵素組成物の使用量は、前処理条件、配合される酵素の種類および性質により適宜決定されるが、バイオマス質量に対して、好ましくは０．０４～６００質量％、より好ましくは、より好ましくは０．１～１００質量％、さらに好ましくは０．１～５０質量％である。
　糖化処理時の反応ｐＨとしては、糖化効率の向上、生産性（生産時間の短縮）向上、および生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ４～９、より好ましくはｐＨ５～８、さらに好ましくはｐＨ５～７である。
　糖化処理時の反応温度は、糖化効率の向上、生産性（生産時間の短縮）向上、および生産コスト低減の観点から、２０～９０℃が好ましく、より好ましくは２５～８５℃、さらに好ましくは３０～８０℃、さらにより好ましくは４０～７５℃、なお好ましくは４５～６５℃、さらになお好ましくは５０～６５℃、よりさらになお好ましくは５０～６０℃である。糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類もしくは量、酵素量などに合わせて適宜設定することができるが、糖化効率の向上、生産性（生産時間の短縮）向上、および生産コスト低減の観点から、好ましくは１～５日間、より好ましくは１～４日間、さらに好ましくは１～３日間である。
　本発明の例示的実施形態として、以下の組成物、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞下記（ａ）～（ｃ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有する、単離または精製されたタンパク質：
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個、好ましくは１～５０個、より好ましくは１～４０個、さらに好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～２０個、なお好ましくは１～１０個、さらになお好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
＜２＞上記キシラナーゼ活性が、ｐＨ７．０～９．０の範囲において、最大活性に対して好ましくは７０％以上、より好ましくは７４％以上であり、ｐＨ７．０～８．５の範囲において、最大活性に対して好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上である、上記＜１＞記載のタンパク質。
＜３＞最適反応ｐＨが、好ましくはｐＨ５．５～８．５の範囲、より好ましくはｐＨ６．０～８．０の範囲、さらに好ましくはｐＨ６．０～７．５の範囲、さらにより好ましくはｐＨ６．０～７．０の範囲である、上記＜１＞または＜２＞記載のタンパク質。
＜４＞好ましくは下記（ｄ）～（ｆ）から選ばれる遺伝子にコードされる、上記＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載のタンパク質：
　（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子；
　（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；および、
　（ｆ）配列番号１で示される塩基配列において１～複数個、好ましくは１～１５０個、より好ましくは１～１２０個、さらに好ましくは１～９０個、さらにより好ましくは１～６０個、なお好ましくは１～３０個、さらになお好ましくは１～１５個、さらによりなお好ましくは１～１０個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子。
＜５＞好ましくは上記遺伝子がＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属由来の遺伝子である、上記＜４＞記載のタンパク質。
＜６＞下記（ａ’）～（ｃ’）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有する、単離または精製されたタンパク質：
　（ａ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
　（ｂ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
　（ｃ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、さらにより好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
＜７＞ｐＨ６．０～９．０の範囲における上記キシラナーゼ活性が、最大活性に対して、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上である、上記＜６＞記載のタンパク質。
＜８＞最適反応ｐＨが、好ましくはｐＨ５．５～９．５の範囲、より好ましくはｐＨ６．０～９．０の範囲、さらに好ましくはｐＨ６．５～８．５の範囲、さらにより好ましくはｐＨ６．６～８．０の範囲である、上記＜６＞または＜７＞記載のタンパク質。
＜９＞好ましくは下記（ｄ’）～（ｆ’）から選ばれる遺伝子にコードされる、上記＜６＞～＜８＞のいずれか１に記載のタンパク質：
　（ｄ’）配列番号１１で示される塩基配列からなる遺伝子；
　（ｅ’）配列番号１１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；および、
　（ｆ’）配列番号１１で示される塩基配列において１～複数個、好ましくは１～９０個、より好ましくは１～６０個、さらに好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～１５個、なお好ましくは１～１０個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子。
＜１０＞好ましくは上記遺伝子がＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属由来の遺伝子である、上記＜９＞記載のタンパク質。
＜１１＞好ましくは上記遺伝子を含むベクターを微生物に導入して得られた形質転換体により生産される、上記＜４＞、＜５＞、＜９＞および＜１０＞のいずれか１に記載のタンパク質。
＜１２＞上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質を含む、バイオマス糖化用酵素組成物。
＜１３＞上記＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載のタンパク質と、上記＜６＞～＜１０＞のいずれか１に記載のタンパク質とを含む、バイオマス糖化用酵素組成物。
＜１４＞上記酵素組成物の総タンパク質量中における、上記＜１＞～＜１１＞に記載のタンパク質の含有量が、好ましくは０．５～７０質量％、より好ましくは１～５０質量％、さらに好ましくは２～４０質量％、さらにより好ましくは２～３０質量％である、上記＜１２＞または＜１３＞記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜１５＞好ましくはセルラーゼをさらに含む、上記＜１２＞～＜１４＞のいずれか１に記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜１６＞好ましくは上記セルラーゼがエンドグルカナーゼを含む、上記＜１５＞記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜１７＞上記酵素組成物の総タンパク質量中における、上記エンドグルカナーゼの含有量が、好ましくは１～７０質量％、より好ましくは５～５０質量％、さらに好ましくは１０～４０質量％である、上記＜１６＞記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜１８＞上記＜１＞～＜１１＞に記載のタンパク質と上記セルラーゼとのタンパク質量比（該タンパク質／該セルラーゼ）が、好ましくは０．０１～１００、より好ましくは０．０５～５、さらに好ましくは０．０５～１、さらにより好ましくは０．０５～０．５である、上記＜１５＞～＜１７＞のいずれか１に記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜１９＞上記＜１＞～＜１１＞に記載のタンパク質と上記エンドグルカナーゼのタンパク質量比（該タンパク質／該エンドグルカナーゼ）が、好ましくは０．０５～１０、より好ましくは０．１～５、さらに好ましくは０．１～２、さらにより好ましくは０．２～１である、上記＜１６＞～＜１８＞のいずれか１に記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜２０＞上記バイオマスが、好ましくは木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉、パーム空果房（ＥＦＢ）、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる１種以上、より好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる１種以上、さらに好ましくは、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）からなる群より選ばれる１種以上、さらにより好ましくはバガスである、上記＜１２＞～＜１９＞のいずれか１に記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜２１＞上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質でバイオマスを糖化する工程を含む、バイオマスの糖化方法。
＜２２＞上記＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載のタンパク質と、上記＜６＞～＜１０＞のいずれか１に記載のタンパク質とでバイオマスを糖化する工程を含む、バイオマスの糖化方法。
＜２３＞上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質でバイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
＜２４＞上記＜１２＞～＜２０＞のいずれか１に記載の酵素組成物でバイオマスを糖化する工程を含む、バイオマスの糖化方法。
＜２５＞上記＜１２＞～＜２０＞のいずれか１に記載の酵素組成物でバイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
＜２６＞好ましくは上記バイオマスを前処理する工程をさらに含み、該前処理が、好ましくはアルカリ処理、粉砕処理および水熱処理からなる群より選ばれる１種以上、より好ましくは、アルカリ処理および粉砕処理からなる群より選ばれる１種以上、さらに好ましくは、アルカリ処理および粉砕処理、さらにより好ましくは、アルカリ処理と粉砕処理を同時に行う処理である、上記＜２１＞～＜２５＞のいずれか１に記載の方法。
＜２７＞上記アルカリ処理に用いられる塩基性化合物が、好ましくはアルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属酸化物、アルカリ土類金属酸化物、アルカリ金属硫化物、およびアルカリ土類金属硫化物からなる群より選ばれる１種以上、より好ましくはアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物、さらに好ましくはアルカリ金属水酸化物、さらにより好ましくは水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、上記＜２６＞記載の方法。
＜２８＞上記粉砕処理における粉砕時間が、好ましくは１分～１２時間、より好ましくは２分間～６時間、さらに好ましくは５分間～３時間、さらにより好ましくは５分間～２時間である、上記＜２６＞または＜２７＞記載の方法。
＜２９＞上記粉砕処理後に得られるバイオマスの平均粒子径が、好ましくは１～１５０μｍ、より好ましくは５～１００μｍである、上記＜２６＞～＜２８＞のいずれか１に記載の方法。
＜３０＞好ましくは、上記バイオマスを含む懸濁液に上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質または上記＜１２＞～＜１９＞のいずれか１に記載の酵素組成物を添加することを含む、上記＜２１＞～＜２９＞のいずれか１に記載の方法。
＜３１＞上記懸濁液中の上記バイオマスの含有量が、好ましくは０．５～２０質量％、より好ましくは３～１５質量％、さらに好ましくは５～１０質量％である、上記＜３０＞記載の方法。
＜３２＞上記懸濁液に対する上記タンパク質または上記酵素組成物の使用量が、上記バイオマスの質量に対して、好ましくは０．０４～６００質量％、より好ましくは０．１～１００質量％、さらに好ましくは０．１～５０質量％である、上記＜３０＞または＜３１＞に記載の方法。
＜３３＞上記糖化工程での反応ｐＨが、好ましくはｐＨ４～９、より好ましくはｐＨ５～８、さらに好ましくはｐＨ５～７である、上記＜２１＞～＜３２＞のいずれか１に記載の方法。
＜３４＞上記糖化工程での反応温度が、好ましくは２０～９０℃、より好ましくは２５～８５℃、さらに好ましくは３０～８０℃、さらにより好ましくは４０～７５℃、なお好ましくは４５～６５℃、さらになお好ましくは５０～６５℃、さらになお好ましくは５０～６０℃である、上記＜２１＞～＜３３＞のいずれか１に記載の方法。
＜３５＞上記バイオマスが、好ましくは木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉、パーム空果房（ＥＦＢ）、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる１種以上、より好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる１種以上、さらに好ましくは、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）からなる群より選ばれる１種以上、さらにより好ましくはバガスである、上記＜２１＞～＜３４＞のいずれか１に記載の方法。
＜３６＞上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質の、バイオマス糖化のための使用。
＜３７＞上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質の、バイオマスからの糖の製造のための使用。
＜３８＞上記＜１２＞～＜２０＞のいずれか１に記載の酵素組成物の、バイオマス糖化のための使用。
＜３９＞上記＜１２＞～＜２０＞のいずれか１に記載の酵素組成物の、バイオマスからの糖の製造のための使用。
＜４０＞上記バイオマスが、好ましくは木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉、パーム空果房（ＥＦＢ）、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる１種以上、より好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる１種以上、さらに好ましくは、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）からなる群より選ばれる１種以上、さらにより好ましくはバガスである、上記＜３６＞～＜３９＞のいずれか１に記載の使用。
＜４１＞バイオマス糖化に使用するための、上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質。
＜４２＞バイオマスからの糖の製造に使用するための、上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１に記載のタンパク質。
＜４３＞バイオマス糖化に使用するための、上記＜１２＞～＜２０＞のいずれか１に記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜４４＞バイオマスからの糖の製造に使用するための、上記＜１２＞～＜２０＞のいずれか１に記載のバイオマス糖化用酵素組成物。
＜４５＞上記バイオマスが、好ましくは木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉、パーム空果房（ＥＦＢ）、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる１種以上、より好ましくは木材、木材の加工物または粉砕物、植物の茎、葉、および果房からなる群より選ばれる１種以上、さらに好ましくは、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）からなる群より選ばれる１種以上、さらにより好ましくはバガスである、上記＜４１＞～＜４４＞のいずれか１に記載のタンパク質または酵素組成物。
　以下の実施例において、「％」は特に断りのない場合、「質量％」を意味する。
＜参考例１＞　ＰＣＲ反応
　以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においては、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　２７２０サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、およびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘを２５μＬ添加して、反応液総量を５０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９８℃で１０秒間、５７℃で３０秒間および７２℃で１０～５０秒間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１０秒）の３段階の温度変化を３０回繰り返すことにより行った。
＜参考例２＞　タンパク質の定量
　タンパク質の定量には、特に断りのない場合、プロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線をもとに計算した。
＜参考例３＞　キシラナーゼ活性の測定
（１）最適反応ｐＨ
　２．０％（ｗ／ｖ）キシラン（キシラン　ｆｒｏｍ　ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μＬと、２５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．４、５．０、もしくは５．６）、２５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．２、６．６、７．０、もしくは７．４）、２５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．８、８．２、８．６、もしくは９．０）、または２５０ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．４、９．８、もしくは１０．０）４０μＬとを混合して、ｐＨの異なる基質溶液９０μＬを調製した。適当な濃度に希釈したキシラナーゼ溶液を基質溶液に添加し、５０℃で１０分間反応させた。
　反応後、反応液にＤＮＳ溶液（水酸化ナトリウム（和光純薬工業）１．６％（ｗ／ｖ）、ジニトロサリチル酸（和光純薬工業）０．５％（ｗ／ｖ）、酒石酸ナトリウムカリウム（和光純薬工業）３０．０％（ｗ／ｖ））を１００μＬ添加して、１００℃にて５分間反応させ酵素反応を停止させた。基質溶液９０μＬにＤＮＳ溶液を１００μＬ添加後、上述のキシラナーゼ溶液１０μＬを加えて同様の操作を行ったものをブランクとした。反応液を冷却後、５４０ｎｍの吸光度を吸光マイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘ（モレキュラーデバイスジャパン）で測定した。
（２）最適反応温度
　２．０％（ｗ／ｖ）キシラン（キシラン　ｆｒｏｍ　ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μＬと、ｐＨ６．０の２５０ｍＭリン酸－クエン酸バッファー４０μＬとを混合して基質溶液９０μＬを調製した。基質溶液に適当な濃度に希釈したキシラナーゼ溶液（１０μＬ）を添加し、Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて４５～７０℃（５℃刻み）で１０分間反応させた。その後、ＤＮＳ溶液を１００μＬ添加し、１００℃にて５分間反応させて酵素反応を停止させた。反応液を冷却後、５４０ｎｍの吸光度を吸光マイクロプレートリーダーにて測定した。なお、既知濃度のキシロース溶液で作成した検量線をもとに反応液中のキシロオリゴ糖量を算出した。
＜参考例４＞　セルロース含有原料の調製
（１）セルロース含有原料中のホロセルロース含有量の算出
　粉砕したセルロース含有原料を、エタノール－ジクロロエタン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５ｇに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇおよび酢酸０．２ｍＬを添加し、７０～８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を添加して加温する操作を、試料が白く脱色するまで３～４回繰り返し行った。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ－３）でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣質量を求めた。下記式によりホロセルロース含有量を算出し、これをセルロース含有量とした。
　　セルロース含有量（質量％）＝［残渣質量（ｇ）／セルロース含有原料の採取量（ｇ：塩基性化合物を除いた乾燥原料換算）］×１００
（２）アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）モル数の算出
　ＡＧＵモル数は、セルロース含有原料中のホロセルロースをすべてセルロースと仮定して、以下の式に基づき算出した。
　　　ＡＧＵモル数＝ホロセルロース質量（ｇ）／１６２
（３）セルロース含有原料の水分量の測定
　セルロース含有原料の水分量の測定には、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、製品名「ＦＤ－６１０」）を使用した。１５０℃にて測定を行い、３０秒間の質量変化率が０．１％以下となる点を測定の終点とした。測定された水分量の値を、セルロース含有原料の乾燥質量に対する質量％に換算した。
（４）粉砕処理物の平均粒子径の測定
　粉砕処理物の平均粒子径は、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置「ＬＡ－９５０」（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。測定試料として粉砕処理物０．１ｇを５ｍＬの水に加え、超音波で１分間処理した試料分散液を用いた。体積基準のメジアン径を、温度２５℃にて測定し、これを平均粒子径とした。
＜実施例１＞　Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼの調製
（ゲノムＤＮＡの抽出）
　Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ　ＤＳＭ１５８９４株をＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ　Ａｇａｒ培地（３．０％Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ、２．０％Ａｇａｒ）に植菌し、２８℃にて１日間培養した。培養して得られた菌体から、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｏ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．製）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
（ベクターの作製）
　得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示したフォワードプライマー１（配列番号５）とリバースプライマー１（配列番号６）を用いて、ゲノム上のキシラナーゼ遺伝子領域（配列番号１）約１．０ｋｂｐ断片（Ａ）を増幅した。
　シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のＢａｍＨＩ制限酵素切断点に、バチルス属細菌ＫＳＭ－Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７８７５）由来のＳ２３７アルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００－２１００８１号公報参照）（配列番号３）をコードするＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７を鋳型とし、表１に示したフォワードプライマー２（配列番号７）とリバースプライマー２（配列番号８）を用いてＳ２３７アルカリセルラーゼ構造遺伝子を除く約５．６ｋｂｐ断片（Ｂ）を増幅した。増幅した遺伝子断片をＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ製）にて精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　精製されたＤＮＡ断片（Ａ）１μＬとＤＮＡ断片（Ｂ）１μＬ、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）に含まれる５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｒｅｍｉ×２μＬ、ＤＮａｓｅフリーの水６μＬを混合し、５０℃で１５分反応させ、キシラナーゼ遺伝子の断片をベクターにクローニングした。その後、反応液２μＬを用いて、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（タカラバイオ）２０μＬを形質転換した。形質転換体の再生培地には、５０ｐｐｍアンピシリンナトリウム（和光純薬工業）、２．０％アガー（和光純薬工業）を含むＬＢ寒天培地を用いた。アンピシリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する菌株を選別した。選別した形質転換体は同様のＬＢ寒天培地を用いて培養後（３７℃、１日間）、得られた菌体からプラスミドをＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて回収、精製した。
（形質転換体の作製）
　プラスミドの宿主菌への導入はプロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１－１１５）に従って行った。この際、宿主菌にはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株プロテアーゼ９重欠損株（ＫＡ８ＡＸ）（特開２００６－１７４７０７号公報）を用いた。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン含有ＤＭ３再生寒天培地（ｘｙｌａｎ　ｆｒｏｍ　ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１．０％（ｗ／ｖ）、バクトカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５％（ｗ／ｖ）、Ｌ－トリプトファン（和光純薬工業）０．０１％（ｗ／ｖ）、コハク酸二ナトリウム六水和物（和光純薬工業）８．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二カリウム（和光純薬工業）０．３５％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム（和光純薬工業）０．１５％（ｗ／ｖ）、グルコース（和光純薬工業）０．５％（ｗ／ｖ）、塩化マグネシウム（和光純薬工業）２０ｍＭ、牛血清アルブミン（和光純薬工業）０．０１％（ｗ／ｖ）、トリパンブルー０．０１％（ｗ／ｖ）（ＡＣＲＯＳ　ＯＲＧＡＮＩＣＳ）、テトラサイクリン塩酸塩（和光純薬工業）０．００５％（ｗ／ｖ）、寒天１．０％（ｗ／ｖ））を用いた。
（キシラナーゼ生産）
　ＤＭ３再生寒天培地上に生育した形質転換体１５ｐｐｍをテトラサイクリン含有ＬＢ培地５ｍＬを用いてシード培養後（３０℃、２５０ｒｐｍ、１６時間）、シード培養液０．６ｍＬを２×Ｌ　Ｍａｌ培地２０ｍＬ（バクトトリプトン２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１．０％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム１．０％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン五水和物（和光純薬工業）７５ｐｐｍ、マルトース一水和物（和光純薬工業）７．５％（ｗ／ｖ）、テトラサイクリン塩酸塩１５ｐｐｍ）に添加し、メイン培養を行った（３０℃、２３０ｒｐｍ、３日間）。培養後、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により培養上清を得た。培養上清３ｍＬを脱塩カラムＥｃｏｎｏ－Ｐａｃ　１０ＤＧ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５へとバッファー交換を行うことで、組換えＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ粗酵素液を調製した。
＜実施例２＞　Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼの調製
　Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ　ＡＴＣＣ４８４株をＧｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ（１．０％Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．２％Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃にて１日間培養した。培養して得られた菌体から、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｏ　Ｂｉｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
　得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示したフォワードプライマー３（配列番号９）とリバースプライマー３（配列番号１０）を用いて、ゲノム上のキシラナーゼ遺伝子領域（配列番号１１）約１．４ｋｂｐ断片（Ａ’）を増幅した。
　実施例１と同様の手順で、上記ＤＮＡ断片（Ａ’）および実施例１で作製したＤＮＡ断片（Ｂ）をベクターにクローニングし、このベクターを用いてコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体から目的の遺伝子が挿入されたプラスミドを回収した。回収したプラスミドをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株プロテアーゼ９重欠損株（ＫＡ８ＡＸ）（特開２００６－１７４７０７号公報）に導入し、テトラサイクリン含有ＤＭ３再生寒天培地で培養した。培地上に生育した形質転換体を実施例１と同様の手順で培養して、組換えＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼ粗酵素液を調製した。
＜試験例１＞
（キシラナーゼ活性および最適反応ｐＨ）
　適当な濃度に希釈した実施例１もしくは実施例２で調製したキシラナーゼ溶液（１０μＬ）または対照キシラナーゼＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ　Ａ／Ｓ）を基質溶液に添加し、前述の参考例３（１）の条件で反応させ、キシラナーゼ活性を測定した。
　既知濃度のキシロース溶液で作成した検量線をもとに、反応液中のキシロオリゴ糖量を算出し、その値から、基質液由来のバックグラウンドの値（ブランク）を差し引いた値を、酵素反応での生成糖量とした。その後、生成糖量から各希釈酵素溶液のキシラナーゼ活性（ｕｎｉｔ）を計算した。１ｕｎｉｔ（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌのＤ－キシロース相当の還元糖を遊離する酵素の活性とした。結果を表２および表３に示す。表２～３中、最大活性に対する相対活性（％）とは、最大活性を得たｐＨ（表２；ｐＨ６．６、表３；ｐＨ７．０）での活性を１００％としたときの相対活性を示し、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃに対する相対活性（％）とは、各ｐＨにおけるＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃの比活性を１００％としたときの相対活性を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１で調製した本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ６．６で最大活性を示し、その際の比活性は約１７１７Ｕ／ｍｇであった。また、当該キシラナーゼは、ｐＨ５．０以上において市販キシラナーゼより高い比活性を示した。さらに、当該キシラナーゼは、ｐＨ７．０～９．０の間で１２００Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、最大活性の７０％以上の活性を維持していた。実施例２で調製した本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ７．０で最大活性を示し、その際の比活性は約４８５Ｕ／ｍｇであった。当該キシラナーゼはまた、ｐＨ５．６～９．０の間で３５０Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、最大活性の７０％以上の活性を維持していた。これらの結果より、当該キシラナーゼが広い範囲のｐＨで高いキシラナーゼ活性を有し、特にアルカリ領域においても高い活性を有することが示された。
＜試験例２＞
（最適反応温度）
　基質溶液に適当な濃度に希釈した実施例１もしくは実施例２で調製したキシラナーゼ溶液（１０μＬ）を添加し、前述の参考例３（２）の測定条件でキシラナーゼ活性を測定した。既知濃度のキシロース溶液で作成した検量線をもとに反応液中のキシロオリゴ糖量を算出した。算出した値からブランクの値を差し引いて、酵素反応で生成されたキシロオリゴ糖量を算出した。最大の生成糖量を示したサンプルを１００％とした際の各温度での生成糖量を相対活性として求めた。結果を表４に示す。本発明のキシラナーゼは、６０℃付近で最もキシラン分解活性が高く、４５～６５℃の範囲で６０℃での活性の６０％以上の活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実施例３＞　キシラナーゼによるバイオマスの糖化
（バイオマスの調製）
　基質として使用するバガス粉砕物は以下のように調製した。
　バガス（サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量７．０質量％）を減圧乾燥機ＶＯ－３２０（アドバンテック東洋）中に入れ、窒素流通下の条件で２時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量７１．３ｗｔ％、結晶化度２９％、水分量２．０ｗｔ％の乾燥バガスを得た。
（混合粉砕処理）
　得られた乾燥バガス１００ｇと粒径０．７ｍｍの粒状の水酸化ナトリウム「トーソーパール」（東ソー社製）８．８ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．５モル相当量）を、バッチ式振動ミルＭＢ－１（中央化工機：容器全容積３．５Ｌ、媒体としてφ３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、断面形状が円形のＳＵＳ３０４製ロッドを１３本使用、ロッド充填率５７％）に投入し、２時間粉砕処理することでバガス粉砕物（平均粒子径約１６．６μｍ）を得た。
（糖化処理）
　２ｍＬ容マイクロチューブに、調製したバガス粉砕物５０ｍｇと０．４ｍＬの水を添加し、１Ｎ－ＨＣｌにて粉砕に使用した水酸化ナトリウムを中和した。中和された溶液に０．４ｍＬの２５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０もしくは５．０）、２５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０もしくは７．０）、または２５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０もしくは９．０）を添加して基質溶液を調製した。基質溶液は、実施例１もしくは実施例２で調製したキシラナーゼ溶液または対照のキシラナーゼ溶液を１サンプルあたり５０μｇ－タンパク質となるように添加後、水を加えて全量を１ｍＬとした。その後、５０℃、１５０ｒｐｍで往復振とうしながら１日間糖化反応を行った。対照のキシラナーゼとしては、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ　Ａ／Ｓ）またはＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来キシラナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ）を用いた。Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ５．０の基質溶液のみに添加した。
　反応終了後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）にて上清を回収し、ＤＸ５００クロマトグラフィーシステム（日本ダイオネクス社製）にて上清中のキシロース、キシロビオースおよびキシロトリオースの濃度を測定した。これら３つの遊離糖量の和をバガス由来の生成糖量とした。結果を表５に示す。表中の相対生成糖量は、各ｐＨにおけるＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃの生成糖量を１００％とした場合の相対値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示したように、本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、測定した全てのｐＨ範囲でＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃよりも高い糖化活性を示し、特にアルカリ領域（ｐＨ７～９）においても安定して高い糖化活性を維持していた。また、本発明のＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ５～９の範囲においてＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃの至適ｐＨであるｐＨ５での糖化活性よりも高い活性を示し、特に中性付近からアルカリ性領域（ｐＨ６～９）でも安定して高い糖化活性を維持していた。なお、市販のＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来キシラナーゼは、ｐＨ５においてＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＨＴｅｃと同等の糖化活性（相対生成糖量１０１％）を示した。これらの結果より、本発明のキシラナーゼは幅広いｐＨにて汎用的な使用が可能であると考えられた。
＜実施例４＞　酵素組成物によるバイオマスの糖化
（バイオマスの調製）
　実施例３で調製したバガス粉砕物（平均粒子径約１６．６μｍ）を用いた。
（セルラーゼの調製）
　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ６ａ株由来エンドグルカナーゼＩ（配列番号１４、以下ＴｒＥＧＩと略す）の調製は以下のように行った。
　ＴｒＥＧＩをコードするＤＮＡ配列（配列番号１３）をＰＣＲにより増幅して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ用発現ベクターであるｐＰＴＲ　Ｉ　ＤＮＡ（タカラバイオ）へとプロモーターと連結後導入した。その後、Ａ．ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株へと作製したベクターを導入し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体を培養することで培養液中へとＴｒＥＧＩを分泌生産させた。発現させたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ＱＭ６ａ株由来エンドグルカナーゼＩ（以下ＴｒＥＧＩ）のタンパク質量は、精製ＴｒＥＧＩのＣＭＣ分解活性とＤＣプロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ社製）によるタンパク質量から比活性（２１１．５Ｕ／ｍｇ－タンパク質）を計算し、培養上清中のＣＭＣ分解活性から上清中のタンパク質量を逆算して求めた。
（糖化処理）
　２ｍＬ容マイクロチューブに、調製したバガス粉砕物５０ｍｇと０．４ｍＬの水を添加し、１Ｎ－ＨＣｌにて粉砕に使用した水酸化ナトリウムを中和した。中和された溶液に０．４ｍＬの２５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）を添加して基質溶液を調製した。基質溶液には、本発明のＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ由来キシラナーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ由来キシラナーゼを含む酵素組成物（試験品）を１サンプルあたり１００μｇ－タンパク質となるように添加後、水を加えて全量を１ｍＬとした。対象としては、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２を１サンプルあたり５０μｇ、１００μｇまたは１５０μｇ－タンパク質を添加後、同様に水を加えて全量を１ｍＬとした。その後、５０℃、１５０ｒｐｍで往復振とうしながら３日間糖化反応を行った。本発明のキシラナーゼを含む酵素組成物には、本発明のキシラナーゼ：ＴｒＥＧＩ：ｅｘｏ－１，４－β－Ｄ－Ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ（メガザイム社）：Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２＝１０：２０：１：３１（タンパク質量比）で混合したものを用いた（タンパク質１００μｇ中、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２を５０μｇ含有）。なお、上記酵素組成物中の各タンパク質量および比率計算には、ＤＣプロテインアッセイキットにて測定したタンパク質量を使用した。
　反応終了後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）にて上清を回収し、ＤＸ５００クロマトグラフィーシステム（日本ダイオネクス社製）にて上清中のグルコース、セロビオース、キシロース、キシロビオースおよびキシロトリオースの濃度を測定した。これら５つの遊離糖量の和をバガス由来の生成糖量とした。結果を図１に示す。図中の相対糖化率は、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２を１サンプルあたり５０μｇ－タンパク質を添加した際の生成糖量を１００％とした場合の相対値である。
　図１に示したように、本発明のキシラナーゼを含む酵素組成物を用いることで、同タンパク質量や１．５倍量のＣｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２と同等またはそれよりも高い糖化活性を示し、本発明のキシラナーゼを含む酵素組成物がバイオマスの糖化に適していることが示された。

Claims (19)

  1. 　下記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物でバイオマスを糖化する工程を含む、バイオマスの糖化方法、
    ここで、該タンパク質（Ａ）は、下記（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり、
    該タンパク質（Ｂ）は、下記（ａ’）～（ｃ’）：
    　（ａ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質である。
  2. 　下記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物でバイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法、
    ここで、該タンパク質（Ａ）は、下記（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり、
    該タンパク質（Ｂ）は、下記（ａ’）～（ｃ’）：
    　（ａ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質である。
  3. 　前記タンパク質（Ａ）は、ｐＨ７．０～９．０の範囲における前記キシラナーゼ活性が最大活性の７０％以上であり、前記タンパク質（Ｂ）は、ｐＨ６．０～９．０の範囲における前記キシラナーゼ活性が最大活性の７０％以上である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記タンパク質（Ａ）の最適反応ｐＨが６．０～７．０であり、前記タンパク質（Ｂ）の最適反応ｐＨが６．６～８．０である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　前記タンパク質（Ａ）が、下記（ｄ）～（ｆ）：
    　（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子；
    　（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；および、
    　（ｆ）配列番号１で示される塩基配列において１～複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子、
    から選ばれる遺伝子にコードされ、
    　前記タンパク質（Ｂ）が、下記（ｄ’）～（ｆ’）：
    　（ｄ’）配列番号１１で示される塩基配列からなる遺伝子；
    　（ｅ’）配列番号１１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；および、
    　（ｆ’）配列番号１１で示される塩基配列において１～複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子
    から選ばれる遺伝子にコードされる、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子がＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属由来の遺伝子であり、前記タンパク質（Ｂ）をコードする遺伝子がＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属由来の遺伝子である、請求項５記載の方法。
  7. 　前記酵素組成物がセルラーゼをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　前記セルラーゼがエンドグルカナーゼを含む、請求項７記載の方法。
  9. 　前記バイオマスを前処理する工程をさらに含み、該前処理がアルカリ処理、粉砕処理および水熱処理からなる群より選ばれる１種以上である、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 前記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉、パーム空果房（ＥＦＢ）、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる１種以上である、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　下記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物の、バイオマス糖化のための使用、
    ここで、該タンパク質（Ａ）は、下記（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり、
    該タンパク質（Ｂ）は、下記（ａ’）～（ｃ’）：
    　（ａ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質である。
  12. 　下記タンパク質（Ａ）もしくはタンパク質（Ｂ）またはそれらを含む酵素組成物の、バイオマスからの糖の製造のための使用、
    ここで、該タンパク質（Ａ）は、下記（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質であり、
    該タンパク質（Ｂ）は、下記（ａ’）～（ｃ’）：
    　（ａ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列；
    　（ｂ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；および、
    　（ｃ’）配列番号１２で示されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
    から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質である。
  13. 　前記タンパク質（Ａ）は、ｐＨ７．０～９．０の範囲における前記キシラナーゼ活性が最大活性の７０％以上であり、前記タンパク質（Ｂ）は、ｐＨ６．０～９．０の範囲における前記キシラナーゼ活性が最大活性の７０％以上である、請求項１１又は１２記載の使用。
  14. 　前記タンパク質（Ａ）の最適反応ｐＨが６．０～７．０であり、前記タンパク質（Ｂ）の最適反応ｐＨが６．６～８．０である、請求項１１～１３のいずれか１項記載の使用。
  15. 　前記タンパク質（Ａ）が、下記（ｄ）～（ｆ）：
    　（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子；
    　（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；および、
    　（ｆ）配列番号１で示される塩基配列において１～複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子、
    から選ばれる遺伝子にコードされ、
    　前記タンパク質（Ｂ）が、下記（ｄ’）～（ｆ’）：
    　（ｄ’）配列番号１１で示される塩基配列からなる遺伝子；
    　（ｅ’）配列番号１１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；および、
    　（ｆ’）配列番号１１で示される塩基配列において１～複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる遺伝子
    から選ばれる遺伝子にコードされる、請求項１１～１４のいずれか１項記載の使用。
  16. 　前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子がＸｙｌａｎｉｍｏｎａｓ属由来の遺伝子であり、前記タンパク質（Ｂ）をコードする遺伝子がＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属由来の遺伝子である、請求項１５記載の使用。
  17. 　前記酵素組成物がセルラーゼをさらに含む、請求項１１～１６のいずれか１項記載の使用。
  18. 　前記セルラーゼがエンドグルカナーゼを含む、請求項１７記載の使用。
  19. 　前記バイオマスが、木材の加工物または粉砕物、パルプ類、紙類、バガス、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉、パーム空果房（ＥＦＢ）、植物殻類、および藻類からなる群より選ばれる１種以上である、請求項１１～１８のいずれか１項記載の使用。
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