CN103215238B

CN103215238B - 一种海洋细菌酯酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103215238B
Application number: CN201310129324.0A
Authority: CN
Inventors: 吴月红; 江夏薇; 许学伟; 魏笑莲; 王春生; 吴敏
Original assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION; Second Institute of Oceanography SOA
Current assignee: China Ocean Mineral Resources Research and Development Association; Second Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2033-04-12
Also published as: CN103215238A

Abstract

本发明公开了一种海洋细菌新型酯酶以及利用该酯酶手性催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。将该酯酶基因克隆到表达质粒，转化大肠杆菌Rosetta。由于该酶能在表达菌株中高度可溶性表达，并且表现出良好的耐盐，耐碱，及手性选择性，因此可以作为工业化生产抗抑郁药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的潜在用酶。通过对其反应条件的优化，可以利用该酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯进而生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，使其转化率和手性选择性大大提高。

Description

一种海洋细菌酯酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种海洋细菌新型酯酶及其制备方法与应用。具体的说，涉及海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2^T中酯酶基因pe8及利用该酯酶手型催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。

背景技术

光学纯的(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯是一系列重要医药中间体的前体。其中最具代表性的是左旋帕罗西汀盐酸盐。它可以使突触间隙中的5-羟色胺（5-HT）浓度增高，发挥抗抑郁作用，对其它递质作用较弱，对植物神经系统和心血管系统的影响较小，作为选择性中枢神经5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂（SSRI）。临床上被广泛应用于治疗抑郁症，强迫症，惊恐障碍或社交焦虑障碍等疾病。近年来，抗抑郁药物帕罗西汀在国内外的市场需求与日俱增，其合成方法也在全球备受关注。因此，探索其简便，高效经济的制备方法成为科学界十分活跃的课题。合成的方法有化学法和酶法，而酶法由于它的高效、绿色和环保等优点成为研究的首选。

Yu等（TetRahedRon Lett.41(2000),5647-5651.）用猪肝脏酯酶选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，得到(S)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，虽然ee值与产率高达95%和86%，但是S构型的产物并不是合成左旋帕罗西汀正确构型前体。

Lopez-GaRcia等（TetRahedRon AsymmetRy.14(2003),603-609.）在有机溶剂中对3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯进行氨解反应，虽然取得了较高的ee值但产率却不尽如人意。

最近，Liu等（PRocess Biochem.47(2012),1037-1041.）利用来自于Candida antaRctica的固定化脂肪酶（Novozym435）催化该反应，得到(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯,虽然产率和ee值都很高，但是由于商品化酶昂贵的价格，不适用于大规模工业化生产。

由于海洋微生物酯酶通常具有与其生存环境相关的特性，譬如良好的耐盐性、耐热性和良好的手性选择性等，为此我们克隆了海洋细菌PelagibacteRium halotoleRans B2^T中酯酶基因pe8并将其在大肠杆菌Rosetta中高度可溶性表达。本发明利用该酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯进而生产药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。通过对其反应条件的优化，使其转化率和手性选择性大大提高。由于该酶能在表达菌株中高度可溶性表达，并且表现出良好的耐盐、耐碱性及手性选择性，因此可以作为工业化生产抗抑郁药物中间体的潜在用酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋细菌新型酯酶、其编码基因及其制备方法，以及利用该酯酶生产(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。

本发明通过PCR方法，从新型海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2^T中意外克隆到一种新型酯酶PE8。海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2^T系发明人之一许学伟等从东海海水样品中分离得到（相关论文发表于International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology；2011；61：1817–1822），该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并可提供给公众使用，保藏编号为CGMCC1.7692^T，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所（100101），保藏日期为2008年6月。

本发明将目前发表的所有酯酶按照不同的家族进行氨基酸多序列比对，找到核心保守序列，然后利用相关软件(例如CODEHOP)寻找可能的兼并引物。依据引物的基本原则和要求:简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的TM值尽可能相近等，选择适宜的兼并引物。

经过比对，本发明设计了一对扩增酯酶全基因的引物。上游引物为pe8F(5’-AGGACATATGACCGAACCCGTAAAG-3’，Nde I)，下游引物为pe8R(5’-CGATAAGCTTCTAGAGGATCTCGCG-3’，HindIII)。以论文（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology；2011；61：1817–1822）中报道的菌株Pelagibacterium halotolerans B2^T（CGMCC1.7692^T）为模板进行PCR扩增，意外获得一种全新的酯酶pe8基因的全长序列，其特征在于全长660bp（核苷酸序列如Seq ID.NO:1所述）。该基因编码的酯酶PE8含219个氨基酸（氨基酸序列如Seq ID.NO:2所述），与已公布的来自于菌株Parvibaculum lavamentivorans DS-1的酯酶(YP_001412908)的同源性低至46%。

酯酶PE8的系统进化树分析如附图6所示，表明PE8和其相似的酯酶属于family VI脂类水解酶。

在不影响酯酶PE8蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶PE8活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶PE8突变体具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以上的同源性，最优选具有至少99%以上的同源性。

同理，本发明还保护对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶PE8蛋白生物学活性的DNA分子。优选的酯酶PE8突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以上的同源性，最优选具有至少99%以上的同源性。

利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶pe8基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶PE8。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞）等，优选采用原核表达系统E.coli。

合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体。一个优选的例子是将本发明克隆到的酯酶基因连接到大肠杆菌表达载体pET28b(+)上，并转化到大肠杆菌Rosetta中,经诱导表达出高活性的重组酯酶PE8。

所述的酯酶基因pe8的表达质粒和重组菌株的构建，表达质粒为pET28b(+)，转化方法为CaCl₂转化法，转化菌株为大肠杆菌DH5α。

所述的利用大肠杆菌Rosetta可溶性表达PE8，表达菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3),以20μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素为选择压力。

所述的利用大肠杆菌Rosetta可溶性表达PE8，表达条件为37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达并转入25℃以振荡培养过夜培养。

对上述得到的酯酶PE8的底物特异性的研究，研究方法为：600μl的反应体系中包括1mM各种碳链长度的对硝基苯酯，100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)和2.7μg纯酶蛋白，反应体系于30℃水浴中反应3-15min，加等体积的乙醇终止反应，后迅速冷却，进行吸光值A₄₀₅的测定并将失活的酶液作为对照用于调零。研究表明，PE8对短链的底物具有很强的催化活性，催化对硝基苯酚乙酸酯(C2)的活性最高，对对硝基苯酚十二酸酯(C12)的活性极其微弱，且不能催化对硝基苯酚十四酸酯(C14)和对硝基苯酚十六酸酯(C16)，因此PE8属于脂类水解酶中的酯酶，对于短链酯类物质具有催化活性。

此外，还研究了二价阳离子对酯酶活性的影响，研究方法为：反应体系分别加入10mM Co²⁺,Cu²⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Sr²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺，Ba²⁺和乙二胺四乙酸，然后测定酶的活性；测活体系为：在600μl的反应体系中包括100mM TRis-盐酸缓冲液(pH7.5)，1mM对硝基苯酚乙酸酯，2.7μg酶液，于30℃水浴中反应3min，加等体积的乙醇终止反应，后迅速冷却，进行吸光值A₄₀₅的测定并将失活的酶液作为对照用于调零。测定结果表明PE8的活性会被Zn²⁺，Cu²⁺和Ni²⁺抑制，但是其他多种二价阳离子的存在下仍能保持较强的活性。

本发明的另一目的是提供一种利用所述的酯酶PE8生产(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。

本发明所述的利用酯酶PE8生产(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法，包括以下步骤：

（1）、利用酯酶PE8选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制备(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，其反应方程式为：

（2）、任选的从反应产物中分离出目标产物(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。

所述方法中，酯酶PE8在反应体系中的浓度范围为1-100mg/ml，优选为5-30mg/ml，更优选为10mg/ml。酯酶PE8纯度可为90%以上，也可以使用含有酯酶PE8的粗酶粉。所述的粗酶粉通过以下方法制备：诱导含有酯酶PE8基因的大肠杆菌Rosetta可溶性表达PE8，离心收集重组细菌菌体，重悬于pH6.5-8.0的PBS缓冲液，超声波破碎处理后离心收集上清，冷冻干燥得到的PE8酯酶粗酶粉末。

所述方法中，利用酯酶PE8选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制备(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，反应体系中3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯的浓度为10-100mM，优选为30-60mM，更优选为40mM。

所述方法中，利用酯酶PE8选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯制备(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯，反应体系中所使用的有机溶剂为正己烷，异丙醚，甲苯，甲基叔丁基醚，异丙醇，丙酮，乙腈，甲醇，N,N-二甲基甲酰胺，1,4-二氧六环或二甲基亚砜其中的一种或其混合物，优选的溶剂为1,4-二氧六环。反应体系中有机溶剂的浓度为0-30%，优选为10%-20%，更优选为17.5%。

所述方法中，反应的温度为20-40℃，优选为30-35℃。

所述方法中，反应时间为10-36h，优选为20-30h。

所述方法中，反应体系的pH范围为4-11，优选为pH7.0-9.0，更优选为pH8.0。

所述方法中，优选的分离纯化方法包括萃取、减压干燥或其组合以分离出目标产物。优选的纯化方法萃取法，萃取剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲苯和四氯化碳等，优选乙酸乙酯。

作为优选，本发明提供了一种利用酯酶PE8生产(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法，包括以下步骤：

（1）、利用酯酶PE8选择性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，反应体系中含有10-100mM3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，1-100mg/mlPE8粗酶粉，0-30%(v/v)的有机溶剂；控制温度在20-40℃，反应时间为10-36h；

（2）、终止反应后，经萃取，减压干燥分离出目标产物(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。

上述方法中的各个参数选择范围如前所述.

本发明提供了一种海洋细菌新型酯酶的制备,生化性质研究及利用其生产(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的方法。该方法成功的克隆表达了一种新型海洋酯酶，并首次利用海洋来源的酯酶生产抗抑郁药物中间体(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。通过条件优化，该方法具有较高的转化率和手性选择性。该酶在最适反应条件下(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的产率能达到73.2%，ee值能达到71.6%。由于该酶在表达菌株中表达量占蛋白总量的23.1%，在pH11和1M磷酸盐缓冲液的条件下仍能保持较高的活性和手性选择性，因此可以作为工业化生产抗抑郁药物中间体的潜在用酶，具有较大的实施价值和社会效益。

附图说明

图1是有机溶剂种类对酯酶PE8水解制备(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯反应的影响，其中所用有机助溶剂的体积比为10%。

图2是有机溶剂浓度(a),反应缓冲液pH(b),缓冲液浓度(c),反应温度(d)，对酯酶PE8水解制备(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的反应的影响，图中实心圆表示转化率，三角形表示ee值，星号表示3-(4-氟苯基)戊二酸的产率，各曲线所属坐标轴如箭头所示。

图3是产物及底物的产率，ee值或转化率随时间变化曲线图。

图4是Rosseta(DE3),PE8粗酶，PE8纯酶的SDS-PAGE电泳图。

图5是不同碳链长度的对硝基苯酚酯对酯酶活性的影响(a),及二价阳离子对酯酶活性影响(b)。

图6为酯酶PE8的系统进化树分析

具体实施方式

以下具体实例来说明本发明的技术方案，但保护的范围并不仅限于此。

实施例1：酯酶基因pe8的重组表达质粒和重组菌株的构建

将海洋细菌Pelagibacterium halotolerans B2^T中酯酶基因pe8克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于目前发表的所有酯酶家族的核心保守序列，设计扩增酯酶全基因的上游引物pe8F(5’-AGGACATATGACCGAACCCGTAAAG-3’，Nde I)和下游引物pe8R(5’-CGATAAGCTTCTAGAGGATCTCGCG-3’，HindIII)，PCR 扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用NdeI和HindIII双酶切PCR产物，割胶回收酶切后的片段，跟同样经过NdeI和HindIII双酶切的质粒pET28b(+)连接，按照CaCl₂转化法转化到大肠杆菌DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Axygen)提取阳性克隆的质粒，进而NdeI和HindIII双酶切鉴定，得到接近660bp的片段，经序列测定为酯酶基因pe8。表明已经成功构建了表达质粒，将此重组表达质粒转化到大肠杆菌Rosetta表达菌株中，构建了表达重组菌株。

实施例2：利用重组表达菌株表达重组酯酶基因pe8

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有20μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6，此时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入25℃以振荡培养过夜。低温离心收集菌体，重悬于PBS缓冲液(137mMNaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄,pH7.4)中，反复洗涤两次，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，冷冻干燥24h得到PE8酯酶粉末。

实施例3：利用酯酶PE8水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯

利用酯酶PE8水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，具体操作：在0.5ml的反应体系中包括40mM3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，5mg PE8 酶粉，30℃，200rpm振荡反应24h，用5M盐酸调pH至2.0以终止反应，加入0.5ml乙酸乙酯萃取二次，真空干燥去除乙酸乙酯，再加入300μl异丙醇溶解沉淀，高效液相色谱法分析产物成分。

实施例4：酯酶PE8水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯生成产物的成分分析

利用高效液相色谱法分析产物成分，具体操作：采用高效液相色谱分析系统(Agilent1100SeRies)，ChiRalpak AD-H column(250×4.6mm)，柱温30℃，采用正己烷(含0.1%三氟乙酸)：异丙醇(95：5)为流动相，流速为0.5ml/min，最高峰在266nm处，3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯的截留时间为19.4min，(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的截留时间为37.9min，(S)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的截留时间为43.9min，3-(4-氟苯基)戊二酸的截留时间为51.6min。

实施例5：酯酶PE8水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯最适反应条件分析

最适有机助溶剂的选择，具体操作：在反应体系中加入加5mg酶粉，0.02mmol3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，0.5ml100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)和10%(体积/体积)的正己烷，异丙醚，甲苯，甲基叔丁基醚，异丙醇，丙酮，乙腈，甲醇，N,N-二甲基甲酰胺，1,4-二氧六环或二甲基亚砜作为助溶剂，反应过程和产物分析同实施例3和实施例4。当使用1,4-二氧六环作为助溶剂时达到最高转化率(74%)和 ee值(63%)。

最适有机助溶剂浓度的选择，具体操作：在反应体系中加入加5mg酶粉，0.02mmol3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，0.5ml100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)和不同浓度的(0-30%)的1,4-二氧六环作为助溶剂，反应过程和产物分析同实施例3和实施例4。当1,4-二氧六环的浓度小于17.5%时，转化率和ee值都随着其浓度的增加而上升，但当浓度继续增加时，转化率和ee值都开始下降，所以综合考虑，17.5%(体积/体积)为最佳助溶剂浓度。

酯酶PE8的最适反应pH的分析在pH4.0-11.0的范围内测定。具体操作为：在反应体系中加5mg酶粉，0.02mmol3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，0.5ml不同pH的缓冲液和17.5%的1,4-二氧六环作为助溶剂，反应过程和产物分析同实施例3和实施例4。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0-pH5.0)，100mM磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，100mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.5-11.0)。测定结果表明PE8的最适pH为pH8.0，在碱性条件下仍然具有良好的活性，具有很好的工业应用前景。

PE8反应最适离子浓度的测定具体操作为：在反应体系中加5mg酶粉，0.02mmol3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，0.5ml不同离子浓度(0-1M)的磷酸盐缓冲液(pH8.0)和17.5%的1,4-二氧六环作为助溶剂，反应过程和产物分析同实施例3和实施例4。在0-0.1M离子浓度下，转化率从50.4%迅速升高至66.8%，ee值也迅速从16.6%升高至98.9%。但是当离子浓度继续上升时，ee值先是保持不变，然后当离子浓度升高到0.6M，ee值达到最高值67.4%。PE8能适应较高的离子浓度，能使用工业要求的需要。

PE8最适反应温度在20℃-40℃的范围内测定，具体操作为：在反应体系中加5mg酶粉，0.02mmol3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，0.5ml0.6M的磷酸盐缓冲液(pH8.0)和17.5%的1,4-二氧六环作为助溶剂，分别在20℃，25℃，30℃，35℃和40℃下反应10小时，产物分析同实施例4。首先转化率随着温度的升高而上升，当温度达到30℃达到最大值61%，同时ee值也达到最高，但是当温度继续升高时，转化率随之下降。结果表明PE8对高温的耐受性较差，这与其起源于海洋微生物有关，因此PE8的最适反应温度为30℃。

实施例6：PE8反应时间和产物生成的关系

在反应体系中加5mg酶粉，0.02mmol3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，0.5ml0.6M的磷酸盐缓冲液(pH8.0)和17.5%的1,4-二氧六环作为助溶剂，反应过程和产物分析同实施例3和实施例4。反应刚开始进行时PE8首先水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯，(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的生成速度远远大于(S)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯。随着反应时间的延长ee值从56.8%(16h)升高至71.6%(36h)，但是(R)-3-(4-氟苯基)戊二酸单甲酯的产率却从74.5%下降至73.2%。

实施例7：酯酶PE8底物特异性分析

酯酶PE8的底物特异性分析采用体系：在600μl的反应体系中包括1mM各种碳链长度的对硝基苯酯，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)和2.7μg纯酶蛋白，使用分光光度计在30℃下连续测定吸光值A₄₀₅5-20min，并使用失活的酶液作为对照用于调零。该体系在30℃水浴中反应3-15min，加等体积的乙醇终止反应，后迅速冷却，进行吸光值A₄₀₅的测定。同样方法，将失活的酶液作为对照用于调零。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明PE8对短链的底物具有很强的催化活性，催化对硝基苯酚乙酸酯(C2)的活性最高，对对硝基苯酚十二酸酯(C12)的活性极其微弱，且不能催化对硝基苯酚十四酸酯(C14)和对硝基苯酚十六酸酯(C16)，因此PE8属于脂类水解酶中的酯酶，对于短链酯类物质具有催化活性。

实施例8：二价阳离子对酯酶PE8活性影响

二价阳离子对PE8活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Co²⁺,Cu²⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Sr²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺，Ba²⁺和乙二胺四乙酸，然后测定酶的活性。测活体系为：在600μl的反应体系中包括100mM TRis-盐酸缓冲液(pH7.5)，1mM对硝基苯酚乙酯，2.7μg酶液；该体系在30℃水浴中反应3min，加等体积的乙醇终止反应，后迅速冷却，进行吸光值A₄₀₅的测定。测定结果表明PE8的活性会被Zn²⁺，Cu²⁺和Ni²⁺抑制，但是其他多种二价阳离子的存在下仍能保持较强的活性。

Claims

1.一种酯酶PE8蛋白，其氨基酸序列与Seq ID NO.2所示序列一致。

2.编码权利要求1所述的酯酶PE8蛋白的pe8基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.携带有权利要求2所述基因的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其为大肠杆菌表达载体pET28b（+）。

5.一种宿主，其由权利要求3所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

6.根据权利要求5所述的宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主，其为大肠杆菌E.coli。

8.根据权利要求7所述的宿主，其为大肠杆菌Rosetta。

9.一种利用权利要求1所述的酯酶PE8生产(R)‐3‐(4‐氟苯基)戊二酸单甲酯的方法，包括以下步骤：

（1）、利用酯酶PE8选择性水解3‐(4‐氟苯基)戊二酸二甲酯制备(R)‐3‐(4‐氟苯基)戊二酸单甲酯，其反应方程式为：

（2）、从反应产物中分离出目标产物(R)‐3‐(4‐氟苯基)戊二酸单甲酯。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的酯酶PE8在反应体系中的浓度范围为1‐100mg/ml。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述的酯酶PE8在反应体系中的浓度范围为5‐30mg/ml。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述的酯酶PE8在反应体系中的浓度范围为10mg/ml。

13.根据权利要求10‐12任一项所述的方法，其特征在于：所述的酯酶PE8纯度为90%以上，或使用含有酯酶PE8的粗酶粉。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述的酯酶PE8粗酶粉通过如下的方法制备：诱导含有酯酶PE8基因的大肠杆菌Rosetta可溶性表达PE8，离心收集重组细菌菌体，重悬于pH6.5‐8.0的PBS缓冲液，超声波破碎处理后离心收集上清，冷冻干燥得到的PE8酯酶粗酶粉末。

15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的反应体系中3‐(4‐氟苯基)戊二酸二甲酯的浓度为10‐100mM。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述的反应体系中3‐(4‐氟苯基)戊二酸二甲酯的浓度为30‐60mM。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述的反应体系中3‐(4‐氟苯基)戊二酸二甲酯的浓度为40mM。

18.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的反应体系中所使用的有机溶剂为正己烷，异丙醚，甲苯，甲基叔丁基醚，异丙醇，丙酮，乙腈，甲醇，N,N‐二甲基甲酰胺，1,4‐二氧六环或二甲基亚砜其中的一种或混合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：所述的反应体系中使用的有机溶剂为1,4‐二氧六环。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂的浓度为0‐30%(v/v)。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂的浓度为10%‐20%(v/v)。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂的浓度为17.5%(v/v)。

23.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中反应的温度为20‐40℃。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于：所述方法中反应的温度为30‐35℃。

25.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中反应时间为10‐36h。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于：所述方法中反应时间为20‐30h。

27.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中反应体系的pH范围为4‐11。

28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于：所述方法中反应体系的pH范围为7.0‐9.0。

29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于：所述方法中反应体系的pH为8.0。

30.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中的分离纯化方法包括萃取、减压干燥或其组合以分离出目标产物。

31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中的分离纯化方法为萃取法，萃取剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲苯和四氯化碳。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中的萃取剂为乙酸乙酯。

33.一种利用权利要求1所述的酯酶PE8生产(R)‐3‐(4‐氟苯基)戊二酸单甲酯的方法，包括以下步骤：

（1）、利用酯酶PE8选择性水解3‐(4‐氟苯基)戊二酸二甲酯，反应体系中含有10‐100mM 3‐(4‐氟苯基)戊二酸二甲酯，1‐100mg/ml PE8粗酶粉，0‐30%(v/v)的有机溶剂；控制温度在20‐40℃，反应时间为10‐36h；

（2）、终止反应后，经萃取，减压干燥分离出目标产物(R)‐3‐(4‐氟苯基)戊二酸单甲酯。