CN105368802B - 一种耐盐酯酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种耐盐酯酶及其编码基因和应用，该酯酶蛋白质分子具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该酯酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明从我国传统发酵食品环境宏基因组文库中筛选获得新的酯酶基因，发现该基因编码蛋白具有良好的酶学特性，催化水解/合成温度范围为25～50℃，pH值为5.5～8.0。该酯酶的最大特点是，在10～18％NaCl条件下，酶蛋白可保持良好的催化活性。可催化乙酸、丙酸、戊酸、己酸与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成乙酸乙酯、丙酸丙酯、戊酸丁酯等相应的短链芳香酯化合物，酯化率大都可以达到80％～90％。该酯酶可应用于短链芳香酯类香料的工业化生物合成，在食品、日化产品中显示出重要的经济和社会价值。

Description

一种耐盐酯酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种耐盐酯酶及其编码基因和应用。

背景技术

酯酶(Esterases,EC 3.1.1.X)是一种催化酯键水解和合成的酶的总称，水解时催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质。酯酶是一类用途广泛的水解酶，在食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业和医药行业等领域得到广泛的使用。近几年，酯酶的新功能和新用途不断被发现和拓展，从而使酯酶具有更高的研究价值和更广阔的应用前景。酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中。动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。

宏基因组学(Metagenomics)是近年来随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展兴起的一门新兴的科学技术。其基本研究思路是直接提取环境中所有微生物的基因组DNA，克隆到合适的载体，构建宏基因组文库，将环境中全部微生物的核酸信息收集在一起，并运用序列筛选或功能筛选方式从文库中获得有用的酶、抗生素、活性物质等。这种完全不依赖于环境中微生物的分离和培养的技术拓展了微生物学的研究思路与方法，为从不同自然生境中的未培养微生物中寻找新的基因资源和活性物质提供了有力的技术手段。

目前，已有报道细菌酯酶及其基因专利筛选于宏基因组文库。中国专利200810226942.6提供了一种酯酶新基因Est p1及其重组表达体系，该基因克隆自中国南海海底100m深海底泥宏基因组文库。中国专利200810222671.7提供了一种酯酶及其编码基因与应用，该基因克隆自中国南海778.5m深海沉积物宏基因组文库。中国专利201010521640.9提供了一种酯酶及其编码基因与应用，该基因克隆自沼气池宏基因组文库。中国专利201110208211.0提供了一种低温酯酶及其编码基因与应用，该基因Est6克隆自太平洋深海5886m深海沉积物宏基因组文库。然而，未见有酯酶基因克隆自我国传统调味品环境宏基因组文库。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种酯酶基因，该基因克隆自我国传统调味品环境宏基因组文库。

本发明所解决的技术问题在于提供一种酯酶基因，该基因编码的酯酶具有很强的耐盐性，在10～18％NaCl条件下，酶蛋白可保持良好的催化活性。

本发明所解决的技术问题在于提供一种酯酶，该酶能够可催化乙酸、丙酸、戊酸、己酸与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成乙酸乙酯、丙酸丙酯、戊酸丁酯等相应的短链芳香酯化合物，对丰富酯酶家族成员，开发新的短链芳香酯化合物合成途径都具有重要意义。

本发明所解决的技术问题在于提供一种合成短链芳香酯化合物的方法，利用基因工程获取的重组酯酶合成短链芳香酯化合物。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种酯酶蛋白质分子，该蛋白质分子具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了一种酯酶基因，该酯酶基因具有编码权利要求1中蛋白质分子的核苷酸序列。

其中，在本发明的一个实施例中，该酯酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

对于具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的酯酶基因，该序列无内含子，具有948bp完整的开放读码框，编码316个氨基酸的多肽。

另外，本发明还提供了一种获取酯酶基因的方法，包括如下步骤：

步骤一、提取我国传统发酵食品环境样品，提取起总DNA并纯化；

步骤二、将纯化后的总基因组经Sau3AI酶切处理；

步骤三、将酶切产物连接到pUC18/BamHI(BAP)载体上，电击转化大肠杆菌DH5α中构建我国传统发酵食品环境宏基因组文库，用含有l-氨苄青霉素、三磷酸甘油酯、葡萄糖和氨基酸复合物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选酯酶阳性克隆，通过高通量筛选得到阳性克隆子；

步骤四、经测序和Blast比较设计引物，以阳性克隆子的质粒为模板，用设计好的引物进行链式酶聚合反应，从而克隆得到如SEQ ID NO:1所示的目的片段。

其中，步骤四中设计用于扩展目的片段的引物包括：

上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGTCCCCGCCGCCGAGTC-3’；

下游引物F2：5’-CGGAAGCTTGGCCTGGCTGTGACATCC-3’。

另外，本发明还提供了一种重组酯酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用如权利要求5中所述方法获取酯酶基因，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(2)用上述基因目的片段经过HindIII和BamHI双酶切，与表达载体pET-32a(+)连接；

(3)用表达载体pET-32a(+)转化宿主细胞BL21(DE3)，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物分离、纯化，获得重组酯酶。该重组酯酶具有以酸类和醇类单体为原料合成短链芳香酯化合物的作用。

另外，本发明还提供了一种利用重组酯酶合成短链芳香酯化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用如权利要求5中方法制备重组酯酶；

(2)将上述重组酯酶粗酶液或纯化的酶液加入到合成反应体系中，在25-35℃条件下进行酶催化反应1-6h，合成相应的短链芳香酯化合物。

(3)上述合成反应体系是以有机溶剂正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷为介质。

(4)上述合成反应体系是以乙酸、丙酸、丁酸、戊酸或己酸，与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇为底物，所述底物的物质的量之比为1∶2，底物酸的浓度为100～200mM。

相比于现有技术，本发明的技术方案应用宏基因组技术从我国传统调味品环境宏基因组文库获得的酯酶，发现了该酶具有耐盐性，在10～18％NaCl条件下，酶蛋白可保持良好的催化活性，具有良好的应用潜力，并且对丰富酯酶家族成员，开发我国传统调味品环境资源都具有重要意义。另外，本发明的方案还通过对该酶在合成短链芳香酯化合物反应中的最适条件进行研究，发现了在以乙酸、丙酸、丁酸、戊酸或己酸，与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇为底物原料的短链芳香酯化合物合成反应中，本发明的酯酶在25-35℃条件下进行酶催化反应1-6h，所述底物的物质的量之比为1∶2，底物酸的浓度为100～200mM，采用上述反应条件能够高效、快速地合成目的产物，酯化率可以达到80％～90％，具有很好的应用价值。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

图1重组酯酶纯化的SDS-PAGE电泳图。M:Protein Marker；1:纯化后蛋白。

图2纯化的酯酶的底物特异性测定结果。

图3纯化的酯酶的耐盐性测定结果。

图4纯化的酯酶的最适反应温度测定结果。

图5纯化的酯酶的最适反应pH值测定结果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1酯酶基因的获得及合成短链芳香酯化合物功能的验证

1、酯酶基因的获得

从我国传统发酵食品(酱油、腐乳、豆酱等)环境样品，构建发酵食品环境宏基因组文库。用含有100μg/ml氨苄青霉素、1％三磷酸甘油酯、1％葡萄糖和0.5％氨基酸复合物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选酯酶阳性克隆。将文库中的细胞同影印接种针复制到固体选择性培养基平板上，37℃下培养3天，筛选菌落周围有水解圈出现的阳性克隆子。

提取上述阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，得到一个酯酶的核酸序列，该序列由948个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其命名为est_115；该核酸编码的多肽，含316个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将其命名为EST_115。

2、基因片段的克隆

根据核酸est_115序列，设计扩增引物：上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGTCCCCGCCGCCGAGTC-3’(下划线为BamHI酶切位点序列)；下游引物F2：5’-CGGAAGCTTGGCCTGGCTGTGACATCC-3’(下划线为HindIII酶切位点序列)。

以阳性克隆子的质粒为模版，以F1和F2为引物，进行PCR扩增，反应体系为：PrimeSTARTM HS DNA Ploymerase(2.5U/μl)0.3μl，5×缓冲液6μl，dNTP Mix(2.5mM)2.4μl，模板(100ng/μl)0.6μl，引物F1和F2(10mM)各0.3μl，超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火15s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃。

将PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后用BamHI和HindIII双酶切16，与经过同样处理的pET-32a(+)(Invitrogen)表达载体进行连接，电转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒DNA，进行测序验证发现其核苷酸序列与SEQ ID NO.1中的序列相同，能够有效地获取目的基因片段。

3、重组酯酶EST_115的获得

将含有经测序验证正确质粒的菌株接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，250r/min下培养14h，按1％的接种量转接至100ml的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，当生长至OD600＝0.8时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度0.6mM，20℃，200r/min下培养20h，12000r/min离心5min，弃上清，将菌体重悬于20ml 50mM Tri-HCl(pH7.5)中，用超声波破碎仪破碎菌体，4℃，13000r/min离心15min，收集上清，即获得重组酯酶粗酶液。

将重组酯酶粗酶液用Invitrogen公司的His标签蛋白纯化试剂盒ProbandPurification system进行纯化重组蛋白，具体操作步骤按该公司产品说明书进行。纯化后的重组蛋白液氮速冻，保存至超低温冰箱中。

4、合成短链芳香酯化合物功能的验证

将上述重组酯酶粗酶液2ml或纯化的酶液20μl，加入8ml正己烷作为反应介质，分别试验不同的底物(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸分别与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇)，酸和醇的物质的量之比为1∶2，底物酸的浓度为100mM，30℃水浴反应6h后，合成相应的短链芳香酯化合物，酯化率大都达到80～90％。产物通过GC-MS进行结构鉴定，酯化率通过酸碱滴定法测定底物酸的消耗量间接计算得出。结果见表1。

表1

实施例2重组酯酶EST_115底物特异性分析

100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，1mM底物，加入纯化的酶液10μl，在35℃测定吸光值A405nm。测定底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚葵酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)。结果如图1所示，重组酯酶EST_115对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C2、C4、C6和C8)具有催化活性，其中催化活性最高的底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)，其次为对硝基苯酚乙酸酯(C2)和对硝基苯酚己酸酯(C6)。

实施例3重组酯酶EST_115耐盐性分析

纯化后的酶液分别在5％、10％、15％和18％的NaCl溶液下室温放置，不同时间点取样，测定酶活力。测定酶活力的方法为：100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)，以1mM对硝基苯酚丁酸酯为底物，加入样品酶液20μl，在35℃测定吸光值A405nm。结果如图2所示，重组酯酶EST_115在18％NaCl浓度下存放30天仍能保持40％的酶活力。结果表明，重组酯酶EST_115具有很强的耐盐性。

实施例4重组酯酶EST_115最适反应温度的测定

100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，以1mM对硝基苯酚丁酸酯为底物，加入纯化后的酶液10μl，分别在15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃测定吸光值A405nm。结果如图3所示，重组酯酶EST_115在25～50℃仍具有较高的催化活性，最适反应温度为35℃。

实施例5重组酯酶EST_115最适反应pH值的测定

以1mM对硝基苯酚丁酸酯为底物，加入纯化后的酶液10μl，分别在pH4.0～7.0(100mM磷酸盐缓冲液)及pH7.0～9.0(Tris-HCl缓冲液)等不同pH值条件下，35℃测定吸光值A405nm。结果如图4所示，重组酯酶EST_115最适反应pH为7.0，在pH5.0～8.0仍有较高的酶活力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种酯酶蛋白质分子，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种分离出的酯酶基因，其特征在于，该酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。