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Die neue rAPLE unterscheidet sich in der Aminsäuresequenz auch von der bekannten Pig Intestinal Carboxyl Esterase (PICE) in 12 von insgesamt 548 Aminosäuren. PICE wird jedoch im Intestinaltrakt des Schweins gefunden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Polypeptid mit Esteraseaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Aminosäuresequenz SEQ. ID. No. 1 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neues rekombinantes Protein mit Esteraseaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Aminosäuresequenz SEQ. ID.
No. 1 aufweist.
Das Polypeptid und die erfindungsgemässe rekombinante rAPLE weisen die Fähigkeit auf Ester der Formel R2. .0^
Y O<R1>
0) zu spalten, in der R1 und R2 unabhängig voneinander einen linearen, verzweigten oder cyclischen C[iota]-C[iota]2-Alkylrest, der gegebenenfalls noch ein oder mehrere Doppeloder Dreifachbindungen oder ein oder mehrere Atom aus der Gruppe O, S oder N in der Alkylkette aufweisen kann und der gegebenenfalls durch einen oder mehreren Substituenten aus der Gruppe F, Cl, Br, NH2, OH, C[iota]-C6-Alkyl, C[iota]-C6-Alkoxy, COOR3, mit R3 gleich d-C[beta]-Alkyl, gegebenenfalls ein oder mehrfach durch C C[beta]Alkyl oder Ci-Ce-Alkoxy substituiertes C6-C2o-Aryl- oder -Heteroaryl, gegebenenfalls durch d-C3-Alkyl substituierter C3-C5-Heterocyclus mit 1 oder 2 Atomen aus der Gruppe O, S oder N substituiert sein kann oder einen C6-C2o-Aryl- oder Heteroarylrest,
der gegebenenfalls durch einen oder mehreren Substituenten aus der Gruppe F, Cl, Br, NH2, OH, Ci-C[beta]-Alkyl oder d-C6-Alkoxy substituiert sein kann, be
deuten oder in der R1 und R2 gemeinsam einen gegebenenfalls durch die oben angeführten Reste substituierten C2-Ci2-Alkylenrest bilden.
Bevorzugt weisen das Polypeptid und die erfindungsgemässe rekombinante rAPLE die Fähigkeit auf racemische Ester selektiv zu spalten.
Das erfindungsgemässe Polypeptid mit Esteraseaktivität, sowie die neue rekombinante Esterase rAPLE unterscheiden sich, wie oben angeführt, in 21 von insgesamt 548 Aminosäure der bekannten Sequenz gemäss FEBS Lett. (1991), 293, 37-41 bzw. in 12 von insgesamt 548 Aminosäuren vom bekannten PICE Protein gemäss David et al., (1998) Eur. J.
Biochem. 257, 142-148.
Die Sequenz des Proteins der neuen, erfindungsgemässen rAPLE unterscheidet sich in folgenden Aminosäurepositionen von der bekannten Sequenz des PLE-Proteins:
APLE Position PLE
Glu 73 Asp lle 75 Val
Gly 76 Val
Gly 77 Glu
Leu 80 Thr
Arg 87 Gly lle 92 Thr
Pro 93 Leu
Val 129 Leu
Ser 133 Pro
Thr 134 Met
Leu 138 Val
Ala 139 Val
<EMI ID=2.1>
Phe 234 Leu
* mm
Ala 236 Val
Gly 237 Ala
Phe 286 Leu
Ala 287 Thr
Leu 290 Phe
Pro 294 Gin
<EMI ID=3.1>
Thr 302 Pro
Das erfindungsgemässe Protein und die neue rekombinante rAPLE können dabei auch in einer veränderten Sequenz gemäss SEQ ID No 1 vorliegen, die beispielsweise durch übliche Modifikationen, wie etwa Insertion, Austausch, Entfernen oder Anfügen von Aminosäure(n) in der Sequenz am N- oder C-Terminus, wie etwa GluAlaGluAla aus der [alpha]-Faktor Signalsequenz,
oder durch Fusion mit anderen Proteinen erhalten werden kann .
Die Erfindung umfasst weiters auch Muteine mit Änderungen innerhalb der Proteinsequenz des erfindungsgemässen Enzyms mit der entsprechenden Aktivität. Muteine können beispielsweise durch Änderungen der DNA, die für das erfindungsgemässe Enzym kodiert, durch bekannte Mutagenesetechniken (Random Mutagenese, Sitedirected Mutagenese, Directed evolution, Gene shuftling, u.s.w.), sodass die DNA für ein Enzym kodiert, das sich zumindest durch eine Aminosäure vom erfindungsgemässen Enzym unterscheidet, und anschliessender Expression der modifizierten DNA in einer geeigneten Wirtszelle erhalten werden.
Die Erfindung umfasst somit auch abgeänderte DNA-Sequenzen gemäss SEQ ID.
No 1 , erhalten durch oben beschriebene Mutationen, Deletionen, Insertionen, Verlängerungen, Fusionen, und die für Enzyme mit der gewünschten Esteraseaktivität kodieren.
Esteraseaktivität ist dabei als Fähigkeit definiert, regioselektive Esterhydrolyse und chirale Trennung von racemischen Estern zu katalysieren.
Die Herstellung des erfindungsgemässen Polypeptides und der rekombinanten rAPLE kann wie nachfolgend beschrieben erfolgen:
Zuerst wird mRNA mittels eines geeigneten Kits aus Schweineleber isoliert und anschliessend die cDNA auf Basis des mRNA-Extraktes durch reverse Transkription generiert.
Im Anschluss daran werden spezifische PCR-Primer, basierend auf der Sequenz des bekannten Schweineleberesterase-Gens GenBank Accession No X63323 (Matsushima et al., 1991) hergestellt, worauf die Amplifikation und Klonierung erfolgt.
Diese spezifischen Primer sind:
Primer 1 : S'-CAG/MUCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-S' Primer 2: 5'-CCGG>W7TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG -3'
Fett geschrieben ist dieser Teil der Primer, der die entsprechenden Nukleotidsequenzen codierend für das PLE-Proteins enthält und der zwingend in den Primern enthalten ist.
Der andere Sequenzteil der Primer enthält beispielsweise Informationen für Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen (in kursiver Schrift) oder Sequenzelemente, die für die Expression von Bedeutung sind.
Dieser Teil kann bei der Herstellung der erfindungsgemässen rAPLE variieren.
Die Amplifikation erfolgt sodann mit den Primern 1 und 2 durch PCR-Methoden nach dem Stand der Technik.
Das PCR -Produkt wird anschliessend verwendet, um mit Methoden nach dem Stand der Technik Expressionskonstrukte für die heterologe Expression des codierten rAPLE Proteins in geeigneten Wirtsorganismen herzustellen. Vorzugsweise wird dabei das PCR Produkt vorerst in geeignete Plasmidvektoren einkloniert. Die auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmide werden sodann in einen geeigneten Wirt, beispielsweise Escherichia coli, transformiert. Anschliessend werden Inserts von mehreren erhaltenen Klonen sequenziert.
Unerwarteterweise wurden dabei 2 Gruppen von rekombinanten Klonen mit unterschiedlichen Sequenzen identifiziert, wobei eine zu 100% identisch ist mit der erwarteten Sequenz für PLE gemäss Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41, und eine neue Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ. ID. No. 2 (Sequenz APLE), die nach Expression zu der erfindungsgemässen Aminosäuresequenz SEQ. ID. No. 1 führt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure bzw.
Nukleotidsequenz, die für das erfindungsgemässe Polypeptid und die rekombinante
Esterase rAPLE codiert.
Beispielsweise weist eine solche Nukleinsäure die Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ.
Id.
No. 2 auf.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleotidsequenzen, die eine
Nukleotidsequenz, die für das erfind ungsgemässe Polypeptid und die rekombinante
Esterase rAPLE codiert oder die Nukleotid-Sequenz gemäss SEQ. Id. No. 2, enthält.
Weiters können entsprechende Oligonucleotide, korrespondierend zu Nukleinsäuresequenzen gemäss vorliegender Erfindung, die für die erfindungsgemässe Esterase kodieren, durch standardisierte, synthetische Techniken, beispielsweise unter Verwendung von automatisierten DNA-Synthesizern, hergestellt werden.
Die rein synthetische Herstellung der Nukleinsäuresequenzen, die für die erfindungsgemässe Esterase kodieren, ist besonders für den Einsatz in der Herstellung von Pharmazeutika oder deren Intermediate von Vorteil, da damit Enzyme aus nicht tierischen Quellen erhalten werden.
Nunmehr erfolgt die Expression der beiden gefundenen Sequenzen (PLE- und
APLE-Sequenz).
Die bekannte Schweineleberesterase (PLE, Swiss-Prot ID Q29550) enthält eine Nterminale Signalsequenz und ein C-terminales ER-Retentions Signal, die 4 letzten
Aminosäuren HAEL.
Um die bekannte PLE und die neue APLE zu exprimieren, werden Vektoren konstruiert, bei welchen die Sequenzen in geeignete Expressionssysteme eingebracht werden. Diese Expressionskonstrukte werden sodann in geeignete Wirtszellen transformiert.
Geeignete Wirtszellen sind dabei beispielsweise Mikroorganismen, tierische Zelllinien und Pflanzen.
Bevorzugt sind eukaryotische Mikroorganismen, besonders bevorzugt Pilze. Beispiele dafür sind Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis oder Aspergillus sp..
Die Expression kann sekretorisch oder intrazellulär und sowohl induzierbar als auch konstitutiv erfolgen.
Vorzugsweise werden die Proteine in sekretorischer Weise exprimiert, wobei bevorzugt Vektoren konstruiert werden, bei welchen die Sequenzen der PLE und der APLE N-terminal mit der [alpha]-Faktor Signalsequenz von S. cerevisiae verbunden werden.
Weiters können Konstrukte hergestellt, bei welchen das C-terminale Tetrapeptide HAEL, das als ER-Retentionssignal dient, wie es beispielsweise in Hardwick et al., (1990) EMBO J. 9, 623-630, beschrieben ist, zusätzlich entfernt ist.
Eine weitere bevorzugte Expression ist die induzierbare Expression von Konstrukten mit oder ohne ER-Retensionssignal.
Unerwarteterweise lassen sich auch Konstrukte mit dem ER-Retentionssignal exprimieren und führen zu einer rAPLE die racemische Ester selektiv spalten können.
Die aus der Nukleotidsequenz des APLE-Gens abgeleitete Aminosäuresequenz der neuen Esterase rAPLE ist durch SEQ ID No. 1 dargestellt.
Die aus der Nukleotidsequenz des APLE-Gens abgeleitete Aminosäuresequenz der neuen Esterase rAPLE ist durch SEQ ID No. 1 dargestellt. *
Unerwarteterweise konnte festgestellt werden, dass das neue Polypeptid bzw. das rAPLE-Protein im Vergleich zu der bekannten rPLE, jeweils erhalten durch Expression der für APLE bzw.
PLE codierenden DNA-Abschnitte, beispielsweise in P. pastoris Zellen, ein teilweise anderes Substratspektrum bzw. erhöhte Aktivität aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des Polypeptides mit Esteraseaktivität oder des erfindungsgemässen rekombinanten Proteins mit der Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID No. 1 oder mit zumindest 80%iger Identität zu der Sequenz gemäss SEQ ID No.1 in der organischen Synthese zur Esterspaltung. Bevorzugt weisen das Polypeptid mit Esteraseaktivität bzw. die erfindungsgemässe rekombinante Esterase (rAPLE) eine zumindest 90%ige, besonders bevorzugt eine zumindest 98%ige Identität mit der Sequenz des Porteins gemäss SEQ ID No 1 auf. Es können auch Polypeptid mit Esteraseaktivität bzw. die erfindungsgemässe rekombinante Esterase (rAPLE) mit abgeänderten DNA-Sequenzen gemäss SEQ ID.
No 1, erhalten durch übliche Modifikationen, wie etwa Mutationen, Deletionen, Verlängerungen, Fusionen, die für Enzyme mit der gewünschten Esteraseaktivität kodieren, eingesetzt werden.
Das Polypeptid und die erfindungsgemässe rekombinante rAPLE eignen sich zur Spaltung von Estern der Formel R2^
Y O<R1>
(i) in der R1 und R2 unabhängig voneinander einen linearen, verzweigten oder cyclischen CrCi2-Alkylrest, der gegebenenfalls noch ein oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen oder ein oder mehrere Atom aus der Gruppe O, S oder N in der Alkylkette aufweisen kann und der gegebenenfalls durch einen oder mehreren Substituenten aus der Gruppe F, Cl, Br, NH2, OH, C C6-Alkyl, C C6-Alkoxy, COOR3, mit R3 gleich C[iota]-C6-Alkyl, gegebenenfalls ein oder mehrfach durch C[iota]-C6-Alkyl oder CrC6-Alkoxy substituiertes C6-C2o-Aryl- oder -Heteroaryl,
gegebenenfalls durch dC3-Alkyl substituierter C3-C5-Heterocyclus mit 1 oder 2 Atomen aus der Gruppe O, S oder N substituiert sein kann oder einen C6-C20-A17I- oder -Heteroarylrest, der gegebenenfalls durch einen oder mehreren Substituenten aus der Gruppe F, Cl, Br, NH2, OH, C[iota]-C6-Alkyl oder C[iota]-C6-Alkoxy substituiert sein kann, bedeuten oder in der R1 und R2 gemeinsam einen gegebenenfalls durch die oben angeführten Reste substituierten C2-C-i2-Alkylenrest bilden.
Unter d-C[iota]2-Alkylreste sind dabei lineare, verzweigte oder cyclische Alkylreste mit 1 bis 12 C-Atomen, wie etwa, Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, sek. Butyl, teil.
Butyl, Hexyl, Cyclohexyl, u.s.w. zu verstehen.
In der Alkylkette können auch eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen enthalten sein.
Weiters kann die Alkylkette ein oder mehrere Atome aus der Gruppe O, S oder N enthalten.
Der Alkylrest kann auch ein- oder mehrfach substituiert sein. Geeignete Substituenten sind dabei F, Cl, Br, NH2, OH, C[iota]-C6-Alkyl, Ci-C[beta]-Alkoxy oder COOR3, mit R3 gleich C[iota]-C6-Alkyl.
Weiters eignen sich gegebenenfalls ein oder mehrfach durch Ci-C[beta]-Alkyl oder Ci-C[beta]Alkoxy substituierte C6-C20-A17I- oder -Heteroarylreste oder ein gegebenenfalls durch d-C3-Alkyl substituierter C3-C5-Heterocyclus mit 1 oder 2 Atomen aus der Gruppe O, S oder N.
Bevorzugt sind dabei gegebenenfalls substituiertes Phenyl oder Naphthyl.
Die Reste R1 und R2 können aber auch gemeinsam einen gegebenenfalls durch die oben angeführten Reste substituierten C -Ci2-Alkylenrest, bevorzugt C -C[iota]2Alkylenrest bilden.
Beispiele für geeignete Substrate sind [alpha]-Methylphenylglycinester, Menthylacetat, Methylsuccinat, 3-Methylglutarat, 3-(4-Methoxyphenyl)-oxiran-2-carbonsäuremethylester, Mandelsäure-methylester, Ibuprofenester, Solketalester, Phenylethano lester, wie etwa (I-Phenylpropyl)butyrat oder (I-Phenyloctyl)acetat, Naproxenester, 2-Alkyl-5-halogen-pent-4-en-carbonsäurealkylester, u.s.w..
Bevorzugt werden das Polypeptid und die erfindungsgemässe rekombinante rAPLE zur Spaltung von racemischen Estern der Formel I eingesetzt.
Das erfindungsgemässe Enzym kann dabei in jeglicher Form verwendet werden.
Beispielsweise als Dispersion, als Lösung, immobilisiert, als [chi]ohe3 Enzym, als Enzym, das aus seiner Quelle durch Kombination von bekannten Reinigungsmethoden erhalten wurde, als ganze Zellen (gegebenenfalls immobilisiert und/oder permeabilisiert), die die erforderliche enzymatische Aktivität (natürlich oder durch genetische Modifikationen) besitzen oder in einem Lysat solcher Zellen.
Normalerweise liegt die Reaktionstemperatur für die erfindungsgemässen Umsetzungen zwischen 0 und 90[deg.]C, bevorzugt zwischen 10 und 60[deg.]C. Der pH-Wert der Reaktionslösung liegt zwischen 4 und 11 , bevorzugt zwischen 6 und 9.
Die Reaktionsparameter, wie etwa Temperatur, pH-Wert, Lösungsmittel u.s.w. werden entsprechend dem gewählten Substrat ausgewählt.
Beispiel 1: mRNA Isolierung und Generierung von cDNA
0,7 g schlachtfrische Schweineleber, erhalten aus einem lokalen Schlachthof, wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, mit einem Mörser homogenisiert und die freigesetzte mRNA unter Verwendung des Fast Track mRNA Extraktions Kit 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) gemäss den vom Hersteller gemachten Angaben isoliert bzw. extrahiert (Fast Track 2.0 Kit Manual; Version J; 082301; 25-0099).
Die Extraktion ergab eine Gesamtmenge von 12,9 [mu]g an mRNA.
0,26 [mu]g dieser mRNA wurden sodann als Template zur Generierung von cDNA mittels 'SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR' nach Herstellerangaben verwendet.
Beispiel 2: Amplifikation und Klonierung von cDNA Fragmenten aus Schweineleber
Es wurden spezifische Primer, basierend auf der Sequenz des Schweineleberesterase-Gens GenBank Acession No X63323 (Matsushima et al., 1991) hergestellt: Primer 1: 5'-CAGA47TCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3' (SEQ ID. No. 3) Primer 2: 5'-CCGG>M7TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG -3' (SEQ ID No. 4) Fett geschrieben sind Basen homolog zur bekannten PLE-Sequenz. Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen sind kursiv hervorgehoben.
Die Amplifikation erfolgte in einem 50 [mu]l Ansatz mit 1 U Phusion DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland), mit 500 ng cDNA als Template, je 20 [mu]mol Primer 1 und 2, 5 [mu]l eines dNTP-Mix (je 2 mM), alles in 1x Phusion HF Puffer entsprechend dem 'Phusion High-Fidelity DNA Polymerase '-Manuals (Finnzymes), beginnend mit einem 30-sekündigen Denaturierungsschritt bei 98[deg.]C, gefolgt von 30 Zyklen (10 sec 98[deg.]C, 20 sec 68[deg.]C, 1 min 72[deg.]C) zur Amplifikation und einer abschliessenden Inkubation für 8 min bei 72[deg.]C zur Herstellung vollständiger Produkte.
Durch diese PCR wurde ein DNA-Fragment in der Grösse von 1,8 kb (festgestellt durch Agarose Gelelektrophorese) erhalten.
Diese PCR-Produkt wurde sodann mittels<'>Quiaquick Kit'(Quiagen, Hilden, Germany) entsprechend dem beigefügten Manual gereinigt.
Etwa 0,1 [mu]g des gereinigten PCR-Produktes wurden mit der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten und in die Plasmidvektoren pHILZ und pHIL-D2 über die EcoRI Schnittstellen einkloniert.
Die Vektoren wurden dann in TOP10 electrocompetent cells, hergestellt gemäss 'Current Protocols in Molecular Biology' transformiert.
Inserts von mehreren resultierenden Klonen wurden unter Verwendung des<'>Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing'Kits (Applied Biosystems Inc., Forster City, Calif., USA) sequenziert
Dabei wurden zwei Sequenzen identifiziert, wobei die eine zu 100% der erwarteten durch Matsushima et al., (1991) FEBS Lett.
293, 37-41, publizierten Sequenz entsprach und die andere Sequenz entsprechend SEQ ID No 2.
Beispiel 3: Einführen der [alpha]-Faktor Signalsequenz und Variationen des Cterminalen Endes.
Um das bekannte Protein PLE und das erfindungsgemässe Protein rAPLE in sekretorischer Weise exprimieren zu können, wurden Vektoren konstruiert, bei welchen die Sequenz von PLE und APLE N-terminal mit der [alpha]-Faktor Startsequenz des cloning Vektors pPICZ [alpha] (Invitrogen) verbunden wurde. Zusätzlich wurden Konstrukte hergestellt, bei welchen das C-terminale Tetrapeptid HAEL entfernt wurde.
PCR I: Das Primerpaar EcoRlalpha1/alphaPLE2 wurde zur Amplifizierung der [alpha]Faktor Signalsequenz des cloning Vektors pPICZ [alpha] (Invitrogen) verwendet.
Die PCR wurde in einem 50 [mu]l Ansatz (2 ng Template, je 0,5 [mu]M Primer, 0,2 mM dNTPs, 1U der Phusion DNA-Polymerase (Finnzymes), alles in 1x Phusion HF Puffer entsprechend dem 'Phusion High-Fidelity DNA Polymerase<'>Manual (Finnzymes)) durchgeführt. a
Nach einer 3-minütigen Denaturierung bei 95[deg.]C, wurde die Amplifikation in 30 Zyklen (30 sec 95[deg.]C, 30 sec 57[deg.]C, 15 sec 72[deg.]C) und einem abschliessenden Schritt für 7 min bei 72[deg.]C erreicht.
PCR II:
Die PLE und APLE Sequenzen wurden von pHILZ Plasmiden unter Verwendung entweder des Primerpaares PLEalpha1/EcoRIPLE+ER2 oder des Primerpaares PLEalpha1/EcoRIPLE2 (Deletion des C-terminalen HAEL Tetrapeptides) amplifiziert.
Diese PCRs wurden wiederum in 50 [mu]l Ansätzen ( 2 ng Template, je 0,5 [mu]M Primer, 0,2 mM dNTPs, 1 U der Phusion DNA-Polymerase (Finnzymes), alles in 1x Phusion HF Puffer entsprechend dem 'Phusion High-Fidelity DNA Polymerase<'>Manual (Finnzymes) durchgeführt.
Nach einer 3-minütigen Denaturierung bei 95[deg.]C, wurde die Amplifikation in 30 Zyklen (30 sec 95[deg.]C, 30 sec 57[deg.]C, 15 sec 72[deg.]C) und einem abschliessenden Schritt für 7 min bei 72[deg.]C erreicht.
PCR III:
3 [mu]l der Produkte von PCR I und PCR II wurden zur Kombination dieser beiden Produkte durch primerlose PCR verwendet.
Die Verlängerung wurde in einem 45 [mu]l Ansatz mit 0.2 mM dNTPs, 1 U der Phusion DNA-Polymerase (Finnzymes), alles in 1x Phusion HF Puffer durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 Minuten auf 95[deg.]C erwärmt und dann wurden 10 Zyklen mit 30 sec bei 95[deg.]C und 45 sec bei 72[deg.]C durchgeführt. Zur Amplifikation dieser überlappenden Verlängerungsprodukte wurden 5 [mu]l Primermix (3 [mu]l Wasser, 1 [mu]l 5 [mu]M Primer EcoRlalphal und 1 [mu]l 5 [mu]M Primer EcoRIPLE+ER2 oder EcoRIPLE2) zugesetzt.
Die Produkte wurden mit 20 PCR-Zyklen (30 sec 95[deg.]C, 30 sec 57[deg.]C, 1 min 72[deg.]C) und einem einzelnen Temperaturstop für 7 min bei 72[deg.]C amplifiziert.
Primer-Sequenzen:
EcoRlalphal : [delta]'-TCTTCGAAG^TTCACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-S'
(SEQ ID No. 5) alphaPLE2: 5'-GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'
(SEQ ID No. 6)
PLEalphal : 5'-AGAGAGGCTGAAGCTGGGCAGCCAGCCTCGCCG-3'
(SEQ ID No. 7)
EcoRIPLE+ER2: 5<,>-ATGG 4CCG \yA7TCTCACAGCTCAGCATGCTTTATCTTG-3'
(SEQ ID No. 8)
EcoRIPLE2: 5'-AT GGTACCGAA 7TCTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTG-3'
(SEQ ID No. 9)
Bereiche mit Homologie zu den Templates in Fettdruck, Erkennungssequenzen für
Restriktionsendonukleasen in kursiver Schrift.
Beispiel 4:
Konstruktion von Expressionskonstrukten für die heterologe Expression von Schweineleberesterasen in Pichia pastoris
Die überlappenden Extensions-PCR-Produkte aus Beispiel 3 wurden mittels 'Qiaquick Kit'(Qiagen, Hilden, Germany) gemäss dem beigelegten Manual gereinigt. Etwa 0,1 [mu]g der gereinigten PCR-Produkte wurden mittels Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten und in den Plasmidvektor pGAPZ A (Invitrogen) über die EcoRISchnittstelle einkloniert.
Die korrekte Orientierung des Inserts zu den Promotoren wurde mit Hilfe von Kontrollschnitten, beispielsweise mit Ncol, geprüft.
In jedem Fall wurde ein Klon mit korrekt orientiertem Insert ausgewählt, sequenziert und konserviert.
Die entsprechenden Plasmide wurden wie folgt benannt:
Plasmide, die die bekannte PLE-Sequenz gemäss Matsushima et al., (1991) FEBS Lett. 293, 37-41 , enthielten wurden pGAPZ A PLE-ER (das HAEL Tetrapeptid wurde entfernt) und pGAPZ A PLE+ER (HAEL Tetrapeptid noch vorhanden) genannt. -
Plasmide, die sich von der neuen APLE Sequenz ableiteten wurden pGAPZ A APLEER (das HAEL Tetrapeptid wurde entfernt) und pGAPZ A APLE+ER (HAEL Tetrapeptid noch vorhanden) genannt.
Beispiel 5: Konstitutive Expression von Schweineleberesterasen in Pichia pastoris
Die Plasmide pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER und pGAPZ A APLE+ER wurden in P.pastoris X-33 transformiert. Die Transformation erfolgte nach den Vorschriften des Protokolls des Pichia Expressions Kit von Invitrogen.
Die Selektion von Transformanten erfolgte auf YPD-Platten (1% Hefeextrakt, 2%Pepton, 2% D-Glukose, 2% Agar), die 100mg/l Zeocin enthielten. 52 Zeocinresistente Klone wurden auf YPD-Platten mit 100 mg/l Zeocin ausgestrichen und in 15% Glycerol konserviert.
Beispiel 6: Qualitative Analyse der Esteraseaktivität
P.pastoris Transformanten wurden auf YPD-Platten mit 100 mg/l Zeocin für 48 h bei 30[deg.]C angezüchtet. Die Zellen wurden auf Whatman 541 hardened ashless 7Omm0 Filter abgehoben und luftgetrocknet.
Die Filter wurden mit einer Lösung aus 6 mg [alpha]Naphthylacetat (Sigma, gelöst in 500 [mu]l Aceton), 2,5 mg tetrazodiertem o-Dianisidin (Fast Blue Salt BN, Sigma, gelöst in 125 [mu]l Wasser) und 5 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7, inkubiert, um die Esteraseaktivität durch Farbreaktion zu visualisieren.
Aktivitäten wurden in allen Transformanten detektiert, die eines der 4 Plasmiden pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER und pGAPZ A APLE+ER integriert hatten. Dies beweist die Expression von funktionalen Proteinen mit Esteraseaktivität. Zur Kontrolle wurde auch ein Klon mit integriertem leerem Vektor auf gleiche Weise getestet.
Hier konnte im vergleichbaren Reaktionszeitraum keine signifikante Esteraseaktivität gesehen werden. "...... ....
Beispiel 7: Stereoselektive Esteraseaktivität bezüglich 5-Chlor-2-(1 methylethyl)-4-pentensäure-methylester
P.pastoris Transformanten, wie in Beispiel 6 beschrieben, wurden auf YPD-Platten mit 100 mg/l Zeocin für 48 h bei 30[deg.]C angezüchtet. Die Zellen wurden auf Whatman 541 hardened ashless 7Omm0 Filter abgehoben und luftgetrocknet.
Die Filter wurden entweder mit Substratlösung A (100 [mu]l razemischer 5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4pentensäure-methylester, 200 [mu]l 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8; 150 [mu]l 10 mg/ml Phenolrot; 450 [mu]l DMSO; 650 [mu]l H2O) oder mit Substratlösung B (identisch mit Lösung A, jedoch wurde (2S,4E)-5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4-pentensäure-methylester anstelle des Razemats eingesetzt).
Aufgrund der spezifischen Esteraseaktivität auf die Substrate resultiert die Säurefreisetzung bei Hydrolyse des Estersubstrates in einer pH-Abnahme, die wiederum zu einer Änderung der Farbe des Indikators Phenolrot zu gelb führt.
Dabei stellte sich heraus, dass Transformanten, die das Plasmid pGAPZ A APLE-ER enthielten, nach Inkubation für 3 bis 4 Stunden Signale (Gelbfärbung um Kolonie) gaben, wenn sie auf Substratlösung A getestet wurden, während bei Substrat Lösung B keine signifikante Konversion festgestellt werden konnte.
(Figur 1 ) Transformanten, die mit den Plasmiden pGAPZ A PLE-ER oder pGAPZ A PLE+ER erhalten wurden, zeigten unter denselben Bedingungen keine Reaktion mit den Substratlösungen A oder B.
Dies zeigte, dass die rekombinante rAPLE eine andere Substratspezifität als rekombinante rPLE aufweist und dass die Hydrolyse von 5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4pentensäure-methylester mittels rAPLE stereoselektiv für das (R)-Enantiomere erfolgt. *
Beispiel 8: Vergleich rAPLE zu PLE
Analogie zu Beispiel 7 wurden folgende Substrate getestet:
2R, 3S- 3-(4-Methoxyphenyl)-oxiran-2-carbonsäuremethylester: Aktivität von rAPLE; rPLE kaum aktiv
R,S-Dimethylmethylsuccinat: rAPLE sehr starke Aktivität; rPLE starke Aktivität
R,S-Dimethyl-3-methylglutarat: rAPLE sehr starke Aktivität; rPLE kaum aktiv
Beispiel 9:
SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese
10 [mu]l eines 2x SDS-Probenpuffers (125 mM Tris-HCI, pH 6,8; 4% SDS, 20% Glycerol, 5 % ss-Mercaptoethanol, 0,05% Bromphenolblau) wurden zu 10 [mu]l kommerziell erhältlicher Schweineleberesterase oder 10 [mu]l der 60-fach konzentrierten (Centricon Ultrafiltrations-Spin Columns, Fa. Sartorius) Überstände der P. pastoris Kulturen (72 h bei 100 rpm und 28[deg.]C in 250 ml YPD-Medium in 2 I Schikanenerlenmeyerkolben), die entweder das Plasmid pGAPZ A APLE-ER oder ein leeres pGAPZ A Plasmid (Kontrollstamm) enthielten, zugesetzt.
Nach dem Erhitzen der Proben auf 95[deg.]C für 5 Minuten, wurden die Proteine auf einem 12.5% Polyacrylamidgel (4%iges Sammelgel) getrennt und zum Nachweis mit Coomassie Brilliant Blue R250 angefärbt.
Die SDS-PAGE zeigt eine Proteinbande bei der erwarteten Grösse für rAPLE (¯ 60 kDa) im Hefestamm mit dem pGAPZ A APLE-ER Plasmid, aber nicht im Kontrollstamm (Figur 2).
Die zum Vergleich mitanalysierte kommerziell erhältliche Schweineleberesterase zeigte zwei Proteinbanden im gleichen Grössenbereich. (Pfeil in Figur 2) *-
Beispiel 10: Induzierte Expression von Schweineleberesterasen mit dem AOX1 Promotor
Die Plasmide pGAPZ A PLE-ER, pGAPZ A PLE+ER, pGAPZ A APLE-ER und pGAPZ A APLE+ER wurden mit der Restriktionsendonuklease Xhol geschnitten und die respektiven Fragmente codierend für APLE und PLE-Proteine, mit oder ohne ERRetentionssignal, wurden über die Xhol Schnittstelle in den pPIC9-Vektor (Invitrogen) einkloniert. Die korrekte Orientierung der Fragmente zum >40X7 Promotor wurde mit Hilfe von Kontrollschnitten mit Restriktionsendonuklease Ncol, geprüft.
Die Vektoren mit AOX1 Promotor, wurden in Analogie zu den in Beispiel 4 genannten Plasmiden pPIC9 PLE-ER, pPIC9 PLE+ER, pPIC9 APLE-ER und pPIC9 APLE+ER genannt, mit Sall linearisiert und in P. pastoris KM71 transformiert. Transformation und SeleWion auf His-Prototrophie erfolgten nach den Vorschriften des Pichia Expressions Kit von Invitrogen. Ausgewählte Transformanten und der KM71 -Stamm wurden gemäss Pichia Expressions Kit von Invitrogen über Nacht auf Vollmedium angezüchtet und 48 h mit 1 % Methanol induziert.
Die erhaltenen Kulturen wurden mittels des in Beispiel 7 beschriebenen qualitativen pH-Shift Assay analysiert wobei in den Ansätzen jeweils 2 [mu]l der Kulturen getestet wurden Die Expression unter Kontrolle des induzierbaren AOX1 Promotors führte, im Vergleich zu der in Beispiel 7 für konstitutive Expression beschriebenen Situation, zu sehr viel höheren Enzymaktivitäten von rAPLE gegenüber razemischem 5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4-pentensäure-methylester. Bereits nach wenigen Minuten konnte der Farbumschlag von Phenolrot (rot zu gelb) erkannt werden (Figur 3). Unerwarteterweise war die Aktivität von rAPLE unabhängig von der Anwesenheit des ER-Retentionssignals HAEL am C-Terminus, d.h. auch Zellen, die rAPLE mit ER-Retentionssignal exprimierten zeigten Aktivität.
Dagegen hatten Hefestämme zur Produktion von rPLE keine Aktivität gegenüber razemischem 5-Chlor-2-(1-methylethyl)-4-pentensäure-methylester.