DE60120456T2

DE60120456T2 - Neue lösliche endoproteasen für die in vitro prozessierung von rekombinanten proteinen

Info

Publication number: DE60120456T2
Application number: DE60120456T
Authority: DE
Inventors: Marco Vanoni; Paolo Tortora; Giancarlo Tonon; Jeoffrey Taylor; Gaetano Orsini
Original assignee: Keryos SpA
Current assignee: Bio-Ker Srl Gessate It
Priority date: 2000-11-16
Filing date: 2001-11-14
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2021-11-15
Also published as: EP1334183B1; US7410775B2; IT1319659B1; ES2265454T3; ITMI20002465A1; US20090042277A1; AU2002216041A1; JP2004513655A; DE60120456D1; JP4252306B2; WO2002040652A2; EP1334183A2; WO2002040652A3; US20030186258A1; US20070298457A1; ATE329017T1; US7241609B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Endopeptidasen mit hoher Schneidespezifität zur Verwendung bei der in vitro-Prozessierung von rekombinanten Proteinen, die für gewerbliche Anwendungen geeignet sind, und insbesondere lösliche, sezernierte Derivate des Kex1-Proteins von Kluyveromyces lactis und deren Verwendung in löslicher Form oder in einer an einem unlöslichen organischen oder anorganischen Träger immobilisierten Form zur Freisetzung des Proteins von Interesse aus Fusionsproteinen.
Gebiet der Erfindung
Die Herstellung von heterologen rekombinanten Proteinen in geeigneten Expressionssystemen stellt eines der Hauptanwendungsgebiete von gewerblichem Interesse der rekombinanten DNA-Technologie dar. Aufgrund der Instabilität des Peptids/Proteins in der Wirtszelle ist es häufig vorteilhaft, das Peptid/Protein von Interesse in Form eines Fusionsproteins herzustellen, das ein schützendes (oder stabilisierendes) Protein umfasst, das anschließend an einer spezifischen, vorbestimmten Stelle prozessiert wird, um das erwünschte Protein oder Peptid freizusetzen.
Dieses Verfahren macht es ferner möglich, das gewünschte Protein oder Peptid ohne die Extension mit einem N-terminalen Methioninrest, der den ersten Aminosäurerest von in bakteriellen Systemen exprimierten Proteinen darstellt, zu erhalten. Fusionsproteine werden auch mit dem Ziel hergestellt, die Expressionsgrade zu erhöhen oder das Reinigungsverfahren zu erleichtern, indem man geeignete Polypeptidsequenzen wählt, an deren amino- oder carboxyterminalen Enden das Protein von Interesse angebracht ist.
Für den Erfolg dieser Strategie ist es erforderlich, dass chemische oder enzymatische Reagenzien verfügbar sind, die die Prozessierung des Fusionsproteins mit dem angestrebten Spezifitätsgrad bewirken können, idealerweise ohne Freisetzung von etwaigen sekundären Produkten, so dass die Kosten für die nachgeschaltete Prozessierung verringert werden. Von den vorgeschlagenen chemischen Verfahren sei das Schneiden an Methioninresten mit CNBr, die Säurehydrolyse am Asn-Pro-Dipeptid oder das Schneiden mit Hydroxylamin am Asn-Gly-Dipeptid erwähnt (Fontana et al., Practical Protein Chemistry, A Handbook, (1986), S. 5569–5575). Die enzymatischen Verfahren verwenden beispielsweise Lysyl-endopeptidasen (Achromobacter-protease I), die spezifisch die Peptidbindung vom Carboxylende des Lysins schneiden und Protease V8 aus Staphylococcus, das spezifisch die Peptidbindung vom Carboxylende von Glutaminsäure schneidet (JP-B-6-87788). Da jedoch diese chemischen Verfahren und die Endoproteasen einen einzelnen Aminosäurerest erkennen, ist es erforderlich, dass dieser Aminosäurerest im angestrebten Peptid nicht vorhanden ist, um das wirksame Ausschneiden des angestrebten Peptids aus dem chimären Protein zu ermöglichen; somit sind die Peptide, die hergestellt werden können, begrenzt. Es wurden daher verschiedene Studien mit dem Ziel durchgeführt, Proteasen mit einer Substratspezifität, die sich für die Verwendung beim spezifischen proteolytischen in vitro-Schneiden von rekombinanten Proteinen von gewerblichem Interesse eignen, aufzufinden und/oder gentechnisch zu bearbeiten. Weitere Endoproteasen mit einer Schneidesequenz, die stärker beschränkt ist, d. h. die eine Sequenz von Aminosäuren und nicht einen einzelnen Rest abdeckt, wurden verwendet. Hierzu gehören beispielsweise Thrombin, Faktor Xa und Enterokinase (Nilsson et al., Current Opinion Struct. Biol., Bd. 2 (1992), S. 569–575).
In neuerer Zeit sind einige Mitglieder der Familie der Subtilasen oder Serin-proteasen auf erhebliches Interesse gestoßen; zu bekannten Mitgliedern gehören: (1) bakterielle Subtilisine, (2) die Kex2-Protease von S. cerevisiae, (3) Furin und Furin-analoge Proteine. Während bakterielle Subtilisine keine ausreichende Schneidespezififät für die in vitro-Prozessierung von Fusionsproteinen aufweisen, ausgenommen in geeigneter Weise gentechnisch bearbeitete Varianten (Balllinger et al., Biochemistry, Bd. 35 (1996), S. 13579–13585; US-Patent 5 837 516), weisen sowohl das Kex2-Protein als auch Furine eine für diesen Zweck angemessene Schneidespezifität auf.
Subtilasen mit einer hohen Schneidespezifität, die nachstehend als Kexin-analoge Proteasen bezeichnet werden, spielen die molekulare/physiologische Rolle von "Pro-hormon-convertasen"; d. h. es handelt sich um Enzyme, die aus ihren Vorläufern in vivo Peptidhormone durch proteolytisches Schneiden am C-terminalen Ende von Paaren der Basenreste Lys-Arg oder Arg-Arg erzeugen. 1 zeigt in schematischer Weise die Struktur von Kexino-analogen Proteasen. Die Subtilisin-analoge katalytische Domäne, die sich über etwa 330 Aminosäuren erstreckt, ist unter den eukaryontischen Proprotein-convertasen hochgradig konserviert. Insbesondere die Reste am aktiven Zentrum, die die katalytische Triade (Ser-His-Asp) darstellen und ein Rest von Asn, der den oxyanionischen Hohlraum im Übergangszustand stabilisiert, sind bei sämtlichen Mitgliedern in entsprechenden Positionen vorhanden, ausgenommen in PC2, wo der Asn-Rest durch einen Asp-Rest ersetzt ist (Bryan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Bd. 83 (1986), S. 3743–3745).
Die Sequenzen, die diese Reste flankieren, sind ebenfalls einwandfrei konserviert. Ferner ist auch die Region von 140 Aminosäuren, die sich an die katalytische Domäne anschließt (bekannt als "Homo B"-, "P"- oder "mittel"-Domäne), unter eukaryontischen Convertasen einwandfrei konserviert, einschließlich bei der Hefeprotease Kex2, sie fehlt aber bei bakteriellen Subtilisinen. Die Homo B-Domäne ist für die katalytische Aktivität wesentlich (Zhong et al., FEBS Lett., Bd. 396 (1996), S. 31–36). Diese Domäne enthält eine konservierte Arg-Gly-Asp-Sequenz, die eine Ähnlichkeit mit der Erkennungssequenz von Integrinen besitzt. Die Mutationen von einem dieser drei Reste in PC1/PC3 verursacht den Verlust der katalytischen Aktivität und das fehlerhafte Dirigieren dieser neuroendokrinen Convertase in Richtung zum konstitutiven sekretiven Weg (Lusson et al., Biochem. J., Bd. 326 (1997), S. 737–744). Eine weitere konservierte Region ist das Propeptid, das autokatalytisch durch Prozessierung der Arg-Xaa-Lys-Arg-Stelle während der Reifung der Convertasen entfernt wird. In Richtung zum C-terminalen Ende, weisen Furin, PACE4, PC5/PC6A und B eine an Cys reiche Domäne auf, die gut konserviert ist und deren Rolle bisher unbekannt ist. Furin, Kex2, PC5/PC6B und LPC/PC7/PC8/SPC7 weisen ferner nahe am C-terminalen Ende eine Transmembrandomäne auf.
Die Kex2-Endoprotease der Hefe Saccharomyces cerevisiae stellte das erste nachgewiesene Enzym dar, bei dem genetische und biochemische Beweise es ermöglichten, die Funktion der Prozessierung von Proproteinen an Zweibasen-Stellen im trans-Golgi-Netzwerk zuzuordnen.
Das KEX2-Gen kodiert für ein Glycoprotein mit 814 Aminosäureresten mit einer Molekülmasse von 100 bis 120 kDa. Dieses Glycoprotein ist an den Membranen des trans-Golgi-Netzwerks verankert und übt die physiologische Rolle einer Prozessierung des α-Faktors und des Killertoxins aus. Das Kex2-Protein ist eine von Calcium abhängige Serin-protease, die spezifische Peptidbindungen am C-terminalen Ende von Lys-Arg-, Arg-Arg- und Pro-Arg-Sequenzen schneidet (Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 144 (1987), S. 807–814). Die Aminosäuresequenz von Kex2 enthält im NH₂-terminalen Bereich eine Prä-pro-domäne mit potentiellen autoproteolytischen Stellen (Lys₇₉-Arg₈₀-Pro₁₀₂-Arg₁₀₃ und Lys₁₀₈-Arg₁₀₉), gefolgt von einer Region (144–438 Aminosäuren) mit einem hohen Grad an Sequenzhomologie (Identität von 30%) zu bakteriellen Subtilasen (Mizuno et al., Biochem., Biophys. Res. Commun., Bd. 156 (1988), S. 246–254; Fuller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 1434–1438). Die Kex2-Protease wird in den MATα-Zellen der Hefe S. cerevisiae als ein inaktiver Vorläufer exprimiert und die NH₂-terminale Region der reifen Form wird durch proteolytisches Prozessieren an der Lys₁₀₈-Arg₁₀₉-Stelle, gefolgt von proteolytischem Schneiden der Dipeptide Leu-Pro und Val-Pro durch das Dipeptidyl-aminopeptidase-enzym Ste13, erzeugt (Brenner und Fuller, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (1992), S. 922–926).
Die katalytisch aktive Kex2-Protease von S. cerevisiae wurde aus Hefe als ein sezerniertes lösliches Enzym (ss-Kex2), das durch die Insertion eines Stoppcodons vor der COOH-terminalen Transmembrandomäne erzeugt worden war, gereinigt. Diese Modifikation erleichterte die Reinigung des Enzyms. Studien über die Substratspezifität der gereinigten ssKex2-S. cerevisiae-Protease zeigten, dass die Protease keinen Rest in der P3-Position ausschließt, ausgenommen Asp und Pro, jedoch andererseits selektiv für die Aminosäuren in der P2- und P1-Position ist. Insbesondere schließen Kex2 in der P2-Position Aminosäuren mit voluminösen Ketten aus, erkennen jedoch solche mit positiv geladenen Resten, während in der P1-Position die Kex2-Endoprotease äußerst selektiv sowohl in bezug auf die Ladung als auch auf die Struktur von Arginin ist. EP-327 377 beschreibt Kex2-Proteasen von S. cerevisiae, die frei von der C-terminalen, hydrophoben Region sind; diese Proteasen sind in Wasser löslich und können in den Außenraum der Zelle sezerniert werden, wobei die Enzymaktivität des nativen Proteins unverändert bleibt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Einige Stämme von Kluyveromyces lactis weisen einen Killer-Phänotyp auf, der ein Toxin sezerniert, das zur Abtötung empfindlicher Zellen verschiedener Spezies von Hefe befähigt ist. Diese Killereigenschaft ist auf die Anwesenheit von zwei Plasmiden von linearer DNA, nämlich pGKL1 und pGKL2, zurückzuführen, die zur Erzeugung des Toxins und einer Komponente, die die Immunität ermöglicht, zusammenwirken. Eine Mutation (kex1) wurde an einem einzigen Locus des K. lactis-Chromosoms, bezeichnet als KEX1, isoliert, wobei diese Mutation zum Verlust des Killer-Phänotyps führt, während die Aufrechterhaltung der vorerwähnten Plasmide ermöglicht wird.
Nach Klonierung durch genetische Komplementierung der vorerwähnten Mutation wurde vom Gen KEX1 festgestellt, dass es mit dem Gen KEX2 von Saccharomyces cerevisiae ortholog ist. Die durch die Gene KEX2 von S. cerevisiae und KEX1 von K. lactis kodierten Proteine weisen einen hohen Grad an Sequenzhomologie (Identität > 50%) auf und jedes dieser Proteine ist dazu fähig, das Fehlen des anderen auszugleichen. Diese Information lässt darauf schließen, dass das KEX1-Gen von Kluyveromyces lactis (Wesolowski-Louvel et al., Yeast, Bd. 4 (1988), S. 71–81) auch für eine Protease kodiert, die über Schneidespezifität für zweibasige Reste verfügt und die an der Erzeugung der reifen Form des Killertoxins, das durch die Prozessierung von dessen Vorläufer erzeugt wird, beteiligt ist. Jedoch waren bisher keine Daten bezüglich der Expression des Produkts des KEX1-Gens verfügbar, noch waren irgendwelche Daten bezüglich der biochemischen und enzymatischen Charakterisierung dieses Proteins verfügbar.
Von rekombinanten Kex1-Proteasen von K. lactis, die den Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung darstellen, wurde nunmehr festgestellt, dass sie frei von der Transmembran-Domäne sind (und mit dem Ausdruck ss-Kex1 bezeichnet werden) und dass sie in vitro eine katalytische Endopeptidase-Aktivität in bezug zu Substraten mit einem Gehalt an Pro-Arg-Resten und Dibasenresten, insbesondere gegenüber Arg-Arg- und Lys-Arg-Resten, zeigen. Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, dass diese rekombinanten Kex1-proteasen, deren Proteinsequenz mit Ausnahme der Deletionen, die die Domäne für die Verankerung an die Membran aufweisen (möglicherweise mit Ausnahme von Deletionen, die die Domäne für die Verankerung an die Membran umfassen), der Proteinsequenz entspricht, die durch das KEX1-Gen von K. lactis kodiert wird, eine erheblich höhere thermische Stabilität in Vergleich zu Proteinen der gleichen Familie zeigen, deren Proteinsequenz der Sequenz entspricht, die durch das Kex2-Gen von S. cerevisiae kodiert wird, so dass sie im Verfahren der zielgerichteten in vitro-Proteolyse unter Bedingungen verwendet werden können, bei denen andere Proteine der Kexin-Familie, insbesondere Kex2 aus S. cerevisiae, inaktiviert werden.
Die erfindungsgemäßen löslichen Kex1-Proteasen sind durch eine höhere Stabilität im Vergleich zu den entsprechenden Varianten, die durch das KEX2-Gen von S. cerevisiae kodiert werden, charakterisiert, wobei die löslichen Kex1-Proteasen mehr als 50% ihrer Aktivität unter Bedingungen, bei denen das Kex2-Protein vollständig inaktiviert wird, behalten.
Wie aus den nachstehenden Ausführungen ersichtlich ist, wird bei den erfindungsgemäßen löslichen Kex1-Endoproteasen die Deletion der Transmembran-Domäne durch Entfernung von mindestens 57 Aminosäureresten vom C-terminalen Ende des Enzyms, das durch das KEX1-Gen von K. lactis kodiert wird, erreicht, wobei es sich bei der experimentell verwendeten Gensequenz um die Sequenz handelt, die bei der EMBL-Datenbank unter der Hinterlegungsnummer X07038 verfügbar ist.
Insbesondere ist die lösliche Kex1-Endoprotease gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sie die Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist oder jedenfalls eine Sequenz mit einer 90%-gen Homologie bzw. einer 95%-igen Homologie zu SEQ ID NO: 2 aufweist.
Die vorliegende Erfindung wird durch ein DNA-Molekül repräsentiert, das für eine lösliche Kex1-Endoprotease kodiert, bei der mindestens 57 und nicht mehr als 100 Aminosäurereste vom C-terminalen Ende entfernt worden sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist dieses DNA-Molekül dadurch gekennzeichnet, dass es (a) die Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, (b) eine Sequenz aufweist, die mit SEQ ID NO: 1 hybridisiert, (c) eine Sequenz aufweist, die als Folge des genetischen Codes zur DNA mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 degeneriert ist, und/oder (d) eine Sequenz mit einer Homologie von 90% und vorzugsweise von 95% zu SEQ ID NO: 1 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung einer biologisch aktiven Substanz von Interesse (ein Peptid oder ein Protein), wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) die Herstellung eines Fusionspolypeptids oder -proteins, das die Sequenz des Peptids oder Proteins von Interesse umfasst, in einem Konstrukt vom Typ NH₂-A-B-C-COOH, wobei es sich bei NH₂ um das NH₂-terminale Ende des Fusionspolypeptids oder -proteins handelt, A ein beliebiges erwünschtes Protein oder Polypeptid (gegebenenfalls nur das Methionin, das durch das Startkodon der Translation kodiert wird) darstellt, B ein verbindendes "Linker"-Fragment darstellt, das mit einer Aminosäuresequenz endet, die von der erfindungsgemäßen Kex1-Endoprotease erkannt wird, C das Polypeptid oder Protein von Interesse darstellt, so dass die erste Aminosäure des reifen Proteins von Interesse sich unmittelbar am Carboxylende der durch die erfindungsgemäße Kex1-Endopeptidase erkannten Sequenz befindet, und COOH das carboxyterminale Ende des Fusionspolypeptids oder -proteins darstellt;
(b) die in vitro-Inkubation des in der vorstehenden Stufe (a) erwähnten Fusionspolypeptids oder -proteins in Gegenwart einer erfindungsgemäßen Kex1-Endoprotease, um das Protein oder Polypeptid von Interesse vom Fusionspartner und mit dem freien NH₂-terminalen Ende entsprechend dem NH₂-terminalen Ende des Polypeptids oder Proteins von Interesse zu trennen;
(c) die Abtrennung und Reinigung des biologisch aktiven Peptids oder Proteins von Interesse.

Die Verfahren zur Durchführung der vorstehenden Schritte (a), (b) und (c) sind aus dem Stand der Technik bekannt und bedürfen daher keiner näheren Erläuterung. Sie sind beispielsweise in EP-327 377, EP-794 254, EP-794 255 und US-5 077 204, deren Inhalt als Bestandteil der vorliegenden Beschreibung anzusehen ist, beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Endoproteasen können zur Prozessierung von Fusionsproteinen mit einem Gehalt an Peptiden oder Proteinen von industriellem und/oder therapeutischem Interesse verwendet werden. Mögliche Proteine, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhältlich sind, sind beispielsweise rekombinante Proteine zur therapeutischen Verwendung, wie Peptidhormone, Interleukine, Interferone, Cytokine, Wachstumsfaktoren, fibrinolytische Enzyme und rekombinante Enzyme von industriellem Interesse, die als Biokatalysatoren verwendet werden können, z. B. Lipasen, Hydrolasen, Nucleasen, Oxidasen und Phosphatasen.
Zu weiteren Gegenständen der Erfindung gehören die DNA-Sequenzen, die für die vorerwähnten Proteasen kodieren, die entsprechenden Expressionsplasmide und die Wirtszellen, die diese enthalten.
Die erfindungsgemäße Kex1-protease von Kluyveromyces lactis wurde erhalten, indem man für die Expression von Varianten der Kex1-Protease, die frei von der Domäne für die Verankerung an der Membran sind, zur Expression in der Hefe Saccharomyces cerevisiae veranlasste. Die Sekretion im Wachstumsmedium der ss-Kex1-Proteasen wurde entweder mittels der homologen Prä-pro-region oder mittels der Prä-pro-region des homologen Kex2-Proteins von S. cerevisiae sowie dank der (prä)-Signalsequenz der Glucoamylase von Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus erreicht. Aufgrund dieser Studien wird überraschenderweise festgestellt, dass die katalytischen Domänen von Kex1 und Kex2 funktionelle Unterschiede aufweisen, was durch die Feststellung nachgewiesen wurde, dass das Kex1-Protein, das mit dem Rest 580 endet, katalytisch inaktiv ist, im Gegensatz zum Kex2-Protein, das mit dem Rest 593 endet, was den entsprechenden Rest im Kex2-Protein darstellt (Gluschankof et al., EMBO J., Bd. 13 (1994), S. 2280–2288). Es wurde auch nach Wachstumsbedingungen, die für die Produktion und Sekretion der Protease in einem Kolben geeigneter sind, gesucht.
Lösliche Kex1's wurden aus dem Wachstumsmedium gereinigt und einige ihrer biochemischen Eigenschaften wurden bestimmt, einschließlich der Schneidewirkungsgrad an Modellsubstraten und die Stabilität und katalytische Aktivität in Gegenwart von verschiedenen physikochemischen Mitteln, wie die Temperatur.
Die auf diese Weise erhaltenen ss-Kex1-Proteasen können als solche verwendet werden oder sie können an einer unlöslichen organischen oder anorganischen Matrix immobilisiert werden. Die auf diese Weise immobilisierten Proteasen können mehrmals bei der in vitro-Prozessierung von Fusionsproteinen von gewerblichem Interesse verwendet werden, was offensichtliche Vorteile mit sich bringt.
Die thermische Stabilität der neuen löslichen, sezernierten ss-Kex1-Endopeptidasen ist so beschaffen, dass sie nach einer 6-minütigen Inkubation bei 50°C etwa 60% oder mehr ihrer ursprünglichen Aktivität behalten, d. h. unter Bedingungen, bei denen die entsprechenden Kex2-Proteine ihre Aktivität vollständig verlieren.
Die geschätzte Molekülmasse der erfindungsgemäßen neuen ss-Kex1-Endopeptidase beträgt etwa 65–70 kDa (aus dem Stamm NP31 erzeugtes Enzym) und 70 bis 80 kDa (aus dem Stamm NP168 erzeugtes Enzym), und zwar bei Bestimmung durch SDS-PAGE nach Erwärmen und Reduktion der Probe.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von speziellen Beispielen erläutert. Die Beispiele dienen lediglich der Klarstellung der Erfindung, sind aber in keiner Weise als eine Beschränkung anzusehen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die strukturelle Organisation in Domänen des Kex2-Proteins, das einen typischen Vertreter und das erste identifizierte Mitglied der Familie der prozessierenden Kexin-analogen Subtilasen darstellt.
2 zeigt die Ausrichtung der Proteinsequenzen von Kex2 aus S. cerevisiae und Kex1 aus K. lactis.
3 zeigt die thermische Stabilität der Proteasen ss-Kex2 aus S. cerevisiae und ss-Kex1 aus K. lactis.
4 zeigt das Aktivitätsprofil als Funktion der Temperatur der Proteasen ss-Kex2 aus S. cerevisiae und ss-Kex1 aus K. lactis.
5 zeigt das Elutionsprofil bei RP-HPLC eines gereinigten Präparats einer erfindungsgemäßen löslichen ss-Kex1-Protease.
6 zeigt die in vitro-Verdauungskinetik eines Fusionsproteins, das mit einer erfindungsgemäßen löslichen ss-Kex1-Protease erhalten worden ist.
7 zeigt das in vitro-Verdauungsprofil eines Fusionsproteins, das mit einer erfindungsgemäßen immobilisierten ss-Kex1-protease erhalten worden ist.
Beispiele
Beispiel 1
Konstruktion von Plasmiden für die Expression von Kex1 aus Kluyveromyces lactis in Saccharomyces cerevisiae
Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden für sämtliche üblichen Manipulationen der rekombinanten DNA herkömmliche Verfahren herangezogen. Eine Zusammenstellung derartiger Maßnahmen findet sich beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning, (1989).
Um Plasmide für die Expression in S. cerevisiae von geschnittenen Varianten der COOH-terminalen Region der Kex1-Protease von K. lactis unter der Kontrolle verschiedener Signalsequenzen zu konstruieren, wurden PCR's mit geeigneten mutagenen Oligonucleotiden unter Einhaltung üblicher Subklonierungsverfahren durchgeführt. Bei den erfindungsgemäß verwendeten Expressionsvektoren handelte es sich um pEMBLyex4 (Baldari et al., EMBO J., Bd. 6 (1987), S. 229–234), pVTU (Vernet et al., Gene, Bd. 52 (1987), S. 225–233) und YEPSTA (Martegani et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Bd. 37 (1992), S. 604–608). Die Plasmide, die Kexine aus diesen Derivaten exprimieren, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Auf der Grundlage der in dieser Tabelle gegebenen Informationen ist es für den Fachmann möglich, die vorerwähnten Plasmide ohne übermäßigen experimentellen Aufwand zu konstruieren. In diesem Patent wird auf die folgenden Protein- und Nucleinsäuresequenzen Bezug genommen: (KEX1-Gen, EMBL-Hinterlegungsnummer X07038; Kex1-Protein, Swiss-Prot-Hinterlegungsnummer 09231; KEX2-Gen, EMBL-Hinterlegungsnummer M22870; Kex2-Protein, Swiss-Prot- Hinterlegungsnummer P13134). Im nachstehenden Text bezieht sich der Ausdruck Nucleotid 1 auf das Adenin-nucleotid (A), das dem Translationsstartkodon (ATG) eines jeden angegebenen Gens, das für Proteasen kodiert, entspricht; gleichermaßen bezieht sich der Ausdruck Aminosäure 1 auf das durch das Startkodon kodierte Methionin. In analoger Weise zur vorstehenden Beschreibung für Kex2 werden die löslichen und enzymatisch aktiven, reifen Formen von Kex1, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, zunächst in Form von inaktiven Prä-pro-proteinen exprimiert, die anschließend an der Lys101-Arg102-Stelle (wenn das homologe Pro-protein verwendet wird) oder an der Lys-113-Arg-114-Stelle (wenn das kex2-Pro-protein verwendet wird) prozessiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die löslichen und enzymatisch aktiven, reifen Formen von Kex1 dadurch charakterisiert, dass sie eine Polypeptidkette zwischen der Aminosäure 103 und der Aminosäure 643 der in 2 angegebenen Sequenz aufweisen. Sie sind mit der ss-Kex1-Cx-Terminologie bezeichnet, wobei x den Aminosäurerest der Sequenz von 2 wiedergibt, der den carboxyterminalen Rest der löslichen Formen von Kex1 darstellt. Lediglich als Beispiel ist die Konstruktion des PL24-Plasmids, das die Kex1-C600-Protease exprimiert, detailliert beschrieben. Da die DNA-Sequenzen bekannt sind, erfolgt die Konstruktion von derartigen Plasmiden im Rahmen des üblichen Fachwissens eines Fachmanns und kann auch gemäß Strategien und Techniken durchgeführt werden, die sich von den beispielhaft angeführten Strategien und Techniken unterscheiden, die aber im Hinblick auf die Gewinnung des oder der erwarteten Produkte gleichwertig sind.
Um das Plasmid für die Expression des Kex1-C600 zu konstruieren, das an der Aminosäure 600 geschnitten ist, wobei dieser Rest der Aminosäure 613 in Kex2-Protein, das durch das KEX2-Gen von S. cerevisiae kodiert wird, entspricht, wurde die Sequenz, die für die Reste 1–600 von Kex1 kodiert, durch PCR mit den nachstehend angegebenen Oligonucleotiden amplifiziert (die Nucleotide, die die Restriktionsstellen für BamHI und HindIII darstellen, sind unterstrichen):
Am Ende der PCR wurde das amplifizierte Fragment der Restriktion mit den Endonucleasen BamHI und HindIII unterworfen, nach präparativer Elektrophorese mit Agarosegel gereinigt und in den Expressionsvektor pEMBLyex4, der vorher mit BamHI und HindIII linearisiert worden war, subkloniert, was es ermöglichte, das Plasmid pL24 zu erhalten, das die Expression des Kex1-C600-Proteins in Hefe unter der Kontrolle des induzierbaren Hybridpromotors GAL1-10-CYC1 möglich machte.
Tabelle 1 Erfindungsgemäß verwendete Plasmide, die verschiedene Formen von kex1 exprimieren.
Beispiel 2
Expression und Sekretion des Kex1-Proteins von Kluyveromyces lactis in Saccharomyces cerevisiae
Verschiedene Stämme von S. cerevisiae wurden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Konstrukte transformiert, um die Expression von katalytisch aktiven und löslichen, sezernierten Formen der Kex1-protease von K. lactis zu erreichen. GRF18* (MATa his 3-11, 15 leu 2-3, 112 ura3); X4004 (MATa lys5 met2 ura3 trp1); MVY4935 (MATa sta10 leu2 ura3 arg4 his3 lys2); W303 1-a (MATa leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11,15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2). Das eingesetzte Tranformationsverfahren entspricht den Angaben von SchiestI und Gietz, Curr. Genet., Bd. 16 (1989), S. 369–346. Die zur Züchtung der Hefe in flüssigem Medium verwendeten Kolben wurden in einem thermostatisierten Dubnoff-Bad inkubiert und kontinuierlich bewegt. Die Züchtung auf einer Platte wurde in geeigneten Inkubatoren in einer feuchten Atmosphäre durchgeführt. Was die Verfahren der Hefebearbeitung betrifft, so wird immer dann, wenn die Verfahren nicht ausdrücklich beschrieben werden, auf C. Guthrie und G. R. Fink, Methods in Enzymology, Bd. 194, verwiesen.
Die tranformierten Zellen wurden auf selektives Minimalmedium (YNB) mit Glucose als Kohlenstoffquelle ausgestrichen und bei 30°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen wachsen die gentechnisch bearbeiteten Zellen ohne Erzeugung des Proteins von Interesse. Das Expressionssystem auf der Basis der pEMBLyex4-analogen Vektoren kann durch Galactose induziert werden, da das Protein von Interesse unter die Kontrolle des induzierbaren Hybridpromotors GAL-CYC gestellt wird und die Anwesenheit von Glucose im Kulturmedium einen Zustand der Repression der Expression herbeiführt. Dieses System sorgt für die Verwertung von Raffinose als Kohlenstoffquelle, um die Derepression zu ermöglichen, und für die Verwertung von Galactose, um den Induktionszustand zu gewährleisten. Ferner sorgt das Expressionssystem auf der Basis von pEMBLyex4-analogen Vektoren, die mit dem selektiven Marker leu2d versehen sind, für die Möglichkeit, die Anzahl der Kopien des Plasmids von Interesse weiter zu amplifizieren, wobei man sich, sofern der Genotyp des transformierten Stammes es erlaubt, der Selektion in leucinfreiem Minimalmedium bedient.
Die transformierten Stämme wurden in den folgenden Kulturmedien gezüchtet:
YP-reiches Medium: Kohlenstoffquelle 20 g/Liter; Pepton 20 g/Liter; Hefeextrakt 10 g/Liter.
YNB-Aminosäure-Minimalmedium: Kohlenstoffquelle 20 g/Liter; YNB ohne Aminosäuren 6,7 g/Liter.
Standard 1040-Medium: YNB ohne Aminosäuren und ohne Ammoniumsulfat 1,7 g/Liter; (NH₄)₂SO₄ 1,32 g/Liter; NH₄Cl 5,0 g/Liter; BIS-TRIS 8,37 g/Liter; Kohlenstoffquelle 20 g/Liter; L-Tryptophan 0,12 g/Liter; Adenin-HCl 0,24 g/Liter; Casaminsäuren 5,0 g/Liter. Gegebenenfalls wurden die Medien mit 2% Agar verfestigt. Nucleotidbasen und Aminosäuren wurden zur Erzielung von 50 mg/Liter zugesetzt.
Das Kulturmedium dieser transformierten Stämme wurde einer Aktivitätsmessung unterzogen, um die Anwesenheit einer katalytisch aktiven, sezernierten Form der Protease von Interesse nachzuweisen. Die Enzymaktivität wurde durch einen kolorimetrischen Test bestimmt, der sich der Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse des Substrats Z-L-Tyrosin-L-lysin-L-arginin-p-nitroanilid (Z-Y-K-R-pNA) bedient. Das Inkubationsgemisch umfasste 0,1 mM Z-Y-K-R-pNA in 0,2 M Hepes, pH-Wert 7,0 und 1 mM CaCl₂ in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml bei 37°C. Die Reaktion wurde bei 405 nm überwacht, einer Wellenlänge, bei der die maximale Abnahme des molaren Extinktionskoeffizienten (Δε), entsprechend 10,9 mM^–1cm^–1, erfolgt. Eine Enzymeinheit ist als die Enzymmenge definiert, die die Transformation von 1 μMol Substrat pro Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen katalysiert. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die in Tabelle 2 vorgelegten Daten auf die Aktivität, die im Wachstumsmedium durch Derivate des W303-Stammes sezerniert wurde, der in einem Kolben bei 30°C unter Rühren (220 U/min) in 1040-Medium-2% Galactose gezüchtet worden war (ausgenommen die Stämme NP255 und NP265, bei denen es sich bei der dem Wachstumsmedium zugesetzten Kohlenstoffquelle um 2% Glucose handelte). Verschiedene Proben wurden entlang der Wachstumskurve für jeden Stamm entnommen. In Tabelle 2 ist die maximale Aktivität, die für jeden transformierten Stamm gemessen wurde, angegeben. Es ist ersichtlich, dass sich gute Sekretionsniveaus sowohl dann beobachten lassen, wenn die Expression von Kex1 durch den GAL10-CYC1-Promotor geleitet wird, als auch dann, wenn der Promotor von Alkohol-dehydrogenase verwendet wird. Die Erfindung ist daher nicht auf den Typ des verwendeten Promotors beschränkt, sofern die Sekretiongrade der erfindungsgemäßen Endoprotease zufriedenstellend sind.
Tabelle 2 Maximale Kex1-Aktivität, die in das Wachstumsmedium in einem Kolben durch die Stämme von S. cerevisiae, die mit für verschiedene Formen der Kex1-Protease von K. lactis exprimierenden Plasmiden transformiert worden sind, sezerniert werden.
Es wurde festgestellt, dass der Ersatz der Prä-pro-sequenz von Kex1 durch die von Kex2 zu einem Protein führte, das im Wachstumsmedium ebenso gut wie das Kex1-Protein, das seine eigene Prä-pro-sequenz verwendete, sezerniert wurde. Umgekehrt führte der Ersatz der Prä-sequenz allein (Signalsequenz) durch die Signalsequenz der durch das STA2-Gen von Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus (Stamm NP33) kodierten Glucoamylase oder durch die Signalsequenz von Kex2 (Stamm NP157) zu einer verringerten Sekretion des Kex1-Proteins. In den Experimenten, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben werden, wurde daher das Protein verwendet, dessen Sekretion durch die Prä-pro-Sequenz von Kex1 oder Kex2 (Stämme NP31 bzw. NP231) geleitet wurde.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass der Stamm NP115, der ein Kex1 exprimiert, das mit der Aminosäure 580 endet, keine nachweisbare Enzymaktivität aufweist. Dieses Ergebnis wird im Gegensatz zur Aufrechterhaltung der Enzymaktivität an dem Teil des Kex2-Proteins, das mit der Aminosäure 593 endet, d. h. die Aminosäure von Kex2, die der Aminosäure 580 von Kex1 von K. Lactis entspricht (Gluschankof et al., a.a.O.; vergl. auch 2 bezüglich der Ausrichtung). Dieses Ergebnis bedeutet, dass trotz des hohen Homologiegrads die Proteine Kex1 von K. Lactis und Kex2 von S. cerevisiae sich erheblich voneinander unterscheiden, so dass sie nicht in sämtlichen Aspekten bezüglich der erfindungsgemäßen Ausführungsformen als Äquivalente angesehen werden können. Diesbezüglich sollten auch die Vergleichsdaten der Wärmestabilität und die Aktivitätsprofile als Funktion der Temperatur, die in den 3 bzw. 4 angegeben sind, berücksichtigt werden. Verglichen mit dem Protein, das in Stamm NP31 vorhanden ist, weisen die Stämme NP180, NP183, NP166 und NP168 carboxyterminale Erweiterungen auf, die dazu befähigt sind, die gesamte Domäne, die reich an Serin/Threonin ist, abzudecken, wobei ein Stopp unmittelbar vor der Transmembrandomäne erfolgt. Keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zum Stamm NP31 werden bei der Kex1-Aktivität beobachtet, die durch die vorerwähnten Stämme in das Wachstumsmedium sezerniert wird.
Beispiel 3
Reinigung des Kex1-Proteins von Kluyveromyces lactis, das durch in geeigneter Weise transformierte Saccharomyces cerevisiae-Stämme in das Wachstumsmedium sezerniert wird.
Die Reinigung der deletierten Variante der Kex1-Protease von K. Lactis-ss-Kex1-C600 wurde ausgehend von transformierten Stämmen von S. cerevisiae, die in einem Kolben oder in einem Fermenter bis zur späten exponentiellen Phase gezüchtet worden waren, durchgeführt. In beiden Fällen wurde das Medium von den Zellen durch Zentrifugation getrennt, über ein Filter mit Poren von 5 μm filtriert und sodann gegen eine Lösung von 0,1% Triton X-100, 4 mM CaCl₂ durch Ultrafiltration an einer Membran mit einer Auschlussgrenze von 10 kDa etwa 10-fach eingeengt und dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde an einer Säure mit SP-Sepharose-Harz, die mit Natriumacetat-Puffer vom pH-Wert 5,2 voräquilibriert worden war, gereinigt und mittels eines linearen pH-Gradienten in Tris-acetat-Puffer eluiert. Die die Enzymaktivität von Kex1 enthaltenden Fraktionen wurden auf eine Säule von Q- Sepharose-Harz, die mit Bis-tris-acetat-Puffer voräquilibriert worden war, aufgesetzt und mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert. Die vereinigten Fraktionen, die die Enzymaktivität von kex1 enthielten, wurden durch RP-HPLC analysiert. Die RP-HPLC-Analyse wurde unter Verwendung einer Vydac-C18-Säule, 2,1 × 250 mm, bei einer Temperatur von 55°C und unter UV-Nachweis bei einer Wellenlänge von 215 nm durchgeführt; die Elution wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,21 ml/min beginnend mit der mobilen Phase A (0,1% Trifluoressigsäure in Wasser) und B (0,08% Trifluoressigsäure in Acetonitril) bei einem linearen Gradienten von 37% bis 87% der mobilen Phase B innerhalb von 21 Minuten durchgeführt. Die Analyse zeigte die Anwesenheit eines homogenen Peaks mit einer Reinheit von mehr als 95% (5) und eine spezifische Aktivität von etwa 100 U/mg.
Beispiel 4
Charakterisierung des Kex1-Proteins von Kluyveromyces lactis
Die kinetischen Konstanten wurden durch ein vereinfachtes Verfahren bestimmt, das es notwendig macht, die Messungen bei einer einzigen Anfangskonzentration des Substrats bis zum Verbrauch des Substrats durchzuführen. Das Verfahren sieht vor, dass zu verschiedenen Zeitpunkten die Mittelwerte der restlichen Konzentration und der Geschwindigkeit zu bestimmen sind. Das Verfahren ist auf Fälle anwendbar, bei denen das Enzym einer vollständig irreversiblen Reaktion unter Arbeitsbedingungen und nicht einer Produkthemmung unterliegt (I. H. Segel, Enzyme Kinetics, Wiley, New York (1975)). Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse wurden unter Verwendung des Grafit-Programms verarbeitet, das die Interpolation des Michaelis-Menten-Profils und die Bestimmung der Werte von K_m und V_max (in Tabelle 3 aufgeführt) ermöglicht. K_cat und das k_cat/K_m-Verhältnis wurden sodann aus diesen Werten und aus der Enzymkonzentration ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden Proteasen ss-Kex1 und ss-Kex2 sich in ihren kinetischen Eigenschaften nicht signifikant unterscheiden.
Tabelle 3 Kinetische Konstanten der Endoproteasen ss-Kex2-C613 und ss-Kex1-C600
Unter den hauptsächlichen Eigenschaften eines Enzyms, die für eine gewerbliche Anwendung als Biokatalysator erforderlich sind, stellt die Stabilität unter den Arbeitsbedingungen sicher eine der wichtigsten Eigenschaften dar. Es ist daher ersichtlich, dass es notwendig ist, die beiden Proteasen auch diesbezüglich zu untersuchen und zu charakterisieren. Wir bestimmten zunächst das Profil der thermischen Inaktivierung der beiden Enzyme bei verschiedenen Temperaturen in Abwesenheit von jeglichem Stabilisierungsmittel. Das Profil wurde erhalten, indem das Enzym bei der vorgegebenen Temperatur inkubiert wurde, wobei zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten Proben entnommen wurden und die restliche Enzymaktivität in den Proben bestimmt wurde. Der Abfall der Aktivität als Funktion der Zeit (wobei angenommen wird, dass die Aktivität proportional zur Konzentration des aktiven Enzyms ist) wird auf diese Weise bestimmt.
Die Inaktivierungsprofile der beiden Proteasen wurden bei Temperaturen von 10 bis 50°C aufgestellt. Die Daten sind in 3 aufgeführt und zeigen, dass überraschenderweise die ss-Kex1-Protease eine thermische Stabilität aufweist, die signifikant höher als die der ss-Kex2-protease ist: beispielsweise wurde das letztgenannte Produkt nach 6-minütiger Inkubation bei 50°C fast vollständig inaktiviert, während unter den gleichen Bedingungen Kex1 50% seiner Aktivität behielt. Die Inaktivierungsprofile der Kex1-Protease bei 60 und 70°C und zum Vergleich das Profil von Kex2 bei 50°C zeigen ferner den erheblichen Unterschied der Thermostabilität zwischen den beiden Molekülen: es ist klar ersichtlich, dass die ss-Kex1-protease bei 70°C in etwa ebenso stabil ist wie das ss-Kex2-Protein bei 50°C.
Wenn ss-Kex1 und ss-Kex2 unter standardmäßigen Bedingungen bei Sättigungskonzentrationen des Substrats und unter Messen der durchschnittlichen Geschwindigkeit in den ersten 5 Reaktionsminuten dosiert wurden, wies das Kex1-Protein eine optimale Funktionstemperatur von etwa 70°C auf, während unter den gleichen Bedingungen die scheinbare optimale Arbeitstemperatur der Kex2-Endopeptidase etwa 50°C betrug (4).
Beispiel 5
Verwendung des Kex1-Proteins von Kluyveromyces lactis bei der Bearbeitung von Fusionsproteinen
Die Bearbeitung von Fusionsproteinen wurde durchgeführt, indem man als Modellprotein ein Fusionsprotein aus einer Peptidsequenz mit 35 Aminosäuren, die das Lys-Arg-Dipeptid am carboxyterminalen Ende und die Sequenz mit 191 Aminosäureresten des humanen Wachstumshormons (h-GH) trägt, untersucht. Das Fusionsprotein mit der Struktur (Peptidteil)-(Lys-Arg)-(h-GH) war in einem transformierten Stamm von E. coli exprimiert, extrahiert und bis zu einem Reinheitsgrad von mehr als 70% gereinigt worden. Die Hydrolyse des Fusionsproteins (1 g/Liter) wurde für eine gesamte Zeitspanne von 18 Stunden in einem Puffer vom pH-Wert 7 mit einem Gehalt an 4 mM Ca²⁺ bei einer Temperatur von 30°C und unter Verwendung von 0,2 mg/Liter eines gereinigten ss-Kex1₆₀₀ΔC-Präparats durchgeführt. Der Reaktionsfortschritt wurde durch RP-HPLC-Analyse überwacht, die eine Reaktionsausbeute von mehr als 95% ergab (6). Die Spezifität der Hydrolyse wurde durch Analyse der NH₂-terminalen Sequenz des Reaktionsprodukts geprüft, die die erwartete Sequenz für h-GH ergab. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn h-GH mit den Polypeptiden von unterschiedlicher Länge fusioniert wurde (20 bis 300 Aminosäurereste).
Beispiel 6
Immobilisierung der Kex1-Protease und deren Verwendung bei der Prozessierung von Fusionsproteinen
Die ss-Kex1-Protease wurde unter Verwendung von Eupergit C250L-Harz als anorganischem festen Träger immobilisiert, wobei die Epoxygruppen des Harzes als reaktive Gruppen für die Bildung von kovalenten Bindungen mit den Amino-, Thiol- oder Hydroxylgruppen des Enzyms wirken. Dadurch wird die strukturelle Flexibilität des Enzyms verringert, was dessen Stabilisierung fördern sollte. Das Inkubationsgemisch umfasste 789 μg Enzym in 1 M Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 in Gegenwart von 8 mg Eupergit C250L-Harz in einem Gesamtvolumen von 55 μl, wobei 4 Tage bei Umgebungstemperatur ohne Bewegen inkubiert wurde. Am Ende der Inkubationsperiode wurde das immobilisierte Enzym aufeinanderfolgenden Waschvorgängen mit dem Dosierungspuffer 0,2 M Hepes, pH-Wert 7,0, +1 nM CaCl₂ unterworfen und bei 4°C in Gegenwart einer Lösung von 0,2 M Hepes, pH-Wert 7,0, 1 mM CaCl₂/60% Glycerin aufbewahrt.
Das immobilisierte Kex1-Protein wurde bei der Prozessierung eines Fusionsproteins PNP20aa-hGH (aa = Aminosäuren) verwendet, wobei das letzgenannte Produkt bei 37°C in einem Verhältnis von 10:1 mit dem immobilisierten Enzym inkubiert wurde. Unter diesen Bedingungen wurde die Prozessierung des Proteins für eine Zeitspanne von 10 Minuten bis 15 Stunden durch SDS-PAGE fortgesetzt. Nach 6-stündiger Inkubation ergab sich ein Verdau von etwa 60% des fusionierten Proteins und ein fast vollständiger Verdau wurde nach 15 Stunden erreicht (7). Eine anschließende Wiederverwendung des gleichen Präparats der immoblisierten Kex1-Protease unter identischen Arbeitsbedingungen führte zu einem Ergebnis, das fast identisch mit dem vorstehenden Ergebnis war, was zeigt, dass unter den angewandten Bedingungen die immobilisierte Kex1-Protease auch nach 30-stündiger Inkubation bei 37°C keinem merklichen Aktivitätsverlust unterliegt und bei der Freisetzung des Proteins von Interesse aus dem Fusionspartner erneut verwendet werden kann.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Lösliche Kex1-Endoprotease mit einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz entspricht, die durch das KEX1-Gen von Kluyveromyces lactis (EMBL Hinterlegungsnummer X07038) kodiert wird und frei von der Transmembrandomäne ist, wobei mindestens 57 und nicht mehr als 100 Aminosäurereste vom C-terminalen Ende entfernt worden sind.
Lösliche Kex1-Endoprotease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Sequenz SEQ ID NO: 2 oder eine Sequenz mit einer Homologie von 90% und vorzugsweise von 95% zu SEQ ID NO: 2 aufweist.
DNA, kodierend für eine lösliche Kex1-Endoprotease nach Anspruch 1.
DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie (a) die Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, (b) eine Sequenz aufweist, die mit SEQ ID NO: 1 hybridisiert, (c) eine Sequenz aufweist, die als Folge des genetischen Codes zur DNA mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 degeneriert ist und/oder (d) eine Sequenz mit einer Homologie von 90% und vorzugsweise von 95% zu SEQ ID NO: 1 aufweist.
Plasmidexpressionsvektor, umfassend DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 4.
Wirtszellen, transformiert durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 5.
Wirtszellen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Hefezellen handelt.
Wirtszellen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Saccharomyces cerevisiae-Hefezellen handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Proteins, umfassend: (a) die Herstellung eines Fusionspolypeptids oder -proteins, das die Sequenz des Peptids oder Proteins von Interesse umfasst und am NH₂-terminalen Ende des Peptids oder Proteins von Interesse eine Aminosäuresequenz mit einer Dipeptidstelle aufweist, die durch die Endoprotease nach Anspruch 1 bis 2 hydrolysierbar ist; (b) die in vitro-Inkubation des Fusionspolypeptids oder -proteins der vorstehenden Stufe (a) in Gegenwart einer Endoprotease nach den Ansprüchen 1 bis 2; (c) die Abtrennung und Reinigung des Peptids oder Proteins von Interesse.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der hydrolysierbaren Dipeptidstelle um Lys-Arg, Arg-Arg oder Pro-Arg handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid oder Protein aus rekombinanten Proteinen für die therapeutische Anwendung ausgewählt ist, beispielsweise aus Peptidhormonen, Interleukinen, Interferonen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, fibrinolytischen Enzymen und rekombinanten Enzymen von industriellem Interesse, die als Biokatalysatoren verwendbar sind, z. B. Lipasen, Hydrolasen, Nucleasen, Oxidasen und Phosphatasen.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Endoprotease nach den Ansprüchen 1 bis 2 an einem unlöslichen organischen oder anorganischen Träger immobilisiert ist.