ES2265454T3 - Nuevas endoproteasas solubles para el procesamiento in vitro de proteinas recombinantes. - Google Patents
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Abstract
Una endoproteasa Kex1 soluble que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen KEX1 de Kluyveromyces lactis (número de acceso de EMBL X07038) y sin dominio transmembranal, en la que se han eliminado al menos 57 y no más de 100 restos de aminoácidos del extremo C-terminal.
Description
Nuevas endoproteasas solubles para el
procesamiento in vitro de proteínas recombinantes.
La presente invención se refiere a nuevas
endopeptidasas que tienen una alta especificidad de corte para usar
en el procesamiento in vitro de proteínas recombinantes que
se pueden usar en aplicaciones industriales y, más en particular, a
derivados de la proteína Kex1 de Kluyveromyces lactis
secretados solubles y a su uso, en una forma soluble o en una forma
inmovilizada en un soporte orgánico o inorgánico, para la liberación
de la proteína de interés a partir de proteínas de fusión.
La fabricación de proteínas recombinantes
heterólogas en sistemas de expresión adecuados es una de las
aplicaciones principales de interés industrial de la tecnología de
ADN recombinante. Debido a la inestabilidad del péptido/proteína en
la célula hospedante, a menudo es ventajoso fabricar el
péptido/proteína de interés en forma de una proteína de fusión que
comprende una proteína protectora (o estabilizante) la cual
posteriormente será procesada en un sitio predeterminado específico
con el fin de liberar la proteína o péptido deseados.
Ese procedimiento también permite obtener la
proteína o péptido deseados sin la extensión de un resto de
metionina N-terminal que constituye el primer resto
de aminoácido de las proteínas expresadas en sistemas bacterianos.
Las proteínas de fusión también se fabrican con el objetivo de
aumentar los niveles de expresión o de facilitar el procedimiento
de purificación por la selección de secuencias de polipéptidos
adecuadas, en los extremos amino y carboxi terminales a los cuales
se une la proteína de interés.
El éxito de esta estrategia requiere la
disponibilidad de reactivos químicos o enzimáticos, que puedan
realizar el procesamiento de la proteína de fusión con el nivel
deseado de especificidad, de ser posible sin la liberación de
ningún producto secundario, para así reducir el coste del
procesamiento corriente abajo. De los procedimientos químicos
propuestos, se puede mencionar el corte en los restos de metionina
con CNBr, la hidrólisis ácida en el dipéptido
Asn-Pro o el corte con hidroxilamina en el dipéptido
Asn-Gly (Fontana y col.; Practical protein
chemistry. A handbook., pág. 5569-575, 1986). Los
procedimientos enzimáticos usan, por ejemplo,
lisil-endopeptidasas (proteasa I de Achromobacter)
que cortan específicamente el enlace peptídico del extremo carboxilo
de la lisina, y la proteasa V8 de estafilococos que corta
específicamente el enlace peptídico del extremo carboxilo del ácido
glutámico (publicación de patente japonesa examinada publicada nº
6-87788). Sin embargo, debido a que estos
procedimientos químicos y las endoproteasas reconocen un solo resto
de aminoácido, es necesario que el resto de aminoácido no esté
presente en el péptido deseado con el fin de permitir la escisión
eficaz del péptido deseado de la proteína quimérica; así pues, los
péptidos que se pueden fabricar son limitados. Por lo tanto,
diferentes estudios se han dirigido a la búsqueda para y/o al diseño
de proteasas que tienen una especificidad de sustrato adecuada para
usar en el corte proteolítico específico in vitro de
proteínas recombinantes de interés industrial. Se han usado otras
endoproteasas que tienen una secuencia de corte que es más
restringida, es decir, que cubre una secuencia de aminoácidos, y no
un solo resto, e incluyen, por ejemplo, trombina, factor Xa y
enteroquinasa (Nilsson y col., Current Opinion Struct. Biol.
2, 569-575, 1992).
Más recientemente, se ha centrado un
considerable interés en algunos miembros de la familia de las
subtilasas, o serina proteasas, cuyos miembros más conocidos son:
(1) subtilisinas bacterianas, (2) la proteasa Kex2 de S.
cerevisiae, (3) furina y proteínas análogas a la furina. En
particular, aunque las subtilisinas bacterianas no presentan una
especificidad de corte suficiente para el procesamiento in
vitro de proteínas de fusión, excepto en variantes diseñadas de
forma adecuada (Ballinger y col., Biochemistry 35,
13579-13585, 1996; patente de EE.UU. 5.837.516),
tanto la proteína Kex2 como las furinas presentan una especificidad
de corte adecuada para este propósito. Las subtilasas que tienen
una especificidad de corte alta, que se denominarán en lo sucesivo
con la expresión proteasas análogas a kexino, tienen la función
molecular/fisiológica de "convertasas de prohormonas"; es
decir, son enzimas que producen hormonas peptídicas a partir de sus
precursores in vivo, por corte proteolítico en el extremo
C-terminal de pares de los restos de bases
Lys-Arg o Arg-Arg. La Fig. 1 muestra
en un diagrama la estructura de proteasas análogas a kexino. El
dominio catalítico análogo a la subtilisina que se extiende en
aproximadamente 330 aminoácidos es altamente conservado entre las
convertasas de proproteínas eucarióticas. En particular, los restos
del sitio activo que constituye la tríada catalítica
(Ser-His-Asp) y un resto de Asn que
estabiliza la cavidad oxianiónica en el estado de transición, están
presentes en las posiciones correspondientes en todos los miembros,
excepto en PC2, en el que el resto Asn está sustituido por un resto
Asp (Bryan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:
3743-3745, 1986).
Las secuencias que flanquean estos restos
también son muy conservadas. Además, la región de 140 aminoácidos
que sigue al dominio catalítico, conocido como dominio "Homo
B", "P" o "medio", también es muy
conservado entre las convertasas eucarióticas, incluyendo la
proteasa de levadura Kex2, pero está ausente en las subtilisinas
bacterianas. El domino Homo B es esencial para la actividad
catalítica (Zhong y col., FEBS Lett.,
396:31-36. 1996). El dominio contiene una secuencia
Arg-Gly-Asp conservada que se parece
a la secuencia de reconocimiento de las integrinas. La mutación de
uno de estos tres restos en PC1/PC3 produce la pérdida de actividad
catalítica y la dirección incorrecta de esta convertasa
neuroendocrina hacia la ruta de secreción constitutiva (Lusson y
col., Biochem. J., 326: 737-744, 1997). Otra
región conservada es el pro-péptido, que se elimina
autocatalíticamente por procesamiento del sitio
Arg-Xaa-Lys-Arg
durante la maduración de las convertasas. Hacia el extremo
C-terminal, la furina, PACE4, PC5/PC6A y B tienen
un dominio rico en Cys, que está bien conservado y cuya función
hasta ahora ha sido desconocida. La furina Kex2, PC5/PC6B y
LPC/PC7/PC8/SPC7 también tienen un dominio transmembranal cerca del
extremo C-terminal.
La endoproteasa Kex2 de la levadura
Saccharomyces cerevisiae fue la primera enzima mostrada,
cuyas pruebas genéticas y bioquímicas han permitido atribuirle la
función de procesamiento de proproteínas en sitios de
di-bases en el retículo trans-Golgi.
El gen KEX2 codifica una glicoproteína de
814 restos de aminoácidos con una masa molecular de 100 a 120 kDa.
Esta glicoproteína está unida a las membranas del retículo
trans-Golgi y tiene la función fisiológica de procesar el
factor \alpha y la toxina asesina. La proteína Kex2 es una serina
proteasa dependiente de calcio que corta específicamente los
enlaces peptídicos en el extremo C-terminal de las
secuencias Lys-Arg, Arg-Arg y
Pro-Arg (Mizuno y col., Biochem Biophys. Res.
Comm. 144: 807-814, 1987). La secuencia de
aminoácidos de Kex2 en la parte de
NH_{2}-terminal contiene un dominio
pre-pro que tiene potenciales sitios
autoproteolíticos (Lys_{79}-Arg_{80},
Pro_{102}-Arg_{103} y
Lys_{108}-Arg_{109}) seguido de una región
(144-438 aa) que tiene un alto grado de homología
de secuencia (identidad del 30%) con las subtilasas bacterianas
(Mizuno y col., Biochem Biophys. Res. Comm. 156:
246-254, 1988; Fuller y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 86: 1434-1438, 1989). La proteasa
Kex2 es expresada en las células MAT\alpha de la levadura
S. cerivisiae como un precursor inactivo y la región
NH_{2}-terminal de la forma madura es generada por
procesamiento proteolítico en el sitio
Lys_{108}-Arg_{109}, seguido de corte
proteolítico de los dipéptidos Leu-Pro y
Val-Pro por la enzima
dipeptidil-aminopeptidasa Ste13 (Brenner y Fuller,
Proc. Natl. Sci. USA, 89:922-926, 1992).
La proteasa Kex2 catalíticamente activa de S.
cerivisiae se purificó de la levadura en forma de una enzima
soluble secretada (ss-Kex2) generada por la
inserción de un codón de parada antes del dominio transmembranal
COOH-terminal. Esta modificación facilitaba la
purificación de la enzima. Los estudios sobre la especificidad del
sustrato de la proteasa ss-Kex2 de S.
cerivisiae purificada, han demostrado que la proteasa no excluye
ningún resto en la posición P3, excepto Asp y Pro, pero por otra
parte, es selectivo para los aminoácidos en la posición P2 y P1. En
particular Kex2 en la posición P2 excluiría los aminoácidos que
tienen cadenas voluminosas, pero sin embargo, reconocería las que
tienen restos cargados positivamente, mientras que en la posición
P1, la endoproteasa Kex2 es extremadamente selectiva para la carga y
para la estructura de la arginina. El documento
EP-32377 describe proteasas Kex2 de S.
cerivisiae que no tienen la región hidrófoba
C-terminal; estas proteasas son solubles en agua y
pueden ser secretadas fuera de la célula, dejando sin alterar la
actividad enzimática de la proteína nativa.
Algunas cepas de Kluyveromyces lactis
presentan un fenotipo asesino que secreta una toxina capas de
asesinar células sensibles de diferentes especies de levaduras.
Esta propiedad asesina se debe a la presencia de dos plásmidos de
ADN lineal, pGKL1 y pGKL2, que cooperan para producir la toxina, y
un componente que permite su inmunidad. Se aisló una mutación
(kexl) en un solo locus del cromosoma de K. lactis,
llamado KEX1, cuya mutación conduce a la pérdida del
fenotipo asesino, mientras que permite que se mantengan los
plásmidos mencionados.
Se encontró que el gen KEX1 clonado por
complementación genética de la mutación anterior, era ortólogo al
gen KEX2 de Saccharomyces cerevisiae. Las proteínas
codificadas por los genes KEX2 de S. cerevisiae y
KEX1 de K. lactis tienen un grado alto de homología
de secuencia (identidad > 50%), y cada una de ellas es capaz de
compensar la deficiencia de la otra. Esta información sugiere que el
gen KEX1 de Kluyveromyces lactis
(Weslowski-Louvel y col., Yeast 4:
71-81, 1988) también codifica una proteasa que tiene
especificidad de corte para los residuos de dibases y que está
implicado en la producción de la forma madura de la toxina asesina
generada por procesamiento de su precursor. Sin embargo, hasta
ahora no se han tenido datos disponibles relacionados con la
expresión del producto del gen KEX1, ni tampoco se ha tenido
ningún dato disponible relativo a la caracterización bioquímica y
enzimática de esta proteína.
Ahora se ha encontrado que las proteasas Kex1
recombinantes de K. lactis, que constituyen el objetivo
principal de la presente invención, no tienen el dominio
transmembranal (y se denominarán con el término
ss-Kex1), y manifiestan actividad catalítica de
endopeptidasa in vitro respecto a sustratos que contienen los
restos Pro-Arg y los restos de dibases, en
particular, respecto a los restos Arg-Arg,
Lys-Arg. Sorprendentemente también se ha encontrado
que las proteasas Kex1 recombinantes cuya secuencia de proteínas,
excepto por las deleciones que comprenden el dominio de unión a la
membrana (posiblemente excepto por las deleciones que comprenden el
dominio de unión a la membrana), corresponde a la codificada por el
gen KEX1 de K. lactis, demuestran una estabilidad
térmica sustancialmente mayor comparadas con las proteínas de la
misma familia, cuya secuencia de proteína corresponde a la
codificada por el gen KEX2 de S. cerevisiae, y por lo
tanto se pueden usar en procedimientos de proteolisis dirigida
in vitro en condiciones en las que otras proteínas de la
familia kexina, en particular Kex2 de S. cerevisiae, son
inactivadas.
De acuerdo con la presente invención las
proteasas Kex1 solubles se caracterizan por una estabilidad mayor
comparadas con las correspondientes variantes codificadas por el gen
KEX2 de S. cerevisiae, manteniendo las proteasas Kex1
solubles más de 50% de su actividad en condiciones en las que la
proteína Kex2 está completamente inactivada.
Como podrá observarse a partir de lo siguiente,
en las endoproteasas Kex1 solubles de acuerdo con la presente
invención, la deleción del dominio transmembranal se logra
eliminando al menos 57 restos aminoácidos del extremo
C-terminal de la enzima codificada por el gen
KEX1 de K. lactis; la secuencia génica usada
experimentalmente es la disponible del banco de datos EMBL con el
número de acceso X07038.
En particular, la endoproteasa Kex1 soluble de
acuerdo con la realización preferida de la presente invención, se
caracteriza por tener la secuencia ID SEC nº 2, o en cualquier caso
por tener una secuencia con una homología de 90%, preferiblemente
una homología de 95% con respecto a la ID SEC nº 2.
La presente invención está representada por una
molécula de ADN que codifica una endoproteasa Kex1 soluble, en la
que se han eliminado al menos 57 y no más de 100 restos de
aminoácido del extremo C-terminal.
De acuerdo con una realización preferida dicha
molécula de ADN se caracteriza porque (a) tiene una secuencia ID
SEC nº 1, (b) tiene una secuencia que hibrida con la ID SEC nº 1,
(c) tiene una secuencia que es degenerada como resultado del código
genético respecto al ADN que tiene la secuencia ID SEC nº 1, y/o (d)
tiene una secuencia con una homología de 90%, preferiblemente una
homología de 95%, con respecto a la ID SEC nº 1.
Un objetivo adicional de la invención lo
constituye un procedimiento para fabricar una sustancia
biológicamente activa de interés (un péptido o una proteína), que
comprende:
(a) la producción de un polipéptido o proteína
de fusión que comprenden la secuencia del péptido o proteína de
interés en una construcción de tipo
NH_{2}-A-B-C-COOH,
en la que NH_{2} es el extremo NH_{2}-terminal
del polipéptido o proteína de fusión, A es cualquier proteína o
polipéptido deseado (opcionalmente sólo la metionina codificada por
el codón de iniciación de la traducción), B es un fragmento
"conector" de unión que termina con una secuencia de
aminoácidos reconocida por la endoproteasa Kex1 de la presente
invención, C representa el polipéptido o proteína de interés, de
modo que el primer aminoácido de la proteína madura de interés está
inmediatamente en el extremo carboxilo de la secuencia reconocida
por la endopeptidasa Kex1 de acuerdo con la presente invención y
COOH representa el extremo carboxi-terminal del
polipéptido o proteína de fusión;
(b) la incubación in vitro del
polipéptido o proteína de fusión mencionados en la etapa (a)
anterior en presencia de una endoproteasa Kex1 de acuerdo con la
presente invención, con el fin de separar la proteína o polipéptido
de interés de la pareja de fusión y con el extremo
NH_{2}-terminal libre correspondiente al extremo
NH_{2}-terminal de la proteína o polipéptido de
interés;
(c) la separación y purificación del péptido o
proteína biológicamente activos de interés.
Los procedimientos para llevar a cabo las
operaciones (a), (b) y (c) listadas antes son conocidas en la
técnica, y por lo tanto no es necesario explicarlas con detalle;
están descritas, por ejemplo, en los documentos
EP-327377, EP-794254,
EP-794255 y US-5.077.204, cuyo
contenido debe considerarse como una parte integrante de la presente
descripción.
Las endoproteasas de acuerdo con la presente
invención se pueden usar para procesar proteínas de fusión que
contienen péptidos o proteínas de interés industrial y/o
terapéutico; las posibles proteínas que se pueden obtener usando el
procedimiento de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo,
proteínas recombinantes para uso terapéutico, tales como, por
ejemplo, hormonas peptídicas, interleucinas, interferones,
citocinas, factores de crecimiento, enzimas fibrinolíticas y
enzimas recombinantes de interés industrial que se pueden usar como
biocatalizadores, tales como, por ejemplo, lipasas, hidrolasas,
nucleasas, oxidasas, fosfatasas.
Otros objetivos de la invención están
representados por las secuencias de ADN que codifican las proteasas
mencionadas antes, por los correspondientes plásmidos de expresión y
por las células hospedantes que las contienen.
La proteasa Kex1 de Kluyveromyces lactis
de acuerdo con la presente invención se obtuvo haciendo expresar
variantes de la proteasa Kex1 que no tienen el dominio de unión a la
membrana, en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La
secreción en el medio de crecimiento de las proteasas
ss-Kek1 se logró mediante la región
pre-pro homóloga o mediante la región
pre-pro de la proteína Kex2 homóloga de S.
cerevisiae, así como gracias a la secuencia (pre) señal de la
glucoamilasa de la variante diastaticus de Saccharomyces
cerevisiae. Debido a estos estudios, se encontró
sorprendentemente que los dominios catalíticos de Kex1 y Kex2 tienen
diferencias funcionales, como se demuestra por la observación de
que la proteína Kex1 que termina en el resto 580 es catalíticamente
inactiva, a diferencia de la proteína Kex2 que termina en el resto
593, que es el resto correspondiente en la proteína Kex2
(Gluschankof y col., EMBO J., 13: 2280-2288,
1994). También se buscaron condiciones de crecimiento más adecuadas
para la producción y secreción de la proteasa en un matraz.
Las Kex1 solubles se purificaron del medio de
crecimiento y se determinaron algunas de sus propiedades
bioquímicas, incluyendo la eficacia de corte en sustratos modelo y
la estabilidad y actividad catalítica en presencia de diferentes
agentes físicoquímicos, tales como la temperatura.
La proteasa ss-KEX1 así obtenida
se puede usar como tal o se puede inmovilizar en una matriz orgánica
o inorgánica insolubles; las proteasas así inmovilizadas se pueden
volver a usar varias veces en el procesamiento in vitro de
las proteínas de fusión de interés industrial, con ventajas
evidentes.
La estabilidad térmica de las nuevas
endopeptidasas ss-Kex1 secretadas solubles es tal,
que mantienen aproximadamente 60% o más de su actividad original
después de incubación a 50ºC durante 6 minutos, en cuyas condiciones
las correspondientes proteínas Kex2 pierden su actividad
completamente.
La masa molecular calculada de las nuevas
endopeptidasas ss-Kex1 de la presente invención es
aproximadamente de 65 a 70 kDa (enzima producida a partir de la
cepa NP31) y de 70 a 80 kDa (enzima producida a partir de la cepa
NP168) determinado por SDS-PAGE después de
calentamiento y reducción de la muestra.
En lo sucesivo la invención se explicará con
ejemplos específicos. Los ejemplos tienen el único propósito de
clarificar la invención, aunque se debe indicar que la invención no
está limitada de ninguna forma por los mismos.
La Figura 1 muestra la organización estructural
en dominios de la proteína Kex2, un miembro típico representativo y
el primero identificado de la familia de las subtilasas de
procesamiento análogas a kexino.
La Figura 2 muestra el alineamiento de las
secuencias de proteína de Kex2 de S. cerevisiae y Kex1 de
K. lactis.
La Figura 3 muestra la estabilidad térmica de
las proteasas ss-Kex2 de S. cerevisiae y
ss-Kex1 de K. lactis.
La Figura 4 muestra el perfil de actividad como
una función de la temperatura de las proteasas
ss-Kex2 de S. cerevisiae y
ss-Kex1 de K. lactis.
La Figura 5 muestra el perfil de elución en
RP-HPLC de una preparación purificada de una
proteasa ss-Kex1 soluble de la presente
invención.
La Figura 6 muestra las cinéticas de digestión
in vitro de una proteína de fusión obtenida con una proteasa
ss-Kex1 soluble de la presente invención.
La Figura 7 muestra el perfil de digestión in
vitro de una proteína de fusión obtenida con una proteasa
ss-Kex1 inmovilizada de la presente invención.
Ejemplo
1
Salvo que se indique lo contrario, se usaron
procedimientos convencionales para todas las manipulaciones estándar
del ADN recombinante. Se da un conjunto de estos procedimientos,
por ejemplo, en Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning.
Con el fin de construir plásmidos para la
expresión en S. cerevisiae de variantes truncadas de la
región COOH-terminal de la proteasa Kex1 de K.
lactis, controlado con diferentes secuencias señal, se llevó a
cabo la PCR con oligonucleótidos mutágenos adecuados, siguiendo
procedimientos de subclonación estándar. Los vectores de expresión
usados en esta invención eran pEMBLyex4 (Baldari y col., EMBO
J., 6: 229-234, 1987), pVTU (Vernet y col.,
Gene 52: 225-233, 1987) y YEPSTA (Martegani
y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 37:
604-608, 1992). Los plásmidos que expresan las
kexinas a partir de estos derivados están listados en la Tabla 1.
Basándose en la información dada en esta Tabla, los expertos en la
técnica podrán construir los plásmidos mencionados son excesiva
experimentación. En esta patente, se hace referencia a las
siguientes secuencias de proteínas y ácidos nucleicos: (gen
KEX1, número de acceso de EMBL X07038; proteína Kex1, número
de acceso de Swiss-Prot 09231; gen KEX2
número de acceso M22870; proteína Kex2, número de acceso de
Swiss-Prot P13134). En el siguiente ensayo, el
nucleótido 1 se refiere al nucleótido adenina (A) que corresponde
al codón de iniciación de la traducción (ATG) de cada gen dado que
codifica proteasas; igualmente, el aminoácido 1 se refiere a la
metionina codificada por dicho codón de iniciación. De forma
análoga a la descripción dada antes para Kex2, las formas maduras
solubles y enzimáticamente activas de Kex1 descritas en la presente
invención se expresan inicialmente en forma de
pre-pro-proteínas inactivas que
posteriormente son procesadas en el sitio de
Lys101-Arg-102 (cuando se usa la
pro-proteína homóloga) o en el sitio de
Lys-113-Arg-114
(cuando se usa la pro-proteína Kex2). Para los
propósitos de la presente invención, las formas maduras solubles y
enzimáticamente activas de Kex1 se caracterizan porque tienen una
cadena de polipéptido entre el aminoácido 103 y el aminoácido 643 de
la secuencia dada en la Figura 2 y se indican por la terminología
ss-Kex1-Cx, en la que x representa
el resto de aminoácido de la secuencia de la Figura 2 que
constituye el resto carboxi-terminal de las formas
solubles de Kex1. Simplemente a modo de ejemplo, se da con detalle
la construcción del plásmido PL24 que expresa la proteasa
Kex1-C600. Puesto que se conocen las secuencias de
ADN, la construcción de estos plásmidos está dentro de la
competencia habitual de un experto en la técnica, y también se
puede llevar a cabo mediante estrategias y técnicas que difieren de
las ejemplificadas, pero que son equivalentes en términos de
obtener el o los productos esperados.
Con el fin de construir el plásmido para la
expresión de Kex1-C6000 truncado en el aminoácido
600, cuyo resto corresponde al aminoácido 613 en la proteína Kex2
codificada por el gen KEX2 de S. cerevisiae, se
amplificó la secuencia que codifica los restos
1-600 de Kex1 mediante la PCR con los
oligonucleótidos indicados a continuación (los nucleótidos que
constituyen los sitios de restricción para BamHI y HindIII
están subrayados):
- 5'CGC GGA TCC ATG ATC C TA TCG TCG CAG C3'
- 5'C CCC AAG CTT TCA TTC AGC ATC CTC TTT GTC3'
\newpage
Al final de la PCR, el fragmento amplificado se
sometió a restricción con las endonucleasas BamHI y HindIII,
se purificó en gel de agarosa después de electroforesis preparativa,
y se subclonó en el vector de expresión pEMBLyex4 que se había
linearizado previamente con BamHI y HindIII, permitiendo así
obtener el plásmido pL24 que permite que la proteína
Kex1-C600 sea expresada en la levadura con control
del promotor híbrido inducible
GAL1-10-CYC1.
Ejemplo
2
Se transformaron diferentes cepas de S.
cerevisiae usando las construcciones descritas antes con el fin
de obtener la expresión de las formas secretadas catalíticamente
activas y solubles de la proteasa Kex1 de K. lactis GRF18*
(MAT\alpha his 3-11, 15 leu
2-3, 112 ura3); X4004 (MAT\alpha lys5 met2
ura3 trp1); MVY4935 (MAT\alpha sta10 leu2 ura3 arg4 his3
lys2); W303 1-a (MAT\alpha
leu2-3,112 ura3-1
trp1-1 his3-11,15
ade2-1 can1-100 GAL SUC2). El
procedimiento de transformación usado es el descrito por Schiestl y
Gietz (1989) Curr. Genet. 16: 339-246. Los
matraces usados para el crecimiento de la levadura en medio líquido
se incubaron en un baño con termostato de Dubnoff y se agitaron
continuamente. El crecimiento en una placa se llevó a cabo en
incubadoras adecuadas en una atmósfera húmeda. Para la metodología
respecto a la levadura, dondequiera que no se describa de forma
explícita, se debe hacer referencia a C. Guthrie y G.R. Fink,
Methods in Enzymology 194.
Las células transformadas se cultivaron en placa
en medio mínimo selectivo (YNB), con glucosa como fuente de carbón,
y se incubaron a 30ºC. En estas condiciones, las células diseñadas
crecen sin producir la proteína de interés. Los sistemas de
expresión basados en los vectores análogos a pEMBLyex4 se pueden
inducir con galactosa, porque la proteína de interés se pone bajo
el control del promotor híbrido inducible GAL-CYC, y la
presencia de glucosa en el medio de cultivo provoca un estado de
represión de la expresión. Este sistema prevé el uso de rafinosa
como la fuente de carbón para permitir la desrepresión, y el uso de
galactosa con el fin de asegurar el estado de inducción. Además, el
sistema de expresión basado en vectores análogos a pEMBLyex4
provisto del marcador selectivo leu2d proporciona la
posibilidad de una amplificación adicional del número de copias del
plásmido de interés, recurriendo, cuando el genotipo de la cepa
transformada lo permite, a la selección en medio mínimo sin
leucina.
Las cepas transformadas se hicieron crecer en
los siguientes medios de cultivo:
Medio rico en YP: fuente de carbón 20 g/l;
peptona 20 g/l; extracto de levadura 10 g/l.
Medio mínimo YNB-aa: fuente de
carbón 20 g/l; YNB sin aminoácidos 6,7 g/l.
Medio estándar 1040: YNB sin aminoácidos y sin
sulfato amónico 1,7 g/l; (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,32 g/l;
NH_{4}Cl 5,0 g/l; BIS-TRIS 8,37 g/l; fuente de
carbón 20 g/l; L-triptófano 0,12 g/l;
Adenina-HCl 0,24 g/l; casaminoácidos 5,0 g/l.
Cuando fue necesario los medios se solidificaron con agar al 2%. Se
añaden bases de nucleótidos y aminoácidos a 50 mg/l.
El medio de cultivo de estas cepas transformadas
se sometió a la medición de la actividad para probar la presencia
de una forma secretada catalíticamente activa de la proteasa de
interés. La actividad enzimática se determinó con un ensayo
colorimétrico que aprovecha la capacidad de la enzima para
hidrolizar el sustrato de
Z-L-tirosina-L-lisina-L-arginina-p-nitroanilida
(Z-Y-K-R-pNA).
La mezcla de incubación comprende
Z-Y-K-R-pNA
0,1 mM en Hepes 0,2 M, pH 7,0 y CaCl_{2} 1 mM, en un volumen
total de 1,5 ml a 37ºC. La reacción se sigue a 405 nm, longitud de
onda a la cual se produce la disminución máxima del coeficiente de
extinción molar (\Delta\varepsilon), igual a 10,9
mM^{-1}.cm^{-1}. Se define una unidad de enzima como la
cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 \mumol de
sustrato por minuto en las condiciones descritas antes. Salvo que se
indique expresamente lo contrario, los datos presentados en la
Tabla 2 se refieren a la actividad secretada en el medio de
crecimiento por derivados de la cepa W303 que se hizo crecer en un
matraz a 30ºC, con agitación (220 rpm), en medio
1040-galactosa al 2% (excepto para las cepas NP225
y NP265 en las que la fuente de carbón añadida al medio de
crecimiento era glucosa al 2%). Se tomaron varias muestras a lo
largo de la curva de crecimiento para cada cepa. La tabla 2 da la
actividad máxima medida para cada cepa transformada. Como puede
verse, se observan buenos niveles de secreción tanto cuando la
expresión de Kex1 es guiada por el promotor
GAL10-CYC1 como cuando se usa el promotor de
la alcohol deshidrogenasa. Por lo tanto, la invención no está
limitada por el tipo de promotor usado, siempre que los niveles de
secreción de la endoproteasa de la invención sean
satisfactorios.
| Nombre de la cepa transformada | Plasmido de expresión | Actividad (mU/ml) |
| NP31 | PL 24 | 1300 |
| NP113 | PL57 | No detectable |
| NP115 | PL 58 | No detectable |
| NP180 | PL98 | 960 |
| NP183 | PL99 | 1260 |
| NP166 | PL86 | 1250 |
| NP168 | PL87 | 1200 |
| NP231 | PL120 | 1230 |
| NP157 | PL68 | 700 |
| Nombre de la cepa transformada | Plasmido de expresión | Actividad (mU/ml) |
| NP33 | PL22 | <120 |
| NP250 | PL132 | 1300 |
| NP251 | PL133 | 1250 |
| NP252 | PL134 | 1280 |
| NP255 | PL135 | 1290 |
| NP265 | PL144 | 1270 |
Se encontró que la sustitución de la secuencia
pre-pro de Kex1 por la de Kex2 daba como resultado
una proteína que era secretada en el medio de crecimiento tan bien
como la proteína Kex1 que usa su propia secuencia
pre-pro. Al contrario, la sustitución sólo de la
secuencia pre (secuencia señal) por la secuencia señal de la
glucoamilasa codificada por el gen STA2 de la variedad
diastaticus (cepa NP33) de Saccharomyces cerevisiae o
la secuencia señal de Kex2 (cepa NP157) daba como resultado una
menor secreción de la proteína Kex1. Por consiguiente, en los
experimentos descritos en los siguientes Ejemplos, se usó la
proteína cuya secreción era guiada por la secuencia
pre-pro de Kex1 o Kex2 (cepas NP31 y NP231,
respectivamente).
Sorprendentemente se encontró que la cepa NP115,
que expresa una Kex1 que termina en el aminoácido 580, no presenta
actividad enzimática detectable. Este resultado contrasta con el
mantenimiento de la actividad enzimática en la parte de la proteína
Kex2 que termina en el aminoácido 593, es decir, el aminoácido de
Kex2 que corresponde al aminoácido 580 de Kex1 de K. lactis
(Gluschankof y col., véase antes, véase también la Figura 2 para las
alineamientos). Este resultado significa que a pesar del alto nivel
de homología, las proteínas Kex1 de K. lactis y Kex2 de
S. cerevisiae difieren considerablemente entre sí, de modo
que no se pueden considerar como equivalentes en todos los aspectos
relacionados con las realizaciones de esta invención. En relación
con esto, también se debe tener en cuenta los datos de estabilidad
térmica y los perfiles de actividad en función de la temperatura
comparativos, que se dan en las Figuras 3 y 4, respectivamente.
Comparadas con la proteína presente en la cepa NP31, las cepas
NP180, NP183, NP166 y NP168 tienen extensiones
carboxi-terminales que pueden cubrir el dominio
entero rico en serina/treonina, parando inmediatamente antes del
dominio transmembranal. Comparada con la cepa NP31 no se observan
diferencias significativas en la actividad de Kex1 secretada en el
medio de crecimiento por las cepas mencionadas antes.
Ejemplo
3
La purificación de la variante suprimida de la
proteasa Kex1 de K. lactis
ss-Kex1-C600 se llevó a cabo
partiendo de las cepas transformadas de S. cerevisiae hechas
crecer en un matraz o en un fermentador hasta la fase exponencial
final. En ambos casos, el medio se separó de las células por
centrifugación, se filtró sobre un filtro que tenía poros de 5
\mum y después se concentró aproximadamente 10 veces y se dializó
frente a una solución de Triton X-100 al 0,1%,
CaCl_{2} 4 mM, por ultrafiltración en una membrana con corte de
exclusión de 10 kDa. La solución de diálisis se purificó en una
columna de resina de SP-Sefarosa preequilibrada con
un tampón de acetato sódico pH 5,2, y se eluyó mediante un gradiente
lineal de pH en tampón de tris-acetato. Las
fracciones que contenían actividad enzimática de Kex1 se
introdujeron en una columna de resina de Q-Sefarosa
preequilibrada con tampón de
bis-tris-acetato y se eluyeron
mediante un gradiente lineal de NaCl. La mezcla de las fracciones
que contenían actividad enzimática de Kex1 se analizó por
RP-HPLC. Los análisis por RP-HPLC
se llevaron a cabo usando una columna Vydac-C18, 2,1
x 250 mm, a una temperatura de 55ºC y con detección UV a una
longitud de onda de 215 nm; la elución se llevó a cabo con un flujo
de 0,21 ml/minuto empezando con las fases móviles A (ácido
trifluoroacético al 0,1% en agua) y B (ácido trifluoroacético al
0,08% en acetonitrilo), con un gradiente lineal de 37% a 87% de
fase móvil B en 21 minutos. Los análisis demostraron la presencia
de un pico homogéneo con una pureza mayor de 95% (Figura 5) y una
actividad específica de aproximadamente 100 U/mg.
Ejemplo
4
Se determinaron las constantes cinéticas por un
procedimiento simplificado que requiere que las mediciones se
lleven a cabo con una sola concentración inicial de sustrato y hasta
que el sustrato se agote. El procedimiento permite que se
determinen los valores medios de concentración residual y velocidad
en diferentes tiempos, y se puede aplicar en los casos en los que
la enzima cataliza una reacción completamente irreversible en las
condiciones de trabajo, y no está sometida a la inhibición por el
producto (Segel, I.H. (1975) Enzyme Kinetics, Wiley, Nueva
York). Los resultados así obtenidos se procesaron usando el programa
Grafit, que permite la interpolación del perfil de
Michaelis-Menten y la determinación de los valores
de K_{m} y V_{max}, presentados en la Tabla 3. Después se
obtuvieron k_{cat} y la relación k_{cat}/K_{m} a partir de
estos valores y a partir de la concentración de enzima. Los
resultados muestran que las dos proteasas ss-Kex1 y
ss-Kex2 no difieren significativamente en sus
propiedades cinéticas.
| V_{max} (\DeltaA min^{-1})x10^{3} | K_{m} \muM | k_{cat} min^{-1} | k_{cat}/K_{m} \muM^{-1}x min^{-1} | |
| ss-Kex1-C600 | 1720 | 61,4 | 1,84 x 10^{5} | 3,0 x 10^{3} |
| ss-Kex2-C613 | 1029 | 56,8 | 1,37 x 10^{5} | 12,4 x 10^{3} |
De las características principales de una enzima
que son necesarias para la aplicación industrial como
biocatalizador, una de las más importantes sin duda es la
estabilidad en las condiciones de trabajo. Por lo tanto se observará
que es necesario investigar y caracterizar las dos proteasas
también desde este punto de vista. Inicialmente se determinó el
perfil de la inactivación térmica de las dos enzimas a diferentes
temperaturas en ausencia de cualquier agente estabilizante. El
perfil se obtuvo incubando la enzima a la temperatura
predeterminada, tomando muestras en tiempos sucesivos y
determinando la actividad enzimática residual en las muestras. Así
se determina la disminución de la actividad en función del tiempo,
actividad que se supone que es proporcional a la concentración de
la enzima activa.
Los perfiles de inactivación de las dos
proteasas se realizaron a temperaturas de 10 a 50ºC. Los datos se
dan en la Figura 3, y muestran que, sorprendentemente, la proteasa
ss-Kex1 tiene una estabilidad térmica
significativamente mayor que la de la proteasa
ss-Kex2: a modo de ejemplo, esta última era casi
completamente inactiva después de 6 h de incubación a 50ºC,
mientras que en las mismas condiciones, Kex1 mantenía no menos del
50% de su actividad. Los perfiles de inactivación de la proteasa
Kex1 a 60º y 70ºC, y por comparación, los de Kex2 a 50ºC, también
muestran la diferencia sustancial de termoestabilidad entre las dos
moléculas: está claro que la proteasa ss-Kex1 es
aproximadamente tan estable a 70ºC como la proteinasa
ss-Kex2 a 50ºC. Cuando se administraron
ss-Kex1 y ss-Kex2 en condiciones
estándar, con concentraciones de saturación del sustrato y midiendo
la velocidad media en los primeros 5 minutos de la reacción, la
proteína Kex1 presentó una temperatura de funcionamiento óptima a
aproximadamente 70ºC, mientras que en las mismas condiciones, la
temperatura de trabajo óptima aparente de la endopeptidasa Kex2 era
aproximadamente 50ºC (Figura 4).
Ejemplo
5
Se estudió el procesamiento de proteínas de
fusión usando, como modelo de proteína, una fusión entre una
secuencia peptídica de 35 aminoácidos que lleva el dipéptido
Lys-Arg en el extremo
carboxi-terminal y la secuencia de 191 restos de
aminoácidos de la hormona de crecimiento humano
(h-GH). La proteína de fusión, que tiene una
estructura (parte
peptídica)-(Lys-Arg)-(h-GH), se ha
expresado en una cepa transformada de E. coli, se ha
extraído y purificado hasta un grado de pureza mayor que 70%. La
hidrólisis de la proteína de fusión (1 gramo/litro) se llevó a cabo
para un periodo total de 18 horas, en tampón a pH 7 que contenía
Ca^{2+} 4 mM, a una temperatura de 30ºC y usando una preparación
de ss-Kex1_{600}\DeltaC purificada de 0,2 mg/ml.
El avance de la reacción se siguió por análisis por
RP-HPLC que mostró un rendimiento de la reacción
mayor que 95% (Figura 6); la especificidad de la hidrólisis se
comprobó por análisis de la secuencia
NH_{2}-terminal del producto de reacción que dio
la secuencia esperada para h-GH. Se obtuvieron
resultados similares cuando h-GH se fusionó con
polipéptidos de diferente longitud (de 20 a 300 restos de
aminoácidos).
Ejemplo
6
La proteasa ss-Kex1 se
inmovilizó usando, como soporte sólido inorgánico, la resina
Eupergit C250L, cuyos grupos epoxi actúan como grupos reactivos
para la formación de enlaces covalentes con los grupos amino, tiol
o hidroxilo de la enzima. Esto reduce la flexibilidad estructural de
la enzima y por lo tanto debería promover su estabilización. La
mezcla de incubación comprende 789 \mug de enzima en tampón de
fosfato potásico 1 M, pH 7,0, en presencia de 8 mg de resina
Eupergit C250L, en un volumen total de 55 \mul a temperatura
ambiente durante 4 días, sin agitación. Al final del periodo de
incubación, la enzima inmovilizada se somete a operaciones de
lavado sucesivas con el tampón de dosificación Hepes 0,2 M pH 7,0 +
CaCl_{2} 1 mM, y se conserva a 4ºC en presencia de una solución
de Hepes 0,2 M, pH 7,0, CaCl_{2} 1 mM/glicerol al 60%.
\newpage
La proteína inmovilizada Kex1 se usó en el
procesamiento de una proteína de fusión
PNP_{20aa}-hGH, incubando esta última a 37ºC con
una relación de 10:1 respecto a la enzima inmovilizada. En estas
condiciones, el procesamiento de la proteína se continuó durante un
periodo de 10 minutos a 15 horas por SDS-PAGE.
Después de 6 horas de incubación, se obtiene una digestión igual a
aproximadamente 60% de la proteína fusionada y después de 15 horas
se obtiene una digestión casi completa (Figura 7). El uso posterior
otra vez de la misma preparación de proteasa Kex1 inmovilizada en
las mismas condiciones de trabajo condujo a un resultado
sustancialmente idéntico al resultado previo, demostrando así, que
en las condiciones adoptadas, la proteasa Kex1 inmovilizada no
pierde actividad de forma apreciable después incluso de 30 horas de
incubación a 37ºC, y se puede volver a usar en la liberación de la
proteína de interés de la pareja de fusión.
<110> Keryos Spa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas endoproteasas solubles para
el procesamiento in vitro de proteínas recombinantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 01nv22e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> MI2000A2465
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-11-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1929
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces lactis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 643
\vskip0.400000\baselineskip
<210> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Kluyveromyces lastis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Una endoproteasa Kex1 soluble que tiene una
secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de
aminoácidos codificada por el gen KEX1 de Kluyveromyces
lactis (número de acceso de EMBL X07038) y sin dominio
transmembranal, en la que se han eliminado al menos 57 y no más de
100 restos de aminoácidos del extremo
C-terminal.
2. Una endoproteasa Kex1 soluble de acuerdo con
la reivindicación 1, que se caracteriza por tener la
secuencia ID SEC nº 2 o por tener una secuencia con una homología
del 90%, preferiblemente una homología del 95% con respecto a la ID
SEC nº 2.
3. ADN que codifica una endoproteasa Kex1
soluble de acuerdo con la reivindicación 1.
4. ADN de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizado porque (a) tiene una secuencia ID SEC nº 1, (b)
tiene una secuencia que hibrida con la ID SEC nº 1, (c) tiene una
secuencia que es degenerada como resultado del código genético
respecto al ADN que tiene la secuencia ID SEC nº 1, y/o (d) tiene
una secuencia con una homología del 90%, preferiblemente una
homología del 95%, con respecto a la ID SEC nº 1.
5. Un vector de expresión plasmídico que
comprende ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
3 a 4.
6. Células hospedantes transformadas por un
vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Células hospedantes de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizadas porque son células de
levaduras.
8. Células hospedantes de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizadas porque son células de
levaduras Saccharomyces cerevisiae.
9. Un procedimiento para fabricar un péptido o
proteína que comprende: (a) la producción de un polipéptido o
proteína de fusión que comprende la secuencia del péptido o proteína
de interés, y que tiene en el extremo
NH_{2}-terminal del péptido o proteína de interés
una secuencia de aminoácidos que contiene un sitio dipeptídico
hidrolizable por la endoproteasa de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 2; (b) la incubación in vitro del polipéptido o proteína
de fusión mencionados en la etapa (a) anterior, en presencia de una
endoproteasa de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2; (c) la
separación y purificación del péptido o proteína de interés.
10. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque el sitio dipeptídico
hidrolizable es Lys-Arg, Arg-Arg o
Pro-Arg.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque el péptido o proteína
se seleccionan de proteínas recombinantes para uso terapéutico,
tales como por ejemplo, hormonas peptídicas, interleucinas,
interferones, citocinas, factores de crecimiento, enzimas
fibrinolíticas y enzimas recombinantes de interés industrial que se
pueden usar como biocatalizadores, tales como por ejemplo, lipasas,
hidrolasas, nucleasas, oxidasas, fosfatasas.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque la endoproteasa de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, se inmoviliza en un soporte
orgánico o inorgánico insoluble.
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