ES2280516T3 - Expresion de la proteinasa k recombinante de tritirachium album en levadura. - Google Patents
Expresion de la proteinasa k recombinante de tritirachium album en levadura. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2280516T3 ES2280516T3 ES02712891T ES02712891T ES2280516T3 ES 2280516 T3 ES2280516 T3 ES 2280516T3 ES 02712891 T ES02712891 T ES 02712891T ES 02712891 T ES02712891 T ES 02712891T ES 2280516 T3 ES2280516 T3 ES 2280516T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- proteinase
- host cell
- species
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
Abstract
Procedimiento para la obtención de proteinasa K recombinante que consta de los pasos siguientes: a) la transformación de una célula hospedante con un vector que contiene un DNA que codifica al compuesto previo zimógeno de la proteinasa K, este DNA está fusionado en la parte ascendente (upstream) de la secuencia codificadora con una secuencia del marco de lectura, que codifica a un péptido de señal y está bajo el control de un promotor adecuado para la célula hospedante, b) la expresión del compuesto zimógeno previo de la proteinasa K, c) la secreción y la activación autocatalítica de la proteinasa K, caracterizado porque la célula hospedante es una célula de levadura elegida entre el grupo formado por la especie Pichia, la especie Hansenula, la especie Saccharomyces y la especie Schizosaccharomyces y el hospedante de expresión secreta la proteína en forma soluble.
Description
Expresión de la proteinasa K recombinante de
Tritirachium album en levadura.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de proteinasa K recombinante en
forma soluble y activa en cantidades interesantes desde el punto de
vista económico.
La proteinasa K (E. C. 3.4.21.64, también
conocida como endopeptidasa K) es una endopeptidasa extracelular,
que se sintetiza a partir del hongo Tritirachium album
Limber. Pertenece al grupo de las serinaproteasas provistas de la
tríada catalítica típica
Asp^{39}-His^{69}-Ser^{224}
(Jany, K.D. y col., FEBS Letters, vol. 199(2),
139-144, 1986). La secuencia de la cadena peptídica,
que tiene una longitud de 279 aminoácidos (Gunkel, F.A. y Gassen,
H.G., Eur. J. Biochem., vol. 179(1), 185-194,
1989) y la estructura tridimensional (Betzel, C. y col., Eur. J.
Biochem., vol. 178(1), 155-71, 1988)
presentan una gran homología con las subtilisinas bacterianas, por
lo cual que considera que la proteinasa K pertenece también al grupo
de la subtilisinas (Pahler, A. y col., EMBO J., vol. 3(6),
1311-1314, 1984; Jany, K. D. y Mayer, B., Biol.
Chem. Hoppe-Seyler, vol. 366(5),
485-492, 1985. La proteinasa K se conoció por su
capacidad de hidrolizar la queratina nativa y, de este modo, de
permitir al hongo el crecimiento en la queratina como única fuente
de C y de N (Ebeling, W. y col., Eur. J. Biochem., vol.
47(1), 91-97, 1974). Por su actividad
específica de más de 30 U/mg, la proteinasa K es una de las
endopeptidasas más activas que se conocen (Betzel, C. y col., FEBS
Lett., vol. 197(1-2),
105-110, 1986) e hidroliza de modo inespecífico las
proteínas tanto nativas como desnaturalizadas.
La proteinasa K del Tritirachium album
Limber se traduce en el hospedante natural como preproteína. En 1989
Gunkel, F.A. y Gassen, H.G., Eur. J. Biochem., vol. 179(1),
185-194, 1989, descifraron la secuencia del cDNA
del gen que codifica a la proteinasa K. Según ellos, el gen de la
preproteinasa K se compone de 2 exones y codifica a una secuencia de
señal que tiene una longitud de 15 aminoácidos, a una prosecuencia
que tiene una longitud de 90 aminoácidos y a una proteinasa K
madura, que tiene una longitud de 279 aminoácidos. Un
intrónproteinasa, que tiene una longitud de 63 bp, se encuentra en
la región de la prosecuencia. Durante la translocación, el
prepéptido se descompone en el retículo endoplasmático (ER).
Actualmente se sabe todavía muy poca cosa sobre el proceso ulterior
que conduce a la proteinasa K madura, previa descomposición del
propéptido.
La proteinasa K madura consta, por tanto, de 279
aminoácidos. La estructura compacta se estabiliza con dos puentes
disulfuro y dos iones calcio fijados. Esto explica que la proteinasa
K tenga una estabilidad muy superior a la de otras subtilisinas en
valores extremos de pH, temperaturas elevadas, sustancias
caotrópicas y detergentes (Dolashka, P. y col., Int. J. Pept.
Protein. Res., vol. 40(5), 465-471, 1992). La
proteinasa K se caracteriza por una elevada termoestabilidad (hasta
65ºC, Bajorath y col., Eur. J. Biochem., vol. 176,
441-447, 1988) y un amplio intervalo de pH (pH
7,5-12,0, Ebeling, W. y col., Eur. J. Biochem., vol.
47(1), 91-97, 1974). La actividad se
incrementa en presencia de sustancias desnaturalizantes, por ejemplo
la urea o el SDS (Hilz, H. y col., J. Biochem., vol. 56(1),
103-108, 1975; Jany, K.D. y Mayer, B., Biol. Chem.
Hoppe-Seyler, vol. 366(5),
485-492, 1985).
Las propiedades recién mencionadas hacen que la
proteinasa K sea especialmente interesante para aquellas
aplicaciones biotecnológicas, en las que se requiera una degradación
proteica inespecífica. Cabe mencionar en especial el aislamiento de
ácidos nucleicos (DNA o RNA) del extracto en bruto y la preparación
de sondas para el análisis del DNA (Goldenberger, D. y col., PCR
Methods Appl., vol. 4(6), 368-370, 1995; US
5,187,083; US 5,346,999). Hay otras aplicaciones en el ámbito
analítico de las proteínas, p.ej. la elucidación de la
estructura.
La proteinasa K se obtiene a nivel comercial en
grandes cantidades por fermentación del hongo Tritirachium
album Limber (p.ej. CBS 348.55, Merck cepa nº 2429 o cepa nº
ATCC 22563). Sin embargo, la producción de la proteinasa K resulta
suprimida por la glucosa o por aminoácidos libres. Por otro lado,
los medios que contienen proteínas inducen la expresión de las
proteasas, por lo tanto tendrán que utilizarse como proteínas
fuentes de nitrógeno únicamente la BSA, la leche en polvo o la
harina de soja. La secreción de la proteasa se inicia cuando la fase
estacionaria ha alcanzado su madurez (Ebeling, W. y col., Eur. J.
Biochem., vol. 47(1), 91-97, 1974).
Por lo tanto, como el Tritirachium album
Limber es poco indicado para la fermentación a escala industrial y,
además, resulta difícil su manipulación genética, se han emprendido
varios intentos para lograr una sobreexpesión de la proteinasa K
recombinante en otras células hospedantes. Sin embargo, debido a la
expresión deficiente, a la formación de "cuerpos de inclusión"
inactivos o a los problemas de naturalización, en dichos ensayos no
se ha detectado una actividad significativa (Gunkel, F.A. y Gassen,
H.G., Eur. J. Biochem., vol. 179(1), 185-194,
1989; Samal, B.B. y col., Adv. Exp. Med. Biol., vol. 379,
95-104), 1996).
El Tritirachium album Limber es un hongo
de crecimiento lento, que segrega al medio cantidades pequeñas de
proteasas. Es un inconveniente el tiempo de ciclo, más lento que el
de las levaduras y la densidad óptica reducida que puede
conseguirse en el fermentador. Es conocido además, que el T.
album además de la proteinasa K produce otras proteasas, que
podrían contaminar la preparación (Samal, B.B. y col., Enzyme
Microb. Technol., vol. 13, 66-70, 1991).
En principio es posible la expresión de la
proteinasa K en la E. coli, pero no se realiza en forma
soluble, sino en los llamados "cuerpos de inclusión", a partir
de los cuales es necesario solubilizar y renaturalizar después la
enzima adoptando determinadas medidas. El inconveniente de este
método estriba en que durante la solubilización y la
renaturalización se pierde mucha proteína.
Es, pues, objetivo de la presente invención el
desarrollo de un procedimiento para la obtención de la proteinasa K
recombinante en cantidades económicamente interesantes.
Ahora se ha encontrado de modo sorprendente que
es posible expresar y secretar una proteinasa K recombinante en
calidad de compuesto previo zimógeno en forma soluble en levaduras,
teniendo lugar una activación autocatalítca que conduce a la
proteinasa K activa. Otro objeto de la invención es la purificación
de la proteinasa K activa del líquido sobrenadante del medio.
Es, pues, objeto de la invención un
procedimiento para la obtención de proteinasa K recombinante que
consta de los pasos siguientes:
a) la transformación de una célula hospedante
con un vector que contiene un DNA que codifica al compuesto previo
zimógeno de la proteinasa K, este DNA está fusionado en la parte
ascendente (upstream) de la secuencia codificadora con una
secuencia del marco de lectura, que codifica a un péptido de señal y
está bajo el control de un promotor adecuado para la célula
hospedante,
b) la expresión del compuesto zimógeno previo de
la proteinasa K,
c) la secreción y la activación autocatalítica
de la proteinasa K,
d) el aislamiento y la purificación de la
proteinasa K,
caracterizado porque la célula
hospedante es una célula de levadura elegida entre el grupo formado
por la especie Pichia, la especie Hansenula, la
especie Saccharomyces y la especie Schizosaccharomyces
y el hospedante de expresión secreta la proteína en forma
soluble.
Es especialmente preferido según la invención el
uso de la Pichia pastoris como célula hospedante.
Se ha constatado además que es ventajoso para el
procedimiento de la presente invención que la célula hospedante se
transforme con un DNA que codifica al compuesto previo zimógeno y
que la proteinasa K se active autocatalíticamente en un momento
posterior, durante o inmediatamente después de su secreción al medio
de cultivo.
Utilizando la Pichia pastoris como célula
hospedante, se clona el gen, que codifica al compuesto previo
zimógeno de la proteinasa K, con preferencia en los vectores
siguientes: pPICZ, pPICZ\alpha, pGAPZ, pGAPZ\alpha,
pPICZ\alphaA y pPIC9K. En este caso son especialmente preferidos
los vectores: pPICZ\alphaA y pPIC9K. Según la invención es
preferido en particular el vector pPICZ\alphaA. Los vectores
recién nombrados son productos comerciales (Invitrogen).
Según el procedimiento de la invención para la
obtención de la proteinasa K recombinante es también preferido que
la expresión de la proteinasa K o del compuesto previo zimógeno de
la proteinasa K se induzca con metanol (vectores pPIC). Otra
posibilidad consiste en la inducción de la expresión con el fosfato
de glicerina-aldehído (vectores pGAP).
En el procedimiento de la invención para la
obtención de la proteinasa K recombinante se inicia la secreción de
la proteína con preferencia mediante la fusión
N-terminal del péptido de señal del factor \alpha
del Saccharomyces cerevisiae. Esto significa por ejemplo en
el caso de la vectores recién mencionados, caracterizados por
\alpha, que estos poseen la secuencia de nucleótidos del péptido
de señal del factor \alpha del Saccharomyces cerevisiae.
Entonces, durante la traducción se genera una proteína de fusión del
péptido de señal en su extremo N y la proteína deseada. Otro
posible péptido de señal sería la secuencia de señal natural de la
proteinasa K.
Ha demostrado ser especialmente favorable que
para la obtención de la proteinasa K recombinante se transforme la
célula hospedante de Pichia pastoris con el vector de
expresión pPICZ\alphaA y pPIC9K, que contienen un DNA que codifica
al compuesto previo zimógeno, y que el gen esté bajo el control del
promotor AOX1 y también del terminador AOX1.
Es también objeto de la presente invención un
vector que contiene un DNA que codifique al compuesto previo
zimógeno de la proteinasa K, este está fusionado en una posición
ascendente (upstream) de la secuencia codificadora con una
secuencia del marco de lectura, que codifica aun péptido de señal
idóneo y el gen codificador está bajo el control de un promotor
idóneo para la célula hospedante y eventualmente de un terminador;
este vector deberá ser idóneo para la transformación de esta célula
hospedante. Según la invención, la célula hospedante es una levadura
que se elige entre el grupo formado por la especie Pichia, la
especie Hansenula, la especie Saccharomyces y la
especie Schizosaccharomyces.
Por lo tanto es también objeto de la invención
un vector recombinante que contiene una o más copias del DNA
recombinante definido anteriormente. El vector es con preferencia un
plásmido, que posee un promotor fuerte para la célula hospedante y
un péptido de señal idóneo para la célula hospedante con vistas a la
secreción de proteínas. Es también imaginable la fusión del péptido
de señal nativo de la preproteinasa K en el extremo N del
propéptido, p.ej. el representado en la SEQ. ID. NO. 21 (secuencia
de señal 1-15 (15 aminoácidos); prosecuencia
16-104 (90 aminoácidos); secuencia de la proteinasa
K madura 106-384 (279 aminoácidos)). Para la
construcción del vector de expresión se aplican métodos que los
expertos ya conocen y se han descrito por ejemplo en Sambrook y
col., 1989.
Otro objeto de la presente invención es una
célula hospedante transformada con uno de los vectores mencionados,
dicha célula hospedante es una levadura elegida entre el grupo
formado por: la especie Pichia, la especie Hansenula
p. ej. la Hansenula polymorfa, la especie
Saccharomyces y la especie Schizosaccharomyces. Como
célula hospedante es especialmente preferida la Pichia
pastris. Es especialmente preferido que se integren varios
vectores (cada uno con una copia del gen ppK) en el genoma.
Para la purificación de la proteinasa K se
eliminan en un primer paso las células de levadura mediante
microfiltración o centrifugación. La solución transparente
resultante contiene a la proteasa. A continuación se realiza un
cambio de tampón mediante una ultrafiltración, con el fin de fijar
el producto sobre un intercambiador catiónico, por ejemplo de
SP-Sepharose o SP-Sephadex
(Pharmacia) o SP-Toyopearl (Tosoh Corporation).
Después de la elución se efectúa un nuevo cambio de tampón mediante
ultrafiltración y fijación sobre un intercambiador aniónico, por
ejemplo de DEAE-Sepharose o
Q-Sepharose (Pharmacia) o
DEAE-Fraktogel (Merck). Después de una nueva elución
se traslada la proteasa pura mediante ultrafiltración a un sistema
tampón estable (Protein Purification, Principles and Practice,
Robert K. Scopes, editorial Springer, 1982). Sin embargo, los
técnicos podrán aplicar también otros métodos de purificación, que
pertenezcan al estado de la técnica.
Con el procedimiento de la invención se logra de
modo sorprendente obtener la proteinasa K recombinante, dicha enzima
se produce en un célula hospedante heteróloga y es soluble y activa.
Para la expresión de la proteinasa K y posterior secreción de la
enzima al medio de cultivo es especialmente ventajoso el hecho de
que se evita que la proteinasa K despliegue un efecto muy tóxico en
el citosol de la célula hospedante. Se garantiza además la correcta
formación de los puentes disulfuro, que en el medio reductor del
citosol no se produciría sin más. Es, pues, una ventaja decisiva
del procedimiento de la invención que se proporciona un camino para
la producción de una proteinasa K recombinante, soluble y activa. Es
muy sorprendente y no se explica, que las proteínas de superficie
de las células hospedantes de la invención no se hidrolicen con la
proteinasa K secretada. Con la hidrólisis que cabría esperar de las
proteínas de superficie, causada por la proteinasa K, se
interferiría en el ciclo vital de la proteinasa K.
Con el procedimiento de la invención se obtiene
una proteinasa K homogénea y, por ejemplo, es indicada en alto grado
para las aplicaciones analíticas y diagnósticas. El compuesto previo
zimógeno de la invención de la proteinasa K puede contener otras
modificaciones en el extremo N, a saber, secuencias que facilitan la
purificación de la proteína buscada ("affinity tags"). El
compuesto previo zimógeno puede contener además secuencias, que
aumenten la eficacia de la traducción, que incrementen la eficacia
de plegamiento y/o incluso secuencias que conducen a la secreción de
la proteína deseada en medio de cultivo (presecuencia natural y
otros péptidos de señal).
En el sentido de la invención se entiende con
preferencia por proteinasa K tanto la secuencia descrita en la SEQ.
ID. NO. 1 por Gassen y col., (1989), como otras variantes de la
proteinasa K de Tritirachium album Limber, como la secuencia
de aminoácidos publicada por Ch. Betzel y col., Biochemistry
40, 3080-3088, 2001, y en especial la
proteinasa T (Samal, B.B. y col., Gene, vol. 85(2),
329-333, 1989; Samal, B.B. y col., Adv. Exp. Med.
Biol., vol. 379, 95-104, 1996) y la
proteinasa R (Samal, B.B. y col., Mol. Microbiol., vol.
4(10), 1789-1792, 1990; US 5,278,062) y así
como las variantes generadas por métodos recombinantes (por ejemplo
las descritas en WO 96/28556). La SEQ. ID. NO. 1 comprende una
prosecuencia (1-90; 90 aminoácidos) y la secuencia
de la proteinasa K madura (91-368; 279 aminoácidos).
La secuencia de aminoácidos de la proteinasa K descrita por Betzel
y col., Biochemistry 40, 3080-3088, 2001,
presenta en particular en la posición 207 de la proteasa activa un
resto aspartato en lugar de un resto
serina.
serina.
En el sentido de la invención, la proproteinasa
K significa en especial una proteinasa K, cuyo extremo N está unido
a una prosecuencia del tipo SEQ. ID. NO. 1. En el caso de la
subtilisina E, muy afín a la proteinasa K, y de las variantes
correspondientes, la prosecuencia tiene una influencia esencial en
el repliegue y en la formación de la proteasa activa (Ikemura, H. y
col., Biol. Chem., vol. 262(16), 7859-7864,
1987). Se sospecha en particular que la prosecuencia actúa como
chaperón intramolecular (Inouye, M., Enzyme, vol. 45,
314-321, 1991). Después del repliegue tiene lugar
el procesado hasta la proteasa subtilisina madura, para ello el
propéptido se descompone autocatalíticamente (Ikemura, H. y Inouye,
M., J. Biol. Chem., vol. 263(26),
12959-12963, 1988). Este proceso tiene lugar a nivel
intramolecular en el caso de la subtilisina E (Samal, B.B. y col.,
Gene, vol. 85(2), 329-333, 1989; Volkov, A. y
Jordan, F., J. Mol. Biol., vol. 262, 595-599,
1996), la subtilisina BPN' (Eder, J. y col., Biochemistry, vol.
32, 18-26, 1993), la papaína (Vernet, T. y
col., J. Biol. Chem., vol. 266(32),
21451-21457, 1991) y la termolisina
(Marie-Claire, C.; J. Biol. Chem., vol.
273(10), 5697-5701, 1998).
Para la función de chaperón parece que son
necesarias únicamente determinadas regiones del núcleo de la
prosecuencia, por lo general regiones hidrófobas, dado que las
mutaciones permanecen invariables en cuanto a la actividad en un
amplio intervalo (Kobayashi, T. y Inouye, M., J. Mol. Biol., vol.
226, 931-933, 1992). Es conocido además que
los propéptidos son intercambiables entre diversas variantes de
subtilisina. Por ejemplo, en la subtilisina BPN' se reconoce
también la prosecuencia de la subtilisina E (Hu, Z. y col., J. Biol.
Chem., vol. 271(7), 3375-3384, 1996).
Es, pues, preferida la prosecuencia de una
longitud de 90 aminoácidos del tipo SEQ. ID. NO. 1, así como otras
variantes, que llevan a cabo una función que favorece el
plegamiento. Es también preferido un propéptido que se añade de
forma exógena para el plegamiento de la proteinasa K madura y que
desempeña las funciones mencionadas.
La ventaja principal del procedimiento de la
invención es, pues, que el hospedante de expresión secreta la
proteinasa K recombinante soluble y activa al medio de cultivo. Por
otro lado, el hospedante de expresión empleado para el
procedimiento de la invención no resulta dañado por la proteasa muy
activa e inespecífica ni tampoco influido negativamente de otras
maneras, es decir, en particular que el crecimiento continúa sin
problemas y no se observa una mayor lisis celular. Además, el
hospedante de expresión de la invención se manipula con mayor
facilidad que el Tritirachium album y se caracteriza por
tener una mayor velocidad de crecimiento.
Figura
1
Plásmido de expresión pPICPK-1.
Una secuencia, que codifica a la proforma zimógena de la proteinasa
K, clonada en el vector de partida pPICZ\alphaA (Invitrogen).
Figura
2
Plásmido de expresión pPICPK-2.
Una secuencia, que codifica a la proforma zimógena de la proteinasa
K, clonada en el vector de partida pPIC9K (Invitrogen).
Se genera el gen de la proteinasa K madura de
Tritirachium album Limber, sin secuencia de señal y sin
intrón, mediante síntesis genética. Como material de partida se
emplea una secuencia, de una longitud de 368 aminoácidos (sin
péptido de señal nativo), de Gunkel y Gassen, 1989. Con la
retrotraducción de la secuencia de aminoácidos se obtiene una
secuencia de ácido nucleico optimizada con codón tanto para la
expresión en E. coli como en levaduras. La secuencia de
aminoácidos se representa en la SEQ. ID. NO. 1, la secuencia de
nucleótidos en la SEQ. ID.
NO. 2.
NO. 2.
Para la síntesis se divide el gen en 18
fragmentos de oligonucleótidos de hebra opuesta complementaria,
sentido e inversos, en orden alternante (SEQ. ID. NO.
3-20). En los extremos 5' y 3' se cuelga en cada
caso una región de una longitud por lo menos de 15 bp, solapada en
cada caso con los oligonucleótidos vecinos. En los extremos 5' y 3'
del gen sintético se cuelgan, fuera de la región codificadora,
sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción con vistas
a la posterior expresión en vectores de expresión. Para la clonación
del gen de la proproteína se emplea como cebador 5' un
oligonucleótido presentado en la SEQ. ID. NO. 3, que contiene un
sitio de rotura de EcoRI. La SEQ. ID. NO. 20 es del cebador 3' con
un sitio de rotura de HindIII. El cebador 3' contiene un codón de
paro adicional, además del codón de paro natural, para tener una
seguridad segura de la traducción.
Los oligonucleótidos se unen entre sí mediante
una reacción PCR y se amplifica el gen resultante. Para ello se
divide el gen en primer lugar en tres fragmentos, cada uno con 6
oligonucleótidos y, en un segundo ciclo PCR, se unen entre sí los
tres fragmentos.
El fragmento 1 se compone de los
oligonucleótidos tales como los que se representan en las SEQ. ID.
NO. 3-8, el fragmento 2 se compone de
oligonucleótidos tales como los que se representan en las SEQ. ID.
NO. 9-14 y fragmento tres se compone de
oligonucleótidos tales como los representados en las SEQ. ID. NO.
15-20.
Para la PCR se aplican los parámetros
siguientes:
arranque
caliente:
| 5 min | 95ºC |
30 ciclos que constan
de:
| 2 min | 95ºC |
| 2 min | 42ºC |
| 1,5 min | 72ºC |
y fin de la
extensión:
| 7 min | 72ºC. |
arranque
caliente:
| 5 min | 95ºC |
6 ciclos (sin cebador en posición
final) que constan
de:
| 1,5 min | 95ºC |
| 2 min | 48ºC |
| 2 min | 72ºC |
adición del cebador en posición
final
y
25 ciclos (con los cebadores en
posición final) que constan
de:
| 1,5 min | 95ºC |
| 1,5 min | 60ºC |
| 2 min | 72ºC |
y fin de la
extensión:
| 7 min | 72ºC. |
\vskip1.000000\baselineskip
Se deposita en un gel de agarosa el material
obtenido en la reacción PCR y en el gel de agarosa (kit Geneclean
II de Bio 101, Inc., CA, EE.UU.) se aísla el fragmento PCR que tiene
una longitud aprox. de 1130 bp. Se rompe el fragmento con las
endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII (Roche Diagnostics
GmbH, Alemania) a 37ºC durante 1 hora. Al mismo tiempo se rompe el
plásmido pUC18 (Roche Diagnostocs GmbH, Alemania) con las
endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII a 37ºC durante 1 hora,
se purifica la mezcla por electroforesis a través de gel de agarosa
y se aísla el fragmento del vector, que tiene una longitud de 2635
bp. A continuación se ligan el fragmento PCR y el fragmento de
vector mediante una ligasa T4 de DNA. Para ello se pipetean 1 \mul
(20 ng) de fragmento de vector y 3 \mul (100 ng) de fragmento PCR,
1 \mul 10 x tampón de ligasa (Maniatis y col., 1989, B. 27), 1
\mul de ligasa T4 de DNA, 4 \mul de H_{2}O estéril
bidestilada, se mezclan con cuidado y se incuban a 16ºC durante una
noche.
Se investiga el gen clonado mediante análisis de
restricción y mediante secuenciación múltiple de ambas hebras.
En primer lugar tiene que aislarse de nuevo el
gen sintético del plásmido pUC. A tal fin se incuba 1 \mug de DNA
plásmido con la endonucleasa de retricción HindIII (Roche
Diagnostics GmbH) con arreglo a las instrucciones del fabricante y
a continuación se inactiva la endonucleasa de restricción por
calentamiento a 65ºC durante 20 min. Seguidamente se llenan las
proyecciones de DNA formadas con la polimerasa de Klenow siguiendo
las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics GmbH) y después
se inactiva la polimerasa de Klenow por incubación a 75ºC durante
10 min. Finalmente se corta el fragmento del vector, ahora
linealizado, del plásmido pUC ya mencionado con la endonucleasa de
restricción EcoRI (Roche Diagnostics GmbH) con arreglo a las
instrucciones del fabricante, la mezcla de la restricción se aplica
sobre un gel de agarosa al 1% y se separan los fragmentos por
tamaños conectando la corriente eléctrica (100 V/150 mA). El
fragmento que tiene un tamaño de unos 1120 bp y contiene el gen de
la proproteinasa K (gen ppk) se aísla en el gel de agarosa (kit de
extracción en gel QIAquick de Qiagen).
Se corta el vector pPICZ\alphaA (Invitrogen)
con la endonucleasa de restricción Asp718I (Roche Diagnostics GmbH)
siguiendo las instrucciones del fabricante y se inactiva la
endonucleasa de restricción por calentamiento de la mezcla incubada
a 65ºC durante 20 min. Seguidamente se llenan las proyecciones de
DNA formadas con la polimerasa de Klenow siguiendo las
instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics GmbH) y después se
inactiva la polimerasa de Klenow por incubación a 75ºC durante 10
min. Finalmente se corta el fragmento del vector, ahora linealizado,
del plásmido pPICZ\alphaA con la endonucleasa de restricción EcoRI
(Roche Diagnostics GmbH) con arreglo a las instrucciones del
fabricante, la mezcla de la restricción se aplica sobre un gel de
agarosa al 1% y se separan los fragmentos por tamaños conectando la
corriente eléctrica (100 V/150 mA). El fragmento que tiene un
tamaño de unos 3550 bp y contiene el gen del vector se aísla en el
gel de agarosa (kit de extracción en gel QIAquick de Qiagen).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los fragmentos así obtenidos se ligan entre sí
por el método estándar (Sambrook y col., 1989). En este vector, el
gen ppk está controlado por el promotor AOX 1 (promotor de la
alcoholoxidasa 1 de la Pichia pastoris, inducible con
metanol) y se clona con esta estrategia de clonación en el marco de
lectura correcto, detrás del péptido de señal del factor \alpha
del Saccharomyces cerevisiae. Se investiga el fragmento de
gen insertado de este modo mediante análisis de restricción y
secuenciación para determinar si su secuencia de bases es impecable.
El vector de expresión así formado, que contiene al gen ppk, que
codifica a la proproteinasa K, se llama pPICPK-1
(ver figura 1).
A continuación se clona también el gen ppk en el
pPIC9K (Invitrogen). Para ello se ha cortado el vector
pPICPK-1 con las endonucleasas de restricción PmeI y
NotI (Roche Diagnostics GmbH) siguiendo las instrucciones del
fabricante, se separan los fragmentos de la mezcla de retricción por
tamaños en un gel de agarosa al 1% y en este gel (kit de extracción
en gel QIAquick de Qiagen) se aísla el fragmento que tiene un tamaño
de 1960 bp y contiene la parte 3' de la región del promotor AOX1,
la secuencia del péptido de señal del factor \alpha y el gen ppk.
Al mismo tiempo se corta el vector pIC9K con las endonucleasas de
restricción PmeI y NotI (Roche Diagnostics GmbH) siguiendo las
instrucciones del fabricante, se separan los fragmentos de la mezcla
de restricción por tamaños en un gel de agarosa al 1% y se aísla en
el gel (kit de extracción en gel QIAquick de Qiagen) el fragmento
del vector que tiene un tamaño de aprox. 8450 bp.
A continuación se ligan entre sí los fragmentos
así obtenidos por un método estándar (Sambrook y col., 1989). En
este vector, el gen ppk está también bajo el control del promotor
AOX 1 (promotor de la alcoholoxidasa 1 de la Pichia
pastoris, inducible con metanol). El vector pPIC9K se diferencia
del vector pPICZ\alphaA por el marcador de selección y por las
tres posibilidades de integración, que los expertos ya conocen, en
el genoma de la Pichia en cada caso después de la
linealización del vector antes de la transformación, durante la
integración del pICZ\alphaA en el lugar
AOX1-Locus. El fragmento de gen insertado se
investiga a continuación mediante análisis de restricción y
secuenciación para comprobar que su secuencia de bases es
impecable.
El vector de expresión así generado, que
contiene el gen ppk que codifica a la proteinasa K, se llama
pPICPK-2 (ver figura 2).
Para la transformación del
pPICPK-1 en la Pichia pastoris
X-33 y su posterior integración en el genoma se
linealiza en primer lugar el vector con PmeI (Roche Diagnostics
GmbH). La transformación se realiza mediante electroporación con el
Gene Pulser II (Biorad).
Para ello se inocula una colonia de la cepa
salvaje de la Pichia pastoris en 5 ml del medio YPD (con
arreglo al catálogo de Invitrogen) y se incuba a 30ºC durante una
noche con agitación. Después se inocula el cultivo de la noche en
una proporción 1 : 2000 en 200 ml de medio YPD fresco (según el
catálogo de Invitrogen) y se incuba a 30ºC durante una noche con
agitación, hasta alcanzar una densidad óptica OD_{600} de
1,3-1,5. Se centrifugan las células (1500 x g/5
minutos) y se suspende de nuevo el culote en 200 ml de agua estéril,
enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células (1500
x g/5 minutos) y se suspenden de nuevo en 100 ml de agua estéril,
enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan las células de nuevo y se
suspenden en 10 ml de sorbita 1M (ICN) enfriada con hielo (0ºC). Se
mantienen las células así obtenidas sobre hielo y se emplean
inmediatamente para la transformación.
Se tratan 80 \mul de células con aprox. 1
\mug del DNA del vector pPICPK linealizado y se transfiere la
totalidad de la mezcla a una cubeta de electroporación enfriada con
hielo (0ºC) y se incuba sobre hielo durante 5 minutos más. A
continuación se introduce la cubeta en el Gene Pulser II (Biorad) y
se realiza la transformación a 1 kV, 1 k\Omega y 25 \muF.
Después de la electroporación se trata la mezcla con 1 ml de sorbita
1 M (ICN) y seguidamente se extiende 100-150 \mul
sobre una placa de agar YPDS (con arreglo al catálogo de Invitrogen)
con 100 \mug/ml de Zeocina™ (Invitrogen). Después se incuban las
placas a 30ºC durante 2-4 días.
Se inoculan los clones en placas de retícula MD
(minimal dextrose) y se continúa su análisis.
Se sacan los clones desarrollados, se
resuspenden en 20 \mul de agua estéril, se tratan con 17,5 U de
Lyticase (Roche Diagnostics GmbH) (1 hora, 37ºC) y se analiza
directamente mediante PCR si es correcta la integración del cassette
de expresión del ppk.
Los clones, que durante la transformación han
integrado el cassette de expresión completo en el genoma, se
utilizan seguidamente para los ensayos de expresión.
Para la transformación del
pICPK-2 en la Pichia pastoris GS115 y
posterior integración en el genoma se linealiza en primer lugar el
vector para la variante 1 con el PmeI (Roche Diagnostics GmbH) para
su integración en el lugar AOXI y para la variante II con el SaII
(Roche Diagnostics GmbH) para su integración en el lugar His4. La
transforman se realiza mediante electroporación con el Gene Pulser
II (Biorad).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para ello se inocula una colonia de la cepa
salvaje de la Pichia pastoris GS115 en 5 ml de medio YPD
(según el catálogo de Invitrogen) y se incuba a 30ºC durante una
noche, con agitación. A continuación se inocula el cultivo de la
noche en proporción 1 : 2000 en 200 ml de medio YPD fresco (con
arreglo al catálogo de Invitrogen) y se incuba a 30ºC durante una
noche, con agitación, hasta alcanzar una OD_{600} de
1,3-1,5. Se centrifugan las células (1500 x g/5
minutos) y se resuspende el culote en 200 ml de agua estéril,
enfriada con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células (1500
x g/5 minutos) y se resuspenden en 100 ml de agua estéril, enfriada
con hielo (0ºC). Se centrifugan de nuevo las células y se
resuspenden en 10 ml de sorbita 1 M (ICN) enfriada con hielo (0ºC).
Se centrifugan de nuevo las células y se resuspenden en 0,5 ml de
sorbita 1 M (ICN) enfriada con hielo (0ºC).
Se tratan 80 \mul de las células con aprox. 1
\mug del DNA del vector pICPK-2 linealizado, se
transfiere la totalidad de la mezcla a una cubeta de electroporación
enfriada con hielo (0ºC) y se incuba sobre hielo durante 5 minutos
más. A continuación se coloca la cubeta en el Gene Pulser II
(Biorad) y se efectúa la transformación a 1 kV, 1 k \Omega y 25
\muF. Después de la electroporación se trata la mezcla con 1 ml de
sorbita 1 M (ICN) y seguidamente se extienden
100-150 \mul sobre placas de agar MM (minimal
medium según el catálogo de Invitrogen) sin histidina. A
continuación se incuban las placas a 30ºC durante
2-4 días. Los clones de Pichia pastoris
GS115, que por mutación poseen un gen His4 defectuoso
(histidinoldeshidrogenasa), solamente conseguirán crecer en esta
placa, si han integrado el vector pPICPK-2, que
como inserto posee el gen His4 capaz de ejercer su función y, por
tanto, elimina la deficiencia en la biosíntesis de la histidina.
Se inoculan los clones sobre placas con una
retícula MD (= minimal dextrose) y se continúa su análisis. Se sacan
los clones desarrollados, se resuspenden en 20 \mul de agua
estéril, se tratan con 17,5 U de Lyticase (Roche Diagnostics GmbH)
(37ºC, 1 hora) y se comprueba directamente mediante la PCR si el
cassette de expresión ppk se ha integrado correctamente.
Los clones, que durante la transformación han
integrado el cassette de expresión completo en el genoma, se
utilizan después para los ensayos de expresión.
Se inoculan los clones positivos en 10 ml del
medio BMGY (con arreglo al catálogo de Invitrogen) y se incuban a
30ºC durante una noche, con agitación. A continuación se determina
la OD a 600 nm y se inocula en 10 ml de medio BMMY (según el
catálogo de Invitrogen) de tal manera que resulte una OD_{600} de
1. El medio BMMY (según el catálogo de Invitrogen) contiene metanol
(Mallinckrodt Baker B. V.), que induce la expresión de la proteinasa
K a través del promotor AOX 1.
Se incuban los contenidos de los matraces a 30ºC
con incubación, se toman muestras cada 24 horas, se determina la
OD_{600}, se realiza un ensayo de actividad para determinar la
expresión de la proteinasa K y en cada caso se añade metanol del
0,5% (Mallinckrodt Baker B. V.) para continuar la inducción. Los
ensayos de expresión duran 168 horas.
Para el ensayo de actividad de la proteinasa K
se necesita CaCl_{2} x 2H_{2}O (Merck, nº catálogo 102382),
DMSO (Merck, nº catálogo 109678), el sustrato
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
(Roche Diagnostics, nº catálogo 0716766) y Tris-Base
(Roche Diagnostics nº catálogo 0153265).
Las soluciones tienen las composiciones
siguientes:
solución 1: 50 mmoles/l
Tris-Base; 10 mmoles/l CaCl_{2}, pH 8,2 solución
2: 125 mg de
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
disueltos en 1 ml de DMSO
Se centrifugan las células (5 min a 10000 rpm en
una centrífuga Eppendorf de sobremesa) y se diluye el líquido
sobrenadante en proporción 1 : 500 en la solución 1.
Se pipetean 2 ml de la solución 1 a una cubeta y
se tratan con 0,02 ml de la solución 2. Se mezclan ambas soluciones
y se mantienen a una temperatura de reacción constante de 25ºC. Se
inicia la reacción por adición de 0,05 ml del líquido sobrenandante
diluido del modo recién indicado y nuevo mezclado, se miden los
cambios de absorción a 405 nm y se determina el valor \DeltaA/min
de la región lineal. La evaluación se realiza con arreglo a la
fórmula siguiente:
actividad =
\frac{2,07}{\varepsilon \ x \ 1 \ x \ 0,05} \ \Delta A/min \ [U/ml \
de \ solución \ de \
muestra]
en la
que
2,07 = volumen de muestra
\varepsilon_{405} = 10,4 [mmoles^{-1} x 1
x cm^{-1}]
1 = grosor de capa de la cubeta
0,05 = volumen de la muestra añadida.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión de la proteinasa K
recombinante de Titirachium album en levaduras
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5441/00/DE
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tritirachium album Limber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tritirachium album Limber
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tritirachium album Limber
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Procedimiento para la obtención de proteinasa
K recombinante que consta de los pasos siguientes:
a) la transformación de una célula hospedante
con un vector que contiene un DNA que codifica al compuesto previo
zimógeno de la proteinasa K, este DNA está fusionado en la parte
ascendente (upstream) de la secuencia codificadora con una
secuencia del marco de lectura, que codifica a un péptido de señal y
está bajo el control de un promotor adecuado para la célula
hospedante,
b) la expresión del compuesto zimógeno previo de
la proteinasa K,
c) la secreción y la activación autocatalítica
de la proteinasa K,
caracterizado porque la
célula hospedante es una célula de levadura elegida entre el grupo
formado por la especie Pichia, la especie Hansenula,
la especie Saccharomyces y la especie
Schizosaccharomyces y el hospedante de expresión secreta la
proteína en forma
soluble.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la célula hospedante es la Pichia pastoris.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que se induce la expresión del
compuesto previo zimógeno de la proteinasa K con metanol.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 3, en el que la secreción de la proteína se
inicia con la fusión de un péptido de señal en el extremo N.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 4, en el que se inicia la secreción de la
proteína por la fusión en el extremo N de un péptido de señal del
factor \alpha del Saccharomyces cerevisiae.
6. Vector que contiene un DNA que codifica al
compuesto previo zimógeno de la proteinasa K, este DNA está
fusionado en una posición ascendente (upstream) de la secuencia
codificadora con una secuencia del marco de lectura, que codifica a
un péptido de señal idóneo, y el gen codificador está controlado por
un promotor adecuado para la célula hospedante y este vector es
apropiado para la transformación de células de levadura, dichas
células de levadura se eligen entre el grupo formado por la especie
Pichia, la especie Hansenula, la especie
Saccharomyces y la especie Schizosaccharomyces.
7. Vector según la reivindicación 6,
caracterizado porque es idóneo para la transformación de la
Pichia pastoris.
8. Célula hospedante elegida entre el grupo
formado por la Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp. y
Schizosaccharomyces sp., transformada con un vector según una
de las reivindicaciones 6 ó 7, dicha célula hospedante es una
levadura.
9. Célula hospedante según la reivindicación 8,
dicha célula hospedante es la Pichia pastoris.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10105911A DE10105911A1 (de) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | Expression der rekombinanten Proteinase K aus Tritirachium album in Hefe |
| DE10105911 | 2001-02-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2280516T3 true ES2280516T3 (es) | 2007-09-16 |
Family
ID=7673416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02712891T Expired - Lifetime ES2280516T3 (es) | 2001-02-09 | 2002-02-05 | Expresion de la proteinasa k recombinante de tritirachium album en levadura. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7368274B2 (es) |
| EP (1) | EP1360283B1 (es) |
| JP (1) | JP2004517643A (es) |
| CN (1) | CN100549169C (es) |
| AT (1) | ATE353960T1 (es) |
| CA (1) | CA2435606C (es) |
| CZ (1) | CZ304969B6 (es) |
| DE (2) | DE10105911A1 (es) |
| DK (1) | DK1360283T3 (es) |
| ES (1) | ES2280516T3 (es) |
| WO (1) | WO2002064760A2 (es) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7153666B2 (en) | 2003-07-17 | 2006-12-26 | General Atomics | Methods and compositions for determination of glycated proteins |
| WO2005097986A1 (en) * | 2004-04-02 | 2005-10-20 | Roche Diagnosticss Gmbh | Highly purified proteinase k |
| US7943385B2 (en) | 2006-07-25 | 2011-05-17 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| WO2008013874A1 (en) * | 2006-07-25 | 2008-01-31 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| CN102076867A (zh) * | 2008-05-13 | 2011-05-25 | 通用原子公司 | 用于直接测定糖化血红蛋白百分比的电化学生物传感器 |
| CN102839165B (zh) * | 2012-09-26 | 2014-12-10 | 金普诺安生物科技（苏州）有限公司 | 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法 |
| CN104059900A (zh) * | 2013-03-19 | 2014-09-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种蛋白酶k及其应用 |
| CN105087529A (zh) * | 2014-05-07 | 2015-11-25 | 天津旭晨科技有限公司 | 基因工程改造蛋白酶k及其生产方法 |
| CN105193640B (zh) * | 2014-06-24 | 2018-10-12 | 金普诺安蛋白质工程技术（北京）有限公司 | 蛋白酶k在皮肤保健和化妆品领域中的应用 |
| CN108450952A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-08-28 | 深圳市唯姿贸易有限公司 | 一种细胞修复口服液 |
| CN110106160B (zh) * | 2019-05-29 | 2021-07-20 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 催化活性提高的碱性蛋白酶突变体prok-g及其编码基因和应用 |
| CN112048518B (zh) * | 2020-08-22 | 2022-06-24 | 江西农业大学 | 一种玉米醇溶蛋白降解酶的制备方法及其应用 |
| CN114181925A (zh) * | 2020-09-14 | 2022-03-15 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种重组蛋白酶k工业化纯化及冻干方法 |
| CN112592931A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-02 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 一种生产重组蛋白酶k的方法 |
| CN113337492B (zh) * | 2021-06-02 | 2023-04-07 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 一种蛋白酶k耐热突变体 |
| CN113481225A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-08 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 一种蛋白酶k高表达工程菌株的构建及应用 |
| PL244825B1 (pl) | 2021-11-26 | 2024-03-11 | Blirt Spolka Akcyjna | Mutant proteinazy K Tritirachium album i jej zymogenu, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i sposób wytwarzania dojrzałej formy mutanta proteinazy K |
| CN115011583A (zh) * | 2021-11-26 | 2022-09-06 | 河南合智医药科技有限公司 | 高表达高比活蛋白酶k突变体序列、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3537708A1 (de) | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
| WO1988007581A1 (en) * | 1987-04-03 | 1988-10-06 | Amgen Inc. | Novel proteolytic enzymes |
| US5191063A (en) | 1989-05-02 | 1993-03-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence |
| IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
-
2001
- 2001-02-09 DE DE10105911A patent/DE10105911A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-05 CN CNB028047745A patent/CN100549169C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-05 CZ CZ2003-2163A patent/CZ304969B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-02-05 ES ES02712891T patent/ES2280516T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-05 DE DE50209478T patent/DE50209478D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-05 DK DK02712891T patent/DK1360283T3/da active
- 2002-02-05 EP EP02712891A patent/EP1360283B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-05 CA CA2435606A patent/CA2435606C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-05 JP JP2002565075A patent/JP2004517643A/ja active Pending
- 2002-02-05 AT AT02712891T patent/ATE353960T1/de active
- 2002-02-05 US US10/468,252 patent/US7368274B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-05 WO PCT/EP2002/001144 patent/WO2002064760A2/de active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE10105911A1 (de) | 2002-08-14 |
| CZ20032163A3 (cs) | 2004-05-12 |
| DE50209478D1 (de) | 2007-03-29 |
| DK1360283T3 (da) | 2007-06-11 |
| WO2002064760A3 (de) | 2002-12-27 |
| JP2004517643A (ja) | 2004-06-17 |
| US20040166560A1 (en) | 2004-08-26 |
| ATE353960T1 (de) | 2007-03-15 |
| CA2435606C (en) | 2011-07-19 |
| CN1592785A (zh) | 2005-03-09 |
| CN100549169C (zh) | 2009-10-14 |
| CZ304969B6 (cs) | 2015-02-18 |
| EP1360283A2 (de) | 2003-11-12 |
| EP1360283B1 (de) | 2007-02-14 |
| US7368274B2 (en) | 2008-05-06 |
| WO2002064760A2 (de) | 2002-08-22 |
| CA2435606A1 (en) | 2002-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2280516T3 (es) | Expresion de la proteinasa k recombinante de tritirachium album en levadura. | |
| ES2370657T3 (es) | Escisión de precursores de insulinas mediante una variante de tripsina. | |
| EP1718742B1 (en) | Fungal cell wall degrading enzyme | |
| Hartleib et al. | High-yield expression, purification, and characterization of the recombinant diisopropylfluorophosphatase from Loligo vulgaris | |
| Shotaro et al. | Cloning and structure of the mono-and diacylglycerol lipase-encoding gene from Penicillium camembertii U-150 | |
| Miyazaki et al. | Characterization of the precursor of Serratia marcescens serine protease and COOH-terminal processing of the precursor during its excretion through the outer membrane of Escherichia coli | |
| Kopitar et al. | Folding and activation of human procathepsin S from inclusion bodies produced in Escherichia coli | |
| Chatterjee et al. | Determination of Km and kcat for signal peptidase I using a full length secretory precursor, pro-OmpA-nuclease A | |
| Jeong et al. | Molecular cloning and characterization of the gene encoding a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis strain A1 | |
| Svendsen et al. | The primary structure of the glutamic acid-specific protease ofStreptomyces griseus | |
| Li et al. | Functional expression of the keratinolytic serine protease gene sfp2 from Streptomyces fradiae var. k11 in Pichia pastoris | |
| AU678019B2 (en) | Processes for producing an enzyme | |
| Yoshimasu et al. | Soluble expression and purification of porcine pepsinogen from Pichia pastoris | |
| Pitts et al. | Multidisciplinary cycles for protein engineering: site-directed mutagenesis and X-ray structural studies of aspartic proteinases | |
| Phongdara et al. | Cloning and characterization of the gene encoding a repressible acid phosphatase (PHO1) from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha | |
| TSUJISO et al. | Cloning and sequence analysis of a protease-encoding gene from the marine bacterium Alteromonas sp. strain O-7 | |
| Kwon et al. | Cloning, sequencing, and expression of a minor protease-encoding gene from Serratia marcescens ATCC21074 | |
| Baier et al. | Evidence for propeptide‐assisted folding of the calcium‐dependent protease of the cyanobacterium Anabaena | |
| Park et al. | Site-directed mutagenesis of conserved Trp39 in Rhizomucor pusillus pepsin: possible role of Trp39 in maintaining Tyr75 in the correct orientation for maximizing catalytic activity | |
| EP1769072A1 (en) | Protein and nucleic acid sequence encoding a krill-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme | |
| Yonezawa et al. | Role of the amino-terminal amino acid sequences determining the in vitro refolding process of prochymosin polypeptide | |
| CN108103045B (zh) | 脂肪酶及其应用 | |
| ES2265454T3 (es) | Nuevas endoproteasas solubles para el procesamiento in vitro de proteinas recombinantes. | |
| JP4191479B2 (ja) | エビのアルカリホスファターゼ | |
| Yang et al. | Cloning and Sequence analysis of preprochymosin cDNA of Xinong Saanen milk goat |