CN104059900A - 一种蛋白酶k及其应用 - Google Patents

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王华明
林艳梅
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
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Abstract

本发明涉及一种蛋白酶K及其应用，所述的一种蛋白酶K的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明筛选出的蛋白酶K切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，可以用来制备脉冲电泳的染色体DNA,蛋白印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶，也可以用于提取组织中非蛋白成份降解含有蛋白质的杂志，比如DNA疫苗和肝素的制备等，具有工业生产应用价值。而且筛选出的蛋白酶K基因可以用来转化工程菌，从而获得具有表达蛋白酶K的重组菌。

Description

一种蛋白酶K及其应用
技术领域
本发明属于酶基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白酶K及其应用。
背景技术
蛋白酶K(E.C.3.4.21.64)是真菌Tritirachium album Limber合成的胞外内肽酶,它是具有典型催化三元组Asp39-His69-Ser224的丝氨酸蛋白酶类中的一员。蛋白酶K具有高于30U/mg的特异活性，是已知的内肽酶中最有活性的之一，并且非特异性水解天然的和变性的蛋白质。
成熟蛋白酶K由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。所以，与其他枯草杆菌蛋白酶相比，蛋白酶K对极端pH值、高温、离液剂和去污剂具有高得多的稳定性，蛋白酶K在高温（达65℃）和宽pH范围（pH 7.5—12.0）具有高稳定性。在变性剂例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性质使得蛋白酶K在要求非特异性蛋白质降解的生物技术领域中具有很好的应用，特别是从粗提取液中分离核酸（DNA或RNA）以及在DNA分析中预制备样品，另外蛋白酶K也可应用于蛋白质分析领域，例如结构释析。
但因为目前的Tritirachium album Limber基因的核苷酸序列不适合大规模发酵，而且难以进行基因操作，之前曾进行过在其它宿主细胞中过量表达的重组蛋白酶K的尝试，但存在着不表达、产生失活“包涵体”或者与复性有关的问题，在这些试验中没有检测到显著活性。因此，需要对其序列进行相应的改造，以满足工业生产的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白酶K及其应用，即一种具有工业应用价值的新型蛋白酶K，以弥补现有技术的不足。
本发明一个方面涉及一种蛋白酶K，包括有：
a）序列为SEQ ID NO：1的酶；
b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
编码上述蛋白酶K的核苷酸，其优化的序列为SEQ ID NO：2。
本发明还提供用于表达上述蛋白酶K的重组表达质粒，是将序列为SEQID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
本发明还涉及携带有表达上述蛋白酶K的重组表达质粒的重组菌。
本发明筛选出的蛋白酶K能切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，可以用来制备脉冲电泳的染色体DNA,蛋白印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶，也可以用于提取组织中非蛋白成份降解含有蛋白质的杂志，比如DNA疫苗和肝素的制备等，具有工业生产应用价值。而且筛选出的蛋白酶K基因可以用来转化工程菌，从而获得具有表达蛋白酶K的重组菌。
附图说明
图1：本发明的蛋白酶K在黑曲霉宿主中的pH稳定性；
图2：本发明的蛋白酶K在黑曲霉宿主中的温度稳定性。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
1、蛋白酶K基因的合成
将Tritirachium album Limber的序列进行改造，形成新的核酸序列ProK，使ProK不被XhoⅠ和XbaⅠ两个酶切位点切断，获得的新的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。在ProK序列两端加XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点，将文本序列送至生物公司（上海生工）合成，合成的ProK被连接在载体PSG-TS上, 插入位点为t-a克隆，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。
2、蛋白酶K基因重组载体的构建
将连在PSG-TS载体上的ProK基因用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段，与同样用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并切胶回收的质粒pGm连接，转化感受态大肠杆菌（E.coli）DH5α后，涂于含有Amp的LB固体培养基上。37℃培养14-16小时，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到4 ml LB液体培养基中进行培养（含Amp），培养14-16小时后，提取质粒，将重组质粒pGm-ProK转入表达宿主黑曲霉G1，含有该重组质粒的重组菌株命名为G1-pGm-ProK。
其中的酶切及连接反应均参照表1。
３、转化黑曲霉及重组子筛选鉴定
（1）将装有100ml CMA 的250ml 4-挡板摇瓶用新鲜的黑曲霉G1菌株孢子接种，在30℃、200rpm条件下使培养物生长12小时。
（2）将（1）中获得的菌体用4层无菌纱布过滤，先用无菌水冲洗3次，再用溶液 A冲洗3次。
（3）在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到原生质体溶液中并在30℃、200rpm温育2小时，显微镜观察监测原生质体化进展。
（4）用无菌Micra-Cloth将原生质体化反应滤入至两个50ml无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45ml，4000 rpm离心10 min。弃上清；向管中加20 ml 溶液B，混匀，4000 rpm离心5min，弃上清；再向管中加20 ml溶液B，混匀，4000 rpm离心5min，弃上清。
（5）加100 μl 溶液B重悬原生质体，原生质体的浓度应达到1×107个/100μl。在冰上，将100μl原生质体溶液转移到预冷的15ml管中，每个转化反应一管。以不超过10μl的体积向管中加入10μg DNA，并加入12.5 μl 溶液 C，温和混匀并在冰上温育20分钟。
（6）将MMSA上层培养基（每管8ml）熔化并保持在55℃。从冰中移出原生质体，向原生质体中加入1ml溶液C和2ml溶液B，并与一管MMSA上层培养基温和混匀，将混合液分别倒入三个amdS下层培养基平板中30℃恒温培养4-7天。
（7）将长出的转化子转接至admS二次验证培养基平板，30℃恒温培养，并进行菌落PCR验证，获得的阳性菌株经测序鉴定正确，α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
溶液A（每500ml）— 2.5ml 1M K2HPO4; 2.5ml 1M KH2PO4;48.156g无水MgSO4(FW 120.37)；加入dlH2O至终体积500ml，pH 5.5。将溶液过滤灭菌并在室温下保存。
原生质体化溶液—将0.6g的β-D-葡聚糖酶（InterSpex Products，Inc,CA）或者450mgβ-D-葡聚糖酶和150mg Driselase（InterSpexProducts，Inc.）溶解于40ml溶液A中，并将溶液过滤灭菌，0.2微米。
溶液B（每500ml）—5ml 1M Tris，pH 7.5；2.77g CaCl2（FW110.99）；109.32g山梨醇（FW 182.2；1.2 M）；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌并在室温下保存。
溶液C(每500ml)—250g PEG4000；2.77g CaCl2；5ml 1M Tris，pH7.5；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌。
MMSA琼脂—将0.59g/L乙酰胺；3.4g/L CsCl；0.52g/L KCl；1.52g/L KH2PO4；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L 痕量元素；10g/L琼脂（顶层琼脂中的低熔点琼脂糖）溶解于1L dlH2O，高压灭菌。灭菌后，在无菌条件下加入10ml 50%葡萄糖和1.25ml 20% MgSO4·7H2O。
CMA（1升）= 20g无水葡萄糖；20g麦芽膏（Difco Brand Malt Extract），1g蛋白胨（Bacto Peptone）；20g琼脂（Bacto Agar）
４、蛋白酶K的活性测定
将获得的阳性菌株接种于液体发酵培养基中，于30℃、200 rpm摇床培养。蛋白酶K酶活用福林法测定。转入了pGm-ProK质粒的黑曲霉G1在pH 7.5、40℃条件下测定的蛋白酶K酶活可达到 1307.56 U/ml，结果证明本发明构建的蛋白酶K的核苷酸序列可以在黑曲霉中大量表达。
4.1、测定本发明蛋白酶K在不同pH下的酶活：
将测酶活的反应缓冲液pH分别设定为pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11，测定在这些pH条件下本发明序列为SEQ ID NO：1的蛋白酶K的酶活，测定结果参见图1。从该图中可以看出，蛋白酶K的最适反应pH为11。
4.2、测定本发明蛋白酶K在pH为11、不同温度下的酶活：
将反应pH设定为11，反应温度分别设定为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。测定结果参见图2。从该图中可以看出，蛋白酶K的最适反应温度为50℃。
5、蛋白酶K的应用实例
本发明使用蛋白酶K水解小麦面筋蛋白，以DPPH 自由基清除率为筛选指标，在温度 50 ℃、pH 9、底物量 5 g、水解时间 25 min的条件下，小麦面筋蛋白混合酶解液 DPPH 自由基清除率达到 87.67%。这表明在本发明的蛋白酶K的作用下，水解的产物的体外抗氧化效果显著，可对其进一步分离纯化研究，为小麦面筋蛋白的综合利用和开发提供一定的基础。

Claims (5)

1.一种蛋白酶K，包括有：
a）序列为SEQ ID NO：1的酶；
b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有
a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一种编码权利要求1所述的蛋白酶K的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2。
3.一种重组表达质粒，所述的重组表达质粒用于表达权利要求1所述的蛋
白酶K。
4.如权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于所述的重组表达质粒是
将序列为SEQ ID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
5.一种重组菌，所述的重组菌携带有权利要求3所述的重组表达质粒。
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