CN104480027B - 一种高产蛋白酶k的黑曲霉菌株及其应用 - Google Patents

一种高产蛋白酶k的黑曲霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黑曲霉，其保藏编号为CCTCC NO:M2014677。本发明通过紫外诱变方法获得的黑曲霉突变菌mk37能够高效表达来源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K，其发酵酶活高达7772.9U/mL，比出发菌株提高了42％。与出发菌株相比，突变菌株mk37的菌落较小、较密实，产孢子数量多，且菌丝分支多、短，菌丝生长更密集，更适合高密度发酵，能有效降低蛋白酶K的生产成本。此外，本发明所述黑曲霉突变菌mk37重组表达的蛋白酶K可广泛应用于食品加工领域。

Description

一种高产蛋白酶K的黑曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明属于酶基因工程技术和微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种高产蛋白酶K的黑曲霉菌株及其应用。
背景技术
蛋白酶K(E.C.3.4.21.64)是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，是由真菌林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)合成的胞外内肽酶，它是具有典型催化三元组Asp39-His69-Ser224的丝氨酸蛋白酶类中的一员。蛋白酶K具有高于30U/mg的特异活性，是已知的内肽酶中最有活性的之一，并且非特异性水解天然的和变性的蛋白质。
蛋白酶K具有非常重要的生物学意义，具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。成熟蛋白酶K由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。所以，与其他枯草杆菌蛋白酶相比，蛋白酶K对极端pH值、高温、离液剂和去污剂具有高得多的稳定性，蛋白酶K在高温(达65℃)和宽pH范围(pH7.5—12.0)具有高稳定性。在变性剂例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性质使得蛋白酶K在要求非特异性蛋白质降解的生物技术领域中具有很好的应用，特别是从粗提取液中分离核酸(DNA或RNA)以及在DNA分析中预制备样品，另外蛋白酶K也可应用于蛋白质分析领域，例如结构释析。
但因为林伯氏白色念球菌生长缓慢，不适合大规模发酵，而且菌体在产生蛋白酶K的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。因此利用基因工程技术实现蛋白酶K的异源重组表达是目前研究的重点和发展趋势。很多科研学者对改变蛋白酶K宿主菌做了多次尝试。Gunkel F.A.等将蛋白酶K转入大肠杆菌体内，实现了蛋白酶K的胞内表达，然而表达量极低，Muelle R.等构建了蛋白酶K的表达载体并将其转入毕赤酵母体内，证明了蛋白酶K可以在酵母体内表达；但还存在着表达量难以满足生产要求的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产蛋白酶K的黑曲霉菌株及其应用，从而弥补现有技术的不足。
本发明一方面提供了一种黑曲霉mk37(Aspergillus niger mk37)，已于2014年12月30日被保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014677。
上述的黑曲霉mk37用于代谢合成蛋白酶K；
所述蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
编码上述蛋白酶K的基因，其一种编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明通过紫外诱变方法获得的黑曲霉突变菌mk37能够高效表达来源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K，其发酵酶活高达7772.9U/mL，比出发菌株提高了42％。与出发菌株相比，突变菌株mk37的菌落较小、较密实，产孢子数量多，且菌丝分支多、短，菌丝生长更密集，更适合高密度发酵，能有效降低蛋白酶K的生产成本。此外，本发明所述黑曲霉突变菌mk37重组表达的蛋白酶K可广泛应用于食品加工领域，经蛋白酶K嫩化后的牦牛肉在色泽、口感方面表现均优于对照组，且肉的平均剪切力、失水率、肌纤维直径，分别比对照组低49.12N/cm2、6.21％、8.56μm，从而说明本发明所述蛋白酶K对冷却牦牛肉的嫩化效果显著。除了食品加工领域外，本发明所述蛋白酶K还可广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、酿造等领域，均具有很好的效果。
附图说明
图1为突变株黑曲霉mk37与出发菌株菌落形态对比图；
图2为突变株黑曲霉mk37与出发菌株菌丝形态对比图；
图3为突变株黑曲霉mk37发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，箭头所指处即为重组表达的蛋白酶K。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
实施例1、蛋白酶K基因的合成
来源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，将此序列按照黑曲霉的密码子偏爱性翻译成相应的核酸序列，使其不被Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个酶切位点切断，得到的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。在蛋白酶K的核苷酸序列两端加Xho Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点，交由上海生工生物工程有限公司进行合成，合成的蛋白酶K核苷酸序列被连接在载体PSG-TS上,插入位点为t-a克隆，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。
实施例2、蛋白酶K基因重组载体的构建
将连在PSG-TS载体上的蛋白酶K基因用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段，与同样用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切并切胶回收的质粒pGm连接，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α后，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒，测序结果显示获得的DNA序列为SEQ IDNO:2，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO:1。从而说明重组质粒构建成功，命名为pGm-ProK。
其中的酶切及连接反应均参照表1。
表1酶切体系及连接体系
实施例3宿主菌黑曲霉LYM-1的获得
申请人通过将来源于棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α‐淀粉酶基因导入黑曲霉(Aspergillus niger)中，构建得到重组表达异源α‐淀粉酶的黑曲霉工程菌株，并经过紫外诱变筛选后获得一种α‐淀粉酶表达量显著提高的突变菌株黑曲霉P11-51，已于2014年1月12日被保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，菌株编号为CCTCC NO:M2014017。
再利用氟乙酰胺平板筛选的方法对黑曲霉P11-51进行反向筛选，获得不含外源α‐淀粉酶基因的黑曲霉菌株，具体方法如下：
将黑曲霉P11-51接种至斜面CMA培养基，30℃培养5d。加10mL的无菌生理盐水，将孢子洗下，通过带脱脂棉的漏斗过滤，置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，震荡均匀，制成单孢子悬液，在光学显微镜下用血球计数仪计数后用无菌生理盐水将孢子悬液稀释至102-104个/mL。
吸取100μl孢子悬液均匀涂布于氟乙酰胺平板上，培养3至4天；将生长出来的单菌落转接到斜面CMA培养基中培养，再进行摇瓶发酵；将发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测分析。结果显示：以黑曲霉P11-51发酵上清液作对照，外源α‐淀粉酶对应的蛋白条带发生缺失的菌株，即为筛选到的目的菌株，申请人将其命名为黑曲霉LYM-1(Aspergillus niger LYM-1)。
氟乙酰胺平板培养基(1升)配方：硝酸钠6.00g,氯化钾0.52g，磷酸二氢钾1.52g,微量元素1.00mL，琼脂20g，调整pH至6.5。在倒平板前，每升培养基加入葡萄糖(40％)25ml，七水合硫酸镁(20％)2.5ml，尿苷(100mg/ml)20ml，精氨酸(50mg/ml)20ml，氟乙酰胺1.2g。
实施例4转化宿主菌黑曲霉LYM-1及重组子筛选鉴定
(1)在装有100ml CMA培养基的摇瓶中接种新鲜的黑曲霉LYM-1菌株孢子，在30℃、200rpm条件下培养12小时；
(2)将(1)中获得的菌体用4层无菌纱布过滤，先用无菌水冲洗3次，再用溶液A冲洗3次；
(3)在无菌条件下，将清洗过的菌丝体转移到原生质体溶液中，并在30℃、200rpm温育2小时，显微镜观察监测原生质体化进展；
(4)用无菌Micra-Cloth将原生质体化反应滤入至两个50ml无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45ml，4000rpm离心10min。弃上清；向管中加20ml溶液B，混匀，4000rpm离心5min，弃上清；再向管中加20ml溶液B，混匀，4000rpm离心5min，弃上清；
(5)加100μl溶液B重悬原生质体，原生质体的浓度应达到1×107个/100μl。在冰上，将100μl原生质体溶液转移到预冷的15ml管中，每个转化反应一管。以不超过10μl的体积向管中加入10μg实施例2构建的重组质粒pGm-ProK，并加入12.5μl溶液C，温和混匀并在冰上温育20分钟；
(6)将MMSA上层培养基(每管8ml)熔化并保持在55℃。从冰中移出原生质体，向原生质体中加入1ml溶液C和2ml溶液B，并与一管MMSA上层培养基温和混匀，将混合液分别倒入三个amdS下层培养基平板中30℃恒温培养4-7天；
(7)将长出的转化子转接至admS二次验证培养基平板，30℃恒温培养，并进行菌落PCR验证，获得的阳性转化子经测序鉴定正确，
溶液A(每500ml)—2.5ml 1M K2HPO4；2.5ml 1M KH2PO4；48.156g无水MgSO4(FW 120.37)；加入dlH2O至终体积500ml，pH 5.5。将溶液过滤灭菌并在室温下保存。
原生质体化溶液—将0.6g的β-D-葡聚糖酶(InterSpex ProductsInc,CA)或者450mgβ-D-葡聚糖酶和150mg Driselase(InterSpex Products，Inc.)溶解于40ml溶液A中，并将溶液过滤灭菌，0.2微米。
溶液B(每500ml)—5ml 1M Tris，pH 7.5；2.77g CaCl2(FW 110.99)；109.32g山梨醇(FW 182.2；1.2M)；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌并在室温下保存。
溶液C(每500ml)—250g PEG4000；2.77g CaCl2；5ml 1M Tris，pH7.5；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌。
MMSA琼脂—将0.59g/L乙酰胺；3.4g/L CsCl；0.52g/L KCl；1.52g/LKH2PO4；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L痕量元素；10g/L琼脂(顶层琼脂中的低熔点琼脂糖)溶解于1L dlH2O，高压灭菌。灭菌后，在无菌条件下加入10ml 50％葡萄糖和1.25ml 20％MgSO4·7H2O。
CMA(1升)＝20g无水葡萄糖；20g麦芽膏(Difco Brand Malt Extract)，1g蛋白胨(Bacto Peptone)；20g琼脂(Bacto Agar)
实施例5蛋白酶K的活性测定与酶学性质分析
将实施例4获得的其中一个阳性转化子命名为黑曲霉kd8(Aspergillusniger kd8)，接种于液体发酵培养基中，30℃、200rpm摇床培养12h，离心，取发酵上清液，用福林法测定上清液中蛋白酶K的酶活。
1、最适作用pH
分别用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲液稀释黑曲霉kd8的发酵上清液，在50℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示，本发明所述蛋白酶K的最适作用pH为10.0。
2、最适作用温度
分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，pH10.0条件下测定黑曲霉kd8的发酵上清液酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示，本发明所述蛋白酶K的最适作用温度为50℃。
实施例6出发菌株黑曲霉kd8的紫外诱变与筛选
CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。
以黑曲霉kd8作为出发菌株进行紫外诱变与筛选。
紫外诱变方法：
1、孢子悬液的制备：将黑曲霉kd8接种至斜面CMA培养基，30℃培养5d。加10mL的无菌生理盐水，将孢子洗下，通过带脱脂棉的漏斗过滤，置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，震荡均匀，制成单孢子悬液，在光学显微镜下用血球计数仪计数后用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到106个/mL，即为待诱变处理的孢子悬液；
2、预热紫外灯30min；将10mL孢子悬液倒入无菌平皿(直径9cm)中，并将平皿置于距离44w紫外灯18cm的紫外诱变箱中；
3、紫外灯预热后，开始紫外诱变，打开皿盖，计时；在0min，5min，10min，20min，30min分别吸取100μL孢子悬液，做系列梯度稀释；
4、诱变结束后，关闭紫外灯，利用红光灯源而非白光灯以避免光修复；将上述各点取出的孢子悬液做梯度稀释；每个稀释度取出100μL涂布筛选平板，在30℃培养箱中避光培养，每个样品做三个平行；
5、紫外诱变结果观察:
培养36小时后，观察菌落形态，并进行菌落计数，计算紫外诱变致死率。计算公式如下:
各个诱变时间平板上的菌落数按照三个平板的平均值来计算。
选择致死率在95％以上的时间点进行紫外诱变，诱变后用显微镜观察诱变菌的菌丝形态，选择菌丝多分支的菌落，划线接种于CMA固体培养基平板，待其长出黑色孢子后，用无菌水洗下，接种于TSB发酵培养基中，发酵5天后检测发酵液中的蛋白酶酶活，将酶活水平最高的一株突变菌命名为黑曲霉mk37(Aspergillus niger mk37)。在相同的培养条件下，从菌落形态上看(如图1)，突变菌mk37的菌落较小、较密实，产孢子数量也比出发菌株多；显微镜观察发现(图2所示)突变菌mk37的菌丝分支比出发菌株分支多且短，菌丝生长更密集，更适合高密度发酵生产。
将出发菌株黑曲霉kd8和突变菌株mk37的孢子悬浮液分别接种于25mL TSB发酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养6d；所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000×g条件下离心10min，收集上清液；分别对上清液进行SDS-PAGE电泳检测和酶活测定。电泳结果如图3所示，箭头所指处的蛋白条带即为重组表达的蛋白酶K。
酶活测定结果显示，在pH10.0，50℃条件下，出发菌株黑曲霉kd8的发酵上清液酶活仅为5483.7U/mL，而所述突变菌株mk37的酶活高达7772.9U/mL，比出发菌提高了42％；且酶学性质分析结果显示，突变菌株mk37重组表达的蛋白酶K的最适作用pH和最适作用温度均与出发菌相同，没有因突变发生改变。
本发明获得的突变菌株黑曲霉mk37已于2014年12月30日被保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014677。
实施例7蛋白酶K的应用实例
酶液样品：黑曲霉mk37发酵上清液，酶活稀释至3000U/mL；
嫩化液配制：向酶液样品中添加0.02％(质量体积比)抗坏血酸，充分溶解，混匀。
选择5岁的健康牦牛，屠宰后1～2h内分割取其后腿部位肉，分切成1kg大小肉块；用注射器按5-10mL/kg的比例将嫩化液均匀注射到肉的各个部位；将注射后的肉块真空包装，在15℃条件下处理3h，完成酶的扩散和嫩化处理；然后在-10℃～-6℃条件下，2h内使肉温降至4℃以下，在0～4℃下贮藏。同时以未加嫩化液的牦牛肉作为对照组。
通过对牦牛肉的肉质进行感官评价和具体指标检测发现：经过本发明所述蛋白酶K嫩化后的牦牛肉在色泽、口感方面表现均优于对照组，且肉的平均剪切力(43.11N/cm2)、失水率(31.09％)、肌纤维直径(41.6μm),分别比对照组低49.12N/cm2、6.21％、8.56μm，从而说明本发明所述蛋白酶K对冷却牦牛肉的嫩化效果显著。
蛋白酶K嫩化处理对牦牛肉的贮藏性无明显影响，在不采取任何其它保鲜措施的情况下，经真空包装，在0～4℃条件下最长贮藏期可达9天。
除了食品加工领域外，本发明所述蛋白酶K还可广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、酿造等领域，效果显著。

Claims (3)

1.一种黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉的保藏编号为CCTCC NO:M2014677。
2.如权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉是通过诱变筛选获得的。
3.权利要求1所述的黑曲霉在代谢合成蛋白酶K中的应用。
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