CN105441336B - 一种有效防止丝状真菌退化及恢复产孢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种有效防止丝状真菌退化及恢复产孢的方法，防止丝状真菌退化的方法包括在丝状真菌的传代过程中，在培养基中添加两种氨基酸。恢复产孢的方法包括将退化的菌株接种到添加两种氨基酸的MM培养基上进行复壮培养，再将复壮培养的菌株，再次接种于添加了两种氨基酸的PDA培养基上培养。本发明突破了传统的菌株复壮的方法，采用简单、经济、无害的氨基酸，且效果显著。

Description

一种有效防止丝状真菌退化及恢复产孢的方法
技术领域
本发明属于真菌保藏领域，特别涉及一种有效防止丝状真菌退化及恢复产孢的方法。
背景技术
子囊菌绿僵菌(Metarhizium robertsii，下简称绿僵菌)作为虫生真菌，其寄主范围可达50科、200余种昆虫。绿僵菌具有典型的真菌侵染过程：分生孢子附着于昆虫体表，孢子萌发并分化形成附着胞，借助各种降解酶的联合作用而穿透昆虫体壁，体内形成虫菌体而快速繁殖，由于营养剥夺及分泌毒素等作用而杀死害虫。绿僵菌已经成为虫生真菌分子致病机理和真菌—昆虫互作研究的理想模式系统。而且在生物害虫防治上作为化学杀虫剂的有效替代方面具有广阔的应用前景，目前已经有多种专门的产品。
蛹虫草作为一种重要的传统中药，其栽培和研究一直备受关注。虫草具有多种药用功效，包括：抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血脂等等。其活性成分包括：核苷酸、多糖、多肽和糖蛋白、甾醇和萜烯。但在在丝状真菌的研究中发现，丝状真菌退化是一种很普遍的现象，表现为产孢能力下降或丧失、毒力下降及次级代谢产物合成能力下降等。因而，退化严重影响了许多丝状真菌的经济性状，给大规模生产及菌种保藏工作带来损失。
导致丝状真菌退化的原因有很多：可以是自发突变的量变到质变，也可能是环境因素不适宜导致的变异，或者微生物污染导致，或者保藏方式的不当，一味的转接、传代，而使得群体中的负变异不断扩大等等原因。
现阶段，丝状真菌包括食用真菌在内，主要采取复壮的方式，使退化菌株恢复优良的性状：
(1)组织分离：将退化的丝状真菌出菇(如蘑菇类或蛹虫草)，选择子实体外观健壮的，在无菌条件下重新进行组织分离。
(2)菌丝纯化与尖端菌丝分离：挑取健壮的菌丝尖端部分，进行培养，以期获得复壮的菌株。
(3)有性孢子分离筛选：选择形态好，生长好的子实体，采用孢子收集器收集有性孢子，进行多孢或单孢分离培养。获得的单核菌丝还要与可亲和的单核菌丝杂交后形成双核菌丝，再进行出菇实验，才能确定获得复壮的菌株。
(4)添加抗生素，对菌株进行复壮。
从以上方法中，可以看出都是在菌株退化后，再利用不同的方法，重新选择。前三种方法都费时耗力，而且不能保证得到复壮的菌株；最后一种方法，虽然简单，但要添加各种不同的抗生素，在现在，抗生素的使用已经得到严格的控制，因此也不能得到很好的推广和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种有效防止丝状真菌退化及恢复产孢的方法，该方法突破了传统的菌株复壮的方法，采用简单、经济、无害的氨基酸，且效果显著。
本发明的一种有效防止丝状真菌退化的方法，包括如下步骤：
将正常的丝状真菌菌株，接种于添加了1～3％组氨酸(Histidine)和0.1～1％赖氨酸(Lysine)的MM固体培养基上，25～28℃培养，进行传代，保藏，即可。其中百分比均指质量浓度。
所述丝状真菌为绿僵菌或蛹虫草。
所述MM固体培养基的组成为：NaNO3 6g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O 0.52g/L，KH2PO4 0.25g/L，Glucose 10g/L，CH3COONa·3H2O 8.2g/L，琼脂粉15g/L。
所述组氨酸和赖氨酸过滤除菌后加入。
本发明的一种丝状真菌恢复产孢的方法，包括如下步骤：
将退化的丝状真菌菌株接种于添加了1～3％组氨酸和0.1～1％赖氨酸的MM培养基中，25～28℃培养10～12天；随后将培养获得的菌株，转接到添加了1～3％组氨酸和0.1～1％赖氨酸的PDA培养基上，25～28℃培养10～12天，即可作为原种使用。其中百分比均指质量浓度。
所述丝状真菌为绿僵菌或蛹虫草。
所述MM培养基的组成为：NaNO3 6g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O 0.52g/L，KH2PO40.25g/L，Glucose 10g/L，CH3COONa·3H2O 8.2g/L。
所述PDA培养基的组成为：购买BD(Becton,Dickinson and Company)公司的PDA复合培养基加水配制，3.9g/100mL。
所述组氨酸和赖氨酸过滤除菌后加入。
有益效果
(1)本发明的方法适用于由于反复传代或环境因素所导致的菌种产孢量明显减少、菌丝气生现象明显、色素明显退化等现象；并适用于菌种的常规实验和保藏，可以明显减少菌种的退化频率。
(2)本发明突破了常规的丝状真菌复壮的方法，不仅能有效的复壮，而且在菌种的保藏、发酵过程中添加无害的试剂，就能有效防止退化的发生；此方法操作简单、经济实惠，安全无害，且效果显著。经此方法培养的绿僵菌已经退化的菌株，产孢量得到明显提高，菌株角变频率明显下降。
附图说明
图1为实施例1罗伯茨绿僵菌菌株的生长图；其中，1-P为在MM固体培养基的正常菌株，1-L为在MM液体培养基的正常菌株；2-P为在MM固体培养基的退化菌株，2-L为在MM液体培养基的退化菌株；3-P为在MM固体培养基的复壮菌株，3-L为在MM液体培养基的复壮菌株；
图2为实施例3蛹虫草的生长图；其中，1-0、2-0为正常的出发菌株；1-10、2-10为连续传代10次后的菌株，1-10在没有添加氨基酸的培养基上生长，2-10在添加了氨基酸的培养基上生长；
图3为实施例3的孢子产量图；其中，1-0、2-0为正常的出发菌株；1-10、2-10为连续传代10次后的菌株，1-10在没有添加氨基酸的培养基上生长，2-10在添加了氨基酸的培养基上生长。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
退化的罗伯茨绿僵菌(M.robertsii ARSEF 2575)，此菌株几乎不产生分生孢子，菌丝形态和颜色明显变化，将此菌株转接到添加了1.5％的组氨酸(Histidine)和0.64％的MM固体培养基(NaNO3 6g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O 0.52g/L，KH2PO4 0.25g/L，Glucose10g/L，CH3COONa·3H2O 8.2g/L，琼脂粉15g/L)中，25℃培养10天；
10天后观察菌落产孢量及菌丝颜色判断菌株复壮状态。
实验结果表明，复壮后的菌株，产孢量大大恢复，菌丝颜色部分恢复。
将复壮后的菌株孢子，接种于添加了1.5％的组氨酸(Histidine)和0.64％的赖氨酸(Lysine)的PDA培养基上，菌株生长状态完成正常，可以进行传代，保藏。
实施例2
正常的罗伯茨绿僵菌(M.robertsii ARSEF 2575)菌株，MM培养基上连续传代，25℃恒温培养箱培养，每组20个平板，每次三组，一代生长10天，连续传代4次，每一代的退化率(出现白色的角变的平板)大约30％；
正常的罗伯茨绿僵菌(M.robertsii ARSEF 2575)菌株，转接到添加1.5％的组氨酸(Histidine)和0.64％的赖氨酸(Lysine)培养基MM(NaNO3 6g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O 0.52g/L，KH2PO4 0.25g/L，Glucose 10g/L，CH3COONa·3H2O 8.2g/L)中25℃恒温培养箱培养，每组20个平板，每次三组，一代生长10天，连续传代4次，每一代的退化率(出现白色的角变的平板)大约10％。
实施例3
正常的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株，PDA培养基上连续传代，25℃恒温培养箱培养，每组10个平板，每次三组，一代生长10天，连续传代10次，几乎所有的菌株第10代出现明显的产孢减少，菌丝色素退化的现象。
正常的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株，转接到添加1.5％的组氨酸(Histidine)和0.64％的赖氨酸(Lysine)培养基PDA上，25℃恒温培养箱培养，每组10个平板，每次三组，一代生长10天，连续传代10次，产孢量减少的量明显降低，菌丝色素退化现象也明显降低。

Claims (6)

1.一种有效防止丝状真菌退化的方法，包括如下步骤：
将正常的丝状真菌菌株，接种于添加了1～3％组氨酸和0.1～1％赖氨酸的MM固体培养基上，25～28℃培养，进行传代，保藏，即可；其中，所述丝状真菌为绿僵菌或蛹虫草。
2.根据权利要求1所述的一种有效防止丝状真菌退化的方法，其特征在于：所述MM固体培养基的组成为：NaNO3 6g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O 0.52g/L，KH2PO4 0.25g/L，Glucose 10g/L，CH3COONa·3H2O 8.2g/L，琼脂粉15g/L。
3.根据权利要求1所述的一种有效防止丝状真菌退化的方法，其特征在于：所述组氨酸和赖氨酸过滤除菌后加入。
4.一种丝状真菌恢复产孢的方法，包括如下步骤：
将退化的丝状真菌菌株接种于添加了1～3％组氨酸和0.1～1％赖氨酸的MM培养基中，25～28℃培养10～12天；随后将培养获得的菌株，转接到添加了1～3％组氨酸和0.1～1％赖氨酸的PDA培养基上，25～28℃培养10～12天，即可作为原种使用；其中，所述丝状真菌为绿僵菌或蛹虫草。
5.根据权利要求4所述的一种丝状真菌恢复产孢的方法，其特征在于：所述MM培养基的组成为：NaNO3 6g/L，KCl 0.52g/L，MgSO4·7H2O 0.52g/L，KH2PO4 0.25g/L，Glucose 10g/L，CH3COONa·3H2O 8.2g/L。
6.根据权利要求4所述的一种丝状真菌恢复产孢的方法，其特征在于：所述组氨酸和赖氨酸过滤除菌后加入。
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