CN103004474A

CN103004474A - 一种解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法

Info

Publication number: CN103004474A
Application number: CN2012105939816A
Authority: CN
Inventors: 陶军; 胡亚鹏
Original assignee: SHAANXI ZHONGXING BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI ZHONGXING BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103004474B

Abstract

本发明涉及一种解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法，特别是涉及蘑菇液体液体菌种的方法，包括使用高效诱变剂步骤，其中高效诱变剂包括伊曲康唑和雷帕霉素，二者占所述营养液体的重量百分比为0.5-5%伊曲康唑和1-7%的雷帕霉素；还可包括低温保藏菌种步骤、调节培养条件步骤、分离纯化步骤。本发明以伊曲康唑和雷帕霉素作为高效诱变剂为核心方法，诱变作用较温和，同时优化了菌种保藏条件、营养液体的营养条件、传代次数条件、纯化条件等，实验证明,对各类蘑菇的液体菌种营养液体菌性变异退化问题能够基本解决，具有显著地经济价值，获得高产菌株。

Description

一种解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法

技术领域

本发明属于食用菌菌种领域，特别涉及一种解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法。

背景技术

菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。菌种退化的本质是染色体的变异。在生产实践中常会遇到菌种退化的问题，有的是菌种的发酵力（如糖、氮的消耗）或繁殖力（如孢子的产生）下降，有的是发酵产品的得率降低，这些都给生产带来很不利的影响。菌种退化的原因是多方面的，但必须将其与培养条件变化而导致的菌种形态和生理上的变异区别开来，因为优良菌种的生产性能是和发酵工艺条件密切相关的。此外，杂菌污染也会造成菌种退化的假象，产量也会下降。总体来说，菌种退化的原因有两方面：一是菌种保藏不妥，二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到某些不利条件，或是失去某些需要的条件。此外，还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特性的情况。

现有技术中，解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法较多，包括在液体发酵中，将气体搅拌代替机械搅拌，天然有机物代替化学试剂、专用母种代替传统母种。但菌性变异退化问题没有得到彻底解决，尤其是没有一个系统的解决问题方法来针对于多种原因引起的变异退化问题。

发明内容

本发明提供了一种能够系统的解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法。

本发明的一种解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法，其中液体菌种为蘑菇液体菌种，具体方法包括如下步骤：

使用高效诱变剂步骤，高效诱变剂包括伊曲康唑和雷帕霉素，二者占所述营养液体的重量百分比为0.5-5%伊曲康唑和1-7%的雷帕霉素；

及如下步骤中的一种或几种：

低温保藏菌种步骤，所述低温保藏菌种步骤是指将菌种置于1-3℃培养，或置于液氮在超低温条件下保藏；

调节培养条件步骤，所述调节培养条件步骤包括根据菌种个体差异来减少菌种移接次数，移接次数最多3次；

分离纯化步骤，所述分离纯化步骤包括有性孢子分离与无性组织分离步骤，所述有性孢子分离是在每次出菇后，挑选符合本品种特征的优良子实体进行组织分离，每年进行一次孢子分离，并经出菇鉴定后，选择性状优良者再进行无性组织分离；所述有性孢子分离与无性组织分离为交替使用。本步骤，是以有性繁殖来发现好的变异菌株，用组织分离来巩固这些优良菌株的遗传。

本发明的雷帕霉素（RAPA）是大环内酯类免疫抑制剂，结构式如下：

本发明的伊曲康唑(itraconazole,ICZ)是亲脂性三氮唑类广谱抗真菌药，其作用机制是高选择性地抑制真菌细胞的细胞色素酶，结构式如下。

本发明的一种解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法，还包括复壮步骤，所述复壮步骤包括选择菌种适合的培养基、培养温度、环境、pH、防止杂菌污染，避免多品种混合栽培。

本发明的蘑菇包括但不限于口蘑、香菇、草菇、金针菇、猴头、平菇、凤尾菇、鲍鱼菇、滑菇。

优选的是，伊曲康唑的用量是2%、雷帕霉素的用量是4%。

本发明的解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法有益效果在于，以伊曲康唑和雷帕霉素作为高效诱变剂为核心方法，诱变作用较温和。同时优化了菌种保藏条件、营养液体的营养条件、传代次数条件、纯化条件等，实验证明,对各类蘑菇的液体菌种营养液体菌性变异退化问题能够基本解决，具有显著地经济价值，获得高产菌株。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

具体实施方式

实施例1

1、供试材料

菌株金针菇（Flammulinavelutipes）

培养基：（1）种子培养基：PDA培养基。（2）摇瓶种子培养基（%）：可溶性淀粉4，葡萄糖1，蛋白胨0.3，KH₂PO₄0.1，7水硫酸镁0.05，VB110ug/ml，VB₂50ug/ml，pH6.5-6.7。（3）摇瓶发酵培养基（%）：大米粉5，葡萄糖1，蛋白胨0.5，KH₂PO₄，PH7.5。

2、退化表现：经2次传代，金针菇菌丝出现生长缓慢和白色、浓密的角形菌落；菌丝长势变稀，子实体原基的产生减少；产生无性孢子的能力大幅度上升或大幅度下降。

3、解决方法：

（1）在营养液体中加入的重量百分比为3%伊曲康唑和5%的雷帕霉素；

（2）将菌种置于液氮在超低温条件下保藏；

（3）有性孢子分离是在每次出菇后，挑选符合本品种特征的优良子实体进行组织分离，每年进行一次孢子分离，并经出菇鉴定后，选择性状优良者再进行组织分离。

4、结果：金针菇菌丝生长正常；菌丝长势、子实体原基的产生、产生无性孢子的能力均正常。

实施例2

1、菌株口蘑（Tricholomagambosum）

培养基：（1）种子培养基：PDA培养基。（2）摇瓶种子培养基（%）：可溶性淀粉4，葡萄糖1，蛋白胨0.3，KH₂PO₄0.1，7水硫酸镁0.05，VB₁10ug/ml，VB₂50ug/ml，pH6.5-6.7。（3）摇瓶发酵培养基（%）：大米粉5，葡萄糖1，蛋白胨0.5，KH₂PO₄，PH7.5。

2、退化表现：口蘑菌丝越来越稀，菌球少，毛刺少，培养周期越来越长，镜检时发现空泡多。菌株斜面培养时，产生异常的色素或由产出色素变为不产色素，或产出色素量大幅度增加或减少。镜检时，大量的菌丝由原来的锁状联合变成无锁状联合而出现大量单核化菌丝。

3、解决方法：

（1）在营养液体中加入的重量百分比为0.5%伊曲康唑和7%的雷帕霉素；

（2）将菌种置于1～3℃培养；

4、结果，3个批次的口蘑液体菌种营养液体菌性均未发生变异退化。

实施例3病毒干扰正常代谢

1、退化表现香菇（Lentinus edodes(Berk.)sing）菌种，在电子显微镜下观察到不同程度地感染上病毒，菌丝细胞内的病毒颗粒大量复制、数量骤增，既摄取大量营养，又干扰细胞正常代谢活动，使菌丝活性衰退，长势减弱。

2、试管种的培养

配方：黄豆粉30～50％，玉米渣10～30％，小米粒5～15％，高粱粉5～15％，鲜鸡蛋10～30％；

方法：取上述重量比的物料，将高粱粉、小米粒、玉米渣用水浸泡至无干心，然后捞出拌入黄豆粉、鲜鸡蛋，然后加水，水的重量为所有物料总重量的60～65％，然后装入试管满试管的1/3，常规灭菌接种得试管种；

液体种的培养

将试管种接入由黄豆粉、玉米粉、高粱粉组成的混合物料，混合物料中黄豆粉、玉米粉、高粱粉各为1/3左右，接试管种的重量为混合物料重量的10～20％，5%伊曲康唑，1%的雷帕霉素，配水灭菌后18～25℃摇瓶培养；

3)栽培培养基

将液体种接入由玉米渣30～50％，黄豆粉20～30％，小麦粒10～20％，高粱粒10～20％组成的混合物料，液体种为混合物料的15～

20％，20～25℃避光静态培养15～20天，得菌丝体，

4、结果菌种退化直接导致食用菌产量减少和品质下降问题得到彻底解决。

实施例4

1、退化原因极性变异与单核化老菌种的单核体中，控制菌丝配对繁殖的极性因子会出现丢失现象，还伴随着其他基因的丢失或变异，从而影响双核菌丝的产生，导致菌丝长势减弱及子实体原基的产生减少。

2、其他内容基本同实施例3，菌种为猴头（猴菇菌）Hericiumerinaceus(Rull ex F.)Pers

3、解决方法

（1）在营养液体中加入的重量百分比为4%伊曲康唑和3%的雷帕霉素；

（2）将菌种置于1～3℃培养；

（3）移接次数为3次；

（4）有性孢子分离是在每次出菇后，挑选符合本品种特征的优良子实体进行组织分离，每年进行一次孢子分离，并经出菇鉴定后，选择性状优良者再进行组织分离；所述有性孢子分离与无性组织分离为交替使用。

实施例5

1、退化原因无限传代产生退化

2、退化表现草菇母种生产中，只做组织分离，不做出菇鉴定，分离出来的菌种直接应用于生产，有的对扩大母种无限制地传代、无限制地转管，转管多，创伤多，出现菌丝减弱、产量降低，且能遗传给后代。

3、其他内容基本同实施例3，菌种为滑菇Pholiota nameko Ito ex Imai.

4、解决方法：

（1）在营养液体中加入的重量百分比为5%伊曲康唑和5%的雷帕霉素；

（2）将菌种置于1～3℃培养；

实施例6

1、退化原因营养不良

1、退化表现用斜面试管PDA培养基，瓶内养分耗尽，菌丝生长活力由强变弱，菌株中遗传密码失去对菌株生长发育的调控，导致整个机体死亡的过程。

2、解决方法

（1）在营养液体中加入的重量百分比为5%伊曲康唑和2%的雷帕霉素；

（2）将菌种置于1～3℃培养；

（3）移接次数为3次；

3、其他内容基本同实施例3，菌种为平菇Pleurotus ostreatus

实施例7

1、退化原因长期低温保藏产生退化

2、退化表现菌种长期保存或长期使用后，菌丝长势减弱，可能是因为菌株在低温下保藏，并未停止其生命活动，仍然存在着变异的潜在可能。

3、其他内容基本同实施例3，菌种为凤尾菇PleiirotussaJurcaju

4、解决方法

（1）在营养液体中加入的重量百分比为1%伊曲康唑和1%的雷帕霉素；

（2）移接次数为2次；

（3）有性孢子分离是在每次出菇后，挑选符合本品种特征的优良子实体进行组织分离，每半年进行一次孢子分离，并经出菇鉴定后，选择性状优良者再进行组织分离；所述有性孢子分离与无性组织分离为交替使用。

实施例4-7结果表明：均能解决液体菌种营养液体菌性变异退化的问题。

以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种解决液体菌种营养液体菌性变异退化的方法，所述液体菌种包括蘑菇液体菌种，其特征在于，所述方法包括：

使用高效诱变剂步骤，所述高效诱变剂包括伊曲康唑和雷帕霉素，二者占所述营养液体的重量百分比为0.5-5%伊曲康唑和1-7%的雷帕霉素；

及如下步骤中的一种或几种：

低温保藏菌种步骤，所述低温保藏菌种步骤是指将菌种置于1～3℃培养，或置于液氮在超低温条件下保藏；

分离纯化步骤，所述分离纯化步骤包括有性孢子分离与无性组织分离步骤，所述有性孢子分离是在每次出菇后，挑选符合本品种特征的优良子实体进行组织分离，每0.5-1.5年进行一次孢子分离，并经出菇鉴定后，选择性状优良者再进行组织分离；所述有性孢子分离与无性组织分离为交替使用。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括复壮步骤，所述复壮步骤包括选择菌种适合的培养基、培养温度、环境、pH、防止杂菌污染，避免多品种混合栽培。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蘑菇包括口蘑、香菇、草菇、金针菇、猴头、平菇、凤尾菇、鲍鱼菇、滑菇。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每1年进行一次孢子分离。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蘑菇为金针菇，所述伊曲康唑的用量是2%、所述雷帕霉素的用量是4%。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蘑菇为口蘑，所述伊曲康唑的用量是0.5%、所述雷帕霉素的用量是7%。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蘑菇为香菇，所述伊曲康唑的用量是5%、所述雷帕霉素的用量是1%。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蘑菇为滑菇，所述伊曲康唑的用量是5%、所述雷帕霉素的用量是5%。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蘑菇为猴头，所述伊曲康唑的用量是4%、所述雷帕霉素的用量是3%。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蘑菇为平菇，所述伊曲康唑的用量是5%、所述雷帕霉素的用量是2%。