CN102626036A - 一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法和质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法及质量检测方法，包括：（1）菌种筛选；（2）配置大米固体培养基，每100重量份中含有大米40~55份和营养液45~60份，灭菌；（3）液体菌种制备：活化菌种，接入液体培养基中，静止培养24小时后置于摇床上进行悬浮培养；（4）子实体培养：将液体菌种接种于固体培养基上，置于20℃条件下暗培养6天，直至菌丝长满培养基表面；将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强100~300勒克司，原基生长阶段：每天光照20~24小时，温度20~24℃；子实体生长阶段：每天光照8~12小时，温度18~20℃，子实体成熟后5~8天采收。通过该技术培育的蛹虫草子实体产量高、有效成分含量高，多批蛹虫草子实体指纹图谱相似值大于0.950，表明其质量稳定可控。

Description

一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法和质量检测方法

 

技术领域

本发明涉及一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法和质量检测方法。

背景技术

虫草类真菌为子囊菌纲肉座菌目麦角菌科虫草属，全世界有350多种，我国有近60种。在众多的虫生菌中冬虫夏草、蛹虫草是研究最深入的两种。冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌Cordyceps sinensis(Berk.) Sace.寄生在蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾Hepialus armoricanus Oberthür越冬幼虫体上的子座与虫体的复合体，属国家Ⅱ级重点保护植物，主要分布在海拔4200~5400米之间高寒草甸，与人参、鹿茸并称为中国三大名贵中药材。虽然冬虫夏草在中医中药中有举足轻重的地位和作用，但蛹虫草作为虫草属的模式种，在资源的可获得性以及产业化应用方面近十年来得到国内外普遍关注。

蛹虫草(Cordyceps milharis)又名北冬虫夏草、北虫草，是虫草属(Cordyceps)的模式种，是我国的一种兼具食用和药用价值的优质珍贵大型真菌。现代研究表明，蛹虫草富含虫草素、虫草酸、虫草多糖、核苷类物质、麦角甾醇、氨基酸等多种有效成分，这些有效成分的含量是蛹虫草子实体品质的重要指标。现代药理学和临床研究发现，蛹虫草具有增强动物机体免疫、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、降血脂、抗疲劳、延缓衰老等多种生理功效。

蛹虫草最早药用源于中国。天然野生蛹虫草始载于《新华本草纲要》，记载其味甘、性平，有“益肺肾、补精髓、止血化痰”的功效；现代中医学巨著《中华药海》记载“蛹草，别名北冬虫夏草，性味甘、平，入肺、肾二经”。蛹虫草已经在《中国药典》上列为中草药，其主要的化学成分药理、药效与野生冬虫夏草极为相似。根据《全国中草药汇编》记载：“北虫草的子实体及虫体可以作为冬虫夏草入药”。经中国医学科学院药物研究所等权威部门的检测表明，蛹虫草的一些主要营养及药物成份如虫草素、虫草多糖、蛋白质、SOD酶和微量元素等还要高于冬虫夏草(详见表13~14)。因此，蛹虫草已发展成为虫夏草理想的替代品。

目前，野生冬虫夏草资源濒临灭绝，已受到国家有关濒危保护植物政策的严格监管，野生冬虫夏草的有性型人工培育困难重重，至今尚未能有突破，目前主要以无性型的菌丝体工业发酵为主流代用品，并已形成相当规模，其主要以医药制剂产品和原料的形式行销国内外市场。野生冬虫夏草唯一的同属姊妹—蛹虫草，具有与野生冬虫夏草最为接近的有效成分和功效作用，也是迄今唯一能够实现规模化有性型人工培植的虫草属真菌，因其产品外形更为直观、功效可靠、味美价廉，因此在药食两用的保健品市场更受欢迎。

中国专利号为93105056.1的“北冬虫夏草菌人工栽培子实体的方法”、专利号为94110061.8的“蛹虫草优良品质的选育及高产栽培方法”、专利号为94105853.0的“蛹虫草高产栽培方法”等虽然报道了一些蛹虫草的人工栽培技术和方法，张红霞等重点考察了蛹虫草中虫草素和腺苷两个指标（食用菌，2011年第5期），温志新等研究大米固体培养基的固体发酵过程，考察了蛹虫草的重量和高度（食用菌，2011年第2期）等等。但现有的这些文献和专利主要关注和评价了蛹虫草子实体虫草素、腺苷等少数活性成分，对蛹虫草子实体的产量以及内在质量的关键指标（如虫草素、虫草酸、虫草多糖、腺苷、麦角甾醇、氨基酸等）缺乏全面、综合的评价；蛹虫草子实体的栽培技术也主要停留在实验室或小批量生产的研究，其报道的栽培技术和方法在规模化和产业化方面缺乏可操作性和可实时性；同时，对生产的多批子实体缺乏采用指纹图谱技术进行质量控制。目前，市场上的蛹虫草子实体品质良莠不齐，据相关检测机构提供的检验结果显示，不同生产厂家或一厂家生产不同批次的蛹虫草子实体的有效成分含量差异较大，直接影响到蛹虫草的应用和整个蛹虫草产业的健康发展。

随着国内外市场对虫草及其深加工产品的需求量日益增加，天然虫草资源遭到严重破坏，其产量已远远满足不了市场需求，发展虫草人工栽培和深加工产业势在必行，并已成为当今合理保护和合理利用冬虫夏草这一濒危珍稀药用资源的重要措施。因此，如何稳定和提高蛹虫草的内在质量，实现蛹虫草生产的标准化、规范化和规模化是目前蛹虫草培养技术亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高品质蛹虫草子实体的规模化栽培方法，通过该方法培育的蛹虫草子实体产量高，品质优良，所含活性有效成分含量高。

上述发明通过以下方式来实现：

优良菌种是保证蛹虫草子实体生产高效、稳定的前提条件。本专利涉及的菌种是从吉林省长白山采集的纯天然野生蛹虫草经过严格筛选、选育和复壮得到，并经中国科学院微生物研究所鉴定为蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Link，[2002]微检字第264号），具有抗杂菌污染好、生长能力强、生长周期短、遗传稳定性好等优点，制备液体菌种后接种到大米固体培养基上，通过控制蛹虫草生长的营养因子和环境条件因子（光照、温度、湿度、pH值等)，经过自然生长出蛹虫草子实体，经过采收、干燥、检测等制成高品质的蛹虫草子实体成品。该生产过程完整地再现蛹虫草菌由无性型阶段(菌丝体)转入有性型繁殖阶段(子实体)的成长全过程，获得与天然蛹虫草尽可能接近的蛹虫草(子实体)。

采用固体发酵技术得到的蛹虫草子实体由于来自于接近自然环境和生长过程的人工培植，与液体发酵培养的菌丝体在内在质量上有明显不同，蛹虫草子实体更接近于自然生长过程，富集的有效成份浓度更高一些、有效成分的比例更趋合理一些，这与菌丝体有着明显的区别。同时，由于虫草素的产生与光反应机制密切相关。液体发酵生产过程中，淹没在液体培养基中的菌丝体难以得到充足的光照，因此虫草素不能大量产生，这也是用液体发酵法生产虫草素难以达到满意效果的原因。用本专利的固体发酵方法生产蛹虫草，其虫草素的含量比报道的液体发酵的最高含量高近2倍，培养时间也明显缩短，并且生产设备简单，生产条件易于控制。因此，本方法是一种高效蛹虫草子实体规模化生产和质量控制的技术和方法，所生产的蛹虫草子实体虫草素含量大于3.80mg/g、虫草酸含量大于45.00 mg/g、虫草多糖含量大于5.50%、腺苷含量大于1.60 mg/g、麦角甾醇含量大于3.10 mg/g、尿苷含量大于0.10%以及总氨基酸大于9.00%，多批蛹虫草子实体指纹图谱相似值大于0.950，表明其质量稳定可控，对蛹虫草子实体的规范化生产和深度开发利用具有重要的现实意义。

一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法，包括以下步骤：

（1）菌种筛选；

（2）配置大米固体培养基，配方是每100重量份中含有大米40~55份和营养液45~60份，灭菌；

（3）液体菌种制备：将菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，23℃暗培养7天，得到活化菌种；将活化菌种接入液体培养基中，静止培养24小时后置于摇床上进行悬浮培养，在23℃的条件下暗培养6天，将液体菌种用磁力搅拌器打碎后即可用于接种；

（4）子实体培养：将液体菌种接种于固体培养基上，置于20℃条件下暗培养6天，直至菌丝长满培养基表面；将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强100~300勒克司；原基生长阶段：每天光照20~24小时，温度20~24℃；子实体生长阶段：每天光照8~12小时，温度18~20℃，子实体成熟后5~8天采收，经干燥、检测得蛹虫草子实体干品。

在上述栽培方法中，步骤(1)所述菌种筛选为：将天然野生蛹虫草经过筛选、选育和复壮得到抗杂菌污染好、生长能力强、生长周期短、遗传稳定性好的菌种。

在上述栽培方法中，步骤(2)中所述营养液的成分为：葡萄糖、蔗糖或甘露醇中的一种5g/L，黄豆8g/L，奶粉5g/L或鲜蛹10g/L，柠檬酸三铵1.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁或氯化镁1.0 g/L，维生素B₁或叶酸10mg/L。

在上述栽培方法中，步骤(2)中所述灭菌为在压力0.12MPa、温度121℃下灭菌20min。

在上述栽培方法中，步骤（4）中的干燥采用冷风脱水干燥或冷冻干燥。

上述虫草素、腺苷、尿苷含量的测定方法：

供试品溶液的制备：精密称定蛹虫草子实体供试品约100mg，置试管中，准确加入水5mL，浸泡1小时，超声提取30min，4500rpm离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，即得蛹虫草子实体供试品溶液

对照品溶液的制备：分别精密称取尿苷（Ⅰ），腺苷（Ⅱ），虫草素（Ⅲ）各5.0mg，置5mL量瓶中，加适量水溶解并定容至刻度，得对照品储备液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。 分别精密吸取上述储备液Ⅰ25，50，100，150，200，300，500μL，Ⅱ25，50，100，150，200，300，500μL，Ⅲ 50，100，200，400，500，750，1000μL，置5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成系列浓度的混合对照品溶液。

色谱条件色谱柱：Inertsil ODS 3柱（250×4.6mm，5μm）。流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（5: 95），流速：1 mL·min-1，柱温：25℃，检测波长：260nm。

根据回归方程分别计算虫草素、腺苷、尿苷含量。

上述甘露醇含量的测定方法：

精密称取蛹虫草子实体供试品0.5g，加热回流提取2次，每次加水40mL，每次提取1小时，提取液经滤纸过滤，滤液置于100mL 容量瓶中，加水定容至刻度，4500rpm离心10min，取上清液2mL于10mL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得蛹虫草子实体，测定甘露醇的供试品溶液。于412nm测定吸光度，根据回归方程计算含量。

上述虫草多糖的测定方法：

按照苯酚-硫酸法测定多糖含量。将样品稀释至一定浓度后吸取1.0mL加入试管，补水至2.0mL，加入6%的苯酚试剂1.0mL，在加入浓硫酸7.0mL，摇匀，静置20min后，490nm处测定吸光值，根据标准曲线得虫草多糖的含量。

上述麦角甾醇含量的测定方法:

精确称取蛹虫草子实体粉末1.000g于具塞离心管，加35ml 75%乙醇溶液，40℃超声提取30min，8000r/min离心10min，收集上清液，抽滤过0.45μm滤膜，取滤液上机测定，根据回归方程计算含量。

上述所得蛹虫草子实体游离氨基酸含量测定方法：

精密称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末1.000g于50ml离心管，加40ml 0.1M三氯乙酸溶液，混匀，30℃超声处理30min，8000r /min离心10min，收集上清液，重复提取3次，合并上清液，抽滤并定容至200ml。取提取液19ml于50ml离心管，加入2M KOH溶液0.9ml，冰水中放置10min后离心，测定上清液570nm处吸光值，根据回归方程计算含量。

上述所得蛹虫草子实体指纹图相似度检测采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行指纹图谱相似度计算（图1）。

供试品制备：取蛹虫草子实体粉粹，过60目筛粉末蛹虫草子实体供试品，精密称取蛹虫草子实体供试品约100mg，置试管中加入水5mL，浸泡1小时，超声提取30min，4500 rpm离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，即得蛹虫草子实体供试品溶液。

色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS 3柱（250×4.6mm，5μm）。流动相组成为甲醇（A）—0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脱，洗脱程序如下：0-20min，A：1%，B：99%；20-40min，A：1-40%，B：99-60%；40-45min, A：40%，B：60%；45-50min：A：40-1%，B：60-99%。检测波长为260nm；进样量为20μL；柱温为25℃；流速为1mL/min。

申请人通过上述方法筛选了高品质蛹虫草子实体的栽培工艺条件（见表1~10）。其最佳培养条件为：白炽光，光强200勒克司，原基生长阶段每：每天22~24小时光照，温度21~23℃，湿度55%~75%，子实体生长阶段：每天12~14小时光照，温度20℃，湿度75%~90%，子实体成熟后5~8天采收。

表1 每天光照时间对原基形成的影响

光照时间（小时）	专色时间（天）	原基形成时间（天）	原基数目
				4	8	15	＋
8	7	12	＋＋
				12	6	10	＋＋＋
16	5	8	＋＋＋＋
				24	4	6	＋＋＋＋＋

表2 每天光照时间对蛹虫草子实体生长的影响

时间（小时）	平均鲜重（g）	平均干重（g）	子实体颜色	平均高度（cm）
					4	27.35	6.00	橙黄偏白	5.24
8	25.96	5.86	橙黄偏白	5.10
					12	25.86	5.91	橙黄	4.59
16	25.32	5.32	橙黄	4.35
					24	24.57	5.02	橙红色	3.95

表3 每天光照时间对蛹虫草子实体有效成分含量的影响

光照时间（小时）	4	8	12	16	24
						虫草素(mg/g)	1.452	1.430	1.143	1.307	1.450
甘露醇(mg/g)	46.889	48.841	51.996	51.320	53.649
						多糖（%）	2.804	2.883	3.130	3.256	3.486
腺苷(mg/g)	1.523	1.587	1.630	1.703	1.730
						麦角甾醇(mg/g)	3.027	3.043	3.058	2.985	3.100
游离氨基酸（%）	6.532	8.845	9.584	8.927	8.846
						尿苷（%）	0.081	0.089	0.127	0.113	0.125

表4 温度对原基形成的影响

温度（℃）	转色时间（天）	原基形成时间（天）	原基数目
				20	7	10	＋＋＋
22	6	7	＋＋＋
				24	6	7	＋＋＋
26	6	不正常	不正常

表5  温度对蛹虫草子实体生长的影响

温度（℃）	平均鲜重（g）	平均干重（g）	子实体颜色	平均高度（cm）
					20	31.95	6.00	橙黄	5.24
22	28.53	5.86	橙黄	5.80
					24	25.86	5.91	橙黄	4.59
26	无	无	无	无

表6  温度对蛹虫草子实体有效成分含量的影响

温度（℃）	20	22	24
				虫草素(mg/g)	0.796	1.865	1.623
甘露醇(mg/g)	68.231	59.557	55.287
				多  糖（%）	5.412	6.153	3.994
腺  苷(mg/g)	1.856	1.732	1.523
				麦角甾醇(mg/g)	2.985	2.287	2.213
游离氨基酸（%）	8.126	9.548	6.289
				尿  苷（%）	0．081	0.135	0.539

表7  湿度对原基形成的影响

湿度（%）	转色时间（天）	原基形成时间（天）	原基数目
				40	7	不正常	不正常
50	6	7	＋＋＋
				60	6	7	＋＋＋
70	5	10	＋＋＋

表8  湿度对蛹虫草子实体生长的影响

湿度（%）	平均鲜重（g）	平均干重（g）	子实体颜色	平均高度（cm）
					60	22.36	5.12	橙黄	4.86
70	22.45	5.68	橙黄	5.42
					80	28.63	6.13	橙黄	5.83
90	29.68	6.58	橙黄	5.97

表9  湿度对蛹虫草子实体有效成分含量的影响

湿度（%）	60	70	80	90
					虫草素(mg/g)	1.598	1.625	1.786	1.933
甘露醇(mg/g)	45.368	48.337	52.648	55.231
					多  糖（%）	3.231	4.528	5.243	5.947
腺  苷(mg/g)	1.325	1.534	1.687	1.897
					麦角甾醇(mg/g)	2.254	2.877	2.785	2.916
游离氨基酸（%）	5.687	7.854	8.952	9.357
					尿  苷（%）	0.0631	0.0984	0.153	0.162

表10  pH值对蛹虫草子实体有效成分含量的影响

pH值	5.5	6.0	6.5	7.0
					虫草素(mg/g)	2.697	3.620	3.863	2.607
甘露醇(mg/g)	33.667	29.310	30.589	16.465
					多  糖（%）	4.570	3.0756	3.863	2.607
腺  苷(mg/g)	1.622	1.524	1.523	1.574
					麦角甾醇(mg/g)	3.502	3.458	3.359	3.413
游离氨基酸（%）	6.945	8.452	9.568	7.631
					尿  苷（%）	0.0401	0.0886	0.1397	0.0921

与现有技术相比，本发明明确了蛹虫草子实体栽培生长的各环节对其质量的影响，通过监控每个生产环节，保证了蛹虫草子实体高产量和高质量。通过该技术栽培的蛹虫草子实体有效成分含量高，质量稳定，有利于蛹虫草资源更好的开发利用。

附图说明

图1为蛹虫草子实体的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

实施例1 

1、固体培养基配制：以大米为固体培养基的主原料，每百克培养基各组份的比例分别是：大米50份，营养液50份，然后于压力0.12MPa、温度121℃灭菌20min。原营养液的成分为：葡萄糖5g/L、黄豆8g/L、奶粉5g/L、柠檬酸三铵1.0 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁1.0 g/L、维生素B₁10mg/L。

2、液体菌种制备：将原始菌种接种到PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）培养基上，23℃暗培养7天，得到活化菌种。将活化菌种接入液体培养基中，静止培养24小时后置于摇床上进行悬浮培养，在23℃的条件下暗培养6天，将液体菌种用磁力搅拌器打碎后即可用于接种。

3、子实体培养：将液体菌种接种于固体培养基上，置于20℃条件下暗培养6天，直至菌丝长满培养基表面吃透整个培养基。将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强200勒克司，原基生长阶段：每天24小时光照，温度23℃，子实体生长阶段：每天12小时光照，温度20℃，子实体成熟后5~8天采收，干燥称重。

实施例2

1、固体培养基配制：固体培养基为大米固体培养基，以每百重量份混配培养基中各组份分别是：大米50份，营养液50份，然后于压力0.12MPa、温度121℃灭菌20min。原营养液的成分为：葡萄糖5g/L、黄豆8g/L、奶粉5g/L、柠檬酸三铵1.0 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁1.0 g/L、维生素B₁10mg/L，pH值为5.5~6.0。

其余操作步骤同实施例1。

实施例3

1、固体培养基配制：固体培养基为大米固体培养基，以每百重量份混配培养基中各组份分别是：大米50份，营养液50份，然后于压力0.12MPa、温度121℃灭菌20min。原营养液的成分为：蔗糖5g/L、黄豆8g/L、奶粉5g/L、柠檬酸三铵1.0 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁1.0 g/L、维生素B₁10mg/L，pH值为5.5~6.0。

其余操作步骤同实施例1。

实施例4

1、固体培养基配制：固体培养基为大米固体培养基，以每百重量份混配培养基中各组份分别是：大米50份，营养液50份，然后于压力0.12MPa、温度121℃灭菌20min。原营养液的成分为：甘露醇5g/L、黄豆8g/L、鲜蛹10g/L、柠檬酸三铵1.0 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁1.0 g/L、维生素B₁10mg/L，pH值为5.5~6.0。

其余操作步骤同实施例1。

实施例5

1、固体培养基配制：固体培养基为大米固体培养基，以每百重量份混配培养基中各组份分别是：大米45份，营养液55份，然后于压力0.12MPa、温度121℃灭菌20min。原营养液的成分为：葡萄糖5g/L、黄豆8g/L、奶粉5g/L、柠檬酸三铵1.0 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、氯化镁1.0 g/L、维生素B₁10mg/L。

其余操作步骤同实施例1。

实施例6

1、固体培养基配制：固体培养基为大米固体培养基，以每百重量份混配培养基中各组份分别是：大米40份，营养液60份，然后于压力0.12MPa、温度121℃灭菌20min。原营养液的成分为：葡萄糖5g/L、黄豆8g/L、奶粉5g/L、柠檬酸三铵1.0 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L、硫酸镁1.0 g/L、叶酸10mg/L。

其余操作步骤同实施例1。

实施例7

同实施例3， 不同的是子实体培养：将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强300lx，原基生长阶段：每天24小时光照，温度23℃，子实体生长阶段：每天10小时光照，温度20℃，子实体成熟后5~8天采收，干燥称重。

实施例8

同实施例3， 不同的是子实体培养：将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强200lx，原基生长阶段：每天22小时光照，温度23℃，子实体生长阶段：每天12小时光照，温度22℃，子实体成熟后5~8天采收，干燥称重。

按各有效成分测定方法测定上述实施例所得蛹虫草子实体的虫草多糖、虫草素、腺苷、麦角甾醇、甘露醇的含量，结果见表11。

 

表11  各实施例中蛹虫草子实体中有效成分含量对比

按蛹虫草子实体指纹图谱检测方法检测上述实施例中所得蛹虫草子实体指纹图的相似度，结果见表12。

表12 各实施例中蛹虫草子实体指纹图谱的相似度结果

实施例	相似度值
		1	0.994
2	0.983
		3	0.997
4	0.981
		5	0.991
6	0.988
		7	0.974
8	0.986

表13  蛹虫草与冬虫草主要功能成分对比

表14  蛹虫草与天然虫草主要氨基酸含量比较

氨基酸	蛹虫草含量（mg/100g）	冬虫草含量（mg/100g）
			天门冬氨酸	1052	227
苏氨酸	879	142
			丝氨酸	495	138
谷氨酸	1762	417
			甘氨酸	547	129
丙氨酸	947	90
			胱氨酸	35	57
缬氨酸	867	163
			蛋氨酸	70	52
异亮氨酸	478	93
			亮氨酸	717	146
酪氨酸	593	67
			苯丙氨酸	436	114
赖氨酸	688	132
			组氨酸	249	136
精氨酸	672	142
			脯氨酸	519	83
色氨酸	139	12
			共计	11145	2340

Claims (6)

1.一种蛹虫草子实体的规模化栽培方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）菌种筛选；

（2）配置大米固体培养基，配方是每100重量份中含有大米40~55份和营养液45~60份，灭菌；

（3）液体菌种制备：将菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，23℃暗培养7天，得到活化菌种；将活化菌种接入液体培养基中，静止培养24小时后置于摇床上进行悬浮培养，在23℃的条件下暗培养6天，将液体菌种用磁力搅拌器打碎后即可用于接种；

（4）子实体培养：将液体菌种接种于固体培养基上，置于20℃条件下暗培养6天，直至菌丝长满培养基表面；将已经长好的菌丝置于白炽光下，光强100~300勒克司，原基生长阶段：每天光照20~24小时，温度20~24℃；子实体生长阶段：每天光照8~12小时，温度18~20℃，子实体成熟后5~8天采收，干燥称重。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(1)所述菌种筛选为：将天然野生蛹虫草经过筛选、选育和复壮得到抗杂菌污染好、生长能力强、生长周期短、遗传稳定性好的菌种。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述营养液的成分为：葡萄糖、蔗糖或甘露醇中的一种5g/L，黄豆8g/L，奶粉5g/L或鲜蛹10g/L，柠檬酸三铵1.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁或氯化镁1.0 g/L，维生素B₁或叶酸10mg/L。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述灭菌为在压力0.12MPa、温度121℃下灭菌20min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中的干燥采用冷风脱水干燥或冷冻干燥。

6.一种蛹虫草子实体的指纹图谱质量检测方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）供试品制备：取蛹虫草子实体粉粹，过60目筛粉末蛹虫草子实体供试品，精密称取蛹虫草子实体供试品100mg，置试管中加入水5mL，浸泡1小时，超声提取30min，4500 rpm离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，即得蛹虫草子实体供试品溶液；

（2）色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS 3柱，流动相组成为甲醇（A）—0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脱，洗脱程序如下：0-20min，A：1%，B：99%；20~40min，A：1~40%，B：99-60%；40~45min, A：40%，B：60%；45~50min：A：40~1%，B：60~99%；检测波长为260nm；进样量为20μL；柱温为25℃；流速为1mL/min；

（3）多批蛹虫草子实体指纹图谱相似值大于0.950，表明其质量稳定可控。

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