CN104845929B - 金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法 - Google Patents

Abstract

金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法，所述建立方法使用金铁索毛状根为外植体诱导愈伤组织并建立悬浮细胞培养体系。本发明从毛状根高效诱导开始，以高效的毛状根诱导及培养为体系建立提供优良的外植体，首次利用CuCl₂处理金铁锁叶片，通过发根农杆菌侵染叶片，在叶柄和叶缘叶脉处2～4天即可发生毛状根，发根时间缩短，3～5天即可产生发根，诱导转化率大大提高，达到60％以上。然后经过筛选、脱分化、诱导产生愈伤组织，并经过草酸钙预处理制备悬浮细胞，悬浮细胞在改良的培养基中培养，培养的悬浮细胞次生代谢和生化遗传稳定，细胞不易退化，为从细胞中提取天然产物提供可靠的材料来源和物质基础。

Description

金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，尤其涉及金铁锁毛状根高效诱导及基于此的细胞悬浮培养体系的建立应用方法。

背景技术

金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)为石竹科金铁锁属多年生草本植物，又名独丁子、小霸王、昆明沙参、金丝矮陀陀、土人参等，是我国西南部特有的单属种药用植物。金铁锁主要以根入药，主要药用成分为三萜、三萜皂苷、环肽和内酰胺等，药理研究发现金铁锁提取物主要有镇痛抗炎、散瘀止血、抗肿瘤、免疫调节、抑菌等作用，用于跌打损伤、风湿痛、胃气痛、创伤出血等的治疗，是多种知名中成药的主要成份之一，如云南白药系列、百宝丹系列、云南红药胶囊、贵州金骨莲胶囊、福建痛血康胶囊等，具有很大的经济价值和社会效益。

近年来金铁锁的药用需求量不断增加，其野生资源连年过采、私采严重。由于森林砍伐、植被石漠化、土层流失等原因，金铁锁生态环境也受到严重破坏。再加上自然气候影响及金铁锁本身自然繁殖力差等诸多因素，造成金铁锁野生资源数量急剧下降，已作为稀有濒危物种列入《中国植物红皮书》中，属国家二级保护植物。由于金铁锁药材主要靠采收野生资源，收获周期较长，受病虫害、气候等外部因素影响大，造成供应量不易控制等实际问题。因此寻求新的替代品或新技术以满足市场需求和解决物种保护问题迫在眉睫。

综合考虑，采用生物技术方法是解决这一问题最为有效的途径。一方面可以缓解植物资源的匮乏，保护珍贵的野生植物资源，避免掠夺性开发；另一方面通过规模化的细胞培养技术可以定向调节细胞的次生代谢产物，使植物细胞定向合成有效的物质，以提高、调控中药材有效成分含量，提高它的药用价值和疗效，降低中药材生产的经济成本。尽管如此，通过细胞培养等手段实现商业化生产的植物种类有限，主要原因是遗传和药用成分生物合成的稳定性差以及单位时间内生物量小等，因此，筛选优质高产细胞株是解决上述瓶颈问题的关键技术环节。

毛状根是发根农杆菌侵染植物细胞导致的特殊不定根，具有遗传稳定、激素自养、生长速度快和次级代谢强等优点，毛状根作为一种转基因器官，一种新的药用原料，日益受到国内外研究者的关注。试验表明，利用毛状根作为外植体诱导的愈伤组织，也保持毛状根生长速度快、遗传稳定的优点，与普通金铁锁愈伤组织相比，固体培养条件下较短时间内能够获得较大的细胞产量，同时皂苷含量也较高。但是在毛状根制备与液体培养过程中存在的突出问题：(1)毛状根诱导率低，20％左右，这是由于植物细胞与发根农杆菌互作过程中固有的特性决定的；(2)液体培养过程中成团性，使内部组织缺氧和养分，逐渐衰老甚至死亡，导致产量降低。另一方面，在以毛状根为原料的金铁锁悬浮细胞制备与培养尝试中，也屡次失败，分析其原因，可能与金铁锁固有的生长习性相关。因此，需要进一步考察分析，以寻找合适的金铁锁悬浮培养体系的建立、培养及应用的方法。以解决金铁锁自然资源缺乏和市场产品紧缺的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法，所述建立方法使用金铁索毛状根为外植体诱导愈伤组织并建立悬浮细胞培养体系。

优选的技术方案中，上述建立方法中，所述的愈伤组织经10～12mmol/L草酸钙水溶液浸泡预处理后用于建立悬浮细胞培养体系。

更为具体的技术方案，所述的金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法包括如下步骤：

(1)以金铁锁毛状根为外植体诱导愈伤组织；

(2)使用10～12mmol/L草酸钙水溶液浸泡愈伤组织20～40min；

(3)步骤(2)处理后的愈伤组织按照4～6％(g(FW)/ml)的接种量接种至悬浮培养基中，25±1℃、110±5r.min^-1摇床上暗培养；所述的悬浮培养基是mMS+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/L KT+30g蔗糖/L；

其中，mMS培养基是在MS培养基的基础上添加KCl，使钾离子浓度达到50mmol/L而得。

其中，所述的步骤(1)，以金铁锁毛状根为外植体诱导愈伤组织，包括如下步骤：

(a)愈伤诱导：选取金铁锁毛状根，剪切成小段接种于添加有1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3～4周；

(b)继代培养：将步骤(a)诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织接种于添加有0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT+30g/L蔗糖的MS培养基上，于25±1℃条件下暗培养，继代周期25±2d；

(c)经过5次以上继代培养，选取合适的愈伤组织作为建立悬浮细胞培养体系的材料。

上述本发明的金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法中述及使用金铁锁毛状根为外植体，具体的技术方案中，所述的金铁锁毛状根通过下述方法制备：

(a)取金铁锁无菌苗叶片，去除叶缘周围组织但保留叶柄，用灭菌的10～15mmol/L的CuCl₂水溶液浸泡外植体10～15min后，用无菌滤纸吸干外植体表面水分；

(b)发根农杆菌ACCC10060菌液接种于YEB固体培养基中，25℃±1下暗培养2～3d获得发根农杆菌ACCC10060克隆菌体；挑取发根农杆菌ACCC10060克隆菌体，接种于YEB培养基中，25℃±1振荡培养；取1体积份OD值为0.6～0.8的菌液置于100体积份YEB液体培养基中振荡培养至OD值为0.6时收集菌液，3500rpm下离心10分钟收集菌体；

(c)所得菌体均匀混入至100体积份含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，并将金铁锁外植体浸染于上述培养基中10～15分钟，取出清洁表面后，将所得的发根农杆菌浸染的外植体接入共培养基中，于26±1℃条件下暗培养24h；

所述的共培养基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；

(d)步骤(c)的培养物转入抑菌继代培养基，3～6d继代培养一次，直至将菌除净；

所述的抑菌继代培养基是含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素1/2MS固体培养基；

所述的抑菌继代培养是：26±1℃条件下，静置暗培养；

(e)步骤(d)的培养物接入无激素1/2MS液体基本培养基进行暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min^-1。

本发明的目的之二在于提供一种金铁锁悬浮细胞培养体系，所述细胞培养体系通过上文所述的金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法制备。

作为优选的具体技术方案，本发明进一步提供一种金铁锁悬浮细胞培养体系，通过下述方法制备：

①取金铁锁无菌苗叶片，去除叶缘周围组织但保留叶柄，用灭菌的10～15mmol/L的CuCl₂水溶液浸泡外植体10～15min后，用无菌滤纸吸干外植体表面水分；

②发根农杆菌ACCC10060菌液接种于YEB固体培养基中，25℃±1下暗培养2～3d获得发根农杆菌ACCC10060克隆菌体；挑取发根农杆菌ACCC10060克隆菌体，接种于YEB培养基中，25℃±1振荡培养；取1体积份OD值为0.6～0.8的菌液置于100体积份YEB液体培养基中振荡培养至OD值为0.6时收集菌液，3500rpm下离心10分钟收集菌体；

③所得菌体均匀混入至100体积份含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，并将金铁锁外植体浸染于上述培养基中10～15分钟，取出清洁表面后，将所得的发根农杆菌浸染的外植体接入共培养基中，于26±1℃条件下暗培养24h；

所述的共培养基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；

④上一步骤的培养物转入抑菌继代培养基，3～6d继代培养一次，直至将菌除净；

所述的抑菌继代培养基是含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素1/2MS固体培养基；

所述的抑菌继代培养是：26±1℃条件下，静置暗培养；

⑤上一步骤的培养物接入无激素1/2MS液体基本培养基进行暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min^-1；培养3～5天产生发根，继续培养至毛状根稳定生长；

⑥愈伤诱导：选取上一步骤的金铁锁毛状根，剪切成小段接种于添加有1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3～4周；

⑦继代培养：将上一步骤诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织接种于添加有0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT+30g/L蔗糖的MS培养基上，于25±1℃条件下暗培养，继代周期25±2d；

⑧经过5次以上继代培养，选取合适的愈伤组织作为建立悬浮细胞培养体系的材料；

⑨使用10～12mmol/L草酸钙水溶液浸泡愈伤组织20～40min；

⑩上一步骤处理后的愈伤组织按照4～6％(g(FW)/ml)的接种量接种至悬浮培养基中，25±1℃、110±5r.min^-1摇床上暗培养；所述的悬浮培养基是mMS+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/L KT+30g蔗糖/L；

其中，mMS培养基是在MS培养基的基础上添加KCl，使钾离子浓度达到50mmol/L而得。

在一方面，本发明在于提供上述金铁锁悬浮细胞培养体系在制备次生代谢产物中的应用。尤其是金铁锁皂苷。

经长期研究分析，发明人注意到金铁锁生长的一些特点，可能与其悬浮培养体系建立相关：其一，金铁锁普遍生长在高山岩石沙化酸性环境中，细胞中离子浓度大，特别是钾离子和钙离子；其次，金铁锁植株常年生长在砂石环境中，具有特殊的根系生长环境。基于此，发明人经过一些列试验，得到本发明的技术方案。本发明从毛状根高效诱导开始，对金铁锁悬浮细胞体系建立过程中的各个技术步骤进行了优化整合，以高效的毛状根诱导及培养为体系建立提供优良的外植体，首次利用CuCl₂处理金铁锁叶片，通过发根农杆菌侵染叶片，在叶柄和叶缘叶脉处2-4天即可发生毛状根，发根时间缩短，3～5天即可产生发根，诱导转化率大大提高，达到60％以上。然后经过筛选，毛状根在无激素培养基中快速生长。利用上述毛状根，经过黑暗培养发生脱分化，产生愈伤组织，筛选疏松易碎的愈伤组织经过草酸钙预处理制备悬浮细胞，悬浮细胞在改良的培养基中培养，培养的悬浮细胞次生代谢和生化遗传稳定，细胞不易退化，为从细胞中提取天然产物提供可靠的材料来源和物质基础。

具体实施方式

无特殊说明，本发明中以齐墩果酸标准品为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定金铁锁组织或培养物中总皂苷含量(李景斌等，《中国中药杂志》2011年，36(5)：547)。其中，金铁锁的培养物包括但不限于毛状根，愈伤组织，悬浮细胞培养物等，培养物中总皂苷提取与测定的具体方法描述如下：

总皂苷的提取：将获得的培养物干燥后称取质量并粉碎，用70％乙醇回流提取三次；合并提取液减压回收乙醇至干膏；将所得干膏用2倍量水溶解，过滤，滤液用等倍量石油醚除去色素等脂类物质；除脂后的水液用等倍量水饱和正丁醇萃取五次，得到的正丁醇萃取液减压蒸发至干膏。所得干膏减压干燥至恒重，即得到金铁锁粗总皂苷。

本实验选择齐墩果酸标准品为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定金铁锁总皂苷含量。

对照品溶液的制备：准确称取约20mg齐墩果酸标准品(120℃减压干燥至恒重),用无水乙醇溶解后，定容于50mL容量瓶中，即得齐墩果酸对照品液。

样品溶液的制备：准确称取约30mg干燥至恒重的金铁锁粗总皂苷，用无水乙醇溶解后，定容于50mL容量瓶中，即得样品溶液。

最大吸收波长的确定：准确量取标准溶液0.6mL和样品溶液5mL，各置于10mL容量瓶中，于75℃水浴上挥发除去溶剂，再加入新配制的浓度为5％香草醛—冰醋酸溶液(50mg香草醛溶于10mL冰醋酸中)0.4mL，高氯酸1.6mL，摇匀，于60℃水浴加热25min，取出后立即用流水冷却3min，摇匀，加入乙酸乙酯定容，以不加标准品溶液和样品溶液的平行样为空白，在400～800nm处进行紫外扫描，结果对照溶液与样品溶液在535nm处均有较大吸收。

标准曲线的绘制：准确吸取齐墩果酸标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL，分别放入1～6号10mL量瓶中，于70℃水浴中挥去乙醇，在535nm处测定吸光值(A)。每个浓度平行测定3次,以A值3次的平均值为纵坐标，齐墩果酸浓度C(mg·mL^-1)为横坐标绘制校准曲线，计算其回归方程为：y＝30.871C—0.1503，r＝0.9997。

金铁锁皂苷含量测定：准确量取样品溶液5mL，置于10mL容量瓶中，于75℃水浴上挥发除去溶剂，再加入新配制的浓度为5％香草醛—冰醋酸溶液0.4mL，高氯酸1.6mL，摇匀，于60℃水浴加热25min，取出后立即用流水冷却3min，摇匀，加入乙酸乙酯定容，以不加样品溶液的平行样为空白，在535nm处测定吸光值，平行测定3次，计算平均值，根据标准曲线回归方程计算总皂苷含量。

方法学验证中精密度、稳定性、重现性、平均加样回收率数据均满足药典要求。

下述本发明的具体实施例为进一步说明本发明，不应当理解为对本发明内容任何意义上的限定。本发明中，如无特殊说明，培养基均使用30g/L蔗糖为碳源。

实施例1金铁锁毛状根系的高效诱导

(1)取金铁锁无菌苗叶片，去除叶缘周围组织，用10mmol/L的CuCl₂水溶液浸泡外植体10min后，无菌滤纸吸干外植体表面多余水分；

(2)以发根农杆菌浸染步骤(1)处理后的外植体：

2a.发根农杆菌ACCC10060菌液接种于YEB固体培养基中，25℃±1下暗培养2～3d获得发根农杆菌ACCC10060克隆菌体；

2b.挑取发根农杆菌ACCC10060克隆菌体，接种于YEB培养基中，25℃±1振荡培养；取1ml OD值为0.6～0.8的菌液置于100ml YEB液体培养基中振荡培养至OD值为0.6时收集菌液，3500rpm下离心10分钟收集菌体；

2c.所得菌体均匀混入至100ml含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；

2d.将金铁锁外植体浸染于步骤(c)所制备的培养基中10～15分钟，取出后清洁表面，得到发根农杆菌浸染的外植体。

将所得到的经发根农杆菌浸染的外植体接入共培养基中，26±1℃条件下暗培养24h；所述的共培养基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；

(3)步骤(2)的培养物转入抑菌继代培养基，3～6d继代培养一次，直至将菌除净；

所述的抑菌继代培养基是含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素1/2MS固体培养基；

所述的抑菌继代培养是：26±1℃条件下，静置暗培养；

(4)步骤(3)的培养物接入无激素1/2MS液体基本培养基进行暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min^-1。

本实施例培养过程中，接种后2-4天，在叶柄和叶缘叶脉处即可发生毛状根，3～5天即可产生发根，发根时间较短；诱导转化率超过60％；然后经过筛选，毛状根在无激素培养基中快速生长。

实施例2：金铁锁毛状根系的对比诱导

按照实施例1的方法，但省略步骤(1)中以10mmol/L的CuCl₂水溶液浸泡外植体10min的步骤，以清洁的金铁锁外植体进行后续步骤，诱导金铁锁毛状根产生。

本实施例培养过程中，接种后4-6天，在叶柄和叶缘叶脉处发生毛状根，5～8天产生发根，发根时间相对于实施例1较长；诱导转化率低于30％.。

实施例3：金铁锁愈伤组织的诱导

分别以实施例1和2中生长状态良好的毛状根，以及去除叶缘周围组织的金铁锁无菌苗叶片为外植体，标记为外植体I，外植体II和外植体III，分别诱导愈伤组织。

(1)将用作外植体的材料剪切成小段，接种于添加1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖的MS固体培养基上，置于25±1℃暗培养室中培养，3～4周诱导出愈伤组织；

(2)将诱导出的愈伤组织与外植体分离后，接种于添加有0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT+30g/L蔗糖的MS培养基上进行继代培养，培养条件为25±1℃，暗培养。25d左右在此培养基上继代一次。

外植体I新诱导出的愈伤组织均色泽暗淡、柔软、水分较大且生长速度较慢，经过5次继代培养，愈伤组织逐渐呈现出质地疏松、易分散、不分泌黏液、白色的颗粒状，大约经过10次左右的继代培养，此时的愈伤组织生长速度较快且非常稳定，适用于建立细胞悬浮培养体系。

同样条件下，外植体II所诱导出的愈伤组织经过15次继代培养，愈伤组织的生长速度和状况与10次继代的外植体I愈伤组织相似，可用于建立细胞悬浮培养体系。

同样条件下，外植体III所诱导出的愈伤组织经过18次继代培养，愈伤组织的生长速度和状况与10次继代的外植体I愈伤组织相似，可用于建立细胞悬浮培养体系。

实施例4：建立金铁锁悬浮细胞培养体系

以实施例3中，分别以外植体I诱导并经10次继代的愈伤组织，以及外植体III诱导所得并经18次继代的愈伤组织为材料，分别建立金铁索悬浮细胞培养体系i和iii。

(1)选取质地疏松、易分散、不分泌黏液的白色颗粒状愈伤组织用于建立悬浮细胞培养体系；

(2)将选取的愈伤组织浸入浓度为10mmol/L的无菌草酸钙溶液中，静止处理30min后取出愈伤组织并用无菌滤纸吸干表面水分；

(3)将步骤(2)处理后的愈伤组织按照4～6％(gFW/ml，愈伤组织鲜重g/ml培养基)的接种量接种至悬浮培养基中(150ml三角瓶，装液量50ml)，25±1℃、110±5r/min摇床上暗培养；所述的悬浮培养基是mMS+1.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/LKT+30g蔗糖/L；其中的mMS培养基为本发明的改良基础培养基，是在MS培养基的基础上添加KCl，使钾离子浓度达到50mmol/L而得。

上述步骤(3)悬浮培养的周期为20d。

悬浮细胞培养体系i和iii的最初几代细胞颗粒均较大，可以通过无菌条件下过筛等方法将大颗粒除去，悬浮细胞培养体系i经过5-8次的继代培养，悬浮培养体系逐渐趋于稳定。悬浮细胞培养体系iii经过12次继代培养，悬浮培养体系逐渐趋于稳定，但生长状态不如悬浮细胞培养体系i。

实施例5.金铁锁悬浮细胞培养体系条件优化

(1)选择MS、1/2MS、mMS、B5、1/2B₅和N₆6种培养基做基本培养基试验，生长速度分别为：0.43，0.72，0.85，0.38，0.40和0.35g·L^-1·d^-1(DW)，通过实验确定mMS液体培养基为最佳基本培养基。

其中，mMS培养基为本发明的改良基础培养基，是在MS培养基的基础上添加KCl，使钾离子浓度达到50mmol/L而得。

(2)在mMS为最佳基本培养基的基础上，选择2,4-D、6-BA、NAA、KT四种激素进行正交试验，实验结果表明，毛状根愈伤组织悬浮培养的最佳激素配方为1.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/L KT+30g/L蔗糖；

(3)以mMS+1.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/L KT+30g/L蔗糖为培养基进行接种量试验，最终确定最佳接种量为4～6％(w/v,g,fw/ml)；

综上所述，金铁锁悬浮细胞培养的最优培养基条件为：

mMS+1.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/L KT+30g蔗糖/L，其中mMS培养基是MS培养基的基础上添加KCl，使钾离子浓度达到50mmol/L。

最优接种量为4～6％(w/v,g(FW)/ml)。

实施例6.金铁锁悬浮细胞放大培养体系

按照实施例5确定的液体培养基配方组成，配制培养基，蔗糖浓度30g/L，利用2.5L鼓泡式反应器进行放大培养，装液量为1.5L，121℃湿热灭菌20min。考虑到反应器的通氧量要比摇瓶培养的高，选择以4％接种量接种固体培养的毛状根愈伤组织，接种后置于25±1℃条件下培养。1.5L培养基接种毛状根愈伤组织60g，培养28～30d左右，收获培养物鲜重可达200g，鲜重增长率220％左右，将培养物置于60℃烘箱中烘干，收获干重12g左右。

实施例7.金铁锁材料及培养物中总皂苷含量测定

对上述实施例1～4中所得的培养物，以及材料来源的金铁锁苗中的皂苷含量进行测定，结果如下表1所示。可见：

金铁锁细胞培养物的皂苷含量均高于金铁锁原植株的皂苷含量，悬浮培养条件下皂苷含量均比固体培养条件下皂苷含量有所提高，无论在何种培养条件下，毛状根愈伤组织的皂苷含量均高于普通的金铁锁愈伤组织，毛状根愈伤组织悬浮培养细胞的皂苷含量可高达0.92％，与毛状根皂苷含量0.97％相差不大，说明其保持了毛状根的遗传稳定、次生代谢能力强的优点。

表1

Claims (7)

1.金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法，其特征在于，使用金铁索毛状根为外植体诱导愈伤组织并建立悬浮细胞培养体系；所述的金铁锁毛状根通过下述方法制备：

(a)取金铁锁无菌苗叶片，去除叶缘周围组织但保留叶柄，用灭菌的10～15mmol/L的CuCl₂水溶液浸泡外植体10～15min后，用无菌滤纸吸干外植体表面水分；

(b)发根农杆菌ACCC10060菌液接种于YEB固体培养基中，25℃±1下暗培养2～3d获得发根农杆菌ACCC10060克隆菌体；挑取发根农杆菌ACCC10060克隆菌体，接种于YEB培养基中，25℃±1振荡培养；取1体积份OD值为0.6～0.8的菌液置于100体积份YEB液体培养基中振荡培养至OD值为0.6时收集菌液，3500rpm下离心10分钟收集菌体；

(c)所得菌体均匀混入至100体积份含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，并将金铁锁外植体浸染于上述培养基中10～15分钟，取出清洁表面后，将所得的发根农杆菌浸染的外植体接入共培养基中，于26±1℃条件下暗培养24h；

所述的共培养基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；

(d)步骤(c)的培养物转入抑菌继代培养基，3～6d继代培养一次，直至将菌除净；

所述的抑菌继代培养基是含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素1/2MS固体培养基；

所述的抑菌继代培养是：26±1℃条件下，静置暗培养；

(e)步骤(d)的培养物接入无激素1/2MS液体基本培养基进行暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min^-1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的愈伤组织经10～12mmol/L草酸钙水溶液浸泡预处理后用于建立悬浮细胞培养体系。

3.根据权利要求1所述的方法，包括如下步骤：

(1)以金铁锁毛状根为外植体诱导愈伤组织；

(2)使用10～12mmol/L草酸钙水溶液浸泡愈伤组织20～40min；

(3)步骤(2)处理后的愈伤组织按照4～6％(g(FW)/ml)的接种量接种至悬浮培养基中，25±1℃、110±5r.min^-1摇床上暗培养；所述的悬浮培养基是mMS+1.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.25mg/L NAA+0.1mg/L KT+30g蔗糖/L；

其中，mMS培养基是在MS培养基的基础上添加KCl，使钾离子浓度达到50mmol/L而得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)包括如下步骤：

(a)愈伤诱导：选取金铁锁毛状根，剪切成小段接种于添加有1.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L6-BA+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3～4周；

(b)继代培养：将步骤(a)诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织接种于添加有0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT+30g/L蔗糖的MS培养基上，于25±1℃条件下暗培养，继代周期25±2d；

(c)经过5次以上继代培养，选取合适的愈伤组织作为建立悬浮细胞培养体系的材料。

5.权利要求1的方法所建立的金铁锁悬浮细胞培养体系。

6.权利要求5所述的金铁锁悬浮细胞培养体系在制备次生代谢产物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的次生代谢产物包括金铁锁皂苷。