CN102898493A - 一种利用小型简易生物反应器培养人参不定根生产人参皂苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用小型玻璃生物反应器(3～10L)培养人参不定根的方法。首先将长度约1.0cm的人参不定根培养在装有2.0L 1/2SH培养基的3L反应器内培养，该培养基含3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖。定期分析人参不定根的生长和三种人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的累积，确定了人参不定根在生物反应器内的最佳收获周期为7周。3L生物反应器培养基中三种蔗糖浓度(20g/L、40g/L、60g/L)中，20g/L、40g/L两个浓度的蔗糖对人参不定根的人参不定根的生长和皂苷的累积优于60g/L蔗糖，两者无显著差别，但从节约角度考虑，应该选择20g/L蔗糖浓度用于生产。该浓度下，人参皂苷含量和产量分别为5.16mg/g、30.71mg。5和10L生物反应器内在初始接种量分别为：10、15、20g和20、25、30g中，最佳量分别为15和30g，其不定根的生长量分别为9.29和19.17g，皂苷含量分别为5.16和4.58mg/g。生物反应器内培养7周的人参与栽培4年的人参相比，人参皂苷Rg1和Re含量相差不大；栽培人参中Rb1的含量远高于生物反应器中培养得人参不定根中的含量。本发明可为人参不定根的小规模和进一步扩大化培养提供技术支持和参数，也可以作为大规模生产提供人参不定根种子生产方法。
Description
技术领域
本发明专利涉及利用一种小型简易生物反应器，人工室内培养人参不定根，并从中提取人参皂苷的技术，属农业生物技术领域。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.May.)为五加科(Araliaccae)人参属名贵中药植物，是我国传统的名贵中药材，被誉为药中之王。人参化学成分复杂，其中主要药用成分为各种人参皂苷，其制品及皂苷提取物具有广阔的世界市场。但人参5～6年栽培的漫长周期使各项管理技术、土地、病虫、农残等问题成为栽培人参难以跨越的障碍。因此，利用生物反应器规模化培养细胞成为解决上述问题的有效方法之一。生物反应器具有工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便、随时随地规模化生产等许多优点。目前，人参细胞生物反应器规模化培养已获得成功[Liu S等，Process Biochem，1998，33(1)：69-79，FuruyaT等，Planta Med，1983，48：83-87]。但有研究认为，人参不定根和毛状根中的人参皂苷含量比愈伤组织(细胞)中多[Yu KW，Chungbuk National University，Korea，2000，博士论文]。因此，人参不定根生物反应器培养更引人注目。韩国该方面的研究处于世界领先地位，Choi等报道了利用500L生物反应器规模化培养人参不定根的中试研究结果[Choi SE等Plant Cell Tissue Organ Cult，2000，62：187-193.]。而我国对人参不定根生物反应器扩大培养的技术研究却相对较少。例如，朴炫春等报道了利用5L气升式生物反应器培养人参不定根的生长周期，但未测定其皂苷的累积[朴炫春等，林业科技，2007，32(6)：54-56]。黄滔等优化了摇瓶培养人参不定根系统，还未进行生物反应器培养[黄滔等，中国中药杂志，2010，35(1)：13-17]。本发明通过一种简单的小型玻璃生物反应器(3～10L)，确定小规模培养人参不定根和生产人参皂苷的方法；目的是提供一种更加简单、室内大量人工培养人参不定根的方法，为大规模培养人参不定根生产人参皂苷，提供技术参数，或为大规模生产提供人参不定根种子培养方法；或为进行小规模培养人参不定根生产人参皂苷提供技术支持。
发明内容
首先将人参不定根在含有3.0mg/L IBA的1/2SH固体培养基中大量繁殖。然后将人参不定根切成1cm长，接种在装有1.5L 1/2SH(加有3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖)培养基、总体积为3L的生物反应器内进行暗培养。定期取材测定不定根鲜重和干重、生长量及3种人参皂苷含量(Rg1+Re+Rb1)，绘制不定根生长和皂苷累积的动态曲线，确定其生长周期以及最佳收获时间为7周。然后，在总体积为3L的生物反应器中加入含有20g/L蔗糖的1.5L 1/2SH培养基(加有3.0mg/L IBA)，接种8g人参不定根段。培养7周后收获，其不定根人参皂苷含量(Rg1+Re+Rb1)及产量最高，分别为5.16mg/g，30.71mg。按照上面的蔗糖浓度，在总体积为5和10L的生物反应器中[分别装有3和6L 1/2SH培养基(加有3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖)]，初始接种人参不定根的鲜重分别为15和30g时，培养7周后它们压、15分钟))后使用的。培养环境为常规组织培养室(温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％)的。
本发明的优越特征
1、小型生物反应器的结构简单，便于操作
2、利用小型生物反应器培养人参不定可以在人为控制条件下，随时随地生产人参不定根
3、小型生物反应器培养人参不定根无任何细菌病毒、重金属污染，安全
4、小型生物反应器生产的人参不定根中的人参皂苷Rg1和Re含量与大田栽培的人参含量相差不大
附图说明
图1生物反应器示意图：a.薄膜空气滤器；b.玻璃罐体；c.空气喷头；d.空气流量计；e.空气压力泵；f.进气口；g.出气口。
图2标准品(A)、生物反应器培养人参不定根(B)和栽培4年人参根(C)中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的HPLC图谱
图3人参不定根的生物反应器增殖培养：A.继代的人参不定根；B.人参不定根在生物反应器培养；C.B中干燥的人参不定根
图4 3L生物反应器中不定根生长(A)和皂苷累积(B)的动态曲线
具体实施方式
实例1确定小型生物反应器内人参不定根收获周期
1)小型玻璃生物反应器
所用小型生物反应器为总体积3、5和10L的气升式小型玻璃生物反应器自己开发，北京玻璃仪器公司定制。
2)人参不定根材料
人参不定根的生物反应器培养都在温度为(25±2)℃培养室中进行暗培养。人参不定根最初从韩国江原道野生山参(Panax ginseng C.A.May.)的须根(由韩国江原大学山林科学学院崔龙义教授鉴定)在1/2SH+3.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+3.0g/L脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)的固体培养条件下诱导而来，然后多次继代增殖。
3)三种人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的分析方法
人参皂苷采用超声提取：精密称取1.0g样品粉末，10mL 80％甲醇浸泡过夜，次日以80％甲醇室温超声提取3次，每次10mL提取30min，合并提取液。80℃水浴减压蒸干溶剂，以20％乙腈溶解并定容至一定体积，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
人参皂苷的高效液相色谱(HPLC)分析方法：流动相为乙腈∶水按表1进行线性梯度洗脱(v/v)；流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长203nm，进样量20μL。利用上述条件分析3种人参皂苷标品(Rg1、Re、Rb1)和样品。3种人参皂苷的保留时间分别为Rg1 23.46min，Re 24.45min，Rb1 37.25min。它们的回归曲线和回归系数分别为Rg1：y＝4273.8x+31641，R2＝0.9991；Re：y＝5602.4x+47471，R2＝0.9994；Rb1：y＝4529.9x+13221，R2＝0.9994。
表1 乙腈/水流动相梯度表(v/v)
人参皂苷产量的计算方法：人参皂苷产量(mg)＝人参皂苷含量(mg/g)×人参不定根生长量(g)
4)3L生物反应器培养人参不定根
将增殖的人参不定根切成1cm长，接种在装有1.5L 1/2SH(加有3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖)培养基、总体积为3L的生物反应器内进行暗培养。初始接种量(鲜重)为8g。重复3～4个生物反应器。每周取材1次，置于(60±1)℃的烘箱中干燥48h后称量干重，计算不定根生长量：不定根生长量(g)＝最终收获不定根鲜/干重(g)-初始接种不定根鲜/重(g)及3种人参皂苷含量(Rg1+Re+Rb1)，绘制不定根生长和皂苷累积的动态曲线，从中确定其生长周期以及最佳收获时间为7周。
实例2确定培养基中合适的蔗糖浓度
在总体积为3L的生物反应器中加入含有不同浓度蔗糖(20、40和60g/L)的1.5L 1/2SH培养基(加有3.0mg/L IBA)，接种8g人参不定根段。每个处理重复3次。培养7周后收获，统计及测定人参不定根的生长及皂苷的累积如表2。蔗糖浓度为40g/L时，人参不定根的生长量达到最大值7.30g，比蔗糖浓度为60g/L时的生长量略高，而远高于20g/L蔗糖浓度时不定根最低的生长量5.95g。人参皂苷含量随蔗糖浓度的增加而降低，蔗糖浓度最低(20g/L)时，皂苷含量达到最大值5.16mg/g。20和40g/L浓度蔗糖下，人参皂苷产量没有显著差异，但都比60g/L蔗糖浓度下人参皂苷产量高。从节省的角度考虑培养应该选用20g/L的蔗糖浓度。
表2 培养基中蔗糖浓度对人参不定根生长和人参皂苷累积的影响
注：运用Duncan多重比较，相同字母为相差不显著(P＜0.05)。下同。
实例3确定生物反应器内人参不定根的最佳初始接种量
总体积为5和10L的生物反应器中[分别装有3和6L 1/2SH培养基(加有3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖)]，初始接种人参不定根的鲜重分别为10、15、20g和20、25、30g，每个处理重复3次。培养7周后收获，不定根的生长量和皂苷累积情况统计如表3和表4。5L生物反应器中不定根的生长量随初始接种量的增加而增加。低接种量(10g)时，不定根生长量最低，为6.21g；中等及较高水平的接种量(15和20g)均对不定根的生长更为有利，但两者间差距不显著(9.29和9.36g)。人参皂苷含量在高接种量(20g)时明显降低(4.42mg/g)；较低及中等接种量(10和15g)时人参皂苷的含量较高，且差异不显著(5.25和5.16mg/g)。在5L生物反应器中，中等水平的初始接种量(15g)最有利于人参皂苷的生产，其产量最高(48.25mg)，远高于低接种量时人参皂苷的最低产量(32.64mg)。
表3 5L生物反应器中初始接种量对人参不定根和人参皂苷累积的影响
与5L生物反应器中不定根生长情况相似，10L反应器中不定根的生长量同样随初始接种量的增加而增加，差异更显著。接种量较低(20g)时，生长量最低，为8.65g；中等及较高水平的接种量(25和30g)更利于不定根的生长，且优于5L反应器中不定根的生长情况，最高生长量可达19.17g。但不同接种量对人参皂苷含量的影响差异不大，而且皂苷含量普遍低于5L反应器中皂苷水平，最高含量仅为4.64±0.05mg/g。与5L反应器不同，在10L生物反应器中，高接种量(30g)最有利于人参皂苷的生产，其产量最高可达到87.75mg，远远高于低接种量(20g)时人参皂苷的最低产量40.18mg以及5L反应器中的皂苷产量。
表4 10L生物反应器中初始接种量对人参不定根和皂苷累积的影响
实例4比较小型生物反应器生产的人参不定根与栽培4年人参根中3中人参皂苷的含量
在利用HPLC分析上述不定根的同时也分析了大田栽培4年人参根中三种皂苷的含量，结果如表5。3-10L生物反应器中，随着容量的增加，人参皂苷含量呈递减趋势，而产量呈递增趋势。生物反应器培养的人参不定根和栽培人参根中人参皂苷Rg1和Re相差不大。Rg1分别为2.19-2.81mg/g，2.67mg/g；Re分别为1.62-1.88mg/g，1.45mg/g。栽培人参中Rb1的含量远高于生物反应器中的Rb1含量，分别为3.96mg/g和0.46-0.50mg/g，两者几乎相差一个数量级。
表5 各容量生物反应器7周生产的人参不定根与栽培4年人参根中人参皂苷含量(mg/g)
Claims (1)
1.一种利用小型简易生物反应器(3～10L)培养人参不定根生产人参皂苷的方法，其特征在于：
长度约1.0cm、鲜重8g的人参不定根培养在装有2.0L 1/2SH培养基的3L反应器内培养，该培养基含3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖。人参不定根生长和三种人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)累积的最佳收获期为7周；3L生物反应器中，相同培养基中含20g/L、40g/L两个蔗糖浓度对人参和三种人参皂苷累积较佳；5和10L生物反应器内最佳初始量分别为15和30g。
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