CN115024322A - 丙二酸单乙酯在植物促生中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了丙二酸单乙酯在植物促生中的应用，属于小分子有机物领域。本发明主要公开了丙二酸单乙酯在以下(1)‑(5)至少一项中的应用：(1)促进植物生长；(2)促进土壤氮代谢，增加土壤可利用氮含量；(3)改善植物果实品质；(4)促进植物吸收氮磷钾；(5)促进植物生理生化酶系的优化。本发明还公开了丙二酸单乙酯最佳促生浓度为100mg/L。此外，本发明还揭示了丙二酸单乙酯促生作用的机制，为有机肥中小分子有机物对植物的促生提供一定的理论参考。

Description

丙二酸单乙酯在植物促生中的应用
技术领域：
本发明属于小分子有机物领域，涉及丙二酸单乙酯在植物促生中的应用。
背景技术：
有机肥俗称农家肥，是由各种动物、植物残体或代谢物组成，主要包括饼肥、堆肥、沤肥、绿肥、厩肥、沼气肥、泥肥等；狭义上，有机肥是以各种动物废弃物和植物残体通过物理、化学、生物技术等加工处理，利用高温、厌氧、堆制等工艺消除病原菌、病害虫等有害物质达到无害化的肥料。有机肥为植物生长提供所需的氮、磷、钾元素，还为植物提供丰富的促生有机物，提高植物抗病性和果实质量。
小分子有机物在植物生长发育过程扮演了重要角色，例如有机酸可以通过影响土壤中矿物溶解调节作物营养吸收，为土壤中微生物提供能量，进而为植物根部生长创造良好的环境。常规氮磷钾化肥无法为植物提供有机酸，而有机肥的小分子有机物含量又难以控制，因此，研发小分子有机物添加剂成为肥料领域的重要方向。
发明内容：
本发明人从鸡粪二次发酵有机肥中筛选出丙二酸单乙酯，首次探索了丙二酸单乙酯对植物的促生效果及其机制，为有机肥中小分子有机物对植物的促生提供一定的理论参考。
本发明的目的是提供丙二酸单乙酯在以下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)促进植物生长；
(2)促进土壤氮代谢，增加土壤可利用氮含量；
(3)改善植物果实品质；
(4)促进植物吸收氮磷钾；
(5)促进植物生理生化酶系的优化。
优选地，所述的植物为草本植物。
优选地，所述的植物为番茄或水稻。
在一实施例中，所述的应用包括以下步骤：将丙二酸单乙酯溶于蒸馏水配置成丙二酸单乙酯溶液对植物种苗进行浇灌。
优选地，所述的丙二酸单乙酯溶液的浓度为100mg/L。
在另一实施例中，所述的应用包括以下步骤：将丙二酸单乙酯溶于蒸馏水中配置成丙二酸单乙酯溶液，再将植物种子置于其中进行培养。
优选地，所述的丙二酸单乙酯溶液为含有25mg/L的丙二酸单乙酯的水溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明验证了丙二酸单乙酯具有一定的植物促生效果：作用于番茄时，与空白组相比，喷施丙二酸单乙酯组的番茄株高、茎粗、叶片数、最长叶长和果重等指标明显提高；而且，喷施丙二酸单乙酯组比有机肥组和空白组更有利于增加番茄茎叶重，提高番茄茎叶生长；作用于水稻时，施用丙二酸单乙酯能促进水稻的根系发育，表现为促进根增长15.86％，使根的鲜重提高34.19％，同时提高了水稻根的活性；
(2)本发明验证了丙二酸单乙酯能够促进土壤氮代谢，增加土壤可利用氮含量：喷施丙二酸单乙酯组在生长期、开花期土壤含磷量明显高于空白组和有机肥组，表明施加丙二酸单乙酯能够明显促进土壤可利用氮磷含量提高，这有利于改善土壤肥力，增加土壤中养分；
(3)本发明验证了丙二酸单乙酯能够提高植物果实品质：在一实施例中，丙二酸单乙酯处理的番茄其果实干重、番茄红素、糖酸比明显超过空白组，丙二酸单乙酯组的番茄红素、横径、纵径均大于有机肥组和空白组；
(4)本发明揭示了丙二酸单乙酯促进植物生长的机制：丙二酸单乙酯的促生效果主要体现在其促进植株生理生化酶系的优化，如促进了植株根系和叶片的ATP酶活性，提升了植株的代谢；代谢提升后，植株体内激素获得激发，促进了植株对营养物质的吸收，叶片含氮含磷量显著高于对照；
(5)本发明进一步研究不同浓度丙二酸单乙酯对番茄幼苗生长指标的影响，发现丙二酸单乙酯最佳促生浓度为100mg/L。
附图说明
图1为不同处理组间番茄的生长情况，图左为有机肥组，图中为丙二酸单乙酯组，图右空白组。
图2为番茄不同生长周期的番茄株高(a)、茎粗(b)、叶片数(c)、叶长(d)以及最终根茎叶果重量(e)，M组为丙二酸单乙酯组，T组为有机肥组，CK组为空白组。
图3为番茄不同生长周期的番茄叶片氮(a)、磷(b)、钾(c)含量，M组为丙二酸单乙酯组，T组为有机肥组，CK组为空白组。
图4为番茄不同生长周期的土壤氮(a)、磷(b)含量，M组为丙二酸单乙酯组，T组为有机肥组，CK组为空白组。
图5为不同浓度的丙二酸单乙酯对番茄幼苗株高(a)、茎粗(b)、叶片数(c)、叶长(d)、鲜重(e)的影响。
图6为丙二酸单乙酯对番茄幼苗激素变化的影响。
图7为丙二酸单乙酯对番茄幼苗的POD酶活性(a)、PAL酶活性(b)、PPO酶活性(c)和GS酶活性(d)的影响。
图8为不同浓度丙二酸单乙酯对番茄植株株高(a)、茎粗(b)、叶数(c)、叶长(d)的影响，L、M、H分别表示浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L的丙二酸单乙酯处理组。
图9为不同浓度丙二酸单乙酯对番茄植株叶片的ATP酶活性(a)、POD酶活性(b)、SOD酶活性(c)和根部酶活性(d)的影响，L、M、H分别表示浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L的丙二酸单乙酯处理组。
图10为不同浓度丙二酸单乙酯对番茄植株叶片的赤霉素(a)、吲哚丁酸(b)的影响，L、M、H分别表示浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L的丙二酸单乙酯处理组。
图11为不同浓度丙二酸单乙酯对番茄叶片含氮量(a)、含磷量(b)、含钾量(c)、根系氮磷钾含量(d)的影响，L、M、H分别表示浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L的丙二酸单乙酯处理组。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：丙二酸单乙酯与畜禽粪便有机肥对番茄的促生作用比较
供试植物：番茄幼苗。
供试土壤：将营养土、椰糠、椰砖按2：1：1比例混合均匀后装入花盆中。
盆栽实验：按不同施肥方法将番茄盆栽分为空白对照组(CK组)、畜禽粪便有机肥组(T组)和丙二酸单乙酯组(M组)，每组设置4个平行。将番茄苗种植在配置好的土壤中，种植时间为3个月(2021年10月—2022年1月)，种植期间所有番茄盆栽每周2次浇灌的时间相同。其中空白对照组(CK组)为每周2次分别往盆栽中浇灌1.5L的水；畜禽粪便有机肥组(T组)是在土壤中一次性施加质量分数为1.5％的有机肥，每周2次分别往盆栽中浇灌1.5L的水；丙二酸单乙酯组(M组)是每周1次往盆栽中浇灌1.5L的水，另1次浇灌1.5L的浓度为100mg/L的丙二酸单乙酯水溶肥。三组番茄植株对比见图1，M组和T组的植株长势明显比CK组的要好。
样品采集：番茄盆栽每两三周对番茄叶片和土壤采一次样。剪下番茄叶片一到两片，装到塑料密封袋中。最后一次采样，将番茄根部附着土壤清理干净，将番茄根茎叶和果实分别装入密封袋中，记好标记。土壤需采集盆栽深处土壤，每次约50g，将土壤装入密封袋做好标记。
样品处理：将每次采集的土壤样品称重冻干，冻干后过筛去除土壤中的木屑、石砾等，再用磨土机磨碎后过筛冰箱保存备用。将植株的根茎叶和果实带回实验室后称鲜重后冻干保存。将剩余根叶放于坩埚中放入烘箱中烘干，记录干样重量。并测定以下指标：
1、每周测量番茄植株株高、茎粗、叶片数、最长叶长，盆栽实验结束后记录根茎叶鲜重和干重，果实重量等。结果见图2。
如图2a所示，番茄株高在生长期生长较为缓慢，丙二酸单乙酯促生效果较好，三组处理组增长值表现为M组(丙二酸单乙酯组)>T组(有机肥组)>CK组(空白组)。根据图2b，从整体上看，丙二酸单乙酯对番茄茎粗促生效果优于空白组，在番茄生长前期对茎粗促生效果较好。从图2c叶片数增长看，在结果期，丙二酸单乙酯组的叶片数增长要大于空白组和有机肥组，叶片数增加较为明显。由图2d可知，番茄最长叶长增长趋势较为平缓，在番茄整个生长周期中，丙二酸单乙酯组最长叶长增长值均明显超过空白组，差异显著。番茄植株叶片数和叶长增加，扩大叶片表面积，有利于植物的光合作用。从番茄株高、茎粗、叶片数、最长叶长等表观指标来看，丙二酸单乙酯对对茎粗、叶片数和叶长具有一定的促生效果且其促生效果超过空白组，与有机肥组较为接近。由图2e来看，丙二酸单乙酯对番茄的茎重和叶重有显著性影响(P<0.05)。丙二酸单乙酯显著提高了番茄的根茎叶鲜重。从根重来看，丙二酸单乙酯和有机肥两组处理组重量相近，大于空白组的根重。丙二酸单乙酯组对番茄茎重、叶重促生效果显著，分别比空白组增加了80.77％、56.93％，三组处理茎叶重表现为丙二酸单乙酯组>有机肥组>空白组，丙二酸单乙酯比空白更有利于提高根茎叶生长，增加番茄根茎叶重。另外，丙二酸单乙酯对番茄的果重有一定的促生效果。上述结果表明丙二酸单乙酯能促进番茄根部以及植株地上部的生长。
2、叶片氮磷钾的测定：称取试样0.1g放入消解管内，往消解管中加少许水润湿叶片，加入5毫升浓硫酸后快速摇匀，加入2次过氧化氢2mL，快速摇晃，消解管中的剧烈化学反应完成后，进行加热消解，将叶片完全溶解为溶液，消解管内硫酸出现白烟后，立即停止加热，取出消化管冷却，再用滴管加入10滴过氧化氢后继续消解十分钟，取出消解管进行冷却，再次加10滴过氧化氢消解15分钟，重复操作直到溶液呈现无色。冷却后将消解液转移定容。配制好的消解液可用于氮磷钾测定。其中，氮的测定使用凯氏定氮仪法。磷的测定使用钼锑抗吸光光度法。钾的测定使用火焰原子吸收分光光度法。
图3a可知，丙二酸单乙酯组在开花期作用显著，丙二酸单乙酯叶片含氮量比空白组增加了35.5％。通过增加植株对氮元素的吸收，促进植物叶片的发育增加叶表面积提高光合作用促进根部、株高、茎粗的生长。从图3b和图3c可见，在初始期，丙二酸单乙酯对叶片钾含量有显著性差异(P<0.05)。
3、土壤氮磷的测定：参照“叶片氮磷钾的测定”所述的方法。
图4显示，在生长期和开花期，丙二酸单乙酯对土壤氮磷含量具有显著性差异(P<0.05)。在初始期空白组含氮量和含磷量要高于丙二酸单乙酯组和有机肥组。丙二酸单乙酯组土壤含氮量在生长期、开花期、结果期比初始期分别提高了80％、68.5％、32.3％，丙二酸单乙酯促进土壤氮代谢，增加土壤可利用氮含量。在生长期和开花期，丙二酸单乙酯组含氮量最高，明显超过有机肥组和空白组，丙二酸单乙酯对土壤可利用氮含量增加效果较好。
4、番茄果实有机酸(总酸)按国家标准《食品中总酸的测定》中的方法测定。
5、番茄红素的提取及测定：准确称取50毫克苏丹I色素，用无水乙醇定容到50毫升。将0.12、0.24、0.36、0.48、0.60、0.72毫升的液体分别放入50毫升的试管中，用蒸馏水定容。这时，6个试管中苏丹I色素标准溶液的浓度是0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L，473nm为空白，测量吸收值，并绘出标准曲线。将2克新鲜番茄肉捣碎，加入20mL的乙醇前处理20分钟，然后进行10分钟的离心，除去上清液，得到番茄泥沉淀。重复以上的程序直到过滤液体变得无色为止。用10mL的提取液对番茄泥中的番茄红素进行提取，超声波处理15分钟后，滤出并收集滤液。反复进行，直至过滤液变得无色为止。用蒸馏水定容收集的过滤液体到100毫升。取10毫升试样到50毫升瓶中，用蒸馏水定容，用473nm波长测量吸光度，并按标准曲线求出番茄红素的含量。
6、番茄果实维生素C按碘量法进行测定。
7、番茄果实可溶性糖按蒽酮比色法进行测定。
上述指标4-7的结果如表1所示，其中糖酸比为可溶性总糖/总酸的比值。
表1番茄果实品质
Figure BDA0003755699860000081
表1结果表明，丙二酸单乙酯和有机肥对番茄果实影响显著，丙二酸单乙酯组的番茄横径、纵径、果实干重均大于空白组，添加丙二酸单乙酯的处理组显著提高了番茄果实的品质。丙二酸单乙酯处理的番茄红素、糖酸比明显超过空白组，分别提高了40.88％、45.57％。且丙二酸单乙酯组的番茄红素含量较高于有机肥组，为三组处理最高值。
实施例2：丙二酸单乙酯对水稻的促生作用
(1)将水稻种子泡在水里24h后，挑取沉底种子放在湿润的滤纸上于28℃恒温培养2-3天至种子破胸。
(2)在650mL的组培瓶中加入200mL蒸馏水及质量分数为0.7％的技术琼脂粉(琼脂培养基)，经高压灭菌(121℃，20min)后稍微冷却，加入25mg/L的丙二酸单乙酯水溶液作为处理组(T)，而空白组(CK)为不添加丙二酸单乙酯溶液的琼脂培养基。选取发芽长势一致的种子分别置于上述组培瓶中，每个处理组设置5个重复。将组培瓶置于光照培养箱(温度28℃，光照12h/d，湿度65％)中培养一周，测定水稻发芽后的苗长、根长、根数及根活，取平均值。结果如表2所示。
根活的测定方法(TTC法)及步骤：
①TTC标准曲线的制作
取0.4％TTC溶液0.2mL放入10ml量瓶中，加少许次硫酸钠摇匀后立即产生红色的甲攒。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲攒25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
②称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液(0.01M,pH＝7.4)的等量混合液10mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸2mL，以停止反应。
③把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4mL和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲攒。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。
④结果计算：
四氮唑还原强度(mg/g(根鲜重)/h)＝四氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)]。
表2丙二酸单乙酯对水稻生长的影响
Figure BDA0003755699860000091
注：不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
结果表明：水稻水培实验结果表明，施用浓度为25mg/L的丙二酸单乙酯能促进水稻的根系发育，表现为促进根增长15.86％，使根的鲜重提高34.19％，同时提高了水稻根的活性。
实施例3：丙二酸单乙酯对番茄的促生作用及最佳促生浓度
(1)将番茄种子用10％(v/v)次氯酸钠溶液浸泡10分钟杀菌，再用无菌蒸馏水冲洗并浸泡12h；
(2)然后在25℃的湿纱布上催芽约3天，直到种子破胸；
(3)取幼根约2mm的种子，分别种入育苗排盆中，以无菌营养土培育；
(4)将丙二酸单乙酯溶于蒸馏水，配置成5个浓度梯度的处理液，其浓度分别为：2.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L，共5个处理组。
(5)选取10盆番茄苗每周浇灌40mL蒸馏水作为空白组，处理组每隔五天浇灌40mL丙二酸单乙酯处理液，每个处理组10盆番茄苗。
(6)日常光照下培育番茄苗5周，每周用游标卡尺测定株高、茎直径(统一为基叶上方2mm处)、最宽叶宽并清点叶片数。
(7)完成最后一次日常观测后，选取长势最好的处理组和空白组进行对比。轻轻将植株取出(避免使根系中断)，用去离子水洗净根系，置于干燥纱布，轻轻吸干，拍照记录植株长势，称量植株总量，记录植株鲜重，测定植株酶活、激素等指标。指标测定方法如下：
①样品前处理：
新鲜、干净的植物样品，采摘后立即用液氮速冻，放入冻存管或者用锡箔纸或自封袋包起来，-20℃、-40℃、-80℃保存，温度越低保存时间越久。
液氮研磨后于液氮中保存。
②植物激素的测定：
激素提取方法：收集新鲜的番茄叶，准确称取叶片0.1g到离心管中，加入异丙醇：水：HCL(2：1：0.002)提取液1mL，将组织冰浴研磨成浆。4℃，300r/min离心30min，取出离心管后加入2mL二氯甲烷，再次离心30min；随后4℃，13000r/min离心5min。吸取有机相层溶液1.8mL，氮气吹干后，加入50％甲醇-水溶液0.5mL，充分溶解后过0.22μm有机滤膜于进样小瓶中。
样品检测方法：色谱柱：RedClassical C18柱(5μm，250×4.6mm)，流动相：0.05％磷酸水-乙腈溶液。线性洗脱梯度：0～3min，10％乙腈；3～15min，10％～60％乙腈；15～30min，60％～95％乙腈；30～40min，10％乙腈。流速为1mL/min，柱温40℃，样品盘温度4℃，进样量10μL，分析时间40min。
③植物酶活的测定：
酶活提取方法：用预冷的PBS溶液(0.01M,pH＝7.4)冲洗组织，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS溶液(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS溶液)，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次(8分钟)，充分研碎，制成10％的匀浆液)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。最后将匀浆液于5000×g离心10分钟，取上清检测。
酶活检测方法：采用植物组织中酶活测定试剂盒(南京建成公司)，根据不同酶活试剂盒测定方法进行检测。
图5结果表明，丙二酸单乙酯最佳促生浓度为100mg/L，相比对照组，丙二酸单乙酯(100mg/L)对番茄苗的苗长(即株高)增加了46.21％，茎粗增加了15.44％，叶片数增加了15.94％，叶长增加了8.79％，显著提高了番茄叶部和根部的鲜重。图6和图7结果表明丙二酸单乙酯主要促进了番茄叶片中吲哚丁酸和茉莉酸的含量，分别促进番茄株高和茎粗的生长。提高了叶片POD和PPO的酶活，抑制了根系POD和PPO的酶活。
实施例4：丙二酸单乙酯对番茄的促生作用及机理
(1)将轻质土和椰糠按5：2的比例进行混合装于盆中；
(2)将丙二酸单乙酯溶于蒸馏水，配置成3个浓度梯度的处理液，其浓度分别为：50mg/L、100mg/L、200mg/L，分别为L、M、H处理组，共3个处理组；
(3)花盆填好土后，将长势一致的番茄苗定植入盆中，空白组为每周定量浇灌纯水1.5L/盆，处理组为每周浇灌丙二酸单乙酯处理液1.5L/盆。每组3个平行。
(6)每周记录植株的生长状况(株高、茎粗、叶数、叶长)。每两周采集叶片和土壤，测定样品氮磷钾(测定方法同实施例1)、激素和酶活(测定方法同实施例3)等指标含量。
结果表明：
(1)M组丙二酸单乙酯水肥获得了最好的促生效果：茎粗、叶数和叶长都显著高于对照(图8)，株高较低，成长为更为强壮的植株；
(2)丙二酸单乙酯的促生效果主要体现在其促进植株生理生化酶系的优化，如促进了植株根系和叶片的ATP酶活性(图9a和d)，提升了植株的代谢；
(3)代谢提升后，植株体内激素获得激发，由图10可见丙二酸单乙酯水肥浇施后番茄植株的赤霉素和吲哚丁酸显著提高，促进了植株对营养物质的吸收，由图11可见，叶片含氮含磷量显著高于对照；
(4)丙二酸单乙酯水肥浇施后，植株结出了更为优质的番茄果实(表3)。
表3不同浓度丙二酸单乙酯对番茄果实品质的影响
Figure BDA0003755699860000131

Claims (7)

1.丙二酸单乙酯在以下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)促进植物生长；
(2)促进土壤氮代谢，增加土壤可利用氮含量；
(3)改善植物果实品质；
(4)促进植物吸收氮磷钾；
(5)促进植物生理生化酶系的优化。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物为草本植物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物为番茄或水稻。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：将丙二酸单乙酯溶于蒸馏水配置成丙二酸单乙酯溶液对植物种苗进行浇灌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的丙二酸单乙酯溶液的浓度为100mg/L。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：将丙二酸单乙酯溶于蒸馏水中配置成丙二酸单乙酯溶液，再将植物种子置于其中进行培养。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的丙二酸单乙酯溶液为含有25mg/L的丙二酸单乙酯的水溶液。
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