CN114451227B

CN114451227B - 一种粗茎秦艽种植方法

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Publication number: CN114451227B
Application number: CN202111678846.7A
Authority: CN
Inventors: 曾锐; 加多五尼; 刘海萍; 李爱暖
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114451227A

Abstract

本发明公开了一种粗茎秦艽种植方法，它是秦艽与粮食作物或经济作物间种；所述粮食作物包括马铃薯、白芸豆、玉米；所述经济作物包括牡丹、三叶草、羌活、光叶紫苕。本发明粗茎秦艽种植方法，通过间种的方式可以有效提高秦艽的生物生长量和药效成分环烯醚萜苷含量，同时还能调节土壤中的无机元素及微生物，起到保护高山中药材种植生态环境，促进秦艽生产的可持续发展，因此具有实际推广应用价值。

Description

一种粗茎秦艽种植方法

技术领域

本发明具体涉及一种粗茎秦艽种植方法。

背景技术

粗茎秦艽为龙胆科植物粗茎秦艽Gentiana crasicaulis Duthie ex Burk.的干燥根，是常用大宗中药品种，始载于《神农本草经》。粗茎秦艽是药典收载“秦艽”的四种基原之一。粗茎秦艽性味辛、苦、平，归胃、肝、胆经，具祛风湿、清湿热、止痹痛和退虚热的功效，主治风湿痹痛，中风半身不遂，筋脉拘挛，骨节酸痛，湿热黄疸，骨蒸潮热，小儿疳积发热。

由于秦艽喜生长在海拔在1500～3000m，土地肥沃的林下或林缘，这使得野生秦艽的产量低，经济效益低。人工栽培粗茎秦艽产量大，质量较为稳定，是栽培秦艽的主要品种。但是人工栽培粗茎秦艽长期以来使用地膜及连作栽培，破坏高山生态，导致土壤退化，病虫害，同时也导致秦艽质量降低，因此如何进行生态友好的可持续的高品质粗茎秦艽的人工种植是秦艽种植产业发展的关键问题之一。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种粗茎秦艽种植方法，它是秦艽与粮食作物或经济作物间种；所述粮食作物包括马铃薯、白芸豆、玉米；所述经济作物包括牡丹、三叶草、羌活、光叶紫苕

进一步地，它是秦艽与粮食作物间种。

更进一步地，所述粮食作物为马铃薯或玉米。

更进一步地，所述粮食作物为马铃薯。

更进一步地，所述秦艽与马铃薯间种包括如下步骤：

1)选地，在秦艽种植季节整地施肥，移栽秦艽幼苗，田间管理；

2)在马铃薯种植季节，将马铃薯成行或成带种植于秦艽田地的厢间，田间管理；

3)马铃薯每年成熟时采收；秦艽在定植2-3年后采收。

进一步地，步骤1)所述选地是选择向阳坡地；所述向阳坡地的土质为疏松肥沃的壤土或砂质壤土。

进一步地，步骤1)所述整地是翻耕开沟垄，垄高15～30cm，沟宽20～40cm，厢面宽60～150cm；所述施肥是每亩施肥1000-2000kg农家肥或200-300kg有机肥。

进一步地，步骤1)所述移栽秦艽幼苗的行距为20～40cm×20～40cm；所述移栽在5d内完成，移栽后浇水1-2次；所述移栽秦艽幼苗于高原时，先用潮湿土假植，并用遮阳网给秦艽幼苗遮荫，定根后撤掉遮阳网。

进一步地，所述田间管理包括除病虫害，除草，除病株，追肥，灌溉除水，摘花蕾。

更进一步地，所述追肥的时间为移栽后3个月内，每月1次，共3次，第1次在栽后20d内；所述第1次追施腐熟农家肥800-1200kg/667m²和菜籽饼肥20kg/667m²，其后每次在上一次的基础上增加腐熟农家肥100-200kg/667m²和菜籽饼肥10kg/667m²；所述摘花蕾是摘掉除留种秦艽植株外的花蕾。

本发明粗茎秦艽种植方法，通过7种间种秦艽模式证实，以秦艽-马铃薯间种模式的生物长量和一二年环烯醚萜苷成分含量为最优，其次为秦艽-玉米间种模式，结合无机元素及微生物研究结果，可确定秦艽-马铃薯间种模式为粗茎秦艽最佳生态种植模式。本发明粗茎秦艽种植方法，通过间种的方式可以有效提高秦艽的生物生长量和药效成分环烯醚萜苷含量，同时还能调节土壤中的无机元素及微生物，起到保护高山中药材种植生态环境，促进秦艽生产的可持续发展，因此具有实际推广应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1地膜(对照1)

图2地膜(对照2)

图3粗茎秦艽-马铃薯间种

图4粗茎秦艽-白芸豆间种

图5粗茎秦艽-牡丹间种

图6粗茎秦艽-三叶草间种

图7粗茎秦艽-羌活间种

图8粗茎秦艽-玉米间种

图9粗茎秦艽-光叶紫苕间种

图10三种栽培模式粗茎秦艽6～11月直径

图11三种栽培模式粗茎秦艽6～11月干重

图12三种栽培模式粗茎秦艽6～11月4种环烯醚萜苷类成分含量比较

图13粗茎秦艽根茎测量

图14粗茎秦艽叶子长度测量

图15粗茎秦艽叶子宽度测量

图16一年生粗茎秦艽干重

图17二年生粗茎秦艽干重

图18一年生粗茎秦艽根茎长度

图19二年生粗茎秦艽根茎长度

图20一年生粗茎秦艽根茎直径

图21二年生粗茎秦艽根茎直径

图22混合对照品(A)粗茎秦艽样品(B)

图23马钱苷酸标准曲线

图24獐牙菜苦苷标准曲线

图25龙胆苦苷标准曲线图

图26獐牙菜苷标准曲线

图27一年生4种环烯醚萜苷总量

图28二年生4种环烯醚萜苷总量

图29粗茎秦艽根茎无机元素含量

图30粗茎秦艽根际土壤无机元素含量

图31旋转空间矩阵图

图32粗茎秦艽根际土壤细菌图

图33粗茎秦艽根际土壤细菌菌落数

图34粗茎秦艽根际土壤真菌图

图35粗茎秦艽根际土壤真菌菌落数

具体实施方式

实施例1、本发明秦艽-马铃薯间种

1)选择土质疏水肥沃的壤土或砂质壤土的高原地区向阳坡地，在秦艽种植季依排水方向拉线翻耕开沟垄，垄高20cm，沟宽30cm，厢面宽90cm，四周开排水沟，以确保排水良好，防止涝害；每亩用腐熟的农家肥1000-2000kg作为低肥，深耕30cm以上，耙平；移栽秦艽幼苗，移栽时先用潮湿土假植，幼苗的行距为25cm×25cm，5d内完成，移栽后浇水1-2次，并用遮阳网遮荫，待秦艽幼苗定根成活后撤掉遮阳网；田间管理；

3)马铃薯每年成熟时采收；秦艽在定植2-3年后采收；

其中，田间管理为：

a)除病虫害：移栽秦艽幼苗时，剔除有病虫害的种苗，以免传染；

b)拔除田间杂草和病株；

c)追肥：移栽后3个月内，每月1次，共3次追肥，第1次追肥在移栽后20d内，第1次追施腐熟农家肥800-1200kg/667m²和菜籽饼肥20kg/667m²，其后每次在上一次的基础上增加腐熟农家肥100-200kg/667m²和菜籽饼肥10kg/667m²；

d)灌溉除水：检查积水并及时排水，防止烂根；

e)摘花蕾：花期除留种秦艽植株外，其余花蕾全部摘掉。

实施例2、本发明秦艽-玉米间种

1)选择土质疏松肥沃的壤土或砂质壤土的平地地区向阳坡地，在秦艽种植季依排水方向拉线翻耕开沟垄，垄高20cm，沟宽30cm，厢面宽90cm，四周开排水沟，以确保排水良好，防止涝害；每亩用机肥200-300kg作为低肥，深耕30cm以上，耙平；移栽秦艽幼苗，幼苗的行距为25cm×25cm，5d内完成，移栽后浇水1-2次；田间管理；

2)在玉米种植季节，将玉米成行或成带种植于秦艽田地的厢间，田间管理；

3)玉米每年成熟时采收；秦艽在定植2-3年后采收；

其中，田间管理为：

a)除病虫害：移栽秦艽幼苗时，剔除有病虫害的种苗，以免传染

b)拔除田间杂草和病株；

d)灌溉除水：检查积水并及时排水，防止烂根；

e)摘花蕾：花期除留种秦艽植株外，其余花蕾全部摘掉。

以下通过试验例说明本发明的有益效果

试验例1本发明粗茎秦艽种植研究

一、粗茎秦艽不同种植模式及其生物量研究

1仪器

DS192G温度记录仪，DALLAS(美国)；ESJ200-4型万分之一电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；灭菌自封袋；尺子，BHC-130011A/B2生物安全柜，BHC-130011A/B2生物安全柜，上海尚道仪器制造有限公司，DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

2粗茎秦艽种植模式

试验所用药材为采用不同种植模式的粗茎秦艽，种植模式为地膜种植、无地膜种植、秦艽-马铃薯间种、秦艽-白芸豆间种、秦艽-牡丹间种、秦艽-三叶草间种、秦艽-羌活间种、秦艽-玉米间种和秦艽-光叶紫苕间种，药材种植于云南省丽江市鲁甸乡粗茎秦艽种植基地。不同种植模式如以下表1，图1～9。

具体栽种步骤为：

1)选地

选择适宜种植，排水良好，日照较长的向阳坡地。

要求土质疏松，保水和透水性好，含腐殖质多、有机质含量较高的疏松肥沃的壤土或砂质壤土。

2)整地

选好种植地后，于3月整地，部分高寒地区开春化雪后整地。清除杂草和残渣。

清洁土地后，每亩用充分腐熟的农家肥1000-2000kg(或生物有机肥200-300kg)作底肥，深耕30cm以上，耙平。依排水方向拉线翻耕开沟垄，垄高20cm，沟宽30cm，厢面宽90cm，四周开排水沟，以确保排水良好，防止涝害。

3)秦艽育苗

育苗时间为3月上旬，育苗周期为1年，选择上一年新产的种子，要求，发芽率不低于85％。本发明选3年以上，植株生长健壮、无病虫害、种质纯正的母株上采集的褐色或棕色秦艽种子。种子使用湿砂和壤土保存。选择有排、灌水条件的砂质壤土做苗圃，整地，耕20cm以上，按宽1m作厢，长度根据地块大小决定。每亩用种量4-8kg，拌20-30倍细沙，均匀撒施在苗床上，均匀耧耙，耧耙深度1-3cm，使种子与表土充分混合，再用木板按压2-3次，保持种子与土表面充分接触。播种后及时浇水。播种后，保持土壤合理墒情，病苗、杂草及时清除。

4)秦艽移栽

在3月移栽秦艽，秦艽苗移栽采挖时剔除有病虫害的种苗，以免传染，同时按不同大小的种苗分级分开移栽。高海拔移栽时，先用潮湿土假植。移栽株行距为25cm×25cm，应在5d内移栽完成，移栽后浇水1-2次。高原日照过强时，用遮阳网遮荫，待秦艽幼苗定根成活后撤掉遮阳网。

5)间作

于每年相应作物适宜种植季节(马铃薯3-5月、白芸豆3-4季、玉米4-5月，牡丹3-4月、羌活春秋季、光叶紫苕和三叶草为四季)，在秦艽田地的厢间种植表1中QJ3～9的作物，在同一块田地上成行或成带(多行)间隔种植。

6)除草和除病株

秦艽生长期内，采用人工除草方法，及时拔除田间杂草。如发现病株，及时拔除并撒施生石灰消毒。

7)追肥

栽后三个月内，每月集中追肥1次，共3次。第一次，栽后20d内，追施腐熟人畜粪水800-1200kg/667m²和20kg/667m²菜籽饼肥；后面二次在上一次的基础上适当增加用量。

8)灌排水

雨后检查积水并及时排水，防止烂根。

9)摘花蕾

花期除留种秦艽植株外，其余花蕾全部摘掉。

10)采收

秦艽在定植2-3年后，在10-11月利用挖掘农用工具或小型机械采收。其他相应作物在每年成熟时采收，采收籽粒后，可将秸秆还田。

表1粗茎秦艽不同种植模式

3粗茎秦艽最佳采收期研究

根据前期预实验发现粗茎秦艽-马铃薯间种生物量较高，故以三种栽培模式：地膜粗茎秦艽、无地膜粗茎秦艽和粗茎秦艽-马铃薯间种，考察6至11月的生物量指标，和4种环烯醚萜苷类成分的变化。结果如下：

表2三种栽培模式粗茎秦艽6～11月粗茎秦艽生物量比较

注：同列不同字母表示差异性显著(P<0.05)，下同

如表2，图10，图11所示，6～11月三种栽培模式的生物量中，秦艽-马铃薯间种的根茎直径与干重在6月份时最低，当达到10月份时，根茎长度，根茎直径和干重大于6～9月。

表3三种栽培模式粗茎秦艽6～11月4种环烯醚萜苷类成分含量比较

注：同列不同字母表示差异性显著(P<0.05)，下同

取三种栽培模式，地膜，无地膜，秦艽-马铃薯间种考察6月、7月、9月、10月和11月的4种总环烯醚萜苷含量的变化，确定最适宜采收期。如表3，图12可知，6～11月三种栽培模式的生物量中，秦艽-马铃薯间种的4种环烯醚萜苷含量10月最高，6月最低。

粗茎秦艽10月根茎的长度、根茎直径和干重较均高，而4种环烯醚萜苷含量以10月最高，6月最低，故建议10月份为粗茎秦艽的最佳采收期，本研究的粗茎秦艽采样均在10月份，以确保药材的品质和产量达到最佳。

4粗茎秦艽生物量的测定

分别采集种植模式为地膜种植、无地膜种植、秦艽-马铃薯间种、秦艽-白芸豆间种、秦艽-牡丹间种、秦艽-三叶草间种、秦艽-羌活间种、秦艽-玉米间种和秦艽-光叶紫苕间种的一、二年生粗茎秦艽样品各3株。

根长，直径：采用尺子测量粗茎秦艽根茎长度，选择适宜根茎大小，测量根茎直径，分别从不同种植模式平行取三株粗茎秦艽测量，计算不同粗茎秦艽种植模式根茎的平均长度和直径，结果见表4、表5、图13。

叶长、叶宽测量：取粗茎秦艽叶子，分别测量其叶子长度和叶子宽度，每株分别平行测量三次。计算粗茎秦艽叶子平均长度及叶子宽度，结果见表4、表5、图14和图15。

干重：采集不同种植模式的粗茎秦艽，使用电热恒温鼓风干燥箱，45℃下烘48h，取烘干后的粗茎秦艽根茎，使用用分析天平称取干重，结果见表4、表5。

表4一年生粗茎秦艽不同种植模式生物量

注：同列不同字母表示差异性显著(P<0.05)，下同

表5粗茎秦艽二年生不同种植模式生物量

注：同列不同字母表示差异性显著(P<0.05)，下同

一年生粗茎秦艽的地上生物量的指标中，秦艽-三叶草间种的叶长最长；无地膜种植的叶片宽度最大，秦艽-牡丹间种最小；秦艽-马铃薯间种的根茎长度最长；秦艽-马铃薯间种干重最大，地膜种植根茎干重最小。

二年生粗茎秦艽生物量的指标中，无地膜种植叶长，叶宽最大，其次为秦艽-牡丹间种，秦艽-三叶草间种叶长最短，秦艽-马铃薯间种叶宽最小；秦艽-玉米间种的根茎长度最长，而地膜较短；秦艽-马铃薯间种的干重与根茎直径最大，地膜最小。根据两年的数据可得一年生粗茎秦艽叶长，叶宽比二年生大，二年生根茎长度、直径和干重比一年生大。

使用统计学软件SPSS2.0分别对根茎长度，根茎直径，干重进行T检验分析，结果如下图16～图21可得，一年生粗茎秦艽的干重中秦艽-马铃薯间种与地膜种植间有显著性差异(P<0.05)，二年生粗茎秦艽的干重中无地膜种植、秦艽-马铃薯间种和秦艽-三叶草间种有显著性差异(P<0.05)，一年生秦艽根茎长度之间无显著性差异，而二年生粗茎秦艽的地膜种植根茎长度与秦艽-马铃薯间种、秦艽-白芸豆间种、秦艽-三叶草间种、秦艽-玉米间种和秦艽-光叶紫苕间种均有差异；一年生粗茎秦艽，二年生粗茎秦艽的根茎直径只有秦艽-马铃薯间种有差异。

5小结

通过连续测定1年生6-11月粗茎秦艽的生物量和4种总环烯醚萜苷含量，结果显示，粗茎秦艽10月根茎的长度、根茎直径和干重均高，且4种总环烯醚萜苷含量以10月最高，6月最低，故10月份为粗茎秦艽的最佳采收期。在此基础上，研究地膜种植(对照1)和无地膜种植(对照2)，秦艽-马铃薯间种、秦艽-白芸豆间种、秦艽-牡丹间种、秦艽-三叶草间种、秦艽-羌活间种、秦艽-玉米间种和秦艽-光叶紫苕间种等7种间种模式的生物量和4种总环烯醚萜苷含量，在干重，根茎长度，根茎直径均有显著性差异，其他种植的生物量指标均高于地膜种植，尤其秦艽-马铃薯间种最高。

二、粗茎秦艽不同种植模式次生代谢的含量测定

1、仪器、试剂与材料

1.1仪器

Waters 2695/2996型高效液相色谱仪，真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、2996PDA检测器，Empower 3化学工作站，Waters公司(美国)；Supersil ODS-B(4.6mm×250mm 5μm)色谱柱，大连依利特分析仪器有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；JP-040S超声波清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司；ESJ200-4型万分之一电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；BT25S型十万分之一电子分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2试剂与材料

对照品马钱苷酸(批号：wkq19011405)、獐芽菜苦苷(批号：wkq19020306)、龙胆苦苷(批号：wkq20051205)、獐芽菜苷(批号：wkq18042610)质量分数均≧98％，均购于四川省维克奇生物科技有限公司；流动相乙腈为色谱纯(批号：204127)，Fisher公司；磷酸(质量分数≧85.9％)，天津市天南区咸枯工业园；纯水，Thremo Barnstead GenPure UV/UF系统制备纯水。样品来源粗茎秦艽样品由2019年11月9号采自云南省鲁甸县鲁甸乡，样品见表1。

2次生代谢产物的含量测定方法及结果

2.1色谱条件

采用Supersil ODS-B(4.6mm×250mm 5μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.05％磷酸水(B)为流动相，梯度洗脱0～9min，10％A-12％A；9～12min，12％A-15％A；12～20min，15％A-20A％；20～25min，20％A-24％A；25～28min，24％A-26％A；28～32min，26％A-28％A；32～38min，28％A-30％A；38～40min，30％A-33％A；进样量为1.0mL·min^-1，检测波长240nm，柱温30℃，进样量10μL。

2.2对照品溶液的制备

分别精密称取龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷对照品适量，置于5mL容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度制成0.078～5.66mg/mL单一对照品溶液。再分别取龙胆苦苷、马钱苷酸2.5mL，定容至5mL容量瓶中，制成龙胆苦苷2.83mg/mL，马钱苷酸0.69mg/mL混合对照品溶液C₀；取獐牙菜苦苷、獐牙菜苷2.5mL，定容至5ml容量瓶，制成獐牙菜苦苷0.94mg/mL、獐牙菜苷0.19mg/mL混合对照品溶液C₁。将对照品溶液及混合对照品溶液冷藏避光保存，待测。

2.3供试品溶液的制备

精密称取不同种植模式的粗茎秦艽粉末0.5g，置于100mL具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇，称定重量，超声处理30min(40℃，功率500w，频率40kHZ)，放冷，称定重量，取甲醇补足失重。滤纸过滤，取滤液，用0.45μm滤头过滤，放入进样瓶中保存，待测。

分别精密吸取10μL待测样品溶液，注入高效液相色谱仪，依3.2.1项的色谱条件测定，如下图22。

2.4方法学考察

2.4.1线性考察

分别精密吸取“3.2.2”项下的对照品溶液C₀、C₁适量，用甲醇连续稀释成1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512倍一系列不同的浓度混合对照品溶液，并将配制好的混合对照品溶液按“3.2.1”项下色谱条件，分别注入高效液相色谱仪进样测定，记录峰面积。以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，不同成分选取5个合适浓度绘制标准曲线，进行线性回归，得到相关的线性回归方程、相关系数和线性范围，结果见表6、图23～图26。

表6各成分的相关方程、相关系数(r)、线性范围

2.4.2精密度考

取“2.4.1”项下稀释倍数为1/4的对照品混合溶液C₀、C₁，按“2.1”项下色谱条件分别连续进样6次，记录4种对照品溶液的峰面积，并计算RSD，结果如表7所示。

表7精密度考察结果

2.4.3重复性试验

分别取同一批药材粉末(二年生秦艽-牡丹间种)，精密称定0.5g 6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积按外标法进行计算。求得供试品溶液中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的平均含量分别为14.55mg·g^-1、2.66mg·g^-1、41.23mg·g^-1、0.73mg·g^-1，RSD分别为1.75％、1.45％、1.69％、1.90％，表明该方法重复性良好，结果见表8。

表8重复性试验结果

2.4.4稳定性试验

取“3.2.3”项下同一供试品溶液(二年生秦艽-牡丹间种)分别于0、4、8、12、24、36h依“2.1”项下色谱条件进行测定，测得马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的峰面积，计算RSD值分别为1.35％、2.57％、1.50％、1.90％，结果表明供试品溶液在36h内基本稳定，结果见表9。

表9溶液稳定性试验结果

2.4.5回收率试验

取“2.4.3”项已知浓度的6份供试品溶液(二年生秦艽-牡丹间种)，精密吸取0.1mL供试液，加入0.043mg/mL马钱苷酸对照品溶液，加甲醇定容至5mL容量瓶，依2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。

取“2.4.3”项已知浓度的6份供试品溶液(二年生秦艽-牡丹间种)，精密吸取1ml供试液，加入0.075mg/mL獐芽菜苦苷对照品溶液，甲醇定容至5mL容量瓶，依2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。

取“2.4.3”项已知浓度的6份供试品溶液(二年生秦艽-牡丹间种)，精密吸取0.1mL供试液，加入0.283mg/mL獐芽菜苷对照品溶液，甲醇定容至5mL容量瓶，依“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。

取“2.4.3”项已知浓度的6份供试品溶液(二年生秦艽-牡丹间种)，精密吸取1mL供试液，加入0.02mg/mL獐芽菜苷对照品溶液，甲醇定容至5mL容量瓶，依2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。

马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的平均回收率98.28％、100.4％、101.0％和101.6％，其中RSD分别为2.96％、1.91％、2.26％和2.58％，说明该方法的回收率良好。结果见表10。

表10加样回收试验结果

2.4.6粗茎秦艽含量测定

分别取不同种植模式的秦艽粉末(过3号筛)0.5g，精密称定，按“2.3”项下制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件，进样测定，以峰面积按外标法计算各成分含量。结果如下表11～12。

表11一年生粗茎秦艽含量测定结果

注：同列不同字母表示差异性显著(P<0.05)，下同

马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷为粗茎秦艽环烯醚萜苷类4种代表性成分，也是目前含量测定中研究较多的成分。由表11，图27可知，根据2020年版《中国药典》规定，马钱苷酸和龙胆苦苷总含量不得少于2.5％(即25mg·g^-1)，由一年生粗茎秦艽中马钱苷酸和龙胆苦苷总含量最高的为秦艽-马铃薯间种为67.45mg·g^-1；其次为秦艽-玉米间种(58.47mg·g^-1)和无地膜种植(58.42mg·g^-1)；秦艽-三叶草间种(46.25mg·g^-1)含量最低；其余粗茎秦艽不同种植模式的马钱苷酸和龙胆苦苷总含量相差不大。分别为地膜种植(52.25mg·g^-1)、秦艽-白芸豆间种(55.13mg·g^-1)、秦艽-牡丹间种(53.9mg·g^-1)、秦艽-羌活间种(53.9mg·g^-1)和秦艽-光叶紫苕间种(50.61mg·g^-1)。计算4种总环烯醚萜苷含量，结果表明，秦艽-马铃薯间种(71.11mg·g^-1)最高；其次无地膜种植(62.16mg·g^-1)；其余总含量相差不大，分别为秦艽-三叶草间种(49.12mg·g^-1)，秦艽-光叶紫苕间种(53.14mg·g^-1)，地膜种植(55.61mg·g^-1)，秦艽-牡丹间种(57.07mg·g^-1)，秦艽羌活间种(57.18mg·g^-1)，秦艽-白芸豆间种(58.04mg·g^-1)，秦艽-玉米间种(61.67mg·g^-1)。

表12二年生粗茎秦艽含量测定结果

注：同列不同字母表示差异性显著(P<0.05)，下同

由表12和图28可知，二年生粗茎秦艽不同种植模式的4种总环烯醚萜苷的含量，分别为地膜种植(50.55mg·g^-1)、秦艽-光叶紫苕间种(54.81mg·g^-1)、秦艽-羌活间种(55.06mg·g^-1)、秦艽-三叶草间种(57.27mg·g^-1)、秦艽-玉米间种(44.84mg·g^-1)、秦艽-牡丹间种(65.52mg·g^-1)、无地膜种植(66.17mg·g^-1)、秦艽-白芸豆间种(71.15mg·g^-1)、秦艽-玉米间种(68.49mg·g^-1)、艽-马铃薯间种(71.79mg·g^-1)。

二年生的4种总环烯醚萜苷含量比一年生高，二年生龙胆苦苷含量与一年生普遍增加，说明种植时间延长能增加秦艽次生代谢产物含量；地膜种植模式中4种总环烯醚萜含量下降。

3小结

实验测定一、二年生粗茎秦艽龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷与獐牙菜苷4种环烯醚萜苷类活性成分含量，发现除一年生秦艽-三叶草间种模式外，其它一年种植和二年生种植模式均高于地膜种植模式。说明生态种植能有效提高植物次生代谢产量含量，长期地膜种植影响了秦艽环烯醚萜苷类成分和累积。地膜种植模式环烯醚萜苷类成分含量下降，可能与长期使用地膜后影响了土壤根际微生物种类和丰富度等因素有关。

三、粗茎秦艽不同种植模式的无机元素分析

1仪器、试剂与材料

1.1仪器

NexION 1000型电感耦合等离子质谱仪，铂金埃尔默公司(美国)；AFS-9531双通原子荧光光度计海光仪器有限公司；ESJ200-4型万分之一电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；APL微波消解器，奥普乐科技集团有限公司。

1.2试剂与材料

硝酸(质量分数≧85.9％)；氢氟酸；纯水，Thremo Barnstead GenPure UV/UF系统制备纯水；标准溶液，元素标准溶液均购自国家钢铁材料测试中心钢铁研究院(见表13)；样品来源及编号见表1。

表13无机元素标准溶液

2粗茎秦艽无机元素含量测定方法

2.1 ICP-MS工作条件

射频功率1.15KW，载气流量12L/min，辅助气流0.5L/min，雾化器压力0.2MPa，冲洗泵速50r·min^-1，分析泵速50r·min^-1，积分时间：短波长15s，长波长5s；样品冲洗时间30s。等离子观测方式：垂直观测。

2.2供试品试液

秦艽样品：取表1中不同种植模式下的粗茎秦艽根茎粉末样品，过65目筛，精密称定样品约0.2g，置耐压耐高温微波消解罐中，加入硝酸6mL、氢氟酸2mL，放好盖上消解罐盖子，密封，按“2.4”项下置微波消解系统中消解，消解完毕，待充分冷却后取出消解罐，取出消解液，移至25mL容量瓶中，定容，过滤，待测，消解罐使用纯水洗净。

土壤样品：取表1样品中对应的粗茎秦艽根际土壤，研磨成粉末状，过150目筛，精密称定样品约0.2g，置耐压耐高温微波消解罐中，加入硝酸6mL、氢氟酸2mL，放好盖上消解罐盖子，密封，按“2.4”项下置微波消解系统中消解，消解完毕，待充分冷却后取出消解罐，取出消解液，移至25mL容量瓶中，定容，过滤，待测，消解罐使用纯水洗净。

2.3对照品溶液

取Hg、Cd、Zn、Mn、Fe、Na、Mg、As、Cu、Se与Pb元素标准液，配制成0.06、0.6、6、60μg·mL^-1，取Al、K、Mo、Ni、Sr、V、B、Co、Ti、Ba与Sn的标准液，配制成0.02、0.2、2、20μg·mL^-1，依“4.2.1”项下工作条件进样，绘制标准曲线。

2.4微波消解程序

粗茎秦艽样品及其根际土壤样品消解的程序见表14。

表14微波消解程序

3无机元素含量测定结果

表15粗茎秦艽根茎无机元素含量

注：*表示未检测出或低于定量限

通过分析粗茎秦艽根茎中22种元素在不同种植方式下的含量，由表15，图29可知，粗茎秦艽根茎中K、Al和Mg含量最高，均达到1000μg·g^-1以上；其次为Fe、Na和Ti含量高于100μg·g^-1以上；而Ba、Mn、Zn、Sr、B、Sn、Ni含量高于10μg·g^-1；Cu、Hg、V、Co、As、Se、Mo、Pd及Cd含量均低，尤其是Se、Mo、Pd和Cd元素，部分样品未达到检测限。

表16粗茎秦艽根际土壤无机元素含量

由表16，图30可得，根际土壤的无机元素含量中Fe、B和Al含量均达到10000μg·g^-1以上；而Mg、K、Ti和Zn在1000μg·g^-1以上；Mn、Ni、Na和Ba含量均达到100μg·g^-1以上；V、Sr、Cu、As、Co、Sn、Se、Mo、Pd、Hg和Cd含量较低。

植物在生长发育过程中需要吸收各种元素，以维持正常的生命活动。无机元素的含量和分布在植物体内存在一定规律，可作为植物鉴别的依据。

由图29，图30可得粗茎秦艽根茎无机元素与粗茎秦艽根际土壤无机元素有关联，根际土壤中Fe、Al、Mg、K和Ti元素含量高，而在粗茎秦艽根茎中Fe、Al、Mg、K和Ti元素的含量也高，图29，图30显示22种元素有相似的峰型，元素分布呈规律性只是含量略有所差异。说明粗茎秦艽在生长过程中受根际土壤无机元素影响。

4相关性分析

采用SPSS20.0对粗茎秦艽根茎中22种无机元素进行相关性分析，由于Se、Mo、Pd和Cd在粗茎秦艽根茎中未检测到，因此以18种元素的各个平均值作为变量进行多变量分析，结果见表17。

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由表17可得，有3对元素极显著相关(在P＝0.01水平上)，分别为V和Mn；Ba和Ni；Ba和V为负相关。有6对元素显著相关(在P＝0.05水平上)，分别为Mg和Ti与Fe为负相关，As和Cu；Sn和Fe；B和Zn为正相关；其余元素之间都有一定的相关性，但未达到显著性水平。正负相关表明无机元素在粗茎秦艽生长过程起一定的协同或拮抗作用。

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表18为粗茎秦艽根茎无机元素与根际土壤无机元素相关性分析，可得有7对元素呈极显著性相关(在P＝0.01水平上)，分别为Al和As'；Co和Co'；Mg'、K'和Ti；As和Hg'显正相关，Mg和Sr'；Hg和V'为负相关；有14对元素呈显著性相关(在P＝0.05水平上)，分别为As和Cu'、As'；Al和Cu'；Ti、Sr、K、Ba和K'；Hg和Zn'为正相关，表明粗茎秦艽根际土壤中Cu'、K'、As'能够促进粗茎秦艽对As、Al、Ti、Sr和K的吸收，Mn'和Mn；Ni、V、Mg和K'为负相关，表明Mn'和K'抑制Mn、Ni、V和Mg的吸收。

5主成分分析

为进一步考察秦艽元素的分布特征，分别对种粗茎秦艽根茎中的18种无机元素进行主成分分析。由于数据大，间的数量级差异大，首先对数据标准化处理，以降低原始数据间的差异。再运用主成分分析对数据进行降维，分析结果见表19～21和图31。

表19主成分的初始值特征和贡献率

表20主成分因子负荷量

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表21综合得分

由表19可得，特征值大于1的有6个成分，总方差为30.052％、22.451％、16.654％、9.931％、8.198％和6.222％。其累积贡献率达93.509％，说明6个主成分可以代表18个元素93.509％，以上的信息。表20为6个主成分的因子负荷量，按照该因子大小分类，第1主成分中，因子负荷量较大的为K、Ba、Ti和Fe，负荷量绝对值均大于0.533，为正相荷载，这些成分呈正相关，说明该成分在粗茎秦艽根茎的累积趋势较一致，而Mg为负相荷载，其绝对值为0.6025，说明该成分在粗茎秦艽根茎中呈相反的富集趋势。

第2主成分：Hg、Mn和Sr为正相荷载，呈高度正相关，负荷量绝对值均大于0.706，而V为负相荷载。

第3主成分：Zn、B和Ti，为正相荷载，负荷量均大于0.599，Zn与B高度正相关，其负荷量高为0.903和0.863。

第4主成分：As、Cu与Al为正相荷载，负荷量均大于0.763，As具有较大正相荷载，呈高度正相关，而Na，具有负相荷载，其负荷量绝对值为0.512，对粗茎秦艽根茎富集影响较低。第5主成分：Sn和Fe为正相荷载，负荷量分别为0.803和0.918。两种元素具有有较大正相荷载。第6主成分；Na具有正相荷载(0.741)，而Co具有较大负相荷载，负荷量为0.874。

总方差的69％来自第1.2.3主成分，所以可以认为，K，Ba，Ti，Fe，Mg，Hg，Mn，Sr，Zn，B和Ti为秦艽特征元素。

根据相关矩阵计算无机元素综合得分值，由表21可知，各个无机元素中总分值无地膜综合得分最高，依次为秦艽-三叶草间种、秦艽-牡丹间种和秦艽-马铃薯间种，地膜种植综合得分最低，表明地膜种植对粗茎秦艽无机元素的积累差，影响粗茎秦艽的生态种植。药材品质的形成与产地的环境因子如气候、土壤、地形和水质密切相关，土壤无机元素对中药品质的影响以及被大量的研究所证明，但它与环境因子并不是孤立的，而是有多种因子的综合生态作用。根据生物量、含量测定及微生物研究可确定无机元素对粗茎秦艽的生态种植研究中，秦艽-马铃薯间种最佳。

6小结

测定了粗茎秦艽与根际土壤中22种无机元素成分。结果表明，粗茎秦艽根茎中K、Al和Mg含量最高；通过对粗茎秦艽根茎间的无机元素与粗茎秦艽根际土壤间的无机元素的相关性分析得出粗茎秦艽根茎与粗茎秦艽根际土壤样品无机元素有关联，无机元素在粗茎秦艽的生长过程中起一定的协同或拮抗作用。且粗茎秦艽无机元素含量与根际土壤元素含量峰型相似，元素分布呈规律性，说明粗茎秦艽在生长过程中受根际土壤无机元素影响；确定了K，Ba，Ti，Fe，Mg，Hg，Mn，Sr，Zn，B和Ti为秦艽特征元素，在粗茎秦艽种植的推广运用中，可通过对无机元素富集的特点，调整施肥配比和用量以提高粗茎秦艽药材的产量与品质。

四、粗茎秦艽不同种植模式的微生物分析

1仪器、试剂与材料

1.1仪器

ESJ200-4型万分之一电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；CHA-AB双功能气浴恒温振荡器，常州市金坛区指前镇旭日实验仪器厂；DH-360电热恒温培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司；BHC-130011A/B2生物安全柜，上海尚道仪器制造有限公司；高温灭菌锅，上海申安医疗机械厂；电炉，天津天泰仪器有限公司。

1.2试剂与材料

牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖、酵母浸出粉、溶性淀粉、氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硝酸钾与硫酸亚铁，成都恒力试剂公司；纯水，Thremo Barnstead GenPure UV/UF系统制备纯水

2粗茎秦艽土壤微生物测定方法

2.1样品采集

分别采集不同种植模式秦艽根际土壤样品，根际土壤取自粗茎秦艽根茎下5cm，保存至-70℃～-80℃。

2.2试验仪器前处理

制备土壤样品、培养细菌、真菌、放线菌都所用仪器，离心试管、移液管、培养皿，纯水、涂布器、烧杯、三角锥形瓶需要高温灭菌处理。

2.3样品制备

用天平称取土样1g，加到装99mL纯水的无菌三角瓶中，振荡15min，即制成10^-2的土壤稀释液。用无菌移液管吸取上面的土壤稀释液1mL，加到装9ml蒸馏水无菌离心试管中，即制成10^-3的土壤稀释液。同样再从其中吸取土壤稀释液1mL加到另外的装9mL纯水无菌离心试管中，每新加入一个无菌离心试管，土壤溶液稀释10倍。以此类推，做细菌的土壤溶液稀释到10^-4，真菌的土壤溶液稀释到10^-3，放线菌溶液稀释10^-2。

2.4培养基的制备

2.4.1细菌培养基

细菌培养基：称取牛肉膏1.5g、蛋白胨2.5g、氯化钠1.5g，加入500mL纯水于1000mL三角锥形瓶中。上述烧杯放在电炉子上加热至微沸，用玻璃棒搅匀，加热溶解之后加琼脂10g，不断搅拌，可适当补水，调节PH值至7.0～7.2，把制备好的培养基包扎好的放入高温灭菌锅，在126℃，1.5Mpa下维持30min进行灭菌。

2.4.2真菌菌培养基

真菌培养基：称取蛋白胨2.5g、磷酸氢二钾0.5g、酵母浸出粉1.0g、硫酸镁0.25g、葡萄糖10.0g，加入500mL纯水于1000mL三角锥形瓶中。加热溶解之后加琼脂10g，不断搅拌，可适当补水。调节PH值至6.6～6.8，把制备好的培养基包扎好的放入高温灭菌锅，在126℃，1.5Mpa下维持30min进行灭菌。

2.5土壤微生物的接种培养

将“2.4.1”项下的培养基灭菌后，放入生物安全柜，待温度降至50℃后，取15mL倒入100mm的培养皿中，开启紫外灭菌2h，待培养基冷却凝固后将制备好的10^-5土壤稀释液取200μL接种到培养基上，涂布均匀，将接种好的细菌培养基放置37℃的恒温培养箱培养1d，取出细菌培养基计数，计算细菌菌落数。

将“2.4.2”项下的培养基灭菌后，放入生物安全柜，待温度降至50℃后，取15mL倒入100mm的培养皿中，开启紫外灭菌2h，待培养基冷却凝固后将制备好的10^-3土壤稀释液取200μL接种到培养基上，涂布均匀，将接种好的真菌培养基放置28℃的恒温培养箱培养3d，取出真菌培养基计数，计算真菌菌落数。

3粗茎秦艽土壤微生物结果与分析

3.1粗茎土壤微生物试验结果

将培养得到稀释培养的细菌和真菌计算其菌落数，根据培养皿中的菌落计算土壤中所含的活菌数，结果见表22。计算公式如下(1)

表22粗茎秦艽不同种植模式微生物数

由表22与图32～图33可知，秦艽-马铃薯间种的细菌菌落数量最高为4.93±1.94×10⁵M，依次为秦艽-白芸豆间种(1.99±0.22×10⁵M)、秦艽-三叶草间(1.6±0.66×10⁵M)、秦艽-玉米间种(1.59±0.14×10⁵M)、秦艽-羌活间种0.47±0.34M)、秦艽-牡丹间种(0.71±0.15×10⁵M)、秦艽-光叶紫苕间种(0.47±0.34M)、无地膜种植(0.09±0.04×10⁵M)和地膜种植(0.05±0.02×10⁵M)；粗茎秦艽中秦艽-马铃薯间种、秦艽-白芸豆间种、秦艽牡丹间种、秦艽-牡丹间种、秦艽-三叶草间种、秦艽-羌活间种和秦艽-玉米间种与地膜种植差异性显著(P<0.05)。

表22与图34～图35可知秦艽-马铃薯间种(2.62±0.83×10⁴)的真菌菌落数最高，其次秦艽-牡丹间种(1.85±0.90×10⁴M)、秦艽-三叶草间种(1.54±0.34×10⁴M)、秦艽-羌活间种(1.51±0.05×10⁴M)、秦艽-白芸豆间种(1.49±0.68×10⁴M)、秦艽-玉米间种(1.25±0.14×10⁴M)和秦艽-光叶紫苕间种(0.89±0.20×10⁴M)，真菌菌落数较低的种植方式为无地膜(0.13±0.04M)和地膜(0.13±0.08×10⁴M)；粗茎秦艽真菌菌落中只有秦艽-马铃薯间种与地膜种植差异显著。

粗茎秦艽不同生态种植模式中的地膜种植模式的细菌菌落和真菌的菌落数均低。可能是地膜覆盖土壤，不利于微生物的生长。二种不同微生物菌落群数量为细菌菌落数大于真菌菌落数。

不同模式的粗茎秦艽根际土壤微生物总量测定结果为：秦艽-马铃薯间种>秦艽-白芸豆间种>秦艽-三叶草间种>秦艽-玉米间种>秦艽-羌活间种>无地膜种植>秦艽-光叶紫苕间种>秦艽-牡丹间种>地膜种植；其中细菌菌落数占微生物总量最多，地膜种植～秦艽-光叶紫苕间种分别为79.36％～95.00％，真菌菌落数所占比重不大，分别为5.05％～66.07％。

3.2微生物量与粗茎秦艽生物量分析

利用SPSS20.0软件统计分析，分析一年生7种间种模式和2种单作种植模式可得细菌和真菌与粗茎秦艽的地上生物量，地下生物量相关性分析。结果如表23所示。

表23微生物量与粗茎秦艽生物量Pearson指数注：“*”在0.05水平上(双侧)显著相关，“**”在0.01水平上(双侧)极显著相关

由表23可得，Pearson指数为正，则为正相指数，负值则为负相指数。细菌与地上生物量叶宽pearson指数(0.529)为正相指数，细菌数对粗茎秦艽叶宽有正向影响，同时也与粗茎秦艽根茎干重显示有相关性pearson指数(0.654)。

粗茎秦艽地上的生物量和地下生物量无相关性，细菌数和真菌数总量对粗茎秦艽的叶长不相关，细菌数和微生物总数与粗茎秦艽叶宽，干重呈现相关性。

3.3土壤微生物群落多样性

表24不同种植模式下土壤微生物群落多样性指数

注：H'代表香农指数、E'代表均匀度指数、D'代表辛普森指数

土壤微生物是土壤中最具活力的组成成分，其种类组成和功能特征与植物的营养和生长关系密切。根际是直接受到植物根系影响的特殊土壤区域。

由表24可知，秦艽-牡丹间种微生物物种多样性指数比其他不同种植模式的微生物物种多样性指数最大，Shannon指数为1.53，Evenness指数0.44，但Simpson指数为-7.26。秦艽-马铃薯间种的Shannon指数最低，但均匀度指数高。说明秦艽-马铃薯间种的根际土壤的微生物分布均匀，微生物量多样性相对丰富。

4小结

生态种植中，根际土壤微生物的种类和丰富度是影响中药材次生代谢产物的重要因素；同时根际土壤微生物可促进分解和合成有机质，不断改善土壤肥力，是土壤有机质积累的重要微环境，对植株根部的生长和营养的吸收有着促进和抑制的作用。研究发现7同间种模式和无地膜的种植粗茎秦艽根际土壤微生物总量均高于地膜种植模式，总量测定结果为：秦艽-马铃薯间种>秦艽-白芸豆间种>秦艽-三叶草间种>秦艽-玉米间种>秦艽-羌活间种>无地膜种植>秦艽-光叶紫苕间种>秦艽-牡丹间种>地膜种植；地膜种植秦艽细菌和真菌含量均为最低，从另一方面揭示了除连作外，长期使用地膜种植导致土壤微生物种类和丰富度双下降，这是导致土壤肥力下降，秦艽病虫害多发的原因之一，应当尽早终止秦艽地膜种植，推广间种模式，间种模式以：秦艽-马铃薯间种为最佳。

综上，本发明证实了长期使用地膜种植会破坏土壤理化性状，不利于培植良好的土壤微生物环境，影响了粗茎秦艽的品质和产量；使用7种间种秦艽和无地膜种植秦艽可以提高秦艽的生物量、环烯醚萜苷成分的含量和显著改善土壤微生物环境。7种间种秦艽模式中，以秦艽-马铃薯间种模式的生物长量和一二年环烯醚萜苷成分含量为最优，其次为秦艽-玉米间种模式。再结合无机元素及微生物研究结果，可确定秦艽-马铃薯间种模式为粗茎秦艽最佳生态种植模式，因此开展秦艽-马铃薯间种模式，为保护高山中药材种植生态环境和促进秦艽生产的可持续发展奠定基础，具有实际应用推广价值。

Claims

1.一种有效提高秦艽生物生长量、药效成分环烯醚萜苷含量，以及调节土壤中无机元素及微生物的粗茎秦艽种植方法，其特征在于：所述粗茎秦艽种植方法是秦艽与马铃薯间种；

所述秦艽与马铃薯间种包括如下步骤：

1）选地，在秦艽种植季节整地施肥，移栽秦艽幼苗，进行田间管理；

2）在马铃薯种植季节，将马铃薯成行或成带种植于秦艽田地的厢间，进行田间管理；

3）马铃薯每年成熟时采收；秦艽在定植2-3年后采收，采收月份为10月；

步骤1）所述选地是选择向阳坡地；所述向阳坡地的土质为疏松肥沃的壤土；

步骤1）所述整地是翻耕开沟垄，垄高15~30cm，沟宽20~40cm，厢面宽60~150cm；所述施肥是每亩施1000-2000 kg农家肥；

步骤1）所述移栽秦艽幼苗的株行距为20~40cm×20~40cm；所述移栽在 5d内完成，移栽后浇水1-2次；移栽秦艽幼苗于高原时，先用潮湿土假植，并用遮阳网给秦艽幼苗遮荫，定根后撤掉遮阳网；

所述田间管理包括除草，除病株，追肥，灌溉，摘花蕾；

所述追肥的时间为移栽后3个月内，每月1次，共3次，第1次在栽后20 d内；第1次追施腐熟农家肥800-1200 kg/667 m²和菜籽饼肥20 kg/667 m²，其后每次在上一次的基础上增加腐熟农家肥100-200 kg/667 m²和菜籽饼肥10kg/667 m²；所述摘花蕾是摘掉除留种秦艽植株外的花蕾。