CN104509442A - 动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，1）初始培养基与营养添加液体积比为2～3﹕1；初始培养基为 3/4SH培养基+ IBA 3mg/L+蔗糖20-35g/L；营养添加液为3/4SH培养基+蔗糖90-120g/L；2）将初始培养基加入鼓泡式生物反应罐中，接种；3）通气培养；4）培养到第5～10天，滴加营养添加液，3-5天滴完；5）继续培养到第30～42天，收获不定根。可根据需要实时滴加营养成份，鼓泡式生物反应罐在上升的气泡作用下，实现了气动搅拌，可以将营养添加液充分混合到基础培养基中，可定向获得缩短培养时间、提高不定根的产量、总皂苷的含量或提高目标皂苷单体在组份中的含量。

Description

动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法

技术领域

本发明属生物技术领域,具体涉及一种生物反应器培养人参不定根的方法。

背景技术

人参（Panax ginseng C. A. Meyer）系五加科（Araliacede）人参属（Panax L.）植物，是闻名遐迩的“东北三宝”之一，更是我国传统的名贵中草药，驰名中外。我国明代伟大的医学家、药学家李时珍在其史诗性巨著《本草纲目》一书中，对人参的功效作了详尽的介绍，奠定了人参“百草之王”的美誉。人参多生长于昼夜温差小、海拔为500～1100米的针叶林或混交林的山坡中，其主产区主要分布在40°～45°(N), 117.5°～134°(E)之间，在我国主要分布在东北三省及河北北部的山地地区，尤以吉林长白山地区为主产区。我国是研究人参最早的国家之一，现存最早的药物学专著《神农本草经》中详细记载了人参具有“补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目益智，久服轻身延年”之功效^[7]。现代药理学研究表明，人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神之功效，同时人参具有抗心律失常、抗溶血、调节免疫系统、调节中枢神经系统等诸多药理学活性^[8]。人参中含有的化学组分比较复杂，除了含有人参皂苷外，人参中还含有多种非皂苷的活性成分，如含有糖类（单糖、寡糖、低聚糖、多糖等）、氨基酸、脂肪酸、黄铜、维生素（VB1、VB2、VB12、烟酸、泛酸等）及挥发油等组分。随着近年来现代药理学、药代动力学研究的不断深入，人参的药用价值及其保健功效进一步得到了认证，人参的价格和地位不断飙升，如今人参不仅作为我国的名贵中草药，更是得到了世界人民的广泛认可。

人参皂苷具有良好的药理活性及保健功效，经药理学研究表明人参皂苷对于心脑血管、中枢神经系统、免疫系统、消化系统等具有良好的药理学活性。而对于单体人参皂苷药理学活性的研究极为活跃，特别是一些含量甚微的稀有人参皂苷，具有极高的药用价值。

由于长期以来人参被视为珍品，野生资源已枯竭，人工栽培占用林地，造成水土流失，周期长、管理成本高、病害严重。

人参细胞培养、根培养的优势在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，根培养中细胞的高度分化使得次生代谢产物的合成能力明显提高，同时表出明显的代谢稳定性。

人参不定根的诱导培养技术已日趋成熟，普遍应用的是，将多年生人参的鲜根洗净、消毒、切割后在含有2,4-D、KT和蔗糖的MS固体培养基中进行愈伤组织诱导。再将诱导出的愈伤组织移至IBA和蔗糖的MS中诱导、增殖不定根。

比起人参细胞培养，根培养的优势在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，根培养中细胞的高度分化使得次生代谢产物的合成能力明显提高，同时表出明显的代谢稳定性和活力的稳定性。

人参不定根生物反应器培养，普遍应用蔗糖提供碳源，随着蔗糖浓度的增加，人参不定根的产量也随之增加，而培养基中蔗糖的浓度在60g\L以上，对不定根的生长有抑制作用。

目前对于生物反应器培养增殖人参不定根，大多采用将配制好培养基一次性加入反应器中，接种不定根，培养至营养耗尽为止。收获不定根。而生物反应器培养不定根的过程中，是一个动态的生长过程，生长各个阶段对营养的需求不尽相同，从理论上培养基的营养成份是一个逐渐减少的过程。一次性加入培养基，不能具体适应各生长阶段的需要。

有报道采用同样的培养基，分两次或三次加入反应器中，次数越多，增殖系数越小。

发明内容

本发明的目的是为解决生物反应器培养人参不定根，各阶段营养不均衡的问题，提高人参不定根的产量及次生代谢产物的含量，而提供动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法。

动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，它包括：

1）初始培养基与营养添加液体积比为2～3﹕1；初始培养基为 基础培养基+ IBA 3～5mg/L+蔗糖20～35g/L；营养添加液为基础培养基+蔗糖90～120g/L，灭菌； 所述的基础培养基为3/4～4/4 SH或3/4～4/4 MS培养基；

2）将初始培养基加入鼓泡式生物反应罐中，接种；

3）通气培养；

4）培养到第5～10天，滴加营养添加液；

5）继续培养到第30～42天，收获不定根；

所述的基础培养基为3/4SH培养基；

所述的IBA为吲哚丁酸钾；

所述的初始培养基的蔗糖为20～30g/L；

最佳浓度为30g/L；

所述的营养添加液还包括：萘乙酸1.5～2.7mg /L和/或茉莉酸甲酯150～240mg/L和/或水杨酸150～240mg/L；

所述的培养温度为23±2℃。

本发明另一个目的是提供动态均衡营养法培养人参不定根的生物反应器，它包括：初始培养基反应罐4、空气压力泵5和营养添加液罐6；初始培养基反应罐4为鼓泡式生物反应罐，其底部设有气动装置，气动装置的喷头为多微孔喷头405，反应罐盖403还设有营养添加液滴加口401；空气压力泵5与气动装置相连；所述的营养添加液罐6底部设有带调节阀出料口64、顶部设有罐盖62和带过滤器进气口61，进气口61设在罐盖62上，营养添加液滴加口401通过管道7与出料口64相连；

所述的营养添加液滴加口401的直径为2.0～0.2mm；

所述的营养添加液罐6的进气口61与空气压力泵5通过进气调节装置相连。

本发明又一个目的是动态均衡营养法培养人参不定根系统，它包括：1个营养添加液罐6和3个初始培养基反应罐4，营养添加液罐6的出料口64与3个初始培养基反应罐4的养添加液滴加口401连接。

所述的初始培养基反应罐4进气装置、营养添加液罐6的进气口61通过管道与空气压力泵相连接。

所述的鼓泡式生物反应罐4和营养添加液罐6均为18L，初始培养基添加量为8-10L，营养添加液的添加量为12-15L。

本发明提供了动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，1）初始培养基与营养添加液体积比为2～3﹕1；初始培养基为 3/4SH培养基+ IBA 3mg/L+蔗糖20-35g/L；营养添加液为3/4SH培养基+蔗糖90-120g/L； 2）将初始培养基加入鼓泡式生物反应罐中，接种；3）通气培养；4）培养到第5～10天，滴加营养添加液，3-5天滴完；5）继续培养到第30～42天，收获不定根。可根据需要实时滴加营养成份，鼓泡式生物反应罐在上升的气泡作用下，实现了气动搅拌，可以将营养添加液充分混合到基础培养基中，可定向获得缩短培养时间、提高不定根的产量、总皂苷的含量或提高目标皂苷单体在组份中的含量。特别是可用高浓度蔗糖的培养基，动态平衡反应罐的蔗糖浓度，可加大蔗糖的添加量提高不定根产量，解决了蔗糖浓度高抑制不定根生长的问题。初始培养基反应罐和营养添加液罐均为18L，初始培养基添加量为8-10L，营养添加液的添加量为12-15L的培养系统，为人参不定根提供了最佳的生长环境。

附图说明

图1为动态均衡营养法定向培养人参不定根的生物反应器的初始培养基反应罐示意图；

图2为动态均衡营养法定向培养人参不定根的生物反应器的营养添加液罐示意图；

图3、4为动态均衡营养法定向培养人参不定根系统示意图。

具体实施方式

实施例1  人参不定根的获得

    选取长白山区（吉林省通化市集安县）6年生园参，切块，用MS培养基诱导愈伤组织，将诱导的愈伤组织用3\4 SH培养基+IBA5.0mg/L+蔗糖30g/L,诱导不定根，继代培养。

实施例2初始培养基及营养添加液的配制

1、培养基的配制

1）初始培养基

3/4SH培养基+吲哚丁酸钾(K-IBA ) 3mg/L+蔗糖30g/L

2）营养添加液

营养添加液（1）：

在每升3/4SH培养基中，加入萘乙酸（C₁₂H₁₀O₂）2.7mg /L，茉莉酸甲酯（C₁₃H₂₀O₃）240mg/L，水杨酸240 mg/L，蔗糖（C₁₂H₂₂O₁₁）90g×3/L。

营养添加液（2）：

在每升3/4SH培养基中，加入萘乙酸（C₁₂H₁₀O₂）2.7mg/L，茉莉酸甲酯（C₁₃H₂₀O₃）204mg/L，水杨酸240mg/L，蔗糖（C₁₂H₂₂O₁₁）120g/L。

实施例3生物反应器动态均衡营养法定向培养人参不定根

1）将初始培养基12L加入18L鼓泡式生物反应罐中，营养添加液6L加入补液器中，生物反应器和补液器在温度120℃、压力0.08Mpa1条件下灭菌；

2）不定根切1cm块，接种到生物反应罐中；

3）通气，23±2℃培养；

4）培养到第10天，滴加营养添加液（1）6L，3-5天滴完；

5）继续培养42天，收获不定根。

实施例4生物反应器动态均衡营养法定向培养人参不定根

1）将初始培养基10L加入18L鼓泡式生物反应罐中，营养添加液5L加入填料罐中，生物反应器和填料罐在温度120℃、压力0.08Mpa1条件下灭菌；

2）不定根切1cm块，接种到生物反应罐中；

3）通气量，23±2℃培养；

4）培养到第5天，向生物反应罐滴加营养添加液（2）2L，滴加1天，培养到第10天，滴加营养添加液（2）3L，4天滴完；滴加时加大通气量。

5）继续培养42天，收获不定根。

实施例5  动态均衡营养法定向培养人参不定根的生物反应器

请参见图1、2，动态均衡营养法培养人参不定根的的生物反应器，它包括：初始培养基反应罐4、空气压力泵5和营养添加液罐6；初始培养基反应罐4为鼓泡式生物反应罐，其底部设有气动装置，气动装置包括多微孔喷头405、反应罐气动装置接口406,、空气过滤器407、空气流量计408、进气控制阀409，顶部设反应罐盖403和带过滤器排气口402，带过滤器排气口402设在反应罐盖403上，反应罐盖403还设有营养添加液滴加口401；空气压力泵5与气动装置相连；

所述的营养添加液罐6底部设有带调节阀出料口64、顶部设有罐盖62和带过滤器进气口61，进气口61设在罐盖62上，营养添加液滴加口401通过管道7与出料口64相连；

所述的营养添加液滴加口401的直径为2.0～0.2mm；

所述的营养添加液罐6的进气口61与空气压力泵5通过进气调节装置相连。

使用时，关闭各进出口阀，将10L初始培养基加入初始培养基反应罐4中，营养添加液罐6加入5L营养添加剂，营养添加液罐6的出料口64与反应罐营养添加液滴加口401连接，放入高压灭菌锅内高压灭菌，在无菌室内接种于鼓泡式生物反应罐4内，移至培养室，启动空气压力泵，打开带过滤器排气口402和空气控制阀，过滤后的空气经多微孔喷头405喷出，不定根悬浮于培养基中，空气经排气口42排出，23±2℃培养，培养5-10天内，打开营养添加液罐6的带过滤器进气口61和带调节阀出料口64，调节进气流量和出料口调节阀，控制滴加速度，滴加营养添加液，在3-5日内滴完。

实施例6 动态均衡营养法定向培养人参不定根系统

请参见图1、2、3、4，动态均衡营养法培养人参不定根系统，它包括：1个营养添加液罐6和3个初始培养基反应罐4，营养添加液罐6的出料口64与3个初始培养基反应罐4的养添加液滴加口401连接。

初始培养基反应罐4进气装置、营养添加液罐6的进气口61通过管道与空气压力泵相连接；

所述的鼓泡式生物反应罐4和营养添加液罐6均为18L，初始培养基添加量为8-10L，营养添加液的添加量为12-15L。

实施例7生物反应器动态均衡定向营养法培养人参不定根产量及皂苷含量的测定

1、以实施例4、5为实验组，以3/4SH培养基+IBA5mg/L+蔗糖50g/L为培养基常规方式培养为对照，结果发现：

对照组从培养开始到第10天，不定根增长缓慢，但10-20天增长迅速，20-30天也呈增长趋势，但较缓慢；30-40天几乎没发现增长。

按实施例4生物反应器动态均衡营养法培养人参不定根方法培养不定根，从培养开始到第10天，第10 -20天比对照组增长显著加快，第20-25天略高于对照组，25-40天与几乎不增长。

按实施例5生物反应器动态均衡营养法培养人参不定根方法培养不定根，各阶段较对照和实施例4增长显著提高，直至35天都有增长趋势，35天-42天几乎不增长。

实施例4较对照组干重略有提高，近5%，实施例5提高了20%。

2、将按实施例4方法培养6周人参不定根， 送吉林省人参检测中心检测， 结果见表2

Claims (7)

1.动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，它包括：

1）初始培养基与营养添加液体积比为2～3﹕1；初始培养基为 基础培养基+ IBA 3～5mg/L+蔗糖20～35g/L；营养添加液为基础培养基+蔗糖90～120g/L，灭菌； 所述的基础培养基为3/4～4/4 SH或3/4～4/4 MS培养基；

2）将初始培养基加入鼓泡式生物反应罐中，接种；

3）通气培养；

4）培养到第5～10天，滴加营养添加液；

5）继续培养到第30～42天，收获不定根。

2.根据权利要求1所述的动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，其特征在于：所述的基础培养基为3/4SH培养基。

3.根据权利要求1所述的动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，其特征在于：所述的IBA为吲哚丁酸钾。

4.根据权利要求1、2或3所述的动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，其特征在于：所述的初始培养基的蔗糖为20～30g/L。

5.根据权利要求4所述的动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，其特征在于：所述的初始培养基的蔗糖为30g/L。

6.根据权利要求4所述的动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，其特征在于：所述的营养添加液还包括：萘乙酸1.5～2.7mg /L和/或茉莉酸甲酯150～240mg/L和/或水杨酸150～240mg/L。

7.根据权利要求6所述的动态均衡营养法定向培养人参不定根的方法，其特征在于：所述的培养温度为23±2℃。