CN113025555A - 一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法，包括以下步骤：采用一步法培养人参不定根；取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团；再依次接种到干细胞继代培养基、干细胞液体培养基中，暗培养，获得干细胞；再将获得的人参干细胞按照3.0％‑8.0％的接种量接种到生物反应装置中，通气量为0.01‑0.35vvm；暗培养，获得人参干细胞。本发明先采用一步法从成熟人参的各个部分诱导产生不定根，再直接从制备的不定根的根尖部分解剖分离干细胞进行培养，省略了愈伤组织诱导步骤和不定根处理步骤，可以大大节约时间，提高培养干细胞的效率。

Description

一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)是五加科人参属植物，分布于中国、日本、韩国，其根茎是名贵的中药材，号称“百草之王”。人参味甘、微苦，微温，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效，多用于体恤欲脱，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，惊悸失眠等。人参皂苷是人参主要的活性成分，有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生产等功效。近年来，人参被广泛地用在各类化妆品、保健品、饮品中，人参的市场前景非常广阔。
目前由于过度采挖、环境破坏等，野生人参资源几乎灭绝，大田栽培是人参的主要来源。然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，栽培技术复杂以及农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。大田栽培人参供应难以满足市场的需求。人参组织培养技术周期短，不受季节限制，容易进行大规模的工业化生产，具有很大的发展前景。
目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，培养的人参中还存在人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求的问题。例如，申请号为201410698528.0的中国专利公开了一种人参不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸。上述方案中，将日龄为28-32天的组培苗切成小块直接诱导不定根，组培苗幼嫩，分化能力强，且实际上需要先经过种子萌发或者外植体培养获得组培苗，仍然需要至少28-32天的时间，外植体培养仍然需要诱导愈伤组织。因此，实际上并没有缩短周期。
人参干细胞是未分化的细胞，具有无限分裂能力，目前可以通过分离与培养人参的干细胞来生产人参相关的药物活性成分。目前现有技术在分离人参干细胞时，均采用已经分化的组织器官为外植体，通过立体培养阶段的培养(脱分化过程)将其诱导为具有分化能力的愈伤组织细胞。但这种细胞本质来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化生产中，容易出现细胞系退化，分裂能力弱。另外，为了分离培养干细胞，往往需要对外植体进行试剂处理，增加了操作步骤。
人参不定根的根尖部分具有分生组织，分裂能力较强。因此，倘若能够探索所需时间更短、步骤更简单的从成熟人参培养获得人参不定根，再进一步培养获得人参干细胞的方法，则能够在短时间内获得大量的高性能人参干细胞，具有广泛的意义。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法。本发明先采用一步法从成熟人参的各个部分诱导产生不定根，再直接从制备的不定根的根尖部分解剖分离干细胞进行培养，不需要试剂处理，获得人参干细胞，步骤更加简单，节约时间。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法，包括：
(1)采用一步法培养人参不定根；
(2)取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；
(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团；
(4)继代培养：将(3)获得的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，暗培养；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，暗培养，获得人参干细胞；
(6)生物反应装置培养：将(5)获得的人参干细胞接种到含有干细胞液体培养基的生物反应装置中，暗培养，获得人参干细胞。
人参不定根的根尖部分具备更多的分生组织，本发明在显微镜下直接从获得的人参不定根的根尖部分解剖分离干细胞区域进行进一步培养，不需要渗透环境筛选，不需要渗透剂，既能够节省步骤，缩短时间，也能够节约成本。
本发明的分离后的人参干细胞，依次在组成和配比适宜的干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基、干细胞液体培养基上暗培养，人参干细胞生长速度快，能够快速得到人参干细胞。
采用本发明改进结构的生物反应装置，再配合干细胞液体培养基、控制条件，能够快速培养获得人参干细胞，且干细胞中活性成分含量高。
步骤(1)中，本发明采用一步法从成熟人参培养人参不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从成熟参一步诱导得到不定根，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，也能够为获得人参干细胞节约时间。
进一步的方案，步骤(6)中，在生物反应装置培养干细胞时，通气量为0.01-0.35vvm；
优选的，通气量为0.05-0.2vvm。
进一步的方案，步骤(6)中，将干细胞接种到生物反应装置的干细胞液体培养基中时，接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的3.0％-8.0％；
优选的，接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的4.0％-8.0％。
进一步的方案，步骤(6)中，生物反应装置包括罐体，罐体的底壁的高度由四周向中心逐渐降低，形成从上到下直径逐渐减小的倒锥形；出料口设置在中心最低的位置，至少两个进气装置围绕出料口间隔均匀分布在由四周向中心逐渐降低的底壁上。
进一步的方案，步骤(2)中，取(1)中培养的人参不定根的根尖部分，在显微镜下观察根尖部分，根据干细胞的特征确定干细胞区域，显微操作以解剖刀切割获得根尖干细胞区域。
在显微镜下观察根尖部分，细胞形状、排列不规则部分为生长点，即分生组织细胞聚集区域，此区域细胞中含有多个液泡。显微操作解剖刀切割获得根尖干细胞区域。
进一步的方案，步骤(3)中，所述干细胞诱导培养基包括2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基。
作为一种优选的实施方式，所述干细胞诱导培养基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基。
本发明的干细胞诱导培养基中，含有吲哚乙酸、赤霉素和激动素，可以诱导干细胞生长，抗坏血酸和柠檬酸能够产生协同抗氧化的作用。该诱导培养基中各个成分协同作用，能够使干细胞在初期快速生长。
进一步的方案，步骤(4)中，所述干细胞继代培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；
作为一种优选的实施方式，所述干细胞继代培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/LWPM培养基。
本发明的干细胞继代培养基中，含有2,4-二氯苯氧乙酸、赤霉素和激动素，使干细胞生长速度大大增加。
进一步的方案，步骤(5)中，干细胞液体培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/LWPM培养基；
作为一种优选的实施方式，干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。
进一步的方案，步骤(3)和(4)中，在20-25℃下黑暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；步骤(5)中，在20-25℃，100-150rpm下黑暗培养，3-5周传代一次。
进一步的方案，本发明中的干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基和干细胞液体培养基的pH为5.6-6.0。
进一步的方案，本发明中干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基和干细胞液体培养基的pH采用NaOH或KOH调节，有利于干细胞生长。
进一步的方案，步骤(1)中，本发明中采用一步法培养人参不定根的培养方法，具体包括：
将成熟人参清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到诱导培养基中继代培养扩繁；然后将获得的人参不定根剪切成段，接种到液体培养基中培养获得不定根。
目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，培养的人参中还存在人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求的问题。
鉴于成熟人参参龄较长，成熟度高，不易再进行分化，目前还没有可以直接从成熟人参诱导不定根的报道。而本发明经过大量的试验，意外的发现在特定诱导培养基上，成熟人参切片可以直接诱导产生不定根，如此，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从成熟参一步诱导得到不定根，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间。
进一步的方案，所述诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.2-1mg/L赤霉素，0.1-0.6mg/L激动素，0.75-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基。
上述方案的诱导培养基，实现了成熟参的各个部分直接诱导产生不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间。
本方案中，萘乙酸是植物生长调节剂，赤霉素是植物激素，都可以促进不定根形成。激动素为一种细胞分裂素，可以促进细胞的分裂。柠檬酸和抗坏血酸能够产生协同抗氧化的作用，防止成熟人参离体组织褐变，有利于从成熟参离体组织直接诱导不定根。诱导培养基中各个成分协同作用，最终实现了从成熟参的各个部分直接诱导产生不定根，而不需要诱导愈伤组织的中间步骤。
进一步的方案，所述诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基。
上述成分配比下的诱导培养基，对成熟参的产生不定根的诱导效果最好，产生的不定根数量多，质量好，有利于下一步扩繁，提高不定根中的活性成分含量。
进一步的方案，所述液体培养基为以B5培养基、WPM培养基或者以1/2MS培养基为基础培养基，含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖。
本发明中，对诱导产生的不定根进行进一步的液体培养时，可以采用常规培养的培养基，如1/2MS培养基，与常用的不定根的培养基保持一致，说明通过本发明一步法诱导产生的不定根，与其他两步法无异，均可以采用常规培养基培养，同时还缩短了诱导时间，降低了污染风险。
进一步的方案，本发明中的诱导培养基和液体培养基的pH为5.6-6.0。
进一步的方案，本发明中诱导培养基和液体培养基的pH采用NaOH或KOH调节，有利于不定根生长。
进一步的方案，所述切片为宽0.5-0.7cm、长0.5-0.7cm和厚0.2-0.5mm的薄片。
进一步的方案，所述成熟人参的参龄为3年以上；
优选的，成熟人参的参龄为6年以上；
作为一种优选的实施方案，所述成熟人参为百年人参。
百年人参在自然界非常罕见，具有很高的食用、药用价值，可补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智；其价值远大于种植的参龄短的人参。本发明不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从百年人参切块直接一步诱导获得不定根，不但可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，还可以获得母本百年老参中特有的功能成分，从而获得营养价值更好的不定根。
进一步的方案，将所述成熟人参的主根部、或芦头、或艼部、或支根、或须根清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根。
进一步的方案，所述人参选自野山参、移山参，林下参，园参；
优选的，所述人参为野山参。
作为一种具体的优选实施方式，本发明利用生物反应装置分离培养干细胞的步骤具体包括：
(一)一步法培养人参不定根
(1)不定根的诱导
清洗成熟人参的主根部，消毒除菌后，切成宽0.5-0.7cm、长0.5-0.7cm和厚0.2-0.5mm的薄片，接种到含有4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基的诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出人参不定根。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的人参不定根接种到和步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的人参不定根，剪切成长度为1-2cm左右的组织，接种到含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖的液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根。
(二)利用生物反应装置培养人参干细胞
(1)取上述一步法培养获得的人参不定根，截取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；
(2)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中，22℃下避光培养25-30天，直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞诱导培养基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基。
(3)继代培养：挑取部分(2)获得的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，22℃下避光培养25-30天，直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞继代培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；
(4)液体培养：将(3)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，在20-25℃，100-150rpm下黑暗培养，3-5周传代一次；干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；
(5)生物反应装置培养：将(4)获得的人参干细胞接种到含有干细胞液体培养基的生物反应装置中，暗培养，获得人参干细胞；
在生物反应装置培养干细胞时，通气量为0.01-0.35vvm；接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的3.0％-8.0％；干细胞液体培养基的体积占生物反应装置容积的30％-80％。需要说明的是本发明中，B5培养基、WPM培养基、1/2MS培养基等为现有技术中已知的培养基。
B5培养基
成分(mg/L)：硝酸钾KNO3 2500，MgSO4·7H2O 250，CaCl2·2H2O 150，(NH4)2SO4134，NaH2PO4.H2O 150，KI 0.75，H3BO3 3.0，MnSO4·4H2O 10，ZnSO4·7H2O 2.0，Na2MoO4·2H2O 0.25，CoCl2·6H2O 0.025，CuSO4·5H2O 0.025，Na2-EDTA 37.3，FeSO4·7H2O 27.8，肌醇100，烟酸1.0，盐酸吡哆醇1.0，盐酸硫铵10。
1/2MS培养基
成分(mg/L)：硝酸钾950，硝酸铵825，二水氯化钙220，硫酸镁185，磷酸二氢钾85，硫酸锰11.15，硫酸锌4.3，硼酸3.1，碘化钾0.415，钼酸钠0.125，硫酸铜0.0125，氯化钴0.0125，乙二胺四乙酸二钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，盐酸0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫铵0.1。
木本植物用培养基(WPM，Woody Plant medium)
成分(mg/L)：硝酸铵400，四水硝酸钙556，硫酸钾990，无水氯化钙72，磷酸二氢钾170，二水钼酸钠0.25，无水硫酸镁180，一水合硫酸锰22.4，七水合硫酸锌8.6，五水合硫酸铜0.25，七水合硫酸亚铁27.8，乙二胺四乙酸二钠37.3，肌醇100，维生素B1 1，烟酸0.5，维生素B6 0.5，甘氨酸2，pH 5.2。
本发明的第二目的是提供一种生物反应装置，用于培养人参干细胞，包括：罐体，所述罐体的顶部设置有可开闭的盖体，盖体上或罐体的顶部设有排气装置；所述罐体的底部设置有至少两个进气装置，空气经进气装置进入罐体内部。
本发明的生物反应装置，是一种小型生物反应器，结构简单，便于操作，易于观察，利用该生物反应装置可以方便的生产人参干细胞，干细胞的扩繁速度快，增长倍数高。
本发明中，罐体内部中空，用于盛放液体培养基。生物反应装置可以由任意适于制备发酵罐的、可用于高温灭菌的材质制成，例如玻璃、不锈钢、耐高温塑料等；优选不锈钢材质，经久耐用，使用寿命长。罐体顶部的盖体可以打开或者关闭，用于向内添加液体培养基，液体培养基加入后盖体与罐体密封连接。罐体的底部具有至少两个进气装置，从不同位置向罐体内通入无菌空气，从而保证罐内的培养物与空气能够充分接触，并且生长均匀，有利于促进人参干细胞的快速生长。
进一步的，本发明的生物反应装置还包括支撑结构，用于支撑罐体竖直放置在平面上。具体的，支撑结构包括支撑脚，所述支撑脚与罐体的下部连接或者一体设置，罐体通过支撑脚放置在平面或平台上。
优选的，罐体锥形的底部位于支撑脚围成的空间内。
进一步的方案，本发明的生物反应装置的容积可以根据需要设置；作为一种实施方式，本发明的生物反应装置的容积为1-50L，优选2-20L，优选3-10L，优选5L。
进一步的方案，所述罐体的底部中心设有出料口，所述进气装置围绕出料口间隔均匀分布；
优选的，所述罐体的底壁的高度由四周向中心逐渐降低，形成上大下小的倒锥形；所述出料口设置在中心最低的位置，所述进气装置围绕出料口间隔均匀分布在由四周向中心逐渐降低的底壁上。
本发明中，进气装置设置在上大下小的倒锥形的罐体底壁斜面上，如此，进入的气体不会垂直上升，进一步的，两个及两个以上的进气装置围绕中心间隔均匀地分布，有利于空气在罐体内均匀分布，有利于罐体内的干细胞生长均匀。
进一步的方案，所述进气装置包括进气口、进气管和空气过滤器，所述进气口位于罐体的底壁上，所述进气管与进气口密封连接，所述空气过滤器设置在进气管上过滤所经空气。
进一步的方案，所述排气装置包括排气口、排气管和过滤装置，所述排气口设置在盖体上或罐体的顶部，所述排气管与排气口密封连通管，所述过滤装置设置在排气管上；
优选的，所述过滤装置为空气过滤器或液体过滤器。
作为一种优选的实施方式，排气口设置在盖体的中心。
上述方案中，排气管上设置的过滤装置为空气过滤器时，可以防止外部的空气从顶部进入，保证罐体内的无菌培养环境。另外，当排气管上的过滤装置更换为液体过滤器时，可以实现从顶部添加液体。
进一步的，所述盖体上或者罐体的顶部设有接种口，用于接种。
进一步的方案，所述罐体上还设置有把手；优选的，把手至少包括两个。
罐体上设置的把手可以对称设置，便于使用者方便地拿取和移动生物反应装置。
进一步的方案，所述罐体上设置有多个透明的观察窗；用于观察内部干细胞的生长情况；
优选的，所述的观察窗设置在罐体的中部和/或下部的侧壁上。
当罐体采用不透明的不锈钢材质时，设置的不同位置的多个透明观察窗可以从不同角度观察罐体内部，及时掌握罐体内干细胞的生长情况。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、人参不定根的根尖部分具备更多的分生组织，本发明的人参干细胞的分离培养方法，在显微镜下观察根尖部分，细胞中含有多个液泡的为分生组织，也就是干细胞区域，直接从获得的人参不定根的根尖部分解剖分离得到，不需要渗透环境筛选，不需要渗透剂，既能够节省步骤，缩短时间，也能够节约成本。
2、本发明的分离后的人参干细胞，依次在组成和配比适宜的干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基、干细胞液体培养基上暗培养，人参干细胞生长速度快，能够快速得到人参干细胞。
3、本发明利用生物反应装置培养人参干细胞，采用改进结构的生物反应装置，生物反应装置底部为平滑过渡的锥形，多个通气装置的通气口设置在斜面上，在各个方向上均匀通气，使通气均匀且充足，有利于人参干细胞的快速生长，扩大生产。另外，配合培养人参干细胞的液体培养基，采用适宜的控制条件，控制接种量、通气量等，既能够有利于人参干细胞的快速生长，也有利于提高人参干细胞中人参皂苷的含量。
4、本发明采用的人参不定根，采用一步法培养获得，将成熟人参的各部分处理后接种到诱导培养基中直接诱导出人参不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，降低污染风险。
5、本发明中，人参不定根的培养方法，采用的诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.2-1mg/L赤霉素，0.1-0.6mg/L激动素，0.75-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基，各个成分协同作用，解决了一步法从成熟参直接诱导不定根的问题，产生的不定根数量多。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是采用本发明实施例1诱导培养基诱导不定根的示意图；
图2是本发明的生物反应装置的结构示意图；
图3是采用对比例1的诱导培养基诱导不定根的示意图；
其中，1罐体，2盖体，3排气装置，4进气装置，5出料口，6进气管，7空气过滤器，8排气管，9过滤装置，10观察窗，11把手，12支撑脚。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
需要说明的是，本发明中没有具体限定的制备方法或者检测方法，均可以采用本领域现有技术中能够实现其目的的方法进行。
实施例1
(1)不定根的诱导
将20年龄的野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在130rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
本实施例中，步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图1所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，成熟野山参切片上直接诱导产生了不定根。
实施例2
(1)不定根的诱导
将10年龄的野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.4mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1.5cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在120rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。
实施例3
(1)不定根的诱导
将6年龄的园参的芦头清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括6mg/L萘乙酸，0.2mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，1.2g/L柠檬酸，0.1g/L抗坏血酸，20g/L蔗糖、5g/L植物凝胶，4g/L B5培养基和1.8g/L WPM培养基，pH值为5.6。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在110rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.6。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。
实施例4
(1)不定根的诱导
将15年龄的林下参的艼部清洗、消毒除菌后，切成宽0.7cm、长0.7cm和厚0.5mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括5mg/L萘乙酸，1mg/L赤霉素，0.1mg/L激动素，0.75g/L柠檬酸，0.03g/L抗坏血酸，40g/L蔗糖，4g/L植物凝胶，2g/L B5培养基和1g/L WPM培养基，pH值为6.0。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为2cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在130rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，WPM培养基和30g/L蔗糖，pH值为6.0。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。
实施例5
(1)不定根的诱导
将20年龄的移山参的主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.4mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括1mg/L萘乙酸，0.5mg/L赤霉素，0.6mg/L激动素，1.5g/L柠檬酸，1g/L抗坏血酸，50g/L蔗糖、6g/L植物凝胶，1g/L B5培养基和2.4g/L WPM培养基，pH值为5.7。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，B5培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.7。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。
实施例6
(1)不定根的诱导
将百年野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在130rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。
实施例7利用生物反应装置培养人参干细胞
(1)采用实施例2制备得到的人参不定根；
(2)不定根根尖干细胞的分离：取(1)中的野山参不定根根尖，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；
(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中，22℃下暗培养25-30天，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞诱导培养基包括：3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基，pH为5.8；
(4)继代培养：挑取部分(3)得到的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，22℃下暗培养25-30天，，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞继代培养基包括：3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基，pH为5.8；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，22℃、120rpm下黑暗培养，3-5周传代一次；
干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；pH为5.8；
(6)生物反应装置培养：将干细胞液体培养基加入生物反应装置的罐体内(容积为5L)，生物反应装置中液体培养基的体积占其容积的70％；121℃灭菌20min后，备用；干细胞液体培养基与步骤(5)中成分含量相同；
收集步骤(5)中得到的人参干细胞，接种到生物反应装置中，接种的干细胞的质量占干细胞液体培养基体积的6.0％；通气量为0.1vvm；22℃下避光培养，获得人参干细胞。
实施例8利用生物反应装置培养人参干细胞
(1)采用实施例3制备得到的人参不定根；
(2)不定根根尖干细胞的分离：取(1)中的人参不定根根尖，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；
(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中，25℃下暗培养25-30天，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞诱导培养基包括：4mg/L赤霉素，0.6mg/L激动素，2mg/L吲哚乙酸，75mg/L抗坏血酸，50mg/L柠檬酸，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，2.4g/L 1/2MS培养基，1g/L B5培养基，pH为5.8；
(4)继代培养：挑取部分(3)得到的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，25℃下暗培养25-30天，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞继代培养基包括：2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L植物凝胶，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基，pH为5.8；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，25℃、150rpm下黑暗培养，2周传代一次；
干细胞液体培养基包括2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基，pH为5.8；
(6)生物反应装置培养：将干细胞液体培养基加入生物反应装置的罐体内(容积为5L)，生物反应装置中液体培养基的体积占其容积的60％；121℃灭菌20min后，备用；干细胞液体培养基与步骤(5)中成分含量相同；
收集步骤(5)中得到的人参干细胞，接种到生物反应装置中，接种的干细胞的质量占干细胞液体培养基体积的3.0％；通气量为0.05vvm；22℃下避光培养，获得人参干细胞。
实施例9利用生物反应装置培养人参干细胞
(1)采用实施例4制备得到的人参不定根；
(2)不定根根尖干细胞的分离：取(1)中的野山参不定根根尖，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；
(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中，20℃下暗培养25-30天，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞诱导培养基包括：2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，4mg/L吲哚乙酸，15mg/L抗坏血酸，150mg/L柠檬酸，60g/L蔗糖，1g/L植物凝胶，1g/L 1/2MS培养基，2.5g/L B5培养基，pH为5.8；
(4)继代培养：挑取部分(3)得到的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，22℃下暗培养25-30天，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞继代培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基，pH为5.8；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，22℃、120rpm下黑暗培养，2周传代一次；
干细胞液体培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基，pH为5.8；
(6)生物反应装置培养：将干细胞液体培养基加入生物反应装置的罐体内(容积为5L)，生物反应装置中液体培养基的体积占其容积的40％；121℃灭菌20min后，备用；干细胞液体培养基与步骤(5)中成分含量相同；
收集步骤(5)中得到的人参干细胞，接种到生物反应装置中，接种的干细胞的质量占干细胞液体培养基体积的8.0％；通气量为0.35vvm；22℃下避光培养，获得人参干细胞。
实施例10
如图2所示，本实施例提供一种生物反应装置，用于培养人参干细胞，包括：罐体，所述罐体的顶部设置有可开闭的盖体，盖体上或罐体的顶部设有排气装置；所述罐体的底部设置有至少两个进气装置，空气经进气装置进入罐体内部。
本发明的生物反应装置，是一种小型生物反应器，结构简单，便于操作，易于观察，利用该生物反应装置可以方便的生产人参干细胞，干细胞的扩繁速度快，增长倍数高。
本发明中，罐体内部中空，用于盛放液体培养基。生物反应装置可以由任意适于制备发酵罐的、可用于高温灭菌的材质制成，例如玻璃、不锈钢、耐高温塑料等；优选不锈钢材质，经久耐用，使用寿命长。罐体顶部的盖体可以打开或者关闭，用于向内添加液体培养基，液体培养基加入后盖体与罐体密封连接。罐体的底部具有至少两个进气装置，从不同位置向罐体内通入无菌空气，从而保证罐内的培养物与空气能够充分接触，并且生长均匀，有利于促进人参干细胞的快速生长。
进一步的，本发明的生物反应装置还包括支撑结构，用于支撑罐体竖直放置在平面上。具体的，支撑结构包括支撑脚，所述支撑脚与罐体的下部连接或者一体设置，罐体通过支撑脚放置在平面或平台上。
优选的，罐体锥形的底部位于支撑脚围成的空间内。
进一步的方案，本发明的生物反应装置的容积可以根据需要设置；作为一种实施方式，本发明的生物反应装置的容积为1-50L，优选2-20L，优选3-10L，优选5L。
进一步的方案，所述罐体的底部中心设有出料口，所述进气装置围绕出料口间隔均匀分布；
优选的，所述罐体的底壁的高度由四周向中心逐渐降低，形成上大下小的倒锥形；所述出料口设置在中心最低的位置，所述进气装置围绕出料口间隔均匀分布在由四周向中心逐渐降低的底壁上。
本发明中，进气装置设置在上大下小的倒锥形的罐体底壁斜面上，如此，进入的气体不会垂直上升，进一步的，两个及两个以上的进气装置围绕中心间隔均匀地分布，有利于空气在罐体内均匀分布，有利于罐体内的干细胞生长均匀。
进一步的方案，所述进气装置包括进气口、进气管和空气过滤器，所述进气口位于罐体的底壁上，所述进气管与进气口密封连接，所述空气过滤器设置在进气管上过滤所经空气。
进一步的方案，所述排气装置包括排气口、排气管和过滤装置，所述排气口设置在盖体上或罐体的顶部，所述排气管与排气口密封连通管，所述过滤装置设置在排气管上；
优选的，所述过滤装置为空气过滤器或液体过滤器。
作为一种优选的实施方式，排气口设置在盖体的中心。
上述方案中，排气管上设置的过滤装置为空气过滤器时，可以防止外部的空气从顶部进入，保证罐体内的无菌培养环境。另外，当排气管上的过滤装置更换为液体过滤器时，可以实现从顶部添加液体。
进一步的，所述盖体上或者罐体的顶部设有接种口，用于接种。
进一步的方案，所述罐体上还设置有把手；优选的，把手至少包括两个。
罐体上设置的把手可以对称设置，便于使用者方便地拿取和移动生物反应装置。
进一步的方案，所述罐体上设置有多个透明的观察窗；用于观察内部干细胞的生长情况；
优选的，所述的观察窗设置在罐体的中部和/或下部的侧壁上。
当罐体采用不透明的不锈钢材质时，设置的不同位置的多个透明观察窗可以从不同角度观察罐体内部，及时掌握罐体内干细胞的生长情况。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
本对比例步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图3所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，采用对比例1的培养基无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
结果，与对比例1图片展示类似，无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚乙酸，WPM，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
结果：第一周，通体颜色变黄，第三周，颜色加深，中部开始变成褐色，第五周，全部变成褐色，并呈干枯状。
试验例1
本试验例将实施例7制备得到的野山参干细胞和实施例2中所用的野山参切片分别进行皂苷检测和多糖检测。
1、皂苷检测方法
(1)原理
试样经提取等前处理后，经C18色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，外标法定量测定人参皂苷各组分的含量。
(2)试剂
甲醇(CH4O)：色谱纯 乙腈(C6H11N)：色谱纯
标准试剂：人参皂苷Re、Rg1、Ra3、Rb1、Rf、F3、Rb2、Rb3、Rd、Rg2、F1
(3)分析步骤
人参干细胞样品制备：
将实施例7得到的人参干细胞样品用水清洗三次、在研钵中磨碎成糊状、超声破壁、冻干后，样品在研钵上研细，准确称取50mg于10ml离心管中，加入70％甲醇溶液，涡旋。于超声振荡器上超声10分钟，重复两次，过滤备用。野山参样品制备：
将野山参切片样品用水清洗三次、在研钵中磨碎成糊状、超声破壁、冻干后，样品在研钵上研细，准确称取50mg于10ml离心管中，加入70％甲醇溶液，涡旋。于超声振荡器上超声10分钟，重复两次，过滤备用。
标准品制备：
储备液的配制(0.8mg/ml)：分别称取8.00mg人参皂苷Re、Rg1、Ra3、Rb1、Rf、F3、Rb2、Rb3、Rd、Rg2、F1共11种标品于10ml容量瓶中，用优级纯甲醇定容。
使用液的配制(32ug/ml)：准确吸取1ml储备液的配制(0.8mg/ml)于25ml的容量瓶中，用优级纯甲醇定容，经过0.22um的有机滤膜过滤，备用。
(4)仪器参考条件
A)色谱柱：C18柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱填料粒径5μm，或相当者；
B)流动相：a：乙腈，b：水过0.45μm微孔滤膜过滤；
C)流速：0.7mL/min；梯度洗脱程序：0～13min，23％～46％乙腈，体积流量0.7mL/min；13～33min，46～68％乙腈，体积流量0.7mL/min；33～46.5min，68～85％乙腈，体积流量0.7mL/min；
D)柱温：30℃；
E)检测波长：203nm；
F)进样体积：10μL。
(5)分析结果的表述
试样中人参皂苷各组分的含量按式(1)计算:
Figure BDA0003029121960000201
式中：
X——试样中人参皂苷各组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L)；
A1——试样中人参皂苷各组分的峰面积
A2——标准品中人参皂苷各组分的峰面积
ρ——标准品中人参皂苷各组分的浓度(ug/ml)
V——试样溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；
M——试样质量，单位为克(g)；
试样中人参皂苷的含量是将检测的各组分相加得到的总和。
2、多糖检测方法
参照吉林省地方标准：DB 22/T 1685—2012的方法进行检测。
3、结果
皂苷检测结果和多糖检测结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003029121960000202
由以上结果可以看出，与成熟野山参切片相比，本发明培养的野山参干细胞中人参皂苷总含量和多糖的含量均有所提高。因此，本发明的人参干细胞的分离培养方法步骤简便，生长速度快，节省时间，且活性成分含量高。
对比例4
本对比例与实施例8的区别在于采用的生物反应装置不同。
本对比例中，生物反应装置仅在罐体的锥形底部的正中心设置一个进风装置(普通发酵罐)，培养方法和液体培养基与实施例8相同。
如此，分别考察采用实施例7-8(采用本发明生物反应装置，容积为5L)和本对比例的普通发酵罐(容积为5L)培养人参干细胞的情况，人参干细胞增长结果如下：
表2
Figure BDA0003029121960000211
因此，与普通发酵罐相比，采用本发明的生物反应装置，人参干细胞的增长倍数更高，生长更好，有利于提高效率，获得更高含量的人参皂苷。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种利用生物反应装置分离培养人参干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用一步法培养人参不定根；
(2)取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；
(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团；
(4)继代培养：挑取部分(3)获得的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，暗培养；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，暗培养，获得干细胞；
(6)生物反应装置培养：将(5)获得的人参干细胞接种到含有干细胞液体培养基的生物反应装置中，暗培养，获得人参干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，在生物反应装置培养干细胞时，通气量为0.01-0.35vvm；
优选的，通气量为0.05-0.2vvm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，将干细胞接种到生物反应装置的干细胞液体培养基中时，接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的3.0％-8.0％；
优选的，接种的干细胞的质量占干细胞扩繁液体培养基体积的4.0％-8.0％。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，生物反应装置包括罐体，罐体的底壁的高度由四周向中心逐渐降低，形成从上到下直径逐渐减小的倒锥形；出料口设置在中心最低的位置，至少两个进气装置围绕出料口间隔均匀分布在由四周向中心逐渐降低的底壁上。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，取(1)中培养的人参不定根的根尖部分，在显微镜下观察根尖部分，根据干细胞的特征确定干细胞区域，显微操作以解剖刀切割获得根尖干细胞区域。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述干细胞诱导培养基包括2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基；
优选的，干细胞诱导培养基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/LB5培养基。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述干细胞继代培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/LWPM培养基；
优选的，干细胞继代培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)中，干细胞液体培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；
优选的，干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。
9.根据权利要求1-5任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，在20-25℃下黑暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；步骤(5)中，在20-25℃，100-150rpm下黑暗培养，3-5周传代一次。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，一步法培养人参不定根的方法包括：将成熟人参清洗消毒，切片，接种到不定根诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到不定根诱导培养基中继代培养扩繁；然后将获得的人参不定根剪切成段，接种到液体培养基中培养获得不定根；
优选的，所述不定根诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.1-0.6mg/L激动素，0.2-1mg/L赤霉素，0.75-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/LB5培养基和1-2.4g/L WPM培养基。
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