CN108739377A

CN108739377A - 一种人参不定根诱导培养基及其应用

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Publication number: CN108739377A
Application number: CN201810398086.6A
Authority: CN
Inventors: 刘汉石; 刘禹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本发明提供了一种人参不定根诱导培养基和人参不定根的诱导方法。人参不定根诱导培养基包括：MS基础培养基，0.2mg/L‑0.5mg/L IBA(吲哚丁酸)、2mg/L‑4mg/L NAA(萘乙酸)及20g/L‑30g/L蔗糖。采用本发明方法制备得到的人参不定根，其中的皂苷含量高，人参细胞遗传性稳定，受环境因素影响小，可以作为人参皂苷生物合成分子调控研究的理想模型，并探索实现工程化细胞大规模生产人参皂苷的有效途径。

Description

一种人参不定根诱导培养基及其应用

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种人参不定根诱导培养基及其应用。

背景技术

药用植物人参是我国传统的名贵中药材，被誉为药中之王。其产品具有广阔的市场。人参Panax ginseng C.A.Meyer为五加科人参属植物，主要分布在中国东北、韩国和日本。它的次生代谢产物人参皂苷(ginsenoside)为异戊二烯单元(五碳)构成的四环三萜达玛烷类化合物，由人参二醇和人参三醇型皂苷组成，主要分布于根部，其次为茎和叶。迄今为止，分离并确定了结构的皂苷成分有50余种。现代研究认为，人参的主要药效活性成分为人参皂苷，不仅对中枢神经、心血管、免疫和内分泌系统具有药理作用，还表现出抗肿瘤、抗应激及抗氧化等多种活性，临床应用十分广泛。近年来随着人参等中药产业化的推进，人参单体皂苷生物活性和药理作用研究的逐步深入，对人参皂苷的需求量显著增加，据估计，世界每年仅销售各种人参未成品就达数10亿美元。

然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，栽培技术复杂，生产受到很大限制。由于多年来的过度采挖，人参赖以生存的森林生态环境遭到严重破坏，野生人参资源枯竭，目前用于药用的多为栽培人参。然而人参的栽培生产周期长(约6年左右)，繁殖系数低，不能连作(种植过人参的土壤20-30年内难以再利用)，且对土壤环境要求严格。占地面积大，且其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，供应难以满足市场的需求；农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。

特别是人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求。通过人参愈伤组织诱导培养，建立细胞培养体系，可以作为人参皂苷生物合成分子调控研究的理想模型，并探索实现工程化细胞大规模生产人参皂苷的有效途径。人参组织培养方法具有不受生长季节限制、不携带病毒、培养周期短等优点，且易于进行工业化大规模生产，因此具有很大的发展前途。

近几年，一些科研院所及高校，有诱导出人参不定根报道，虽具有较好的生长特性及人参皂苷合成能力。但仍存在不足：(1)人参皂苷含量低；(2)对外在环境适应能力差；(3)细胞遗传稳定性差，传代次数增加后，发生退化迹象等。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术中人工诱导的人参不定根皂苷含量低、细胞遗传稳定性差得的问题，提供一种人生不定根的诱导方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种人参不定根诱导培养基，所述诱导培养基包括：MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/L IBA(吲哚丁酸)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)及20g/L-30g/L蔗糖。

优选的，所述诱导培养基还包括0.6g/L-0.8g/L琼脂。

优选的，所述诱导培养基包含IBA为0.4mg/L，所述NAA为3mg/L，蔗糖为25mg/L。

优选的，所述诱导培养基包括琼脂为0.7g/L。

本发明进一步提供了一种人参不定根的诱导方法，包括如下步骤：

(1)人参愈伤组织制备：取野生人参根为外植体，消毒后去除表面表皮，接种在愈伤诱导培养基上，培养获得人参愈伤组织；

(2)人参细胞的培养：取步骤(1)中的人参愈伤组织，接种在人参细胞培养基中，30-40天转接一次；

(3)人参不定根的诱导：收集步骤(2)中的人参细胞，接种在人生不定根诱导培养基中，22-27℃暗培养，30-40天转接细胞组织一次，就会诱导出人参不定根，其中，所述诱导培养基包括：MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/LIBA(吲哚丁酸)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)及20g/L-30g/L蔗糖。

优选的，所述步骤(3)中的诱导培养基还包括0.6g/L-0.8g/L琼脂。

优选的，所述步骤(3)中的诱导培养基包含IBA为0.4mg/L，所述NAA为3mg/L，蔗糖为25mg/L。

优选的，所述步骤(3)中的诱导培养基包含琼脂为0.7g/L。

优选的，所述步骤(3)中暗培养的时间为25℃，细胞转接的时间为36天。

本发明进一步提供了一种人参不定根，所述人参不定根由上述诱导方法制备得到。

本发明进一步公开了上述诱导培养基在人参不定根诱导培养中的应用。

本发明通过提供一种能够诱导人参不定根的诱导培养基及人参不定根的诱导方法，解决了人参不定根的组织诱导培养问题。采用本发明提供的诱导培养基和人参不定根的诱导方法，制备得到的人参不定根皂苷含量高，人参皂甙含量占培养物干重的4-5％；生长旺盛，细胞生长速率可达6-8g干重/升/月。稳定性高，可无限传代。通过本发明方法可进行大规模生产，与野生型相比生产周期大大缩短，并且所生产的培养物质量稳定产量高；本发明方法不占耕地，不破坏野生资源，保护了生态环境，解决了人参短缺的问题，适合广泛推广应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

1.培养基的配置

1)配制人参愈伤诱导培养基，MS基础培养基(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L GA(赤霉素)、20g/L-30g/L蔗糖、0.6g/L-0.8g/L琼脂。

2)配制人参细胞培养基，MS基础培养基(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、2-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L-0.8g/L琼脂及20g/L-30g/L蔗糖。

3)配制人生不定根诱导培养基，MS基础培养基(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L-0.8g/L琼脂及20g/L-30g/L蔗糖。

2.人参不定根的诱导

(1)人参愈伤组织制备：取野生人参根为外植体，，用75％酒精浸泡10-30s，然后用0.1-0.4％氯化汞溶液消毒8-12min，再用无菌水反复冲洗4-5次后放在无菌滤纸上吸干外植体表面水分，消毒后去除表面表皮，接种在愈伤诱导培养基上，培养获得人参愈伤组织。

(2)人参细胞的培养：取步骤(1)中的人参愈伤组织，接种在人参细胞培养基中，30-40天转接一次。

(3)人参不定根的诱导：收集步骤(2)中的人参细胞，接种在人生不定根诱导培养基中，22-27℃暗培养，30-40天转接细胞组织一次，就会诱导出人参不定根。

附表1：MS基础培养基配方

实施例1配制人参愈伤诱导培养基

配制MS基础培养基(配方见附表1)，在MS基础培养基中添加0.5mg/LGA(赤霉素)、30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂。将配好的培养基高温灭菌后，冷却倒平板备用。

实施例2配制人参细胞培养基

配制MS基础培养基(配方见附表1)，在MS基础培养基中添加0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、4mg/L NAA(萘乙酸)、0.8g/L琼脂及30g/L蔗糖。将配好的培养基高温灭菌后，冷却倒平板备用。

实施例3配制人生不定根诱导培养基

配制MS基础培养基(配方见附表1)，在MS基础培养基中添加0.4mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、3mg/L NAA(萘乙酸)、0.7g/L琼脂及25g/L蔗糖。将配好的培养基高温灭菌后，冷却倒平板备用。

实施例4人参不定根的诱导

(1)人参愈伤组织制备：取野生人参根为外植体，用75％酒精浸泡30s，然后用0.4％氯化汞溶液消毒8min，再用无菌水反复冲洗5次后放在无菌滤纸上吸干外植体表面水分，消毒后去除表面表皮，接种在实施例1配置的愈伤诱导培养基上，培养获得人参愈伤组织；

(2)人参细胞的培养：取步骤(1)中的人参愈伤组织，接种在实施例2配置的人参细胞培养基中，35天转接一次；

(3)人参不定根的诱导：收集步骤(2)中的人参细胞，接种在实施例3配置的人生不定根诱导培养基中，25℃暗培养，36天转接细胞组织一次，诱导获得人参不定根。

实施例5人参不定根中皂苷含量的测定

采用标准曲线法测定，将本发明制备得到的人参不定根和野生人参根，烘干后作为样品测定。(I)标准曲线的绘制：①取Rg10.020g溶于甲醇中，定容为2mg/ml；②取Rgl对照品溶液30、60、90、120、150μl；③分别置于5支试管中(10ml，具塞)，甲醇定容为150μl，以相应试剂作对照；④将试管置于冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％硫酸摇匀，60℃恒温水浴20min；⑤冰水浴15min后在751分光光度仪544nm处检测；以人参为标准品比色测定，根据标准曲线Y＝503.29X+4.456，R2＝0.9924求得样品皂苷含量(％)；(II)根中总皂苷的测定：取一定量人参根，蒸馏水冲洗后，用滤纸吸干发状根表面的水分，称量根鲜重，然后于真空干燥箱中80℃下干燥至恒重，称量；将干燥后的根粉碎，放入三角瓶中，加入一定量的浓度为40％的乙醇溶剂，并将三角瓶口用封口膜密封，置于超声发生器中进行分离提取，提取时间15min，超声频率为28KHz，提取两次；在冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％H2S04染色，60℃恒温水浴10min，冰水浴15min，于544nm处测吸光度。测定结果如下：

附表2：皂苷占人参根干重比例

皂苷/野生人参根干重	2.98％
		皂苷/本发明的人参不定根干重	4.32％

实施例6：人参细胞生长速率测定

取一定量的实施例4步骤2中的细胞，继代培养2次，每30天转接一次，60天后，测定细胞的干重，计算细胞的生长速率可达7g干重/升/月。

实施例7：细胞稳定性试验

取一定量的实施例4步骤2中的细胞，经过多次继代培养后，再对其采用不定根诱导培养进行诱导生根，并对得到的根中的皂苷的含量测定，发现其中的皂苷含量趋于稳定。表明，采用本方法制备得到的人参细胞遗传性质稳定，受环境因素影响较小。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种人参不定根诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基包括：MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/L IBA(吲哚丁酸)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)及20g/L-30g/L蔗糖。

2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于：所述培养基还包括0.6g/L-0.8g/L琼脂。

3.根据权利要求1-2任一权利要求所述的诱导培养基，其特征在于：所述IBA为0.4mg/L，所述NAA为3mg/L，所述蔗糖为25mg/L。

4.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于：所述琼脂为0.7g/L。

5.一种人参不定根的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)人参不定根的诱导：收集步骤(2)中的人参细胞，接种在权利要求2-4任一所述的人参不定根诱导培养基中，22-27℃暗培养，30-40天转接细胞组织一次，就会诱导出人参不定根。

6.根据权利要求5所述的人参不定根的诱导方法，其特征在于：步骤(3)中暗培养的时间为25℃，细胞转接的时间为36天。

7.根据权利要求5所述的人参不定根的诱导方法，其特征在于：步骤(1)中的愈伤诱导培养基包括，MS基础培养基，0.5mg/L GA(赤霉素)、30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂。

8.根据权利要求5所述的人参不定根的诱导方法，其特征在于：步骤(2)中的人参细胞培养基包括，MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L-0.8g/L琼脂及20g/L-30g/L蔗糖。

9.一种人参不定根，其特征在于，由权利要求5-8任一权利要求所述的诱导方法制备得到。

10.权利要求1-4任一权利要求所述的诱导培养基在人参不定根诱导培养中的应用。