CN106962193B - 一种适用于不同种源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法 - Google Patents
一种适用于不同种源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种适用于不同种源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域，其步骤如下：(1)无菌苗制备：收集不同种源的黑果枸杞种子，消毒处理后，接种于MS培养基上，长出的小苗待用；(2)嫩茎段诱导不定芽分化培养基的筛选：利用茎段诱导丛生芽中激素种类及梯度设置，进行嫩茎段诱导不定芽的分化培养，筛选培养基条件；(3)生根培养基的筛选：利用步骤(2)得到的嫩芽进行诱导生根，筛选培养基条件。本发明摸索出一套简洁有效、适合不同种源黑果枸杞快速繁育的方法，为以后黑果枸杞无菌快繁工作提供了方向，为未来黑果枸杞的大规模工厂化育苗奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑果枸杞的快速繁殖方法，特别涉及一种适用于不同种源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)属于茄科、枸杞属多年生灌木，具有耐旱、耐盐碱的特性，是集盐碱地绿化价值、经济价值、药用价值等为一体的野生灌木树种，在生态建设和区域经济发展中有巨大的应用前景。黑果枸杞主要分布在我国西部，集中在青海的柴达木盆地(格尔木、都兰、德令哈等地区)，甘肃河西走廊(瓜洲、玉门、靖远等地区)以及内蒙的额济纳旗、阿拉善左旗和右旗，各自然群体具有丰富的表型多样性和遗传多样性。
由于近年来野生黑枸杞高额利润带来的野蛮采摘，黑果枸杞野生资源已濒临灭绝，保护和利用各地区野生资源迫在眉睫。利用植物组织培养技术既可以保留原有植株的优良性状，又可将优良单株快速繁殖成无性系，迅速在生产中推广应用。
目前，黑果枸杞快速繁殖研究方面，有如下三个方面：
(1)以嫩茎段为外植体的快速繁殖体系研究：
浩仁塔本等人在《植物生理学通讯》(2005，41(5):631-631)中公开的“黑果枸杞的组织培养”一文中，首次发表了有关黑果枸杞组织培养的研究报告，利用带腋芽的嫩茎段进行MS(MS培养基：Murashige and Skoog培养基)+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)1.0mg/L+NAA(萘乙酸)0.2mg/L+2.5％蔗糖+0.8％琼脂和MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L+NAA0.2mg/L+2.5％蔗糖+0.8％琼脂两种诱导分化培养基的比较，发现细胞分裂素高时，易产生愈伤组织，不定芽数量少，且芽茎较短，叶片多，不适合继代。两种不定芽增殖培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L和MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，但蔗糖琼脂均减半(即蔗糖12.5％，琼脂0.4％)；生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L，约20天后生根，生根率88％左右。杜敏智在2015年公开的“大果黑果枸杞组培快繁技术体系的研究”一文中，以大果黑果枸杞为研究对象，采用嫩茎段器官为材料，比较了ZT(异戊烯氨基嘌呤)和6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)与IBA(吲哚丁酸)不同浓度(0.5-1.75mg/L)组合下诱导分化的效果，得出6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)玻璃化更严重，ZT与IBA组合更适合黑果枸杞增殖培养(琼脂浓度5.5g/L)，IBA激素1mg/L为该研究中得到的最适浓度。针对玻璃化现象对蔗糖含量、琼脂含量以及光照强度进行调整，该研究认为随着琼脂含量增高，光照强度增加可一定程度减轻玻璃化，通过ZT浓度循环调整，也可达到减轻继代过程中更容易出现的玻璃化的目的。胡相伟等人在《甘肃农业科技》(2015(5):73-74)发表的“黑果枸杞组织培养技术”一文中公开：用一年生休眠枝带一个芽的小茎段为材料得出，各阶段培养基成分含量依次为：芽诱导培养基：MS+0.5mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+30mg/g蔗糖+6mg/g琼脂；继代培养基：MS+0.3mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.05mg/L NAA+30mg/g蔗糖+6mg/g琼脂；生根培养基：1/2MS+0.5mg/LIAA(吲哚乙酸)+15mg/g蔗糖+6mg/g琼脂。该研究下最适生根培养基在约20天长出不定根。马彦军等人在《林业实用技术》(2015(6):26-28)中发表的“黑果枸杞组织培养快繁技术研究”，文中公开了：采用1年生苗的茎段诱导愈伤，其中MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L愈伤组织诱导率最高，质量最好，愈伤组织培养30天左右，有丛生芽长出；当NAA浓度为0.2mg/L，6-BA浓度在0.1-0.4mg/L之间时，随着6-BA浓度增大，不定芽的出芽数量在减少，增殖系数降低，6-BA浓度为0.1mg/L时增殖系数最大，为3.58；6-BA浓度达到0.4mg/L时，增殖系数仅为1.93，而且在基部形成大量愈伤组织，不定芽短缩，透明、玻璃化现象严重。NAA 0.2mg/L+IBA 0.2mg/L的组合，黑果枸杞组培苗生根率、平均根数及平均根长最大，依次分别为93.3％，12.5条，6.8cm。
(2)利用叶片为外植体的快速繁殖体系研究：
杨宁等人在《西北师范大学学报(自然科学版)》(2016年02：84-88)中发表的“黑果枸杞的组织培养和快速繁殖”一文中公开了如下内容：利用叶片诱导脱分化产生愈伤，筛选得到的最优愈伤诱导培养基：MS+0.5mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.1mg/L 2,4-D(二氯苯氧乙酸)+10g/L蔗糖，出愈率达88％，愈伤组织生长状态良好；利用愈伤诱导不定芽分化，发现当6-BA浓度为0.2mg/L时，黑果枸杞不定芽的增殖状态最好。选用IBA为诱导生根激素，当IBA浓度为0.1mg/L时，生根率50％；浓度达到0.2mg/L时，生根率达到95％。孙晓红等人在《植物生理学报》(2016,52(5):653-658)中发表的“黑果枸杞的叶片分化与快速繁殖”一文中公开了如下内容：以黑果枸杞成熟叶片为外植体,诱导愈伤组织及不定芽的分化，获得再生植株，建立了黑果枸杞组织培养和快速繁殖技术新体系。结果表明：诱导叶片脱分化形成愈伤组织的适宜培养基为MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)1.0mg/L+NAA0.2mg/L,诱导率100％，愈伤组织绿色，致密团状，无玻璃化；诱导愈伤组织分化和生长的适宜培养基为MS+ZT(异戊烯氨基嘌呤)1.4mg/L+NAA(萘乙酸)0.02mg/L,平均丛生芽数为23.7株；诱导生根的适宜培养基为MS+IBA(吲哚丁酸)0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.4mg/L。但研究中发现，在NAA浓度固定的情况下,随着6-BA浓度的增高，愈伤组织诱导率和分化率均增高，但愈伤组织玻璃化现象严重，有效不定芽数减少；培养基中只添加玉米素ZT(异戊烯氨基嘌呤)一种激素时，随着ZT浓度的升高，丛生芽的平均高度和数目均增加，芽生长状态由弱到强，但都有不同程度的玻璃化；培养基中添加0.02mg/L的NAA后再添加ZT(异戊烯氨基嘌呤)，玻璃化程度大大减弱。
(3)其他：
王方琳等人在《干旱区资源与环境》(2016(10):104-109)公开的“荒漠区药用植物黑果枸杞(Lycium ruthencium)的组织培养”一文中公开了如下内容：以黑果枸杞无菌苗的子叶、茎段、胚轴为外植体材料，研究不同激素配比的培养基对不同外植体愈伤组织培养、丛生芽增殖及生根培养的影响。比较得出，叶片是最适宜黑果枸杞进行愈伤组织诱导的外植体材料，筛选得到的培养基为MS+0.36-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+1.0 2,4-D(二氯苯氧乙酸)；较高浓度的细胞分裂6-BA对丛生芽增殖具有明显的促进作用，在6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)为3.0mg/L、KT(激动素)0.3mg/L、NAA(萘乙酸)0.5mg/L时丛生芽增殖率达到最大值90.2％，且丛生芽数量多、茎干健壮、生长旺盛；最适宜的生根培养基为1/2MS+0.5NAA+1/2MgSO4，丛生芽4天时，开始生根，生根率可达98.2％，平均生根数和根长分别为5.19个和4.51cm，且根长，粗壮，根毛发达。乔永旭在《中药材》(2015(10):2031-2034)中“黑果枸杞高频再生体系的建立”一文中公开了如下内容：试验中探讨了子叶、下胚轴和胚根3种外植体诱导愈伤组织的情况，发现下胚轴诱导的愈伤组织最好。诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)1.0mg/L+NAA0.5mg/L，愈伤组织诱导率高达100％；丛生芽诱导和增殖的最佳培养基为MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L+NAA0.5mg/L，增殖系数为7.73；根诱导的最适培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L(1/2MS+IBA0.1mg/L(50％))。但试验中发现各培养基均出现不同程度的玻璃化。冀菲等人在《北华大学学报(自然科学版)》(2016，17(4):537-539)中公开的“黑果枸杞组培繁殖培养基选择”一文中公开了如下内容：研究结果表明，无菌苗在0.1mg/LIBA浓度不变的情况下，在细胞分裂素含量较高的培养基中愈伤组织形成的量较大，得出MS+1.0mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.1mg/L IBA培养基中可以形成较好的愈伤组织；愈伤在MS+0.4mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.1mg/L IBA培养基中不定芽数量较多，继代培养周期约为36天，在继代培养过程中通过逐渐降低培养基细胞分裂素含量的方式，继代培养效果较好；在IBA浓度依次设置为0、1.0、1.5mg/L时，1/2MS+1.5mg/L IBA生根率最高，为98％，平均生根数为4条/株。
目前，虽然已有部分关于黑果枸杞组织培养研究的报告，但目前研究报告都局限于单一种源(品种)培养条件探索，因此常出现在各阶段培养基条件的摸索中，不同实验室即使使用了同一种激素，最终获得最适培养基激素浓度不尽一致，给黑果枸杞的工厂化育苗带来不便。
此外，大部分报道中都提到不同程度的玻璃化的现象，说明玻璃化问题没有得到根本解决。
因此，提供一种适于不同种源的黑果枸杞种质资源，具有普遍适用性且操作过程简单方便、成苗繁殖速度快、成活率高的黑果枸杞的高效快速繁殖方法就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于不同种源的黑果枸杞种质资源，具有普遍适用性且操作过程简单方便、成苗繁殖速度快、成活率高的黑果枸杞的高效快速繁殖方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种适用于不同种源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，其步骤如下：
(1)无菌苗制备：收集不同种源的黑果枸杞种子，消毒处理后，接种于MS培养基上，长出的小苗待用；
(2)嫩茎段诱导不定芽分化培养基的筛选：利用茎段诱导丛生芽中激素种类及梯度设置，进行嫩茎段诱导不定芽的分化培养，筛选培养基条件，得到嫩芽；
(3)生根培养基的筛选：
利用步骤(2)得到的嫩芽进行诱导生根，设计生根培养基，筛选培养基条件。
优选地，所述步骤(1)中，所述消毒处理的具体过程如下：放进2ml离心管后，先用75％酒精消毒30秒，蒸馏水冲洗2-3次，然后用70％的84消毒液消毒6分钟，蒸馏水再冲洗3-4次，吸干水分后，用杀过菌的镊子接种于MS培养基上。
优选地，所述步骤(2)中，培养基条件为MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+肌醇100mg/L+6-BA0.1mg/L。
优选地，所述步骤(2)中，所述嫩芽为2cm左右，优选1-3cm。
优选地，所述步骤(3)中，培养基条件为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+IBA0.2mg/L。
本发明所提供的黑果枸杞无菌快速繁殖技术，适于不同种源的黑果枸杞种质资源，具有普遍适用性，且操作过程简单方便、成苗繁殖速度快、成活率高。
本发明的优点在于：
本发明在考虑组织快速繁殖的快速性、高效性、经济性的同时，把激素成本和激素使用的方便程度考虑进去，选取不同种源地收集的不同黑果枸杞种质，同时进行各阶段共性培养基的筛选，以获得稳定、高效适应所有黑果枸杞种质生长的培养基条件。
本发明对已有的有关黑果枸杞茎段组织培养的培养基的关键条件进行了筛查检验，在此基础上摸索出一套简洁有效、适合不同种源黑果枸杞快速繁育的方法，为以后黑果枸杞无菌快繁工作提供了方向，为未来黑果枸杞的大规模工厂化育苗奠定基础。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
具体实施方式
实施例1
一种适用于不同种源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，其步骤如下：
(1)无菌苗制备
从新疆(库尔勒、巴楚、沙雅)、青海(格尔木、诺木洪、德令哈)、内蒙(阿拉善左旗)、甘肃(瓜洲、永靖)地区收集到9个不同种源的黑果枸杞种子，挑选饱满个儿大的种子，放进2ml离心管后，先用75％酒精消毒30秒，蒸馏水冲洗2-3次，然后用70％的84消毒液消毒6分钟，蒸馏水再冲洗3-4次，吸干水分后，用杀过菌的镊子接种于MS培养基上，长出的小苗待用；
(2)嫩茎段诱导不定芽分化培养基的筛选
1)方法：种子萌发后，待幼苗长至5-6cm时，将其剪切成1cm长左右的小茎段，去掉叶片，分别转接至含不同浓度的6-BA与IAA的MS分化培养基中，诱导分化丛生芽，培养温度23-25℃，光周期16小时/8小时(昼/夜)，光照强度3klx。每28天继代1次。利用嫩茎段诱导丛生芽中培养基条件以及激素种类和梯度设置为：I、MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA 0.1mg/L+IAA 0.2mg/L；II、MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.1mg/L+IAA0.4mg/L；III、MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.05mg/L+IAA 0.2mg/L；IV、MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+100mg/L肌醇+6-BA0.1mg/L；V、MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+100mg/L肌醇+6-BA0.2mg/L；VI、MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+100mg/L肌醇+6-BA 0.3mg/L。
I、MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA 0.1mg/L+IAA 0.2mg/L：接种4天时，观察发现所有茎段上有褐色或绿色小芽出现；10天左右，可以看出，小芽已明显长成很小的不定芽，并无愈伤生成，但大多已经明显有玻璃化倾向；两个月后，几乎所有茎段分化的不定芽均严重玻璃化，叶片肥厚，水分含量大，后期生长停滞。
II、MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.1mg/L+IAA0.4mg/L：通过增加IAA浓度的方式，达到降低6-BA在培养基中激素比例的目的，茎段诱导分化出的不定芽仍然严重玻璃化，不定芽后期停止长大。
III、MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.05mg/L+IAA0.2mg/L：将6-BA浓度由0.1mg/L降低至0.05mg/L的方式，达到降低6-BA浓度，相应增加IAA比例的目的；10天时观察，发现所有茎段表面分化出的不定芽小叶正常，后期的30天以及45天两个时间段观察发现，不定芽与前期相比，大小保持在刚分化状态，生长缓慢，但不玻璃化。
IV、MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+100mg/L肌醇+6-BA 0.1mg/L：8天左右，芽点已继续分化为小的成形的不定芽，所有基因型也无玻璃化出现，培养基稳定，后期可以长成正常的丛生芽。
V、MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+100mg/L肌醇+6-BA0.2mg/L：能诱导出不定芽，但又都存在不同程度的玻璃化现象，因此，茎段诱导分化培养基不稳定。
VI、MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+100mg/L肌醇+6-BA0.3mg/L：能诱导出不定芽，但又都存在不同程度的玻璃化现象，茎段诱导分化培养基不稳定。
2)结果讨论：
在6-BA 0.1mg/L+IAA 0.2mg/L组合中，十天左右开始有芽点长出，但已经明显有玻璃化倾向，叶片肥厚，水分含量大，后期生长停滞不前，许多研究中均提到细胞分裂素6-BA是极其容易导致玻璃化的激素，且浓度越高玻璃化越严重，因此，解除玻璃化可以采取降低6-BA浓度的方法，使其浓度不过高；此外，解除玻璃化还可以通过增加蔗糖浓度，降低培养基的渗透压，来达到减少植株吸收水分减轻玻璃化的目的；适当提高琼脂含量，减少培养基含水量，也可减轻甚至解除玻璃化；
因此，针对培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA 0.1mg/L+IAA 0.2mg/L中存在的玻璃化问题，本研究过程中相应的采取了以下五种措施：
①降低6-BA(由0.1mg/L降至0.05mg/L)浓度，其他成分不变；②IAA浓度由0.2增加到0.4mg/L，6-BA浓度不变，从而提高IAA的相对比例，其他成分不变；③增加蔗糖浓度(由30g/L增加到45g/L)，其他成分不变；④增加琼脂浓度(6g/L增加到7.5g/L)，其他成分不变；⑤同时增加两者浓度(30g/L蔗糖+6g/L琼脂改为45g/L蔗糖+7.5g/L琼脂)，其他成分不变。
结果显示：采用降低6-BA浓度的方法一定程度上对玻璃化的减轻有一定效果，但是，茎段诱导分化产生芽的时间明显延迟，并且，芽后期很难继续长大；而其他四种措施对茎段诱导丛生芽玻璃化问题均无得到缓解甚至玻璃化加重；因此，该6-BA和IAA激素浓度组合并不适合作为茎段诱导分化培养基的选择。
分别单独添加0.2mg/L6-BA和0.3mg/L6-BA的情况下，均能诱导出不定芽，但又都存在不同程度的玻璃化现象，培养基不稳定。
0.1mg/L 6-BA时，8天左右，有芽点长出，没有愈伤，也无玻璃化问题，培养基稳定，重复性好，因此，该浓度适合茎段诱导丛生芽，培养基条件为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+肌醇100mg/L+6-BA0.1mg/L。
(3)生根培养基的筛选：
1)方法：利用步骤(2)得到的2cm左右的嫩芽诱导生根，选取生长一致的种源和株系，逐步设计生根培养基；培养基条件及激素种类和梯度设置为：I、1/2MS+蔗糖30g/L+植物凝胶(1.5-2.5g/L)+IBA0.6mg/L+NAA0.4mg/L；II、1/2MS+蔗糖30g/L+植物凝胶(1.5-2.5g/L)IBA(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/L)；III、1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g+IBA1mg/L；IV、1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g+IBA(0.1、0.2、0.25mg/L)。
I、1/2MS+蔗糖30g/L+植物凝胶(1.5-2.5g/L)+IBA 0.6mg/L+NAA0.4mg/L组合，在接种20天时统计，如下表1所示，所有的黑果枸杞植株基部只膨大，不生根。
表1
| 种源 | 接种个数 | 生根率(％) | 生长状态 |
| AKS-L3(阿克苏株系3) | 24 | 0 | 只长愈伤不生根 |
| SY(沙雅) | 24 | 0 | 只长愈伤不生根 |
| DGL(大格勒) | 24 | 0 | 只长愈伤不生根 |
| KEL(库尔勒) | 24 | 0 | 只长愈伤不生根 |
| AKS-L1(阿克苏株系1) | 24 | 0 | 只长愈伤不生根 |
II、对于1/2MS+蔗糖30g/L+植物凝胶(1.5-2.5g/L)+IBA(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/L)，在添加不同浓度梯度IBA(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/L)做诱导激素的情况下，以阿克苏株系1AKS-L1(阿克苏)、阿克苏株系3AKS-L3以及SY(沙雅)、DGL(大格勒)种源为材料，10天后统计生根情况，如下表2所示，接种的所有茎段只有在个别IBA浓度下生根，且生根率都不高，茎段基部有膨大成的愈伤组织。大部分都还没生根，茎段基部只膨大长成愈伤。30天后再统计，发现在培养期间只有个别浓度个别株有新生根，具有明显的偶然性。0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/L IBA浓度下，此时的生根率依次为8.33％、4.16％、4.16％、4.16％、4.16％、25％。总的来说在这几类培养基条件下黑果枸杞生根启动时间明显延迟，即使生根，数量也稀少。因此，影响生根的可能的因素仍需要进一步深入探究。
表2
III、1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g+IBA1mg/L组合，第13天时统计生根率，如下表3所示，各种源或同一种源的不同株系无菌苗均有生根，但生根率不高，在12％-30％之间。
表3
| 种源 | 接种个数 | 生根率(％) | 生长状况 |
| AKS-L1 | 24 | 25.00 | 根3-4条，根长2mm左右 |
| AKS-L2 | 24 | 8.30 | 根长1-2cm，3-4条 |
| AKS-L3 | 24 | 12.50 | 根3-4条，根长2mm左右 |
| AKS-L7 | 24 | 29.17 | 根3-4条，根长2mm左右 |
| DGL | 24 | 6.67 | 根3-4条，根长2mm左右 |
| SY | 24 | 20.00 | 根长1cm左右，3-4条 |
IV、1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g+IBA(0.1、0.2、0.25mg/L)三种组合下，将生长健壮的不定芽移栽至新的诱导生根培养基中，培养过程中共观察发现植株地上部分开始逐渐长高，第5天从植株底部也开始生根；第14天统计生根情况，如下表4、表5及表6所示，接种的几个种源植株均生根，根长在0.2cm-1cm不等。第21天时，根明显伸长，且有明显的根毛。无论0.1mg/L IBA(表4)、0.2mg/L IBA(表5)还是0.25mg/L IBA(表6)的情况下，各种质苗茎段基部均没有膨大，直接生根，但相比较而言，IBA含量为0.25mg/L时生根率更高，效果更好，且生根早，5天左右即开始生根，20天后，几乎所有接种茎段均能生根。
表4
表5
| 种源 | 接种个数 | 生根率(％) | 生长状况 |
| ALS | 24 | 80 | 基部无膨大，根3‐5条，根长2mm左右 |
| SY | 24 | 75 | 基部无膨大，根3‐5条，根长1cm左右 |
| BC | 24 | 80 | 基部无膨大，根长2mm‐1cm不等 |
| AKS‐L3 | 24 | 100 | 基部无膨大，根4‐6条，根长1cm左右 |
表6
| 种源 | 接种个数 | 生根率(％) | 生长状况 |
| ALS | 24 | 83 | 基部无膨大，根3‐5条，根长2－5mm |
| SY | 24 | 80 | 基部无膨大，根3‐5条，根长1cm左右 |
| BC | 24 | 92 | 基部无膨大，根长0.5‐1cm |
| AKS‐L3 | 24 | 100 | 基部无膨大，根4‐6条，根长1cm左右 |
2)结果讨论：
为方便观察生根情况，最先选用透明植物凝胶作为MS培养基中的凝固剂，在已有文献报道的生根培养基激素组合IBA0.6mg/L+NAA0.4mg/L的基础上，对不同种源嫩茎段进行生根培养，结果观察到，IBA0.6mg/L+NAA0.4mg/L组合在接种20天时，几乎所有种源的黑果枸杞植株基部只膨大，不生根；然后，仍以植物凝胶做凝固剂，以不同浓度梯度IBA(0.2、0.25、0.4、0.5、0.75、0.8mg/L)做诱导激素继续摸索诱导生根的条件，结果显示，设置不同浓度IBA梯度后，依然是大多数只出现基部膨大，少数种源可以生根，但带有偶然性，根的数量也稀少。
针对茎段基部只膨大不生根的问题，推断一种可能性是培养基中使用的植物凝胶影响了培养基的凝固状态，从而影响到植株生根。因此，改用琼脂粉代替植物凝胶，仍然只用IBA激素，参照已有文献，扩大IBA浓度至1mg/L，结果显示，各种源均有不同比率的生根(如表3所示)，为12％-30％之间，但生根率很低。研究表明，较低浓度IBA对植株有一定的诱导作用，因此，又以IBA0.1mg/L、IBA0.2mg/L和IBA0.25mg/L三个浓度作为比较，在三种情况下，各种源均可以在茎段基部直接生根，且生根率较高，IBA含量为0.25mg/L时生根率更高(表6)，且生根更早，5天左右即开始生根，20天后各种源接种茎段生根率均接近100％，说明使用IBA0.25mg/L诱导生根效果更好，因此具有不同种源诱导生根普适性的培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+IBA0.25mg/L。
本发明的有益效果：
(1)现有技术中，研究都是针对特定种源的黑果枸杞种质或某特定种，如大果黑果枸杞进行无菌快繁培养基的筛选，因不同种源之间基因型差异较大，一种类型的培养基可能并不一定适合所有来源及基因型的黑果枸杞；给黑果枸杞的组织培养生产带来了不便，本发明选取不同种源地优良种质黑果枸杞种子经无菌消毒后灭菌，获得的不同种质不同基因型无菌苗，利用其茎段进行各阶段培养基配方的筛选，更具有说服力。
(2)与现有技术相比，本发明的目的不同，高效培养体系的建立过程也不同，本发明通过条件摸索，是利用茎段直接获取丛生芽，最后诱导生根，高效快捷。
(3)已有文献信息显示，黑果枸杞组织培养中普遍存在的玻璃化的现象并未得到很好的解决，这给实际生产带来了困难。本发明得到的黑果枸杞组织培养快速繁殖大大降低了丛生芽的玻璃化概率，基本解决了玻璃化现象。
(4)组织培养体系建立的过程中，激素的选择起至关重要的作用。根据已经发表的研究报告，发现黑果枸杞各阶段培养基的筛选中，即使使用同一种激素得到激素的最适宜浓度不一样，缺乏重复性。本发明综合了这些研究结果，在深入研究的基础上验证了部分结论，增强了其可靠性。
(5)针对特定激素比如细胞分裂素ZT，生长素IAA，存在不耐高温、易分解、不稳定、配制培养基过程中，需要过滤灭菌的缺点，会给实际生产带来不便的问题。本发明选择了几种灭菌过程简单、使用方便，效果明显的几种植物激素。
(6)本发明解决诱导生根过程中茎段仅仅基部只膨大或大部分膨大，影响正常生根的问题。
以上所述实施例的各技术特征可以任意组合，为使描述简洁，未对以上所述实施例的各技术特征所有可能的组合进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不矛盾，都应该被认为是本说明书记载的范围。
Claims (2)
1.一种适用于不同种源的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，其步骤如下：
(1)无菌苗制备：收集不同种源的黑果枸杞种子，消毒处理后，接种于MS培养基上，长出的小苗待用；
(2)嫩茎段诱导不定芽分化培养基的筛选：利用茎段诱导丛生芽中激素种类及梯度设置，进行嫩茎段诱导不定芽的分化培养，筛选培养基条件，得到嫩芽，其中，所述培养基条件为MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+肌醇100mg/L+6-BA0.1mg/L；
(3)生根培养基的筛选：
利用步骤(2)得到的嫩芽进行诱导生根，设计生根培养基，筛选培养基条件，其中，所述培养基条件为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+IBA0.25mg/L。
2.根据权利要求1所述的黑果枸杞的高效快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述消毒处理的具体过程如下：放进2mL 离心管后，先用75％酒精消毒30秒，蒸馏水冲洗2-3次，然后用70％的84消毒液消毒6分钟，蒸馏水再冲洗3-4次，吸干水分后，用杀过菌的镊子接种于MS培养基上。
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