CN111226797A - 一种黑果枸杞组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黑果枸杞组织培养方法，涉及苗木快繁技术领域；所述方法以种子萌发后形成的子叶和/或胚轴为外植体进行组织培养。利用本发明所述方法，诱导培养30d后可得胚性愈伤组织，诱导率达100％；将所述愈伤组织转移进行继代培养和不定芽诱导，所述愈伤组织每30d可继代一次，不定芽诱导率可达100％，增殖系数为15～20；切取生长健壮的不定芽进行生根培养，生根率可达100％，平均根数16.7条/株。
Description
技术领域
本发明属于苗木快繁技术领域，具体涉及一种黑果枸杞组织培养方法。
背景技术
黑果枸杞(LyciumRuthenicum Murr)，为茄科(Solanceae)枸杞属多年生多棘刺灌木植物，是重要的抗旱、抗盐碱沙漠先锋树种之一，其在我国西藏、宁夏贺兰山、青海东部、陕西北部、新疆北部、内岭、河床沙滩等条件相当恶劣的环境中皆有零星分布。
野生黑枸杞是有效的天然抗氧化剂，具有超强的增强免疫力、延缓衰老的滋补作用，且还含有大量的维生素和矿物质等营养成分，导致黑果枸杞的价格一直较高，所以近年来，黑果枸杞的栽培种植日益广泛。然而目前黑果枸杞苗木市场仍以种苗为主，但种苗价格较高，且很难完全保持亲本的优良性状。
诚然在现有专利中也有涉及到黑果枸杞再生苗的培育方法，如中国专利文献CN105850733A何CN105815221A等，但是目前的快繁培育方案均存在周期长，不定芽诱导率低和增殖系数低等缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黑果枸杞组织培养方法，提高黑果枸杞组培时的愈伤组织诱导率、不定芽诱导率、生根率，同时还能提高增殖系数。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种黑果枸杞组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将消毒的黑果枸杞种子接种于萌发培养基上进行萌发培养，得萌芽；所述萌发培养基包括MS培养基；
(2)以所述萌芽的子叶和/或胚轴为外植体，将所述外植体接种至诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA0.5～1.0mg/L、NAA0.2～0.5mg/L、蔗糖25～30g/L和琼脂5.5～5.8g/L；
(3)将所述愈伤组织接种至继代培养基上进行继代和不定芽诱导，得不定芽；所述继代培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA 0.3～0.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30gL和琼脂5.5～5.8g/L；
(4)将所述不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得黑果枸杞组培苗；所述生根培养基以WPM为基本培养基，还包括：IBA 0.3～0.5mg/L、蔗糖20～30g/L和琼脂5.6～6.0g/L。
优选的，步骤(1)所述黑果枸杞种子的处理方法，包括：将采集后风干、贮存在4℃冷藏条件下的黑果枸杞果实用清水浸泡，充分揉搓果实直至果肉与种子分离，用清水漂洗数次。
优选的，步骤(1)所述消毒包括：用体积百分含量为70％的乙醇水溶液消毒30s，无菌水漂洗3次；再用质量百分含量为0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次。
优选的，步骤(1)所述萌发培养的温度为25±1℃，湿度为40～50％，光照时间为13h/d。
优选的，步骤(2)所述外植体的长度为0.5～0.6cm。
优选的，步骤(2)所述诱导培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃，湿度为40～50％。
优选的，步骤(3)所述继代和不定芽诱导的温度为25±1℃，湿度为40～50％，光照时间为13h/d。
优选的，步骤(4)所述不定芽的高度为2～3cm。
优选的，步骤(4)生根培养的温度为25±1℃，湿度为40～50％，光照时间为13h/d。
优选的，在得到所述黑果枸杞组培苗后，还包括在根长2～3cm时进行炼苗和移栽。
本发明提供了一种黑果枸杞组织培养方法，以种子萌发后形成的子叶和/或胚轴为外植体进行组织培养。利用本发明所述诱导培养基进行诱导培养30天，外植体就会完全脱分化成结构致密，呈乳白色的胚性愈伤组织，诱导率达100％；将所述愈伤组织转移在继代培养基中进行继代培养和不定芽诱导，所述愈伤组织每30d可继代一次，不定芽诱导率可达100％，增殖系数为15～20；切取生长健壮的不定芽进行生根培养，生根率可达100％，平均根数16.7条/株。
附图说明
图1为黑果枸杞种子萌芽状；
图2为以子叶为外植体进行愈伤组织诱导图；
图3为以胚轴为外植体进行愈伤组织诱导图；
图4为以胚轴为外植体诱导出的愈伤组织；
图5为以子叶为外植体诱导出的愈伤组织；
图6为愈伤组织诱导得到的不定芽；
图7为不定芽生根状；
图8为得到的黑果枸杞组培苗。
具体实施方式
本发明提供了一种黑果枸杞组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将消毒的黑果枸杞种子接种于萌发培养基上进行萌发培养，得萌芽；所述萌发培养基包括MS培养基；
(2)以所述萌芽的子叶和/或胚轴为外植体，将所述外植体接种至诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA 0.5～1.0mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、蔗糖25～30g/L和琼脂5.5～5.8g/L；
(3)将所述愈伤组织接种至继代培养基上进行继代和不定芽诱导，得不定芽；所述继代培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA 0.3～0.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30gL和琼脂5.5～5.8g/L；
(4)将所述不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得黑果枸杞组培苗；所述生根培养基以WPM为基本培养基，还包括：IBA 0.3～0.5mg/L、蔗糖20～30g/L和琼脂5.6～6.0g/L。
本发明将消毒的黑果枸杞种子接种于萌发培养基上进行萌发培养，得萌芽；所述萌发培养基包括MS培养基。本发明所述黑果枸杞种子的处理方法，优选包括：将采集后风干、贮存在4℃冷藏条件下的黑果枸杞果实用清水浸泡，充分揉搓果实直至果肉与种子分离，用清水漂洗数次。本发明所述贮藏的时间优选为15～20h。本发明将所述种子消毒后进行萌发培养，所述消毒优选包括：用体积百分含量为70％的乙醇水溶液消毒30s，无菌水漂洗3次；再用质量百分含量为0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次。本发明所述萌发培养的温度优选为25±1℃，湿度优选为40～50％，光照时间优选为13h/d，光照度优选为2000～3000lux。本发明所述萌发培养的时间优选为15d。
得萌芽后，本发明以所述萌芽的子叶和/或胚轴为外植体，将所述外植体接种至诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.5g/L。本发明优选待所述萌芽长出两片子叶但真叶尚未长出时，切取子叶和/或胚轴作为外植体进行所述诱导培养。本发明以子叶作为外植体时，优选的切除两端，长度保留0.5～0.6cm；以胚轴为外植体时，优选将胚轴切成数段，每段0.5～0.6cm。本发明所述诱导培养优选为暗培养，所述暗培养的温度优选为25±1℃，湿度优选为40～50％。利用本发明所述条件，经过30d的诱导培养，外植体就会完全脱分化成结构致密、呈乳白色的胚性愈伤组织，愈伤组织诱导率达100％。
得愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织接种至继代培养基上进行继代和不定芽诱导，得不定芽；所述继代培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30gL和琼脂5.5g/L。本发明所述继代和不定芽诱导可同时进行，所述继代和不定芽诱导的温度优选为25±1℃，湿度为40～50％，光照时间为13h/d。本发明所述光照时的光照度优选为2000-3000lux。本发明所述愈伤组织的继代周期为3～5d。本发明在所述继代培养基上进行培养30天后，继续在同一条件下继续培养，直至长出不定芽，不定芽诱导率可达100％，增殖系数为15～20。
得不定芽后，本发明将所述不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得黑果枸杞组培苗；所述生根培养基以WPM为基本培养基，还包括：IBA0.5mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L。在本发明中，优选待不定芽长至2～3cm时，切取生长健壮的不定芽进行生根培养。本发明所述生根培养的温度优选为25±1℃，湿度优选为40～50％，光照时间优选为13h/d，光照度优选为2000～3000lux。本发明在所述生根培养10d左右，开始长出不定根，30d后，不定根可长至2～3cm，即可进行炼苗和移栽。本发明对所述炼苗和移栽的方法以及管理并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的黑果枸杞组织培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、初代培养
1、外植体的培养
将采集后风干、贮存在4℃冷藏条件下的黑果枸杞种子用清水浸泡，充分揉搓果实直至果肉与种子分离，用清水漂洗数次，直至清除所有杂质。将纯净的种子在超净工作台上转移至灭过菌的容器内，用70％酒精消毒30s，无菌水漂洗3次；再用0.1％升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次。
将消过毒的种子接种在事先配制好的不含任何激素的MS培养基上，在13/11h光照条件下，温度25±1℃，湿度为40～50％的条件下培养。15d后，待种子发芽，长出两片子叶但真叶尚未长出时(图1)，切取子叶和胚轴作为外植体进行愈伤组织诱导。
2、愈伤组织诱导
切取子叶(图2)和胚轴(图3)作为初代培养的外植体。子叶切除两端，长度保留0.5～0.6cm，胚轴切成数段，每段0.5～0.6cm，接种在事先配制好的愈伤组织诱导培养基上。培养基配方为WPM+6-BA 0.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L。愈伤组织诱导率可达100％。
将接好外植体的培养瓶置于温度25±1℃，湿度为40-50％的条件下暗培养。30d后，外植体就会完全脱分化成结构致密，呈乳白色的胚性愈伤组织(图4和图5)，即可进行下一步继代培养和不定芽诱导。
二、继代培养和不定芽诱导
将初代培养后形成的愈伤组织转移在继代培养基中进行继代培养和不定芽诱导，继代培养基为WPM+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30gL+琼脂5.5g/L。不定芽诱导率可达100％，增殖系数为15～20。
将转接好的继代培养瓶置于光照13h/黑暗11h，温度25±1℃，湿度40～50％的条件下培养。30d后，继续在同一条件下继续培养，直至长出不定芽(图6)。愈伤组织培养周期为3～5d。
三、生根培养
待不定芽长至2～3cm时，切取生长健壮的不定芽进行生根培养。不符合生根条件的不定芽，继续在继代培养基中培养。生根培养基为WPM+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.6g/L，生根率可达100％，平均根数16.7％。接种10d左右，开始长出不定根，30d后，不定根可长至2～3cm(图7)，即可对得到的组培苗(图8)进行练苗移栽。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种黑果枸杞组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将消毒后的黑果枸杞种子接种于萌发培养基上进行萌发培养，得萌芽；所述萌发培养基包括MS培养基；
(2)以所述萌芽的子叶和/或胚轴为外植体，将所述外植体接种至诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA 0.5～1.0mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、蔗糖25～30g/L和琼脂5.5～5.8g/L；
(3)将所述愈伤组织接种至继代培养基上进行继代和不定芽诱导，得不定芽；所述继代培养基以WPM为基本培养基，还包括：6-BA 0.3～0.5mg/L、NAA 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30gL和琼脂5.5～5.8g/L；
(4)将所述不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得黑果枸杞组培苗；所述生根培养基以WPM为基本培养基，还包括：IBA 0.3～0.5mg/L、蔗糖20～30g/L和琼脂5.6～6.0g/L。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述黑果枸杞种子的处理方法，包括：将采集后风干、贮存在4℃冷藏条件下的黑果枸杞果实用清水浸泡，充分揉搓果实直至果肉与种子分离，用清水漂洗数次。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述消毒包括：用体积百分含量为70％的乙醇水溶液消毒30s，无菌水漂洗3次；再用质量百分含量为0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述萌发培养的温度为25±1℃，湿度为40～50％，光照时间为13h/d。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述外植体的长度为0.5～0.6cm。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃，湿度为40～50％。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述继代和不定芽诱导的温度为25±1℃，湿度为40～50％，光照时间为13h/d。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述不定芽的高度为2～3cm。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)生根培养的温度为25±1℃，湿度为40～50％，光照时间为13h/d。
10.根据权利要求1或9所述方法，其特征在于，在得到所述黑果枸杞组培苗后，还包括在根长2～3cm时进行炼苗和移栽。
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