CN110367121B - 一种金果榄雌株脱毒苗培养方法 - Google Patents

一种金果榄雌株脱毒苗培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金果榄雌株脱毒苗培养方法，包括以下步骤：包括以下步骤：金果榄雌株的选择、金果榄雌株茎尖表面消毒、金果榄雌株茎尖剥离、病毒检测与脱毒株系建立、金果榄雌株脱毒苗的快速繁殖、金果榄雌株脱毒苗驯化培养。本发明选择金果榄雌株作为采集对象，驯化获得的均是脱毒金果榄雌株，种植后都会开花结果；采用的是植株茎尖生长点分生组织，该部位细胞含病毒较少或不含病毒，并经过病毒检测合格，所生产的苗株是不含病毒的，可恢复植物原有性状，显著提高金果榄的块茎品质、产量，降低病虫害带来的种植风险；本发明利用植物细胞的全能性，通过本发明的扩繁培养方法建立了一个完整的无菌繁殖系统，大大提高育苗产量和品质。

Description

一种金果榄雌株脱毒苗培养方法
技术领域
本发明涉及植物栽培技术领域，具体涉及一种金果榄雌株脱毒苗培养方法。
背景技术
金果榄为青牛胆属常绿缠绕藤本植物，主产于四川、湖南、广西、湖北、贵州等地，具有清热解毒、利咽止痛的功效，内服主治各种炎症，如咽喉肿疼、扁桃体炎，急性肠胃炎、痈疽疗毒、泄泻、痢疾脘腹热痛等。外用制膏、磨汁涂擦或研末调抹，用于治疗静脉炎、毒蛇咬伤等症。金果榄块根含掌叶防己碱(Palmatine)防已内酯（columbin），异防已内酯（isocolumbin），药根碱（jatrrhizine），金果榄甙（tinoside）。根含掌叶防已碱，药根碱，非洲防已碱（coumbamine），千金藤宁碱（stepharanine），去氢分离木瓣树胺（dehydrodiscretamine），蝙蝠葛任碱（menisperine），木兰花碱（magnoflorine），2-脱氧-甲壳甾酮（2-deoxycrustecdysone），2-脱氧-3-表甲壳甾酮（2-deoxy-3-epicrustecdysone），2-去氧甲壳壳甾酮-3-0-β吡喃葡萄糖甙（2-deoxycrustecdysone-3-O-β-glucopyra-noside），民间广泛用于治疗胃病。现代药理学研究表明，金果榄具有明显的抗炎镇痛、抗菌、抗肿瘤、降血压、应急解毒等作用，被喻为可替代抗生素的天然药物。
在实现本发明的过程中，发明人发现：
由于掠夺式采挖，金果榄野生资源濒危灭绝，同时在利益驱使下，金果榄藤茎也遭到灭绝式砍伐用于扦插育苗，特别是赖以快速繁殖的金果榄雌株（种子繁殖，金果榄属于雌雄异株，野生状况下雌雄比约1:50）也遭到灭顶之灾。
目前，在现有技术中对于金果榄育苗繁殖方面研究较多，多采用块茎繁殖、扦插繁殖、种子繁殖、组织培养诱导丛生芽繁殖等。金果榄属于多年生藤本块茎植物，由于病毒的长期积累，植株的病虫害会不断上升，生长状态和产量会不断下降，给种植户带来巨大损失。
发明内容
本发明目的是为了解决金果榄资源短缺，及现有人工育苗繁殖技术中存在的未根除病毒导致成活率低的问题，提供一种金果榄雌株脱毒苗培养方法。
为此本发明的技术方案为：一种金果榄雌株脱毒苗培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1）金果榄雌株的选择：金果榄雌株选择野生状态下，采集前2-3年开花结果正常，植株健壮，无病虫害的金果榄雌株作为材料采集对象；采集时间选择在每年3-6月，植株开花前，挑选主茎或侧茎生长旺盛的茎尖作为外植体；
2）金果榄雌株茎尖表面消毒：采集来的茎尖剪取茎尖1-1.5厘米，自来水添加洗洁精清洗表面附着脏物，用自来水流水冲洗10分钟，用0.3%新洁尔灭溶液浸泡表面杀菌20分钟，纯净水流水冲洗2小时，移入事先准备好的超净工作台备用；在超净工作台内先用75%酒精浸泡外植体30秒，无菌水冲洗2次，然后置于0.1%氯化汞溶液中浸泡15-20分钟，用无菌水冲洗3-5次取出放置在无菌滤纸上吸干表面水分备用；
3）金果榄雌株茎尖剥离：在已灭好菌的超净工作台内，在解剖显微镜下剥取金果榄茎尖带1-2个叶原基的约0.15-0.2mm生长点，将剥离下茎尖接种于快速生长1号培养基上培养45天获得完整金果榄雌株；
4）病毒检测与脱毒株系建立：将步骤3）获得的完整植株采用ELISA法进行病毒检测，检测合格后，将合格植株接入诱导培养基以建立脱毒金果榄雌株株系；
5）金果榄雌株脱毒苗的快速繁殖：病毒检测合格后，将步骤4）中获得的合格脱毒植株控制适宜的温度、湿度、光照进行扩繁；
将合格脱毒植株茎尖接种于愈伤组织诱导2号培养基上培养45天获得愈伤组织；
将愈伤组织切成0.5X0.5mm小块接种于继代增殖3号培养基培养45天，形成大量原球茎；
将原球茎接种于不定芽分化4号培养基培养60天（根据需要可增加不定芽增殖继代次数），可获得大量脱毒金果榄无根苗；
将不定芽接种于生根5号培养基培养80天，可获得已生长3-5条根的完整金果榄脱毒雌株；
6）金果榄雌株脱毒苗驯化培养：将上述5）培养的金果榄雌株脱毒瓶苗移入遮阴度75%的大棚炼 苗，先将组培瓶苗移入大棚缓苗5天，逐步开取瓶盖让组培苗适应大棚环境2天，加入清水用镊子轻轻取出瓶苗，栽植于已配置好的炼 苗培养基上，按照行距株距10cmX10cm定植，浇足定根水，常规化培养90天，即得金果榄雌株脱毒驯化苗。
作为优选，
步骤3）中快速生长1号培养基的成分为：MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.1-0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8；
步骤5）中愈伤组织诱导2号培养基的成分为：MS+6-BA1-1.5mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+TDZ0.1-0.25mg/L+GA30.5-1mg/L+PVP0.05%，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，PH值4.5；
步骤5）中继代增殖3号培养基的成分为：MS+6-BA1-3mg/L+NAA0.3-0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值4.5；
步骤5）中不定芽分化4号培养基的成分为：MS+6-BA0.5-1mg/L+TDZ3-4mg/L+NAA0.1-0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8；
步骤5）中生根5号培养基的成分为：1/2MS+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.5-1mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8。
作为优选，步骤5）中控制适宜的温度为23-25℃，湿度60-80%，光照1500-2000Lux，每天光照10-12小时。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优势在于：
1、本发明培育的全部是金果榄脱毒雌株，种植户种植五年后就会开花结果，有了种子就可以轻易繁殖大量优质金果榄幼苗，以缓解因种苗短缺造成药材供需矛盾，给种植户带来可观的经济效益；
2、本发明生产的是金果榄雌株脱毒苗，所采用的是植株茎尖生长点分生组织（生长点），不仅生长速度快，繁殖率高、该部位细胞含病毒较少或不含病毒，并经过病毒检测合格，所生产的苗株是不含病毒的，可恢复植物原有性状，显著提高金果榄的块茎品质、产量，降低病虫害带来的种植风险，进而提高种植户的经济效益；
3、本发明利用植物细胞的全能性，通过本发明的培养方法建立了一个完整的无菌繁殖系统，采用挑选茎尖作为外植体、表面消毒处理、对茎芽进行剥离获得金果榄雌株、再通过金果榄雌株获得愈伤组织、形成大量原球茎、再进行不定芽分化等扩繁步骤，可以获得大量的脱毒金果榄雌株，这是现有技术中通过金果榄幼嫩带腋芽茎段诱导丛生芽、再获得新植株的数量所无法相比的，本发明大大提高了育苗产量和品质。
附图说明
图1是本发明中筛选的野生金果榄雌株图片。其中：
图1（a）是野生金果榄雌株开花中的图片；
图1（b）是野生金果榄雌株结果中的图片；
图1（c）是成熟中野生金果榄种子的图片；
图1（d）是成熟中野生金果榄种子的图片；
图2是本发明的金果榄雌株茎尖脱毒培育的图片。
图3是本发明的经病毒检测完金果榄愈伤组织增殖培养的图片。
图4是本发明的金果榄脱毒雌株原球茎增殖中的图片。
图5是本发明的金果榄雌株幼苗生根中的图片。
图6是本发明的金果榄雌株脱毒苗大棚驯化中的图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但实施例不应理解为对本发明的限制。
实施例一：
一种金果榄雌株脱毒苗培养方法，包括以下步骤：
1）金果榄雌株的选择：金果榄雌株选择野生状态下，采集前2-3年开花结果正常，植株健壮，无病虫害的金果榄雌株作为材料采集对象；采集时间选择在每年3-6月，植株开花前，挑选主茎或侧茎生长旺盛的茎尖作为外植体；
2）金果榄雌株茎尖表面消毒：采集来的茎尖剪取茎尖1-1.5厘米，自来水添加洗洁精清洗表面附着脏物，用自来水流水冲洗10分钟，用0.3%新洁尔灭溶液浸泡表面杀菌20分钟，纯净水流水冲洗2小时，移入事先准备好的超净工作台备用。在超净工作台内先用75%酒精浸泡外植体30秒，无菌水冲洗2次，然后置于0.1%氯化汞溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗3-5次取出放置在无菌滤纸上吸干表面水分备用。
3）金果榄雌株茎尖剥离：在已灭好菌的超净工作台内，在解剖显微镜下剥取金果榄茎尖带1-2个叶原基的约0.15-0.2mm生长点，将剥离下茎尖接种于快速生长1号培养基上，快速生长1号培养基的成分为：MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8，培养45天获得完整金果榄雌株。
4）病毒检测与脱毒株系建立：将步骤3）获得的完整植株采用ELISA法进行病毒检测，检测合格后，将合格植株接入诱导培养基以建立脱毒金果榄雌株株系。
5）脱毒苗的快速繁殖：病毒检测合格后，将步骤3）中获得的合格脱毒植株控制适宜的温度、湿度、光照进行扩繁：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
将合格脱毒植株茎尖接种于愈伤组织诱导2号培养基上，愈伤组织诱导2号培养基的成分为：MS+6-BA1mg/L+IBA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+GA31mg/L+PVP0.05%，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，pH值4.5，培养45天，获得愈伤组织；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
将愈伤组织切成0.5X0.5mm小块接种于继代增殖3号培养基上，继代增殖3号培养基的成分为：MS+6-BA2mg/L+NAA0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，马铃薯汁100g/L，PH值4.5。培养45天，形成大量原球茎；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
将原球茎接种于不定芽分化4号培养基上，该培养基的成分为：MS+6-BA1mg/L+TDZ3mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8，培养60天（根据需要可增加不定芽增殖继代次数），可获得大量脱毒金果榄无根苗；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
将不定芽接种于生根5号培养基上，该培养基的成分为：1/2MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8，培养80天，可获得已生长3-5条根的完整金果榄脱毒雌株。
6）金果榄雌株脱毒苗驯化培养：将上述5）培养的金果榄雌株脱毒瓶苗移入遮阴度75%的大棚炼 苗，先将组培瓶苗移入大棚缓苗5天，逐步开取瓶盖让组培苗适应大棚环境2天，加入清水用镊子轻轻取出瓶苗，栽植于已配置好的炼 苗培养基上，按照行距株距10cmX10cm定植，浇足定根水，常规化培养90天，即得金果榄雌株脱毒驯化苗。
实施例二：
与实施例一相比，步骤2）中将外植体置于0.1%氯化汞溶液中浸泡的时间为20分钟。
实施例三：
与实施例一相比，步骤2）中将外植体置于0.1%氯化汞溶液中浸泡的时间为18分钟。
下面通过以采用常规75%酒精浸泡外植体30秒消毒、冲洗后再进行茎尖剥离后无菌接种作为对照组，与采用本发明的三个实施例脱毒处理过的金果榄雌株驯化情况进行对照，每组脱毒处理为100瓶，将对照组和三个实施例的脱毒种苗分别移栽到大棚驯化，在相同条件下作对比实验，得到的结果如下：
组别 项目 茎尖成活率 繁殖系数脱毒率 驯化成活率
对照组1 0 0 0
实施例一 78 83.5 98.3
实施例二 62 80.2 97.8
实施例三 70 82.1 97.5
由上表结果可得，与对照组相比较，本发明的茎尖脱毒方法，能显著增加金果榄雌株茎尖的成活率，提高脱毒率和移栽成活率，其中以实施例一的效果最佳，特别适用于金果榄雌株快速繁殖的需求。
本发明的核心在于：1）选择金果榄雌株作为采集对象，驯化获得的均是脱毒金果榄雌株，种植后都会开花结果；2）采用的是植株茎尖生长点分生组织，该部位细胞含病毒较少或不含病毒，并经过病毒检测合格，所生产的苗株是不含病毒的，可恢复植物原有性状，显著提高金果榄的块茎品质、产量，降低病虫害带来的种植风险；3）本发明利用植物细胞的全能性，通过本发明的扩繁培养方法建立了一个完整的无菌繁殖系统，利用脱毒茎尖分生组织诱导愈伤组织形成大量原球茎，进而分化成新植株，大大提高育苗产量和品质，有别于目前技术通过茎尖直接诱导丛生芽获得新植株。
本说明书中未作详细说明之处，为本领域公知的技术。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种金果榄雌株脱毒苗培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1）金果榄雌株的选择：金果榄雌株选择野生状态下，采集前2-3年开花结果正常，植株健壮，无病虫害的金果榄雌株作为材料采集对象；采集时间选择在每年3-6月，植株开花前，挑选主茎或侧茎生长旺盛的茎尖作为外植体；
2）金果榄雌株茎尖表面消毒：采集来的茎尖剪取茎尖1-1.5厘米，自来水添加洗洁精清洗表面附着脏物，用自来水流水冲洗10分钟，用0.3%新洁尔灭溶液浸泡表面杀菌20分钟，纯净水流水冲洗2小时，移入事先准备好的超净工作台备用；在超净工作台内先用75%酒精浸泡外植体30秒，无菌水冲洗2次，然后置于0.1%氯化汞溶液中浸泡15-20分钟，用无菌水冲洗3-5次取出放置在无菌滤纸上吸干表面水分备用；
3）金果榄雌株茎尖剥离：在已灭好菌的超净工作台内、在解剖显微镜下剥取金果榄茎尖带1-2个叶原基的0.15-0.2mm生长点，将剥离下茎尖接种于快速生长1号培养基上培养45天获得完整金果榄雌株；
4）病毒检测与脱毒株系建立：将步骤3）获得的完整植株采用ELISA法进行病毒检测，检测合格后，将合格植株接入诱导培养基以建立脱毒金果榄雌株株系；
5）金果榄雌株脱毒苗的快速繁殖：病毒检测合格后，将步骤4）中获得的合格脱毒植株控制适宜的温度、湿度、光照进行扩繁；
将合格脱毒植株茎尖接种于愈伤组织诱导2号培养基上培养45天获得愈伤组织；
将愈伤组织切成0.5× 0.5mm小块接种于继代增殖3号培养基培养45天，形成大量原球茎；
将原球茎接种于不定芽分化4号培养基培养60天，可获得大量脱毒金果榄无根苗；
将不定芽接种于生根5号培养基培养80天，可获得已生长3-5条根的完整金果榄脱毒雌株；
6）金果榄雌株脱毒苗驯化培养：将上述5）培养的金果榄雌株脱毒瓶苗移入遮阴度75%的大棚炼 苗，先将组培瓶苗移入大棚缓苗5天，逐步开取瓶盖让组培苗适应大棚环境2天，加入清水用镊子轻轻取出瓶苗，栽植于已配置好的炼 苗培养基上，按照行距株距10cm ×10cm 定植，浇足定根水，常规化培养90天，即得金果榄雌株脱毒驯化苗；
其中：
步骤3）中快速生长1号培养基的成分为：MS+6-BA1-2mg/L+NAA0.1-0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8；
步骤5）中愈伤组织诱导2号培养基的成分为：MS+6-BA1-1.5mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+TDZ0.1-0.25mg/L+GA30.5-1mg/L+PVP0.05%，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，pH值4.5；
步骤5）中继代增殖3号培养基的成分为：MS+6-BA1-3mg/L+NAA0.3-0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值4.5；
步骤5）中不定芽分化4号培养基的成分为：MS+6-BA0.5-1mg/L+TDZ3-4mg/L+NAA0.1-0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8；
步骤5）中生根5号培养基的成分为：1/2MS+6-BA0.1-0.5mg/L+NAA0.5-1mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6.5g/L，马铃薯汁100g/L，pH值5.8。
2.根据权利要求1所述一种金果榄雌株脱毒苗培养方法，其特征在于：步骤5）中控制适宜的温度为23-25℃，湿度60-80%，光照1500-2000Lux，每天光照10-12小时。
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