CN112273236A - 一种金果榄组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种金果榄组织培养方法，首先获得无菌外植体，然后启动培养基的筛选，再筛选增殖培养基，最后再进行生根和移栽；组培苗在1/2MS培养基上生长2周后开始出现根系，4周统计生根率为100％，平均根数为6条，平均根长为6.2cm。移栽到基质中成活率为90％，生长良好，4周后能观察到新叶的生成，6周后根系生长旺盛，上部茎开始从基部分化。

Description

一种金果榄组织培养方法
技术领域
本发明涉及金果榄培养领域，具体涉及一种金果榄组织培养方法。
背景技术
金果榄为防己科青牛胆属青牛胆Tinospora sagittata(Oliv.)Gagnep.或金果榄Tinospora capillipes Gagnep.的干燥块根，为常绿缠绕藤本植物，主产于四川、湖南、广西、湖北、贵州等地，具有清热解毒、利咽止痛的功效，主治咽喉肿痛、痈疽疔毒、泄泻、痢疾、脘腹热痛等。金果榄块根含掌叶防己碱、咖伦宾、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、千金藤碱、蝙蝠葛碱和木兰花碱等成分，民间广泛用于治疗胃痛。现代药理学研究表明，金果榄有明显的抗炎镇痛、抗菌、抗肿瘤、降血糖、抗应激及解毒等作用，又被喻为可替代抗生素的天然药物。由于长期采挖，金果榄野生资源日趋枯竭，人工种植和抚育势在必行。另外，金果榄雌雄异株，授粉受到环境影响极大，自然结实率低。在资源调查和引种中发现，雄株远多于雌株，结果机会大大减少，且种子有明显的休眠期，发芽率较低。这也导致现有的金果榄的人工培养繁殖效率较低，成本较大，因此，解决这一类的问题显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出一种金果榄组织培养方法，首先获得无菌外植体，然后启动培养基的筛选，再筛选增殖培养基，最后再进行生根和移栽。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种金果榄组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一：获取无菌外植体
首先选取健壮、腋芽饱满的金果榄枝条，剪去茎段上的叶片，形成1-2cm长短的茎段，每个茎段带一个腋芽，然后放入烧杯中，并滴入2-3滴洗洁精，加入自来水进行震荡，烧杯顶部用纱布包裹，并置于自来水下冲洗30min；然后在超净工作台上先用75％酒精浸润茎段30s，接着用无菌水冲洗2-3次，然后倒入0.1％HgCl2，滴入1-2滴吐温-20，震荡消毒4-7min，无菌水冲洗4-5遍；然后将灭菌后的茎段接种到无激素的MS培养基。
步骤二：启动培养基的筛选
7天后将无污染的茎段接种到9种MS+不同浓度组合BAP和NAA组成的启动培养基中，然后4周后统计出芽率。
步骤三：增殖培养基的筛选
将诱导出的腋芽从茎段上切下，接种到9种MS+不同浓度组合TDZ、BAP和NAA组成的增殖培养基，6周后统计增殖系数和平均苗高。
步骤四：生根和移栽
将增殖的丛生芽分成单棵，接种到无激素的1/2MS培养基中进行生根，4周后统计生根数和平均根长；将生根后的金果榄采取逐步开瓶的方式，第一天拧松盖子、第二天盖子开一半，持续二天，第三天盖子开2/3，持续二天，第六天盖子全部打开，持续一天，第七天把组培苗从瓶子中取出，洗净根部的培养基，移栽到基质上，2周后统计成活率。
步骤五：给出统计方法
污染率＝(污染的苗数/总苗数)×100％；
褐化率＝(褐化的苗数/总苗数)×100％；
出芽率＝(萌发的苗数/总苗数)×100％；
增殖系数＝增殖株数/接种株数
数据经SPSS通过单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
步骤六：得出最优的培养方法
根据统计出的数据得出金果榄组织培养的方法。
进一步改进在于，在步骤一中，所述无激素的MS培养基含30g蔗糖、7g琼脂，pH为5.8；每个时间处理茎段10个，重复3次，7天统计污染率和褐化率，培养温度为24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
进一步改进在于，在步骤四中，所述基质的材料为泥炭、腐殖质和园土，且所述泥炭、腐殖质和园土的成分比例为1:1:3。
进一步改进在于，在步骤六中，根据统计出的数据得出的结果包括有：不同启动培养基影响茎段萌发，TDZ、BAP和NAA不同浓度组合影响组培苗增殖以及HgCl2处理时间对茎段污染率和褐化率的影响。
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
本发明首先获得无菌外植体，然后启动培养基的筛选，再增殖培养基的筛选，最后再生根和移栽；组培苗在1/2MS培养基上生长2周后开始出现根系，4周统计生根率为100％，平均根数为6条，平均根长为6.2cm。移栽到基质中成活率为90％，生长良好，4周后能观察到新叶的生成，6周后根系生长旺盛，上部茎开始从基部分化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的金果榄快繁体系的建立示意图。
其中：a、用作灭菌的茎段；b、茎尖萌发；c、组培苗的增殖情况；d、组培苗的生根情况；e、组培苗移栽2周后的情况；f、移栽1个月后，根系生长旺盛。
Bar在a图中代表1cm，在图c中代表2cm，在f图中代表5cm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
参见图1所示，本发明实施方式公开了一种金果榄组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一：获取无菌外植体
首先选取健壮、腋芽饱满的金果榄枝条，剪去茎段上的叶片，形成1-2cm长短的茎段，每个茎段带一个腋芽(见图1a)，然后放入烧杯中，并滴入2-3滴洗洁精，加入自来水进行震荡，烧杯顶部用纱布包裹，并置于自来水下冲洗30min；然后在超净工作台上先用75％酒精浸润茎段30s，接着用无菌水冲洗2-3次，然后倒入0.1％HgCl2，滴入1-2滴吐温-20，震荡消毒4-7min(见表1)，无菌水冲洗4-5遍；然后将灭菌后的茎段接种到无激素的MS培养基。
步骤二：启动培养基的筛选
7天后将无污染的茎段接种到9种MS+不同浓度组合BAP和NAA组成的启动培养基中(见表2)，然后4周后统计出芽率；
步骤三：增殖培养基的筛选
将诱导出的腋芽(1-2cm)从茎段上切下，接种到9种MS+不同浓度组合TDZ、BAP和NAA组成的增殖培养基(见表3)，6周后统计增殖系数和平均苗高；
步骤四：生根和移栽
将增殖的丛生芽分成单棵，接种到无激素的1/2MS培养基中进行生根，4周后统计生根数和平均根长；将生根后的金果榄采取逐步开瓶的方式，第一天拧松盖子、第二天盖子开一半，持续二天，第三天盖子开2/3，持续二天，第六天盖子全部打开，持续一天，第七天把组培苗从瓶子中取出，洗净根部的培养基，移栽到基质上，2周后统计成活率。
步骤五：给出统计方法
污染率＝(污染的苗数/总苗数)×100％；
褐化率＝(褐化的苗数/总苗数)×100％；
出芽率＝(萌发的苗数/总苗数)×100％；
增殖系数＝增殖株数/接种株数
数据经SPSS通过单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
步骤六：得出最优的培养方法
根据统计出的数据得出金果榄最优的组织培养方法。
在步骤一种，所述无激素的MS培养基含30g蔗糖、7g琼脂，pH为5.8；每个时间处理茎段10个，重复3次，7天统计污染率和褐化率，培养温度为24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
在步骤四中，所述基质的材料为泥炭、腐殖质和园土，且所述泥炭、腐殖质和园土的成分比例为1:1:3。
在步骤六中，根据统计出的数据得出的结果包括有：
HgCl2处理时间对茎段污染率和褐化率的影响，随着HgCl2处理时间的增长，金果榄茎段的污染率呈下降的趋势，褐化率呈升高的趋势(见表1)，6min时茎段的污染率为6.7％，显著低于4、5min的，褐化率为13.3％，7min时茎段的污染率为0，但褐化率为33.7％，显著高于6min的，因此，HgCl2最佳的处理时间为6min。
表1不同HgCl2处理时间对茎段污染和褐化的影响
Figure BDA0002779201090000061
不同启动培养基对茎段萌发的影响，茎段在启动培养基上7d左右开始出现萌动，2周可以看到腋芽明显的萌发(如图1b)。由表2可知，不同组合的BAP和NAA对茎段萌发影响显著，茎段在8号培养基(MS+BAP 3mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1)上培养后，出芽率为90％，和5号培养基(MS+BAP 2mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1)的出芽率差异不显著(86.7％)，显著高于其余组合。
表2不同激素组合对金果榄茎段萌发的影响
Figure BDA0002779201090000071
不同浓度组合对组培苗增殖的影响，将金果榄的组培苗接种到不同浓度组合的培养基进行增殖培养，培养1周左右，组培苗基部开始出现芽点，2周左右，侧芽从基部开始生长，4周增殖效果明显(如图1c)。当不添加NAA时，组培苗的增殖系数为1.2-1.5，TDZ、BAP、NAA三种激素的组合更利于组培苗增殖。最佳的增殖培养基为MS+TDZ 2mg·L-1+BAP 1mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1，增殖系数为4.4，平均苗高为5.7，显著高于其他培养基(表3)。
表3不同激素及浓度对金果榄组培苗的增殖效果
Figure BDA0002779201090000072
Figure BDA0002779201090000081
金果榄组培苗的生根和移栽，组培苗在1/2MS培养基上生长2周后开始出现根系，4周统计生根率为100％，平均根数为6条，平均根长为6.2cm(如图1d)。移栽到基质中成活率为90％，生长良好，4周后能观察到新叶的生成(如图1e)，6周后根系生长旺盛，上部茎开始从基部分化(如图1f)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种金果榄组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：获取无菌外植体
首先选取健壮、腋芽饱满的金果榄枝条，剪去茎段上的叶片，形成1-2cm长短的茎段，每个茎段带一个腋芽，然后放入烧杯中，并滴入2-3滴洗洁精，加入自来水进行震荡，烧杯顶部用纱布包裹，并置于自来水下冲洗30min；然后在超净工作台上先用75％酒精浸润茎段30s，接着用无菌水冲洗2-3次，然后倒入0.1％HgCl2，滴入1-2滴吐温-20，震荡消毒4-7min，无菌水冲洗4-5遍；然后将灭菌后的茎段接种到无激素的MS培养基上。
步骤二：启动培养基的筛选
7天后将无污染的茎段接种到9种MS+不同浓度组合BAP和NAA组成的启动培养基中，然后4周后统计出芽率；
步骤三：增殖培养基的筛选
将诱导出的腋芽从茎段上切下，接种到9种MS+不同浓度组合的TDZ、BAP和NAA组成的增殖培养基，6周后统计增殖系数和平均苗高；
步骤四：生根和移栽
将增殖后的丛生芽分成单株，接种到无激素的1/2MS培养基中进行生根，4周后统计生根数和平均根长；将生根后的金果榄采取逐步开瓶的方式，第一天拧松盖子、第二天盖子开一半，持续二天，第三天盖子开2/3，持续二天，第六天盖子全部打开，持续一天，第七天把组培苗从瓶子中取出，洗净根部的培养基，移栽到基质上，2周后统计成活率。
步骤五：给出统计方法
污染率＝(污染的苗数/总苗数)×100％；
褐化率＝(褐化的苗数/总苗数)×100％；
出芽率＝(萌发的苗数/总苗数)×100％；
增殖系数＝增殖株数/接种株数
数据经SPSS通过单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异。
步骤六：得出最优的培养方法
根据统计出的数据得出金果榄最优的组织培养方法。
2.根据权利要求1所述的一种金果榄组织培养方法，其特征在于，在步骤一中，所述无激素的MS培养基含30g蔗糖、7g琼脂，pH为5.8；每个时间处理茎段10个，重复3次，7天统计污染率和褐化率，培养温度为24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
3.根据权利要求1所述的一种金果榄组织培养方法，其特征在于，在步骤四中，所述基质的材料为泥炭、腐殖质和园土，且所述泥炭、腐殖质和园土的成分比例为1:1:3。
4.根据权利要求1所述的一种金果榄组织培养方法，其特征在于，在步骤六中，根据统计出的数据得出的结果包括有：不同启动培养基影响茎段萌发，TDZ、BAP和NAA不同浓度组合影响组培苗增殖以及HgCl2处理时间对茎段污染率和褐化率的影响。
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