CN105815221A - 以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于林木生物技术领域，具体涉及以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速方法，本发明通过无菌种苗的获得、外植体接种、继代增殖及炼苗移栽等完成。以种苗叶片为外植体，接种1个月时，外植体芽形成率为87.5%。以茎段为外植体，接种一个月时的芽形成率为100%。饥饿干燥处理完接种1个月后统计，玻璃化解除率为85.3%。该方法的再生效率极高。随繁殖次数的增加，再生效率呈指数级增加。生根率和移栽成活率均达80%以上。本发明以成熟种子作为最初实验材料，保存方便，不受季节限制。结合解除玻璃化的方法，非常适合稀缺黑果枸杞资源的保护和开发利用。繁殖个体的成本极低，适合黑果枸杞的工厂化育苗。

Description

以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速繁殖方法

技术领域

本发明属于林木生物技术领域，具体涉及黑果枸杞组培快速繁殖和黑果枸杞玻璃化材料的去玻璃化。

背景技术

黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.）为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木。是重要的抗旱、抗盐碱沙漠先锋树种之一。黑果枸杞果实糖具有抗疲劳、防治糖尿病的功效。此外，黑果枸杞被称为原花青素之王。其原花青素具有清除自由基、增强免疫力、延长果蝇寿命、降低小鼠血清总胆固醇和甘油三脂、升高血清、肝组织和机体总抗氧化能力等功效。黑果枸杞集经济价值、生态价值、药用价值及保健价值于一身，其价格一直居高不下。近年来，农牧民疯狂采摘让一些野生黑果枸杞植株不再挂果。如何保护并充分合理的开发利用黑果枸杞资源，是非常值得关注的重要课题。目前黑果枸杞苗木市场仍以种苗为主。种苗价格较高，并且很难完全保持亲本的优良性状。植物组织培养最可能成为快速提供优质低价苗木的有效方法，我们前期的研究已经建立了以黑果枸杞叶片和茎段为外植体的高效再生体系（图1）。该体系为黑果枸杞快速育苗、种质保存、叶片脱分化以及愈伤再分化研究、叶腋分生组织和包埋茎形成层分化研究、叶盘转化、分子育种、体细胞无性系变异育种研究等提供了不可或缺的基础。但是随着离体培养时间的延长，黑果枸杞体细胞胚、丛生芽或不定芽存在一定比例的玻璃化。玻璃化严重降低了黑果枸杞的有效增值系数，造成人力、财力和实验材料等的浪费。

所谓玻璃化是植物组织培养过程中经常发生的一种生理失调现象，玻璃化苗通常生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状。玻璃化苗的生根能力大大减弱，难以移栽成活，严重影响离体快速繁殖效率。玻璃化与污染、褐化并称为植物组织培养过程中的三大难题，引起人们的极大关注。针对黑果枸杞以外的其它植物种，人们尝试过多种预防组培玻璃化的方法。但是几乎没有能够完全抑制玻璃化产生的方法。对于快速繁殖的黑果枸杞组培材料，玻璃化很难防患于未然。因此，玻璃化组培材料的去玻璃化非常必要。尤其对于一些珍贵稀缺的黑果枸杞组培材料，去玻璃化显得尤为重要。截止到目前，未检索到任何预防或者解除黑果枸杞组培材料玻璃化的方法报道。

发明内容

为解决黑果枸杞野生资源稀缺、种苗价格高昂的问题，本发明提供一种高效快速的黑果枸杞无性繁殖方式。此外，为解决组培材料玻璃化的问题，本发明提供一种去除黑果枸杞组培材料玻璃化的简单方法。

以下为本发明采用的技术方案：

1.无菌种苗的获得

将黑果枸杞成熟种子置于35～37℃温水中处理7～24h或者不处理。在无菌超净工作台用70-75%(体积/体积)酒精浸泡种子30S～1min，再用0.1～0.2%（质量/体积）的氯化汞水溶液或者2%（质量/体积）次氯酸钠溶液浸泡2～5分钟，无菌水冲洗3～6遍。将种子接种到不添加任何植物生长调节剂的1/2MS或MS固体培养基上，20～28℃每天8～16小时光照培养。此步和以下各步用到的MS固体培养基均添加0.43～0.7%（质量/体积）的固化剂琼脂，3～4%（质量/体积）的蔗糖。121℃高压灭菌15～20min之前用NaOH或KOH溶液将pH值调节到5.4～5.8。1/2MS固体培养基添加蔗糖浓度为MS固体培养基的一半。

2.外植体接种

待步骤1萌发的种苗长到叶片数为10～20时，将生长良好的幼叶片横向剪或切为直径3～5mm的小块（单片叶剪为2～3块），接种到含6-BA0.05～1.0mg/L+NAA0～0.5mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下置于微弱散射光下培养1～4周。之后转到正常光照下培养，每天光照8～12h。将有叶或去叶的茎剪切为0.5～2cm的小段，下端朝下插入含6-BA0.05～1.0mg/L+NAA0～0.5mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下每天光照8～12h。也可用叶片或茎外植体产生的无菌完整植株或无菌无根植株的幼嫩叶片和茎段做为外植体。

3.继代增殖

外植体接种4周左右进行继代，将培养材料转接到相同的培养基上。叶外植体产生的高度达到1cm以上的芽可切下诱导生根。有节茎段产生的高度2cm以上的芽可切下诱导生根。切完之后的材料继代到相同培养基置于相同的培养条件下继续增殖。继代间隔时间为4周左右。

4.干燥饥饿法去除玻璃化

随着离体培养时间的延长，部分材料会出现玻璃化现象（图2A）。将玻璃化或部分玻璃化的丛生芽、不定芽、带芽愈伤组织或带芽外植体放入无菌且透气良好的空瓶中（图2C）。20～25℃每天光照8～12小时。3～28天后玻璃化现象消失。将解除玻璃化的材料按步骤3的方法进行继代培养（图2B）。

5.根的诱导

不添加任何植物生长调节剂的MS或1/2MS培养基均可用于诱导生根。但是不同株系生根效果差别较大。也可添加较低浓度的生长激素用于生根。本方法获得的无性小植株（或无根植株）的茎和叶可再按步骤2～5的方法进行2次繁殖。

6.炼苗移栽

生根完整小植株要进行壮苗培养，木质化之后进行移栽驯成活率较高。移栽介质121℃高压灭菌30min以上。采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽。注意控制湿度，并适量使用甲基托布津等广谱杀菌剂。

本发明可在相对短的时间内大量产生基因背景相同黑果枸杞植株。以种苗叶片为外植体，接种1个月时，外植体芽形成率为87.5%。以茎段为外植体，接种一个月时的芽形成率为100%。饥饿干燥处理完接种1个月后统计，玻璃化解除率为85.3%。解除玻璃化的材料能继续产出大量正常芽丛。该方法的再生效率极高(图1B，F；图2B）。随繁殖次数的增加，再生效率呈指数级增加。生根率和移栽成活率均达80%以上。本发明以成熟种子作为最初实验材料，保存方便，实验基本不受季节限制。结合解除玻璃化的方法，本发明非常适合稀缺黑果枸杞资源的保护和开发利用。本发明为黑果枸杞的转基因奠定基础。本方法繁殖个体的成本极低，适合黑果枸杞的工厂化育苗。

附图说明

图1以黑果枸杞种苗茎和叶为外植体的高效再生体系。接种1个月的叶片外植体产生小芽丛（A），黑色箭头指示外植体叶片；叶片再生较大芽丛（B）；C叶片再生芽诱导生根（黑色箭头）；D接种1个月的茎外植体叶腋产生芽丛，包埋茎切口产生芽原基（黑色箭头）；E包埋茎芽原基放大图（白色圆圈内）；F接种2个月单块茎外植体产生大量芽丛（中间较高几株芽来自叶腋，四周较低芽丛来自包埋茎产生的芽原基）；G茎外植体产生芽丛诱导生根（方框内）。

图2饥饿干燥法解除黑果枸杞组培材料玻璃化。A玻璃化组培材料（愈伤组织上布满玻璃化红色芽点）；B饥饿干燥后解除玻璃化的材料（芽点正常生长发育）；C饥饿干燥中的材料。

具体实施方式

下面将结合实际操作对本发明作进一步的说明，但本发明的范围并不局限于以下的实施例。

实施例1：

1.无菌种苗的获得

将黑果枸杞成熟种子置于35℃温水中处理24h。在无菌超净工作台用70%(体积/体积)酒精浸泡种子30S，再用0.1%（质量/体积）的氯化汞水溶液浸泡2分钟，无菌水冲洗3遍。将种子接种到不添加任何植物生长调节剂的MS固体培养基上，20℃每天8小时光照培养。此步和以下各步用到的MS固体培养基均添加0.43%（质量/体积）的固化剂琼脂，3%（质量/体积）的蔗糖。121℃高压灭菌15min之前用NaOH溶液将pH值调节到5.8。

2.外植体接种

待步骤1萌发的种苗长到叶片数为10时，将生长良好的幼叶片横向剪为直径3mm的小块，接种到含6-BA0.05mg/L+NAA0.5mg/L的MS固体培养基上，20℃下置于微弱散射光下培养4周。之后转到正常光照下培养，每天光照8h。将去叶的茎剪切为0.5cm的小段，下端朝下插入含6-BA0.05mg/L+NAA0.5mg/L的MS固体培养基上，20℃下每天光照8h。

3.继代增殖

外植体接种4周进行继代，将培养材料转接到相同的培养基上。叶外植体产生的高度达到1cm以上的芽可切下诱导生根。有节茎段产生的高度2cm以上的芽可切下诱导生根。切完之后的材料继代到相同培养基置于相同的培养条件下继续增殖。继代间隔时间为4周。

4.干燥饥饿法去除玻璃化

将玻璃化的带芽愈伤组织放入无菌且透气良好的空瓶中。20℃每天光照8小时。玻璃化现象消失后，将解除玻璃化的材料按步骤3的方法进行继代培养。

5.根的诱导

不添加任何植物生长调节剂的MS培养基用于诱导生根。本方法获得的无根植株的茎和叶可再按步骤2～5的方法进行2次繁殖。

6.炼苗移栽

生根完整小植株要进行壮苗培养，木质化之后进行移栽驯成活率较高。移栽介质121℃高压灭菌30min。采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽。注意控制湿度，并适量使用甲基托布津等广谱杀菌剂。

实施例2：

1.无菌种苗的获得

将黑果枸杞成熟种子置于37℃温水中处理24h。在无菌超净工作台用75%(体积/体积)酒精浸泡种子1min，再用2%（质量/体积）次氯酸钠溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗6遍。将种子接种到不添加任何植物生长调节剂的1/2MS固体培养基上，28℃每天16小时光照培养。此步和以下各步用到的MS固体培养基均添加0.7%（质量/体积）的固化剂琼脂，4%（质量/体积）的蔗糖。121℃高压灭菌20min之前用KOH溶液将pH值调节到5.4。1/2MS固体培养基添加蔗糖浓度为2%。

2.外植体接种

待步骤1萌发的种苗长到叶片数为20时，将生长良好的幼叶片横向切为直径5mm的小块，接种到含6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的MS固体培养基上，28℃下置于微弱散射光下培养4周。之后转到正常光照下培养，每天光照12h。将有叶或去叶的茎剪切为2cm的小段，下端朝下插入含6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的MS固体培养基上，28℃下每天光照12h。

3.继代增殖

外植体接种32天进行继代，将培养材料转接到相同的培养基上。叶外植体产生的高度达到1cm以上的芽可切下诱导生根。有节茎段产生的高度2cm以上的芽可切下诱导生根。切完之后的材料继代到相同培养基置于相同的培养条件下继续增殖。继代间隔时间为32天。

4.干燥饥饿法去除玻璃化

将玻璃化或部分玻璃化的丛生芽放入无菌且透气良好的空瓶中。25℃每天光照12小时。等玻璃化现象消失之后，将解除玻璃化的丛生芽按步骤3的方法进行继代培养。

5.根的诱导

不添加任何植物生长调节剂的1/2MS培养基用于诱导生根。本方法获得的无性小植株的茎和叶可再按步骤2～5的方法进行2次繁殖。

6.炼苗移栽

同实施例1。

Claims (1)

1.以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速繁殖方法，其特征是具体步骤如下：

1)无菌种苗的获得

将黑果枸杞成熟种子置于35～37℃温水中处理7～24h或者不处理，在无菌超净工作台用70-75%体积比的酒精浸泡种子30S～1min，再用0.1～0.2%质量体积比的氯化汞水溶液或者2%质量体积比次氯酸钠溶液浸泡2～5分钟，无菌水冲洗3～6遍，将种子接种到不添加任何植物生长调节剂的1/2MS或MS固体培养基上，20～28℃每天8～16小时光照培养，此步和以下各步用到的MS固体培养基均添加0.43～0.7%质量体积比的固化剂琼脂，3～4%质量体积比的蔗糖,121℃高压灭菌15～20min之前用NaOH或KOH溶液将pH值调节到5.4～5.8,1/2MS固体培养基添加蔗糖浓度为MS固体培养基的一半；

2)外植体接种

待步骤1萌发的种苗长到叶片数为10～20时，将生长良好的幼叶片横向剪或切为直径3～5mm的小块，单片叶剪为2～3块，接种到含6-BA0.05～1.0mg/L+NAA0～0.5mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下置于微弱散射光下培养1～4周，之后转到正常光照下培养，每天光照8～12h，将有叶或去叶的茎剪切为0.5～2cm的小段，下端朝下插入含6-BA0.05～1.0mg/L+NAA0～0.5mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下每天光照8～12h，或用叶片或茎外植体产生的无菌完整植株或无菌无根植株的幼嫩叶片和茎段做为外植体；

3）继代增殖

外植体接种4周左右进行继代，将培养材料转接到相同的培养基上，叶外植体产生的高度达到1cm以上的芽切下诱导生根，有节茎段产生的高度2cm以上的芽切下诱导生根，切完之后的材料继代到相同培养基置于相同的培养条件下继续增殖，继代间隔时间为4周；

4）干燥饥饿法去除玻璃化

随着离体培养时间的延长，部分材料会出现玻璃化现象，将玻璃化或部分玻璃化的丛生芽、不定芽、带芽愈伤组织或带芽外植体放入无菌且透气良好的空瓶中，20～25℃每天光照8～12小时，3～28天后玻璃化现象消失，将解除玻璃化的材料按步骤3）的方法进行继代培养；

5）根的诱导

不添加任何植物生长调节剂的MS或1/2MS培养基均能用于诱导生根，或添加较低浓度的生长激素用于生根，本方法获得的无性小植株或无根植株的茎和叶或再按步骤2～5的方法进行2次繁殖；

6）炼苗移栽

生根完整小植株要进行壮苗培养，木质化之后进行移栽驯，移栽介质121℃高压灭菌30min以上，采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽，控制湿度，并适量使用甲基托布津广谱杀菌剂。