CN102138521A

CN102138521A - 一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法

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Publication number: CN102138521A
Application number: CN 201010592325
Authority: CN
Inventors: 王中华; 蔺经; 李晓刚; 王宏伟; 杨青松; 盛宝龙; 常有宏
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: CN102138521B

Abstract

本发明涉及一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，属于生化工程技术。将豆梨玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置72小时，使试管苗组织含水量达50-70%；再放入转接入无细胞分裂素的培养基上，在温度为25℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。可以有效恢复玻璃化苗，轻度玻璃化苗恢复率在90%以上，重度玻璃化苗恢复率30%以上。是一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。

Description

一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法

技术领域

本发明属于生化工程技术中植物培养的方法，特别涉及一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法。

背景技术

试管苗玻璃化(hyperhydricity)是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。玻璃化现象的产生与很多因素有关，如植物组织畸形、木质素含量过低，植物体内会发生乙烯过饱和、细胞通透性降低或气孔关闭等，从而导致细胞内多余水分不能及时排出，发生玻璃化现象。

根据玻璃化程度又分为轻度玻璃化和重度玻璃化。轻度玻璃化苗茎半透明水浸状，叶片狭长，边缘卷曲半透明，茎叶均脆弱易碎。重度玻璃化苗植株矮小，茎透明肿胀，无明显茎节，叶片肥厚、扭曲、透明，茎叶均脆弱易碎。

玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎段培养物的不定芽。通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是试管苗生产中亟待解决的问题。玻璃化现象的产生与很多因素有关，如植物组织畸形、木质素含量过低，植物体内会发生乙烯过饱和、细胞通透性降低或气孔关闭等，从而导致细胞内多余水分不能及时排出，发生玻璃化现象。

玻璃化苗含水量高于正常苗，因此，玻璃化发生与植物体内含水量过高有关。植物排除体内多余水分方式之一就是靠蒸腾作用。在玻璃化的植物苗中只有一个保卫细胞，而且畸形，形状狭窄，气孔关闭，所以蒸腾作用减少，引进体内水分积累，细胞体积膨胀，液泡程度加剧，细胞质变薄，这一系列变化造成对细胞的挤压，促使气孔进一步关闭。

通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是试管苗生产中亟待解决的问题。目前，已经有80多种植物有玻璃化现象报道，但试管苗玻璃化后，恢复措施研究相对较少。现有研究认为，培养温度由恒温改为变温、降低培养基中6-BA浓度、增加卡拉胶含量可以使仅部分叶片出现玻璃化的红叶石楠组培苗转为正常苗。蓝莓玻璃化苗恢复研究中也认为，玻璃化试管苗在调整培养温度及玉米素浓度的条件下，可以不同程度的恢复。番木瓜恢复措施研究方面，则认为利用番木瓜营养液培养其玻璃化组培苗能有效地控制玻璃化苗的发生，使其逆向转化。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于：提供一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。

技术方案

一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，步骤如下：

(1)配制培养基：在MS培养基中添加30g/L的蔗糖，6g/L的琼脂，pH值调至5.6-6.0，并进行高压灭菌处理；

(2)玻璃化试管苗脱水处理：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置72小时，使试管苗组织含水量达50-70％。

(3)玻璃化苗恢复培养：将经脱水处理的试管苗取出，放入上述培养基中培养，在温度为25℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。

试管苗脱水处理所用的三角瓶和封口膜均经高温灭菌处理。条件为温度25℃，12h/d光照，光强为2000-5000lux。

有益效果

豆梨生长过程中含水量急剧增加，玻璃化苗超度含水，组织含水量较正常苗高50％以上。本发明在对玻璃化苗适度脱水处理后，转接入无细胞分裂素的培养基上，进行培养，可以有效恢复玻璃化苗，轻度玻璃化苗恢复率在90％以上，重度玻璃化苗恢复率30％以上。是一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。

附图说明

图1所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗植株形态。

图2所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗叶片扫描电镜观察结果。

a.正常苗叶片气孔分布；b.轻度玻璃化苗叶片气孔分布；c重度玻璃化苗叶片气孔分布；d.正常苗叶片单个气孔；e.轻度玻璃化苗单个畸形气孔；f.重度玻璃化苗单个畸形气孔；g.恢复苗叶片气孔分布；h.恢复苗单个气孔

图3所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗叶绿体结构透射电镜观察效果。

备注：a.正常苗椭圆形叶肉细胞；b.正常苗叶绿体细胞；c.正常叶绿体类囊体细胞；d.轻度玻璃化苗的叶肉细胞；e.轻度玻璃化苗的叶绿体细胞；f.轻度玻璃苗化叶绿体的类囊体细胞；g.重度玻璃化苗叶肉细胞；h.重度玻璃化苗叶绿体细胞；i.重度玻璃化苗叶绿体类囊体细胞；j.恢复苗叶肉细胞；k.恢复苗叶绿体细胞；l.恢复苗叶绿体类囊体细胞

实施例1：不同脱水处理对玻璃化苗恢复的影响，本例以轻度玻璃化苗的恢复为例，设9种脱水处理，比较不同处理对玻璃化苗修复的差异。

(2)玻璃化试管苗脱水处理：

具体处理如下：

处理1：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置72h，温度25℃，12h/d光照，光强为2000-5000lux。

处理2：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置48h，温度25℃，12h/d光照，光强为2000-5000lux。

处理3：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置24h，温度25℃，12h/d光照，光强为2000-5000lux。

处理4：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，摆放于超净工作台，开口吹30min，风速0.3m/s。

处理5：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，摆放于超净工作台，开口吹20min，风速0.3m/s。

处理6：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，摆放于超净工作台，开口吹10min，风速0.3m/s。

处理7：玻璃化苗植入培养基，摆放于超净工作台，开口吹90min，风速0.3m/s。

处理8：玻璃化苗植入培养基，摆放于超净工作台，开口吹60min，风速0.3m/s。

处理9：玻璃化苗植入培养基，摆放于超净工作台，开口吹30min，风速0.3m/s。

(3)玻璃化苗恢复培养

将上述处理1-6的脱水苗取出，放入培养基中封口培养。培养温度为25℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。

处理7-9脱水处理后脱水苗在原培养基中封口培养，培养温度为25℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。

对照设置：轻度玻璃化苗未经脱水处理后直接转入培养基封口后，在温度为25℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。

处理结果如表1所示：9个处理中，处理1玻璃化苗恢复率最高。另外，比较了处理1条件下重度玻璃化苗和轻度玻璃化苗的修复效果(表2)，处理1对重度玻璃化苗的恢复率达到32.1％。

表1轻度玻璃化苗脱水处理结果

实施例2：实施例1中优选处理1方法对不同程度玻璃化苗修复比较

结果表明，处理1对重度玻璃化苗恢复率也能达到32.1％(表2)。

表2处理1对不同程度玻璃化苗修复比较

实施例3：恢复苗与正常苗增殖能力比较

将实施例1中处理1所述恢复苗接种在培养基(MS+6-BA 0.6mg/L+NAA0.2mg/L)上进行增殖培养，比较恢复苗与正常苗的增殖能力(表3)。从表3可以看出，恢复苗与正常苗继代3次的增殖率基本一致，而且增殖率均随继代次数的增加呈下降趋势，可见恢复苗可以进行正常增殖生长。

表3修复苗与正常苗增殖率的比较

实施例4：恢复苗与正常苗生根能力比较

将实施例1中处理1所述恢复苗与正常苗均在生根培养基上(1/2MS+NAA2.0mg/L)进行培养，比较恢复苗与正常苗的生根能力。从表4可以看出，二者生根率差异不显著，这说明由玻璃化苗恢复成正常苗的过程不影响其正常生根。

表4恢复苗与正常苗与生根率的比较

处理	培养基	NAA(mg/L)	生根率(％)
				正常苗	1/2MS	2.0	75.2a
修复苗	1/2MS	2.0	70.6a

试验结果效果描述

本发明在对玻璃化苗适度脱水处理后，转接入无细胞分裂素的培养基上，进行培养，玻璃化苗得到有效恢复，轻度玻璃化苗恢复率在90％以上(表1)，重度玻璃化苗恢复率30％以上(表2)，恢复苗最高增殖系数达到5.0以上(表3)，生根培养生根率达到70％左右，与正常苗没有显著差异(表4)。植株形态叶片平展，茎叶正常(图1)。从超微结构看，恢复苗叶片气孔开张(图2)，叶绿体数量、大小均和正常苗相一致，类囊体清晰可见(图3)。

Claims

1.一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，步骤如下：

（1）配制培养基：在MS培养基中添加30g/L的蔗糖，6g/L的琼脂，pH值调至5.6-6.0，并进行高压灭菌处理；

（2）玻璃化试管苗脱水处理：将豆梨玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置72小时，使试管苗组织含水量达50-70%；

（3）玻璃化苗恢复培养：将经脱水处理的试管苗取出，放入上述培养基中培养，在温度为30℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。

2.按权利要求1所述恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，其征在于：试管苗脱水处理所用的三角瓶和封口膜均经高温灭菌处理。

3.按权利要求1或2所述恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，其征在于：所述步骤（2）玻璃化试管苗脱水处理条件为温度25℃，12h/d光照，光强为2000-5000lux。