CN103733995A - 一种芍药愈伤组织诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物的组织培养领域，具体提供一种芍药愈伤组织诱导方法，具体步骤如下：将经灭菌消毒的芍药茎段先后接种到启动培养基、诱导培养基、增殖培养基、分化培养基进行常规培养，并将获得的愈伤组织接种到不定根诱导培养基进行光照培养或黑暗培养，获得芍药组培苗。本发明所提供的芍药愈伤组织诱导方法操作简单，成本廉价，能够广泛适用于多数芍药品种，有效解决了芍药传统分株繁殖不能满足产业化生产需求，芍药地下芽组培均存在困难的问题。本发明还提供所述芍药愈伤组织诱导方法在芍药繁育中的应用。

Description

一种芍药愈伤组织诱导方法
技术领域
本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种芍药愈伤组织诱导方法。
背景技术
芍药（Peaonia lactiflora Pall.）为芍药科芍药属的多年生宿根草本花卉，在我国栽培历史悠久，达3900多年的历史。
芍药通常以分株繁殖为主，3-5年分一次，繁殖周期较长且繁殖系数较低。播种繁殖法较简单，但繁殖周期长，通常4-5年才可开花，且无法保持母本的优良性状，不宜进行大规模商业化生产。组织培养可以避免以上缺点，并具有繁殖速度快、不受环境条件限制等优点，因而可大面积推广。以植物的叶片、茎段等作为外植体诱导产生愈伤组织，从而诱导新的植株产生，是目前芍药重要的快速繁殖和育种途径之一，但尚未形成一套完整的体系。
发明内容
为了建立一套完整的芍药快速繁殖体系，本发明的目的在于提供一种芍药愈伤组织诱导方法，具体步骤如下：
将经灭菌消毒的芍药茎段先后接种到启动培养基、诱导培养基、增殖培养基、分化培养基进行常规培养，并将获得的愈伤组织接种到不定根诱导培养基进行光照培养或黑暗培养，获得芍药组培苗。
其中，芍药茎段取材的时间为4月初。
其中，所述灭菌消毒的具体方法为：将芍药嫩茎冲洗干净，用洗洁精和质量百分比0.26%的NaClO浸泡20～30min，冲洗后吸干水分，用体积百分比75%的酒精消毒30s，无菌水冲洗，再用质量百分比0.1%的HgCl2消毒10min，无菌水冲洗，横切成长0.1-0.3cm的茎段备用。
其中，所述启动培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.5mg/L、2,4-D的浓度为0.5mg/L、NAA的浓度为0.5mg/L的培养基。
其中，所述诱导培养基为：以WPM培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.5mg/L、2,4-D的浓度为0.5mg/L的培养基。
其中，所述增殖培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.1mg/L、NAA的浓度为0.2mg/L的培养基。
其中，所述分化培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS固体培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.1-0.5mg/L、2,4-D的浓度为0-1.0mg/L、NAA的浓度为0-0.5mg/L的培养基。分化培养基优选为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS固体培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.5mg/L、NAA的浓度为0.5mg/L的培养基。
其中，所述不定根诱导培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS培养基为基本培养基，含有IBA的浓度为1.0mg/L的培养基。
其中，所述获得的愈伤组织接种到不定根诱导培养基上，优选进行光照培养。
其中，以启动培养基培养的时间为30天；以诱导培养基培养的时间为30天；以增殖培养基培养的时间为30天；以分化培养基培养的时间为30天；以不定根诱导培养基培养的时间为30天。
其中，所述常规培养和光照培养的培养条件均为温度23±2℃，光照时间14小时/天，光照强度2000-3000lx；所述黑暗培养的培养条件为黑暗条件下温度23±2℃。
其中，所述芍药为芍药品种珊瑚落日。
本发明还提供所述的一种芍药愈伤组织诱导方法在芍药繁育中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）芍药组培一直是国内外的难题，本发明通过基本培养基的筛选、不同培养条件和培养方式的比较、不同生长调节物质对愈伤组织的诱导、增殖和分化的影响等步骤，提供了一种有效的芍药愈伤组织培养方法。
（2）本发明为芍药愈伤组织诱导的组培方法，操作简单，成本廉价，能够广泛适用于多数芍药品种的愈伤组织诱导培养。
附图说明
图1是实施例1中4月份抽茎期取材时芍药生长状况的照片；
图2是实施例1中‘珊瑚落日’在1/2MS（Ca2+加倍）为基本培养基的启动培养上的生长情况照片；
图3是实施例1中‘珊瑚落日’在激素组合为0.5mg/LTDZ+0.5mg/L2,4-D的诱导培养基上的生长情况照片；
图4是实施例1中‘珊瑚落日’在增殖培养基0.2mg/LTDZ+0.2mg/L NAA上的生长情况照片；
图5是实施例1中固体培养条件下1/2MS（Ca2+加倍）+0.5mg/LTDZ+0.5mg/L NAA对‘珊瑚落日’愈伤组织分化的影响照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1.材料与方法
试验材料于2011年4月初取自北京市昌平区小汤山国家花卉工程中心，取材时芍药的生长状况见图1。以嫩茎作为外植体采自3年生以上的芍药品种‘珊瑚落日’。
将取回来的嫩茎在流水下冲洗干净，再用洗洁精和质量百分比浓度为0.26%的NaClO浸泡20～30min，再在流水下冲洗30～40min，用吸水纸吸取所带的水分，放置到超净工作台上进行消毒处理。用体积百分比75%的酒精消毒30s，无菌水冲洗2遍，再用质量百分比0.1%的HgCl2消毒10min，无菌水冲洗4次，接种时，将茎段横切成0.1-0.3cm的薄片，接种于诱导培养基表面。
将‘珊瑚落日’茎段接种到以三种不同固体基本培养基为基础的启动培养基上，培养基为MS+0.5mg/L TDZ（苯基噻二唑基脲）+0.5mg/L 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）+0.5mg/L NAA（萘乙酸）、1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L NAA、WPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L NAA，30d后统计数据。其中，MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L NAA即为：以MS培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.5mg/L、2,4-D的浓度为0.5mg/L、NAA的浓度为0.5mg/L的培养基，其它的培养基以此类推。
将‘珊瑚落日’的茎段接种于三种不同激素组合的固体培养基中进行诱导培养，诱导培养基分别为WPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L2,4-D、WPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA、WPM+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L NAA培养基中，30d后统计数据。
愈伤组织增殖培养基采用L9(34)的正交设计，为固体培养基，增殖培养基分别为㈠1/2MS(Ca2+加倍)+0.1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA、㈡1/2MS(Ca2+加倍)+0.2mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.0mg/L6-BA、㈢1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+1.0mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA、㈣1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA、㈤1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+1.0mg/L NAA、㈥1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA、㈦1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ+1.0mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA、㈧1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA、㈨1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA，30d后统计增殖倍数等数据。
愈伤组织分化培养基采用固体培养和液体培养两种方式，分化培养基分别为：㈠固体培养1/2MS(Ca2+加倍)+0.1mg/L TDZ+0.2mg/LNAA、㈡固体培养1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/LTDZ、㈢固体培养1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA、㈣固体培养1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA、㈤液体培养1/2MS(Ca2+加倍)+0.1mg/L TDZ+0.2mg/LNAA、㈥液体培养1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/LTDZ、㈦液体培养1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA、㈧液体培养1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA，30d后统计褐化率、增殖倍数和生长情况。
将‘珊瑚落日’增殖产生的愈伤组织以光照和黑暗两种方式培养，不定根诱导培养基为：㈠光照1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L IBA、㈡光照1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L IBA、㈢光照1/2MS(Ca2+加倍)+2.0mg/L IBA；㈣黑暗1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L IBA、㈤黑暗1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L IBA、㈥黑暗1/2MS(Ca2+加倍)+2.0mg/LIBA，30d后统计增殖倍数和生长情况。
2.结果与分析
（1）不同基础培养基对启动培养的影响
结果如表1所示：
表1‘珊瑚落日’启动培养的基本培养基筛选
Figure BDA0000443159590000051
在1/2MS(Ca2+加倍)的培养基中‘珊瑚落日’茎段愈伤组织的诱导率为100%，污染率为零，褐化率为零，且愈伤组织生长良好，颜色呈深绿色，具体生长情况见图2。‘珊瑚落日’的茎段愈伤组织在MS培养基中褐化率为25%，颜色呈浅绿色。愈伤组织在WPM培养基中，褐化严重，颜色发黑，很多褐化死亡，诱导率仅为62.5%。本发明提供的适宜‘珊瑚落日’愈伤组织诱导的基本培养基为1/2MS(Ca2+加倍)基本培养基。
（2）不同培养基对愈伤组织诱导的影响
不同培养基对愈伤组织诱导的影响见表2。‘珊瑚落日’茎段愈伤组织在本发明用的0.5mg/L TDZ+0.5mg/L 2,4-D为激素组合的培养基中，诱导率为100%、污染率为零、严重褐化率仅为3.57%、中度褐化率为零，见图3。
表2不同诱导培养基对‘珊瑚落日’茎段愈伤组织诱导的影响
Figure BDA0000443159590000061
（3）愈伤组织的增殖
本发明提供的愈伤组织增殖培养基为㈠1/2MS(Ca2+加倍)+0.1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA、㈡1/2MS(Ca2+加倍)+0.2mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA、㈢1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+1.0mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA、㈣1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA、㈤1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+1.0mg/L NAA、㈥1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA、㈦1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ+1.0mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA、㈧1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+1.5mg/L 6-BA、㈨1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA。具体结果见表3。
表3不同处理组合对‘珊瑚落日’愈伤组织增殖的影响。
Figure BDA0000443159590000071
‘珊瑚落日’愈伤组织在㈠1/2MS(Ca2+加倍)+0.1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA培养基中的增殖倍数最大，为3.57，并显著高于其他8个组合，同时愈伤组织长势良好，具体见图4，在原有愈伤组织的周围又长出许多新的愈伤组织。
（4）不同的培养方式对愈伤组织的分化的影响
‘珊瑚落日’愈伤组织在液体培养基中均未分化出芽点，且褐化严重。在固体培养基中有芽点分化，且愈伤组织长势良好，褐化程度较轻，增殖倍数较高。在‘珊瑚落日’愈伤组织分化过程中，固体培养1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA是‘珊瑚落日’分化最适宜的培养基，见图5。具体见表4。
表4不同培养方式对‘珊瑚落日’愈伤组织的分化的影响
（5）光照条件和IBA浓度对诱导不定根的影响
本发明以光照和黑暗两种方式培养，诱导不定根的培养基为固体培养基，具体为：㈠光照1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L IBA（吲哚丁酸）、㈡光照1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L IBA、㈢光照1/2MS(Ca2+加倍)+2.0mg/L IBA；㈣黑暗1/2MS(Ca2+加倍)+0.5mg/L IBA、㈤黑暗1/2MS(Ca2+加倍)+1.0mg/L IBA、㈥黑暗1/2MS(Ca2+加倍)+2.0mg/L IBA。结果见表5。
表5‘珊瑚落日’愈伤组织诱导不定根
Figure BDA0000443159590000082
当IBA浓度为1.0mg/L时‘珊瑚落日’愈伤组织无论在光照条件下还是黑暗条件下，增值倍数均为最大值，1.0mg/L IBA是诱导‘珊瑚落日‘愈伤组织不定根的最佳浓度，而光照条件下增殖倍数更高为2.56。光照条件下，‘珊瑚落日’愈伤组织增长较快，质地较硬，为黄绿色；而黑暗条件下，形成的愈伤组织较松散，为白色。因此，光照条件下，1.0mg/L IBA是‘珊瑚落日’愈伤组织分化不定根的最好培养条件和激素浓度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，具体步骤如下：
将经灭菌消毒的芍药茎段先后接种到启动培养基、诱导培养基、增殖培养基、分化培养基进行常规培养，并将获得的愈伤组织接种到不定根诱导培养基进行光照培养或黑暗培养，获得芍药组培苗。
2.如权利要求1所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述启动培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.5mg/L、2,4-D的浓度为0.5mg/L、NAA的浓度为0.5mg/L的培养基。
3.如权利要求1所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基为：以WPM培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.5mg/L、2,4-D的浓度为0.5mg/L的培养基。
4.如权利要求1所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述增殖培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.1mg/L、NAA的浓度为0.2mg/L的培养基。
5.如权利要求1所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述分化培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS固体培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.1-0.5mg/L、2,4-D的浓度为0-1.0mg/L、NAA的浓度为0-0.5mg/L的培养基。
6.如权利要求5所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述分化培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS固体培养基为基本培养基，含有TDZ的浓度为0.5mg/L、NAA的浓度为0.5mg/L的培养基。
7.如权利要求1所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述不定根诱导培养基为：以Ca2+浓度加倍的1/2MS培养基为基本培养基，含有IBA的浓度为1.0mg/L的培养基。
8.如权利要求1所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述获得的愈伤组织接种到不定根诱导培养基上，进行光照培养。
9.如权利要求1所述一种芍药愈伤组织诱导方法，其特征在于，以启动培养基培养的时间为30天；以诱导培养基培养的时间为30天；以增殖培养基培养的时间为30天；以分化培养基培养的时间为30天；以不定根诱导培养基培养的时间为30天。
10.权利要求1-9任一项所述的一种芍药愈伤组织诱导方法，在芍药繁育中的应用。
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