CN104996304A - 一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养基和培养方法，该方法是在3月下旬选取幼嫩的芍药叶片；叶片灭菌处理后接种于诱导培养基，温度25±2℃，暗培养2个月诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织转至分化培养基，温度25±2℃，光照时间12h·d^-1，光照强度1200±100lx，培养2个月获得不定芽。本发明可以使芍药叶片的愈伤诱导率高达98.60％，玻璃化率为0％，不定芽分化率可达58.99％，每个愈伤组织块可形成4-10个不定芽，解决了以芍药叶片为外植体诱导愈伤组织、分化不定芽比率低的技术难题，为芍药基因工程的开展提供了技术支撑，市场前景广阔。

Description

一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养基及培养方法

技术领域

本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养基及培养方法。

背景技术

芍药是我国的传统名花，除华南部分地区天气炎热不适于生长外，几乎遍及全国各地园林之中，但多数为常规的栽培品种，具有新奇性状的新品种较少，因此，我国芍药种植者及科研机构均在积极地进行芍药品种改良与新品种培育的工作。芍药品种改良与新品种培育主要通过杂交育种进行，这种传统的方法具有周期长、效率低、不能进行定向改良等缺点，延缓了我国芍药优良新品种的选育与推广步伐。近年来，逐渐新兴起来的基因工程技术为芍药新品种的培育带来了一丝曙光，这种方法不仅可以克服杂交育种的盲目性，具有定向改良植株性状的优点，而且能够缩短育种周期，目前在康乃馨、玫瑰等观赏植物上已经取得了举世瞩目的成就。然而采用该方法进行育种的一个必要前提就是建立一个稳定、高效的组织培养再生体系。

与其他观赏植物相比，芍药的组织培养难度较大，虽然当前也取得了一定的进展，但主要集中于以种胚、茎段、叶柄、地下茎等为外植体，并且存在愈伤组织诱导率低、褐化严重、芽分化不良、植株再生率偏低等问题，难以为芍药转基因育种提供良好的受体系统。如赵明等人发表的论文‘芍药愈伤组织诱导及遗传转化技术的初步研究’(赵明,张松荣,何小弟,周美艳,曹兆阳.芍药愈伤组织诱导及遗传转化技术的初步研究.林业实用技术,2009,1:10-11.)中阐述了以芍药成熟种子为外植体诱导形成愈伤组织的方法，在6-BA、2,4-D和NAA3种激素配比时愈伤诱导率最高仅为60％。于晓南等人发表的论文(于晓南,吴红娟,潘瞳.4个品种芍药愈伤组织的诱导和分化.湖南农业大学学报(自然科学版),2011，37(2)：166-171.)中阐述了以茎段和叶柄为外植体，通过6-BA、2,4-D和NAA3种激素配比可成功诱导出愈伤组织，但均未能在愈伤组织上诱导出不定芽。王吉凤等人(王吉凤,李青,孟会.5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究.北京林业大学学报,2011,32(3):213-216.)发表的论文‘5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究’中成功诱导出愈伤组织，并分化出不定芽，但其愈伤褐化严重、玻璃化、易碎，芽分化率低，仅有7.95％。CN1675992A公开了一种茎尖无性繁殖的途径，但茎尖的繁殖不经过脱分化过程，不能形成根系，在生产和科研上均无应用价值。CN104304029A同样公开了一种地下茎的无性繁殖途径，依然不适宜转基因研究应用。CN103733995B公开了一种获得芍药组培苗的方法，但该方法是以茎段为外植体进行培养，而在大多数植物中，叶片是公认的用于建立转基因研究的最佳受体系统。孙晓梅等人(孙晓梅,程婉,刘萍,周文强,王丹,杨宏光.芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究.沈阳农业大学学报,2014-02,45(1):24-27.)发表的论文‘芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究’中虽然阐述了以芍药无菌苗的叶片为外植体诱导出愈伤组织，其愈伤诱导率偏低，仅为32.2％，这与芍药遗传转化再生体系的要求相差甚远。为此，研发一种通过芍药叶片高效诱导愈伤组织分化的培养基及培养方法尤为重要。

发明内容

为了解决以芍药叶片为外植体诱导愈伤组织、分化不定芽比率低的技术难题，为芍药基因工程的开展提供了技术支撑。本发明提供了一种以芍药叶片为外植体，诱导愈伤组织，并且分化不定芽的培养基及培养方法，利用该方法可以使芍药叶片的愈伤诱导率高达98.60％，玻璃化率为0％，不定芽分化率可达58.99％，每个愈伤组织块可形成4-10个不定芽，解决了以芍药叶片为外植体诱导愈伤组织、分化不定芽比率低的技术难题，为芍药基因工程的开展提供了技术支撑，市场前景广阔。

本发明所述的通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养基，包括诱导培养基和分化培养基，所述诱导培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ0.1～2.0mg·L^-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，pH为5.8；所述分化培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ0.5～3.0mg·L^-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，水解酪蛋白600mg·L^-1，活性炭1g·L^-1，pH为5.8。

本发明还公开了一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养方法，是在3月下旬选取幼嫩的芍药叶片；叶片灭菌处理后接种于上述诱导培养基，温度25±2℃，暗培养2个月诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织转至上述分化培养基，温度25±2℃，光照时间12h·d^-1，光照强度1200±100lx，培养2个月获得不定芽。

本发明中所述叶片灭菌处理采用酒精与升汞相结合的灭菌方法，具体步骤如下：

①先将幼嫩叶片在流水中冲洗10min，去除外部泥土，再用洗洁精清洗一下，流水冲洗干净；

②将幼嫩叶片置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75％酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5～6次；

③再用0.1％升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5～6次；

④外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去叶片的边缘部分和主脉，切成1cm×1cm的大小接种上，为避免交叉感染，每瓶接种3个叶片。

本发明的有益效果体现在：

(1)芍药叶片的愈伤诱导率可达98.60％，玻璃化率可达0％，解决了愈伤组织诱导率低、质量差的问题，可为通过叶盘介导法进行芍药的转基因育种奠定基础。

(2)不定芽分化率可达58.99％，每个愈伤组织块可形成4-10个不定芽，增殖倍数普遍高于前人文献报道解决了以芍药叶片为外植体芽分化比率低、分化不良的技术难题，可为通过遇上侵染法进行芍药的转基因育种奠定基础。

(3)本发明从叶片到芽分化成功只需经过2个培养基(愈伤诱导培养基、芽分化培养基)，中途转接1次，节省了大量的人力、物力，减少了多次继代过程发生污染的风险，是一种简便、快捷、适合转基因研究的愈伤组织分化的方法。

附图说明

图1是叶片开始膨大。

图2是愈伤组织形成。

图3是愈伤组织开始分化。

图4是愈伤组织分化出芽过程。

具体实施方式

实施例1

以栽植于扬州大学园艺与植物保护学院芍药种质资源圃中的芍药托桂型品种‘紫凤羽’为试材来开展本研究工作：

(1)取材时间：2014年3月28日；

(2)选材：选取幼嫩的叶片；

(3)叶片的灭菌及接种：

嫩叶采回来后，采用酒精与升汞相结合的灭菌方法，具体步骤如下：

①先将幼嫩叶片在流水中冲洗10min，去除外部泥土，再用洗洁精(上海和黄白猫有限公司)清洗一下，流水冲洗干净；

②将幼嫩叶片置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75％酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5～6次；

③再用0.1％升汞(上海中西化工厂)消毒3min，无菌水反复冲洗5～6次；

④外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去叶片的边缘部分和主脉，切成1cm×1cm的大小接种于诱导培养基上，为避免交叉感染，每瓶接种3个叶片，共接种200瓶。

(4)愈伤组织诱导：

①培养基配方：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ 1.0mg·L^-1+椰汁10％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，pH为5.8。TDZ购于北京索莱宝科技有限公司、蔗糖购于上海实验试剂有限公司、琼脂购于北京索莱宝科技有限公司、椰汁购于上海嘉果食品有限公司。

②培养条件：温度25±2℃，暗培养时间2个月。

(5)不定芽分化：将诱导出来饱满鲜绿、结构紧密、又白色突出芽点的愈伤组织块去除褐化部分，接入不定芽分化培养基，每瓶接种3个，共接种200瓶。

①培养基配方：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ 1.0mg·L^-1+椰汁5％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，水解酪蛋白600mg·L^-1，活性炭1g·L^-1，pH为5.8；TDZ购于北京索莱宝科技有限公司、蔗糖购于上海实验试剂有限公司、水解酪蛋白购于生工生物工程(上海)股份有限公司、活性炭购于国药集团化学试剂有限公司、琼脂购于北京索莱宝科技有限公司、椰汁购于上海嘉果食品有限公司。

本发明中所述改良1/2MS基本培养基：

大量元素

硝酸钾 KNO₃ 125mg/L

硝酸铵 NH₄NO₃ 250mg/L

磷酸二氢钾 KH₂PO₄ 275mg/L

硫酸镁 MgSO₄·7H₂O 125mg/L

硝酸钙 Ca(NO₃)₂·4H2O 250mg/L

微量元素

碘化钾 KI 0.83mg/L

硼酸 H₃BO₃ 6.2mg/L

硫酸锰 MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L

硫酸锌 ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L

钼酸钠 Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L

硫酸铜 CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L

氯化钴 CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L

铁盐

乙二胺四乙酸二钠 Na₂·EDTA 37.3mg/L

硫酸亚铁 FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L

有机成分

肌醇 100mg/L

甘氨酸 2mg/L

盐酸硫胺素 VB₁ 0.1mg/L

盐酸吡哆醇 VB₆ 0.5mg/L

烟酸 VB₅ 0.5mg/L

蔗糖 30g/L

琼脂 6.4g/L。

②培养条件：温度25±2℃，光照时间12h·d^-1，光照强度1200±100lx，培养时间2个月。

(5)统计指标及方法：将消毒好的叶片接入愈伤组织诱导培养基中培养60d后开始统计出愈率，玻璃化情况。

出愈率＝出现愈伤组织的叶片数/接种叶片总数×100％；

玻璃化率＝出现玻璃化的愈伤组织数/愈伤组织总数×100％。

在愈伤组织转接入不定芽分化培养基中培养60d后统计芽分化率。

芽分化率＝分化出芽的愈伤组织块/接入的愈伤组织总块数×100％。

(6)结果：将方块状的叶片接种于愈伤组织诱导培养基中进行暗培养，2个星期左右可以观察到如图1所示的膨大叶片，2个月左右可以观察到如图2所示的愈伤组织，出愈率可达98.60％，玻璃化率为0％。在转接入不定芽分化培养基中培养1个月左右可以观察到如图3所示开始分化的愈伤组织，2个月后可见如图4示愈伤组织上分化出来的芽，不定芽分化率为58.99％，每个愈伤组织块可形成4-10个不定芽。

Claims (3)

1.一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养基，包括诱导培养基和分化培养基，其特征在于，所述诱导培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ0.1～2.0mg·L^-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，pH为5.8；所述分化培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ0.5～3.0mg·L^-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，水解酪蛋白600mg·L^-1，活性炭1g·L^-1，pH为5.8。

2.一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

3月下旬选取幼嫩的芍药叶片；叶片灭菌处理后接种于诱导培养基，温度25±2℃，暗培养2个月诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织转至分化培养基，温度25±2℃，光照时间12h·d^-1，光照强度1200±100lx，培养2个月获得不定芽；所述诱导培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ0.1～2.0mg·L^-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，pH为5.8；所述分化培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加TDZ0.5～3.0mg·L^-1+椰汁5～15％，附加蔗糖30g·L^-1，琼脂6.4g·L^-1，水解酪蛋白600mg·L^-1，活性炭1g·L^-1，pH为5.8。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述叶片灭菌处理采用酒精与升汞相结合的灭菌方法，具体步骤如下：

①先将幼嫩叶片在流水中冲洗10min，去除外部泥土，再用洗洁精清洗一下，流水冲洗干净；

②将幼嫩叶片置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75％酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5～6次；

③再用0.1％升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5～6次；

④外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去叶片的边缘部分和主脉，切成1cm×1cm的大小接种上，为避免交叉感染，每瓶接种3个叶片。