CN107926711A - 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，包括以下步骤：选取无菌植株作为外植体供体，将叶片尖部1/2~1/3剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；添加蔗糖和琼脂，灭菌，之前用碱溶液调pH值；接种完用散射光培养，待外植体长出根系再置于光周期的光照下培养生芽；芽体可以迅速生长为植株；优点在于：不添加植物生长调节剂，成本低廉、操作简单、一次成苗、所得植株无玻璃化且生长健壮；取叶片为外植体，不影响供体植物的生长；不经过愈伤组织阶段直接成苗，所得植株的体细胞无性系变异频率较低、能在更大程度上保持供体植株的性状；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
Description
技术领域
本发明属于林木生物技术领域，具体涉及一种黑果枸杞离体快速繁殖方法。
背景技术
黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木，是一种盐生药用植物，重要的生态经济型树种。在我国，黑果枸杞主要分布在宁夏、山西、甘肃、青海、新疆、西藏等省区。黑果枸杞中含有多种人体必需的氨基酸和微量元素，可提高人体免疫能力；黑果枸杞被称为原花青素之王，其原花青素具有清除自由基、增强免疫力、延长果蝇寿命、降低小鼠血清总胆固醇和甘油三脂、升高血清、肝组织和机体总抗氧化能力等功效；从果汁中提取的黑果枸杞色素稳定性好、着色力强，是国内急需的理想食用天然花色甙，不但可应用于药品和食品中，还可作为天然染料应用于轻纺工业。同时，黑果枸杞具有抗旱、抗寒、耐盐碱、根蘖性强和耐土壤贫瘠等诸多优点，是盐碱地治理、护坡、防止水土流失的良好树种。因此，黑果枸杞无论在经济产品开发，还是在生态环境治理方面都具有广泛的市场前景和开发潜力，可以成为医药保健、经济林建设和盐碱地生物防治的重要生态经济型树种。黑果枸杞集经济价值、生态价值、药用价值及保健价值于一身，其价格一直居高不下。近年来，农牧民疯狂采摘让一些野生黑果枸杞植株不再挂果。如何保护并充分合理的开发利用黑果枸杞资源，是非常值得关注的重要课题。目前，黑果枸杞的研究绝大多数集中在对其生理生态、有效成分分析、开发利用以及治理荒漠化和野生种源驯化等方面。有关黑果枸杞的组培无性繁殖，近几年也有报道。但是均在培养基中添加了不同种类和浓度的植物生长调节剂，例如6-BA和NAA等。目前未见在不使用任何植物生长调节剂的条件下建立黑果枸杞离体快速繁殖体系的报道。
发明内容
为了解决黑果枸杞野生资源稀缺、种苗价格高的问题，本发明提供一种高效、快速、低成本的黑果枸杞离体繁殖方法。
一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
1）选取组培瓶内驯化良好的无菌小植株，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿，无菌实生种苗、组培苗均可；无菌种苗要求在组培瓶内生长1个月以上；培养室光周期为12h，光照强度5500~6500 lx，温度24~26℃，相对湿度25~35%；
2）用手术剪在超净工作台内将种苗叶片尖部或中部1/3~1/2剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40g/L的蔗糖和4.0-5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min，之前用碱溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于培养室的散射光或完全黑暗条件下培养7~15 d散射光强度为8~12lx；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12h光周期的弱光或者强光条件下培养，弱光为1000~2000lx，强光为5500~6500lx；此条件下根系基部又会产生芽体；芽体可以迅速生长为植株；以上培养均在培养室内进行，温度24~26℃，湿度25~30%，光源均由LED灯管提供。
3）叶切片接种1~2月，产生的植株便可移栽；
步骤1）中所述的光照强度为6000 lx，温度为25℃，相对湿度30%；
步骤2）中所述的散射光强度为10lx；所述弱光强度为1000lx；所述强光强度为5500lx
步骤2）中所述的培养基添加40g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂；所述的碱溶液为NaOH或KOH；
步骤2）中所述的碱溶液为KOH，pH值调为5.6；
所述的培养室光的光源由LED灯管提供。
本发明提供了一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，包括以下步骤：选取无菌植株作为外植体供体，将叶片尖部1/2~1/3剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；添加蔗糖和琼脂，灭菌，之前用碱溶液调pH值；接种完用散射光培养，待外植体长出根系再置于光周期的光照下培养生芽；芽体可以迅速生长为植株；本发明建立了以黑果枸杞无菌驯化叶片为外植体的离体快速繁殖体系，优点在于：不添加植物生长调节剂，成本低廉、操作简单、一次成苗、不定根产生频率和出芽率均高达100%、周期短、所得植株无玻璃化且生长健壮；取叶片为外植体，不影响供体植物的生长；不经过愈伤组织阶段直接成苗，所得植株的体细胞无性系变异频率较低、能在更大程度上保持供体植株的性状；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
附图说明
图1 叶尖外植体在黑暗条件下生根；
图2叶尖外植体不定根基部产生的芽体迅速成苗。
具体实施方式
实施例1 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌实生种苗或组培植株，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内生长驯化40 d。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12 h，光照由LED灯管提供，光照强度6000 lx。培养室温度25℃，相对湿度30%。
用手术剪在超净工作台内将健康叶片尖部1/3剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加40 g/L的蔗糖和4.5 g/L的琼脂，用1 mol/L的KOH溶液将培养基pH值调为5.6，121℃高压灭菌15 min；将接种完的材料置于10 lx弱光下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达100%，且无玻璃化现象产生；待有效外植体均长出不定根之后（如图1），再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度6000 lx。在此条件下根系基部又会产生多芽体（如图2），出芽率达100%；芽体迅速生长为植株。以上培养均在培养室中进行，温度均为25℃，湿度均为28%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种48 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
实施例2 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌组培植株或种苗，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内驯化40 d。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12 h，光照由LED灯管提供，光照强度6000 lx。培养室温度25 ℃，相对湿度30%。
用手术剪在超净工作台内将健康叶片尖部1/3剪下，远轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加40 g/L的蔗糖和4.5 g/L的琼脂，用1mol/L的KOH溶液将培养基pH值调为5.6，121℃高压灭菌15 min；将接种完的材料置于10 lx弱光下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达100%，且无玻璃化现象产生；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度6000 lx。在此条件下根系基部又会产生芽体，出芽率达22.22%；芽体可以迅速生长为植株。以上培养均在培养室内进行，温度均为25 ℃，湿度均为28%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种48 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
实施例3 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌组培植株或种苗，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内生长驯化1~2个月。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12 h，光照由LED灯管提供，光照强度5500~6500 lx。培养室温度24~26℃，相对湿度25~30%。
用手术剪在超净工作台内将健康叶片中部1/3~1/2横向剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40 g/L的蔗糖和4.3~5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min之前用1mol/L的KOH或NaOH溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于8~12 lx散射光下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达100%，且无玻璃化现象产生；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度5500~6500 lx。在此条件下根系基部又会产生芽体，出芽率达14.29%；芽体可以迅速生长为植株。以上培养均在培养室内进行，温度均为24~26 ℃，湿度均为25~30%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种30~60 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
实施例4 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌组培植株或种苗，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内生长驯化1~2个月。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12 h，光照由LED灯管提供，光照强度5500~6500 lx。培养室温度24~26 ℃，相对湿度25~30%。
用手术剪在超净工作台内将种苗叶片中部1/3~1/2剪下，远轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40 g/L的蔗糖和4.3~5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min之前用1mol/L的KOH或NaOH溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于8~12 lx散射光下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达100%且无玻璃化现象产生；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度5500~6500 lx。在此条件下根系基部又会产生芽体，出芽率达11.11%；芽体可以迅速生长为植株。以上培养均在培养室内进行，温度均为24~26 ℃，湿度均为25~30%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种30~60 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
实施例5 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌实生种苗或组培植株，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内生长驯化1~2个月。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12h，光照由LED灯管提供，光照强度5500~6500 lx。培养室温度24~26 ℃，相对湿度25~30%。
用手术剪在超净工作台内将健康叶片尖部1/3~1/2剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40 g/L的蔗糖和4.3~5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min之前用1mol/L的KOH或NaOH溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于完全黑暗条件下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达83.33%，且无玻璃化现象产生；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度1000~2000 lx。在此条件下根系基部又会产生芽体，出芽率6.00%；芽体可以迅速生长为植株。以上培养均在培养室内进行，温度均为24~26 ℃，湿度均为25~30%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种30~60 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
实施例6 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌实生种苗或组培植株，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内生长驯化1~2个月。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12h，光照由LED灯管提供，光照强度5500~6500 lx。培养室温度24~26 ℃，相对湿度25~30%。
用手术剪在超净工作台内将健康叶片尖部1/3~1/2剪下，远轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40 g/L的蔗糖和4.3~5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min之前用1mol/L的KOH或NaOH溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于完全黑暗条件下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达94.00%，且无玻璃化现象产生；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度1000~2000 lx。在此条件下根系基部又会产生芽体，出芽率12.50%；芽体可以迅速生长为植株。以上培养均在培养室内进行，温度均为24~26 ℃，湿度均为25~30%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种30~60 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
实施例7 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌组培植株或种苗，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内生长驯化1~2个月。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12 h，光照由LED灯管提供，光照强度5500~6500 lx。培养室温度24~26 ℃，相对湿度25~30%。
用手术剪在超净工作台内将健康叶片中部1/3~1/2横向剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40 g/L的蔗糖和4.3~5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min之前用1mol/L的KOH或NaOH溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于完全黑暗下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达90.91%，且无玻璃化现象产生；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度1000~2000 lx。在此条件下根系基部又会产生芽体，出芽率达27.27%；芽体可以迅速生长为植株。以上培养均在培养室内进行，温度均为24~26 ℃，湿度均为25~30%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种30~60 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
实施例8 一种黑果枸杞离体快速繁殖方法
选取组培瓶内驯化良好的无菌组培植株或种苗，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿。种苗已在组培瓶内生长驯化1~2个月。组培苗参照专利201610206401.1的方法获取或者按照本专利方法获取。培养室光周期为12 h，光照由LED灯管提供，光照强度5500~6500 lx。培养室温度24~26 ℃，相对湿度25~30%。
用手术剪在超净工作台内将种苗叶片中部1/3~1/2剪下，远轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40 g/L的蔗糖和4.3~5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min之前用1mol/L的KOH或NaOH溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于完全黑暗条件下培养7~15 d，叶片切口处可直接生根，生根率达12.50%，外植体璃化率为22.22%；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12 h光周期条件下培养，光照强度1000~2000 lx。在此条件下根系基部又会产生芽体，出芽率达12.50%；芽体可以迅速生长为植株。以上培养均在培养室内进行，温度均为24~26 ℃，湿度均为25~30%，光源均由LED灯管提供。
叶切片接种30~60 d，将植株进行移栽。移栽方法参照专利201710307900.4进行；植株移栽之后生长良好，成活率高达100%。
Claims (6)
1.一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，包括以下步骤：
1）选取组培瓶内驯化良好的无菌小植株，要求植株健康幼嫩、尚未木质化、生长旺盛、叶片浓绿，无菌实生种苗、组培苗均可；无菌种苗要求在组培瓶内生长1个月以上；培养室光周期为12h，光照强度5500~6500 lx，温度24~26℃，相对湿度25~35%；
2）用手术剪在超净工作台内将种苗叶片尖部或中部1/3~1/2剪下，近轴面朝下平接在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上；培养基添加35~40g/L的蔗糖和4.0-5.0 g/L的琼脂，121℃高压灭菌15~20 min，之前用碱溶液将pH值调为5.4~5.8；将接种完的材料置于培养室的散射光或完全黑暗条件下培养7~15 d散射光强度为8~12lx；待有效外植体均长出根系之后，再将材料置于12h光周期的弱光或者强光条件下培养，弱光为1000~2000lx，强光为5500~6500lx；此条件下根系基部又会产生芽体；芽体可以迅速生长为植株；以上培养均在培养室内进行，温度24~26℃，湿度25~30%，光源均由LED灯管提供；
3）叶切片接种1~2月，产生的植株便可移栽；
步骤1）中所述的光照强度为6000 lx，温度为25℃，相对湿度30%；
步骤2）中所述的散射光强度为10lx；所述弱光强度为1000lx；所述强光强度为5500lx
步骤2）中所述的培养基添加40g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂；所述的碱溶液为NaOH或KOH；
步骤2）中所述的碱溶液为KOH，pH值调为5.6。
2.根据权利要求1所述的一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，其特征在于：步骤1）中所述的光照强度为6000 lx，温度为25℃，相对湿度为30%。
3.根据权利要求1或2所述的一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，其特征在于：步骤2）中所述的散射光强度为10lx；所述弱光强度为1000lx；所述强光强度为5500lx。
4.根据权利要求3所述的一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，其特征在于：步骤2）中所述的培养基添加40g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂；所述的碱溶液为NaOH或KOH。
5.根据权利要求4所述的一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，其特征在于：步骤2）中所述的碱溶液为KOH，pH值调为5.6。
6.根据权利要求5所述的一种黑果枸杞离体快速繁殖方法，其特征在于：所述的培养室光的光源为LED灯管提供。
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| 马彦军等: "黑果枸杞组织培养快繁技术研究", 《林业科技通讯》 * |
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| CN107926711B (zh) | 2020-12-29 |
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