CN112913692B - 一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，包括以下步骤：选取5月初刚采收的方竹种子作为外植体材料，经过预处理、消毒、接种、丛芽诱导、培养和生根生成组培苗。本发明填补了方竹种子通过种子作为外植体快速繁殖得到丛苗的空白，以方竹种子为外植体材料，结合不同生长调节剂的组合，设计出适合诱导方竹丛芽和生根的培养基，完成方竹种子生根苗仅为20周左右，且能在短时间内获得大量丛芽，有效解决了方竹繁殖困难，克服了传统的母株移栽效率低、运输成本高等缺点。

Description

一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法。
背景技术
方竹属（Chimonobambusa）由日本学者牧野富太郎(Tomitaro Makino) 于1914年发表成立，当时方竹属只有寒竹一个种。寒竹原产我国和日本，早在19世纪，就被引种到英国。方竹属的竹种在长期演化过程中逐渐适应寒冷、喜湿和耐阴的环境，因此，它们主要分布在中高海拔的山地。方竹的自然分布在秦岭以南各省区和西藏南部，但集中分布的地区在贵州、四川、重庆和云南等省区。向南延伸至越南和缅甸，向东延伸至日本。其中寒竹、方竹等观赏价值以及经济价值较高的竹种被广泛引种栽培。
据确切记载，方竹曾经于1935-1938年在重庆南川的金佛山和相邻贵州省桐梓县的柏芷山和箐坝大山大面积开花。自1985年至今，方竹分布区内又出现多地零星开花现象，面积在半亩到十亩不等（张弘,邹家云,王永燕.桐梓县金佛山方竹开花结实的探讨.竹子研究汇刊. 1994,13(2):66-69）。方竹的果实与我们常见的水稻、小麦和玉米等禾本科植物的果实一样，都属于颖果。但不同的是方竹的果实成熟时含水量较高，果皮（种皮）大多呈绿色或略带一点紫色。因此，也称为浆果状颖果。近年来，桐梓县利用方竹的实生苗进行大规模的造林。
随着人们生活水平和文化水平的提高，竹子的经济价值逐渐凸显，其重要性愈加突出。方竹笋乃纯天然保健食品，为笋中之王，世界一绝，中国独有。一直以来，竹子繁殖主要以移竹、竹蔸、埋鞭、埋秆、埋节等传统方法为主，这些方法具有消耗母竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点，尤其对资源稀少的珍贵竹种来说，传统的繁殖方法受到了较大限制，难以快速规模化发展资源。针对这些问题，近几年人们开始研究竹类植物新的繁殖方法，其中最直观有效的就是竹类组织培养获得再生植株。
国内有关竹子的组织培养最早开始于20世纪90年代，此后，关于竹类植物组织培养的研究日益增多，竹子的快繁技术受到愈来愈多的重视。目前对竹子以芽繁芽途径大多数均采用秆茎段的方式，而关于通过以方竹种子为外植体高效快繁的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，以缓解方竹鲜笋市场集中供应，造成产品积压、价格下降、竹农收益降低的问题，具有广泛的经济价值和推广意义。
本发明的目的是提供一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，包括以下步骤：
S1外植体的预处理:选取5月初刚采收的方竹种子作为外植体材料，先将种子用洗洁精洗净，流水下冲洗4～5h，然后用吐温80浸泡10min，流水下再冲洗0.5～1h；
S2外植体的消毒: 在无菌操作台上，将步骤S1处理好的方竹种子经70-80%酒精灭菌处理45-60s，无菌水冲洗3～5次，再用质量百分比为10%的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水冲洗3～5次；
S3接种: 将步骤S2消毒后的种子接种至MS+2mg/L 6-BA基本培养基上；
S4丛芽诱导: 将得到的无菌方竹种子接种至MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L KT诱导培养基上进行丛芽诱导，诱导25 d后方竹种子先后生出具根以及2～3个芽的小苗；
S5丛芽培养: 将步骤S4中长有2～3个芽的小苗剪掉根及种子，并接种至MS+4mg/L6-BA+0.5mg/L TDZ增殖培养基中，培养40d后至丛芽形成，在增殖培养基中继代2次，至大量丛芽形成；
S6生根培养:将步骤S5得到的丛苗接种至生根培养基MS+4mg/L 6-BA+1mg/L NAA,培养30d至生根组培苗形成。
作为优选，所述基本培养基、诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中均含有30g/L蔗糖和2.25g/L植物凝胶。
作为优选，步骤S2中所述次氯酸钠溶液中滴加有3～4滴吐温80。
作为优选，步骤S3、S4、S5和S6中培养温度为25±1℃。
作为优选，步骤S3、S4、S5和S6中光周期为14h光照/10h黑暗。
作为优选，步骤S3、S4、S5和S6中培养物表面的光照强度为3000lx。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明填补了方竹种子通过种子作为外植体快速繁殖得到丛苗的空白，以方竹种子为外植体材料，结合不同生长调节剂的组合，设计出适合诱导方竹丛芽和生根的培养基，完成方竹种子生根苗仅为20周左右，且能在短时间内获得大量丛芽，有效解决了方竹繁殖困难，克服了传统的母株移栽效率低、运输成本高等缺点，且不受季节的限制，为方竹的快速繁殖奠定了坚实的基础，对于实现方竹规模化育苗具有重要的意义，是一种方便、快捷和有效的方竹再生植株培养方法。
附图说明
图1为方竹的外植体材料种子图；
图2为消毒处理后方竹种子图；
图3为方竹种子在基本培养基上培养7d后的生长状态图；
图4为方竹小苗剪掉根和种子后在增殖培养基上生长状态图；
图5为方竹在增殖培养基上增殖40 d后丛芽萌发的生长状态图；
图6为方竹丛芽在增殖培养基上继续增殖35 d后的生长状态图；
图7为方竹丛芽在生根培养基上生长40 d后生根苗生长状态图。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中，基本培养基、诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中均含有30g/L蔗糖和2.25g/L植物凝胶，以上培养基在灭菌前将pH调到5.8，灭菌条件为121℃，20min，培养温度为25±1℃，光周期为14h/黑暗10h，培养物表面的光照强度为3000lx。
本发明的目的是提供一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，包括以下步骤：
S1外植体的预处理:选取如图1所示的5月初刚采收的方竹种子作为外植体材料，先将种子用洗洁精洗净，流水下冲洗4h，然后用吐温80浸泡10min，流水下再冲洗0.5h；
S2外植体的消毒: 在无菌操作台上，将步骤S1处理好的方竹种子经70%酒精灭菌处理45s，无菌水冲洗3～5次，再用质量百分比为10%的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水冲洗3～5次，次氯酸钠溶液中滴加有3～4滴吐温80。通过以上消毒方法处理后的方竹种子接种后，不同消毒剂处理不同时间对方竹种子无菌培养的影响，如表1所示。
Figure 405377DEST_PATH_IMAGE001
S3接种: 将步骤S2消毒后的种子接种至MS+2mg/L 6-BA基本培养基上；
S4丛芽诱导: 将得到的无菌方竹种子接种至MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L KT诱导培养基上进行丛芽诱导，如图4所示，7d后芽生长至1～2cm，继续诱导18d后方竹种子先后生出具根以及2～3个芽的小苗；
S5: 在无菌条件下，将步骤S4中长有2～3个芽的小苗剪掉根和种子，并接种至9种增殖培养基中，其配方如表2所示，培养40d后至丛芽形成，如图5所示，在增殖培养基中继代2次，至大量丛芽形成，如图6所示；
Figure 119255DEST_PATH_IMAGE002
由表2可知，增殖培养基的配方为MS+4mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ时，丛芽增殖系数最高。
S6:将步骤S5得到的丛苗接种至9种生根培养基中，其配方如表3所示，培养30d至生根组培苗形成，得到完整苗，如图7所示。由表3可知，生根培养基配方为MS+4mg/L 6-BA+1mg/L NAA时，丛芽生根率最高。
Figure 56249DEST_PATH_IMAGE003
本发明填补了方竹种子通过种子作为外植体快速繁殖得到丛苗的空白，以方竹种子为外植体材料，结合不同生长调节剂的组合，设计出适合诱导方竹丛芽和生根的培养基，完成方竹种子生根苗仅为20周左右，且能在短时间内获得大量丛芽，有效解决了方竹繁殖困难，克服了传统的母株移栽效率低、运输成本高等缺点，且不受季节的限制，为方竹的快速繁殖奠定了坚实的基础，对于实现方竹规模化育苗具有重要的意义，是一种方便、快捷和有效的方竹再生植株培养方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何的简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1外植体的预处理:选取5月初刚采收的方竹种子作为外植体材料，先将种子用洗洁精洗净，流水下冲洗4～5h，然后用吐温80浸泡10min，流水下再冲洗0.5～1h；
S2外植体的消毒: 在无菌操作台上，将步骤S1处理好的方竹种子经70-80%酒精灭菌处理45-60s，无菌水冲洗3～5次，再用质量百分比为10%的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水冲洗3～5次；
S3接种: 将步骤S2消毒后的种子接种至MS+2mg/L 6-BA基本培养基上；
S4丛芽诱导: 将步骤S3得到的无菌方竹种子接种至MS+3mg/L 6-BA +0.5mg/L KT诱导培养基上进行丛芽诱导，诱导25 d后方竹种子先后生出具根以及2～3个芽的小苗；
S5丛芽培养: 将步骤S4中长有2～3个芽的小苗剪掉根和种子，并接种至MS+4mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ增殖培养基中，培养40d后至丛芽形成，在增殖培养基中继代2次，至大量丛芽形成；
S6生根培养:将步骤S5得到的丛芽接种至生根培养基MS+4mg/L 6-BA+1mg/L NAA,培养30d至生根组培苗形成。
2.根据权利要求1所述的一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，其特征在于，所述基本培养基、诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中均含有30g/L蔗糖和2.25g/L植物凝胶。
3.根据权利要求1所述的一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，其特征在于，步骤S2中所述次氯酸钠溶液中滴加有3～4滴吐温80。
4.根据权利要求1所述的一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，其特征在于，步骤S3、S4、S5和S6中培养温度为25±1℃。
5.根据权利要求1所述的一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，其特征在于，步骤S3、S4、S5和S6中光周期为14h光照/10h黑暗。
6.根据权利要求5所述的一种以方竹种子为外植体高效繁育的方法，其特征在于，步骤S3、S4、S5和S6中培养物表面的光照强度为3000lx。
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