CN112920986B - 一种利用人参干细胞发酵生产人参皂苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用人参干细胞发酵生产人参皂苷的方法，包括：(1)制备人参干细胞初级种子；(2)一级培养：将(1)中的初级种子接种到一级培养发酵罐中，在通气量0.02‑0.2vvm下发酵培养20‑25天后，作为一级种子；(3)二级培养：将(2)中的一级种子接种到二级培养发酵罐中，在通气量0.02‑0.2vvm下发酵培养20‑30天后，作为二级种子；(4)三级培养：将(3)中的二级种子接种到三级培养发酵罐中，在通气量0.05‑0.5vvm下发酵培养30‑40天，结束发酵，过滤收集干细胞，检测人参皂苷含量。本发明采用多级发酵生产人参皂苷的方法，干细胞生长速率快且稳定，产生的人参皂苷含量高，耗费时间短，提高了生产效率。

Description

一种利用人参干细胞发酵生产人参皂苷的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一种利用人参干细胞发酵生产人参皂苷的方法。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)是五加科人参属植物，分布于中国、日本、韩国，其根茎是名贵的中药材，号称“百草之王”。人参味甘、微苦，微温，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效，多用于体恤欲脱，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，惊悸失眠等。人参皂苷是人参主要的活性成分，有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生产等功效。近年来，人参被广泛地用在各类化妆品、保健品、饮品中，人参的市场前景非常广阔。
目前由于过度采挖、环境破坏等，野生人参资源几乎灭绝，大田栽培是人参的主要来源。然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，栽培技术复杂以及农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。大田栽培人参供应难以满足市场的需求。人参组织培养技术周期短，不受季节限制，容易进行大规模的工业化生产，具有很大的发展前景。
目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，培养的人参中还存在人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求的问题。
人参干细胞是未分化的细胞，具有无限分裂能力，目前可以通过分离与培养人参的干细胞来生产人参相关的药物活性成分。目前现有技术在分离人参干细胞时，均采用已经分化的组织器官为外植体，通过立体培养阶段的培养(脱分化过程)将其诱导为具有分化能力的愈伤组织细胞。但这种细胞本质来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化生产中，容易出现细胞系退化，分裂能力弱。而人参不定根的根尖部分具有分生组织，分裂能力较强。现有的利用人参干细胞发酵生产药物活性成分的方法中，存在干细胞生长不稳定、产生的活性成分含量低、耗费时间长等缺陷。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种利用人参干细胞发酵生产人参皂苷的方法。本发明采用多级发酵生产人参皂苷的方法，干细胞生长速率快且稳定，产生的人参皂苷含量高，耗费时间短，提高了生产效率。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种利用人参干细胞发酵生产人参皂苷的方法，包括：
(1)制备人参干细胞初级种子；
(2)一级培养：将(1)中的初级种子接种到一级培养发酵罐中，在通气量0.02-0.2vvm下发酵培养20-25天后，作为一级种子；
(3)二级培养：将(2)中的一级种子接种到二级培养发酵罐中，在通气量0.02-0.2vvm下发酵培养20-30天后，作为二级种子；
(4)三级培养：将(3)中的二级种子接种到三级培养发酵罐中，在通气量0.05-0.5vvm下发酵培养30-40天，结束发酵，过滤收集干细胞，检测人参皂苷含量。
本发明采用多级发酵生产人参皂苷的方法，通过控制每级发酵培养的工艺条件，使干细胞生长速率快且稳定，产生的人参皂苷含量高，耗费时间短，提高了生产效率。
进一步的方案，步骤(2)中，接种的初级种子的质量占一级发酵罐中液体培养基体积的1-5％，在20-25℃下进行发酵培养。
进一步的方案，步骤(3)中，接种的一级种子的质量占二级发酵罐中液体培养基体积的1-8％，在20-25℃下进行发酵培养。
进一步的方案，步骤(4)中，接种的二级种子的质量占三级发酵罐中液体培养基体积的5-10％，在22-26℃下进行发酵培养。
进一步的方案，所述一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐的容积逐级增大；
优选的，一级发酵罐的容积为5L，二级发酵罐的容积为50L，三级发酵罐的容积为500L。
进一步的方案，本发明中，一级、二级、三级发酵的过程，接种量逐级增大，培养温度逐级升高，通气量逐级增大，均有助于干细胞快速、稳定的生长，有助于提高人参皂苷的含量。
进一步的方案，步骤(2)-步骤(4)中，采用的液体培养基包括：2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；
优选的，液体培养基包括：3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。
本发明中，制备人参干细胞初级种子的方法可以采用现有技术中的方法，也可以采用本申请中改进的人参干细胞的初级种子的制备方法。本申请的初级种子的制备方法能够获得活力高的干细胞初级种子。
作为一种优选的实施方式，本发明中制备人参干细胞初级种子的方法，包括：
(1)采用一步法培养人参不定根；
(2)取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；
(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团；
(4)继代培养：将(3)获得的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，暗培养；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，暗培养，获得人参干细胞。
人参不定根的根尖部分具备更多的分生组织，本发明的人参干细胞的分离培养方法，直接从获得的人参不定根的根尖部分解剖分离得到，不需要渗透环境筛选，不需要渗透剂，既能够节省步骤，缩短时间，也能够节约成本。
本发明的分离后的人参干细胞，依次在组成和配比适宜的干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基、干细胞液体培养基上暗培养，人参干细胞生长速度快，能够快速得到人参干细胞。
本发明采用一步法从成熟人参培养人参不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从成熟参一步诱导得到不定根，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间。
进一步的方案，步骤(3)中，所述干细胞诱导培养基包括2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基。
作为一种优选的实施方式，所述干细胞诱导培养基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶1.8g/L1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基。
本发明的干细胞诱导培养基中，含有吲哚乙酸、赤霉素和激动素，可以诱导干细胞生长，抗坏血酸和柠檬酸能够产生协同抗氧化的作用。该诱导培养基中各个成分协同作用，能够使干细胞在初期快速生长。
进一步的方案，步骤(4)中，所述干细胞继代培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；
作为一种优选的实施方式，所述干细胞继代培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/LWPM培养基。
本发明的干细胞继代培养基中，含有2,4-二氯苯氧乙酸、赤霉素和激动素，使干细胞生长速度大大增加。
进一步的方案，步骤(3)和(4)中，在20-25℃下黑暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团。
进一步的方案，步骤(5)中，干细胞液体培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/LWPM培养基；
作为一种优选的实施方式，干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。
进一步的，步骤(5)中，在20-25℃，100-150rpm下黑暗培养，3-5周传代一次。
进一步的方案，本发明中的干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基和干细胞液体培养基的pH为5.6-6.0。
进一步的方案，本发明中干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基和干细胞液体培养基的pH采用NaOH或KOH调节，有利于干细胞生长。
进一步的方案，步骤(2)中，取(1)中培养的人参不定根的根尖部分，在显微镜下观察根尖部分，根据干细胞的特征确定干细胞区域，显微操作解剖、切割获得根尖干细胞区域。
在显微镜下观察根尖部分，细胞形状、排列不规则部分为生长点，即分生组织细胞聚集区域，此区域细胞中含有多个液泡。显微操作解剖刀切割获得根尖干细胞区域。
进一步的方案，步骤(1)中，本发明中采用一步法培养人参不定根的培养方法，具体包括：
将成熟人参清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到诱导培养基中继代培养扩繁；然后将获得的人参不定根剪切成段，接种到液体培养基中培养获得不定根。
目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，培养的人参中还存在人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求的问题。
鉴于成熟人参参龄较长，成熟度高，不易再进行分化，目前还没有可以直接从成熟人参诱导不定根的报道。而本发明经过大量的试验，意外的发现在特定诱导培养基上，成熟人参切片可以直接诱导产生不定根，如此，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从成熟参一步诱导得到不定根，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间。
进一步的方案，所述诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.2-1mg/L赤霉素，0.1-0.6mg/L激动素，0.75-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基。
上述方案的诱导培养基，实现了成熟参的各个部分直接诱导产生不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，从而可以简化诱导步骤、缩短诱导时间。
本方案中，萘乙酸是植物生长调节剂，赤霉素是植物激素，都可以促进不定根形成。激动素为一种细胞分裂素，可以促进细胞的分裂。柠檬酸和抗坏血酸能够产生协同抗氧化的作用，防止成熟人参离体组织褐变，有利于从成熟参离体组织直接诱导不定根。诱导培养基中各个成分协同作用，最终实现了从成熟参的各个部分直接诱导产生不定根，而不需要诱导愈伤组织的中间步骤。
进一步的方案，所述诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/LWPM培养基。
上述成分配比下的诱导培养基，对成熟参的产生不定根的诱导效果最好，产生的不定根数量多，质量好，有利于下一步扩繁，提高不定根中的活性成分含量。
进一步的方案，所述液体培养基为以B5培养基、WPM培养基或者以1/2MS培养基为基础培养基，含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖。
本发明中，对诱导产生的不定根进行进一步的液体培养时，可以采用常规培养的培养基，如1/2MS培养基，与常用的不定根的培养基保持一致，说明通过本发明一步法诱导产生的不定根，与其他两步法无异，均可以采用常规培养基培养，同时还缩短了诱导时间，降低了污染风险。
进一步的方案，所述切片为宽0.5-0.7cm、长0.5-0.7cm和厚0.2-0.5mm的薄片。
进一步的方案，所述成熟人参的参龄为3年以上；
优选的，成熟人参的参龄为6年以上；
作为一种优选的实施方案，所述成熟人参为百年人参。
百年人参在自然界非常罕见，具有很高的食用、药用价值，可补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智；其价值远大于种植的参龄短的人参。本发明不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从百年人参切块直接一步诱导获得不定根，不但可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，还可以获得母本百年老参中特有的功能成分，从而获得营养价值更好的不定根。
进一步的方案，将所述成熟人参的主根部、或芦头、或艼部、或支根、或须根清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根。
进一步的方案，所述人参选自野山参、移山参，林下参，园参；
优选的，所述人参为野山参。
作为一种具体的优选实施方式，步骤(1)中，一步法培养不定根的步骤具体包括：
(1)不定根的诱导
清洗成熟人参的主根部，消毒除菌后，切成宽0.5-0.7cm、长0.5-0.7cm和厚0.2-0.5mm的薄片，接种到含有4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基的诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出人参不定根。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的人参不定根接种到和步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的人参不定根，剪切成长度为1-2cm左右的组织，接种到含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖的液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根。
进一步的方案，本发明中的诱导培养基和液体培养基的pH为5.6-6.0。
进一步的方案，本发明中诱导培养基和液体培养基的pH采用NaOH或KOH调节，有利于不定根生长。
需要说明的是本发明中，WPM培养基、B5培养基、1/2MS培养基等为现有技术中已知的培养基。
1/2MS培养基
成分(mg/L)：硝酸钾950，硝酸铵825，二水氯化钙220，硫酸镁185，磷酸二氢钾85，硫酸锰11.15，硫酸锌4.3，硼酸3.1，碘化钾0.415，钼酸钠0.125，硫酸铜0.0125，氯化钴0.0125，乙二胺四乙酸二钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，盐酸0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫铵0.1。
B5培养基
成分(mg/L)：硝酸钾KNO3 2500，MgSO4·7H2O 250，CaCl2·2H2O 150，(NH4)2SO4134，NaH2PO4.H2O 150，KI 0.75，H3BO3 3.0，MnSO4·4H2O 10，ZnSO4·7H2O 2.0，Na2MoO4·2H2O0.25，CoCl2·6H2O 0.025，CuSO4·5H2O 0.025，Na2-EDTA 37.3，FeSO4·7H2O 27.8，肌醇100，烟酸1.0，盐酸吡哆醇1.0，盐酸硫铵10。
木本植物用培养基(WPM，Woody Plant medium)
成分(mg/L)：硝酸铵400，四水硝酸钙556，硫酸钾990，无水氯化钙72，磷酸二氢钾170，二水钼酸钠0.25，无水硫酸镁180，一水合硫酸锰22.4，七水合硫酸锌8.6，五水合硫酸铜0.25，七水合硫酸亚铁27.8，乙二胺四乙酸二钠37.3，肌醇100，维生素B1 1，烟酸0.5，维生素B6 0.5，甘氨酸2，pH 5.2。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明采用多级发酵生产人参皂苷的方法，干细胞生长速率快且稳定，耗费时间短，提高了生产效率。与成熟参切片相比，本发明利用人参干细胞进行多级发酵产生的人参皂苷含量大大增加，接近成熟参皂苷含量的两倍。
2、本发明在显微镜下观察根尖部分，细胞中含有多个液泡的为分生组织，也就是干细胞区域，直接从获得的人参不定根的根尖部分解剖分离得到，不需要渗透环境筛选，不需要渗透剂，既能够节省步骤，缩短时间，也能够节约成本。
3、本发明的分离后的人参干细胞，依次在组成和配比适宜的干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基、干细胞液体培养基上暗培养，人参干细胞生长速度快，能够快速得到人参干细胞初级种子。
4、本发明采用的人参不定根，采用一步法培养获得，将成熟人参的各部分处理后接种到诱导培养基中直接诱导出人参不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，降低污染风险。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是采用本发明实施例1诱导培养基诱导不定根的示意图；
图2是本发明实施例7中培养获得的干细胞初级种子在显微镜下放大1000倍后的细胞图像；
图3是采用对比例1的诱导培养基诱导不定根的示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
需要说明的是，本发明中没有具体限定的制备方法或者检测方法，均可以采用本领域现有技术中能够实现其目的的方法进行。
实施例1
(1)不定根的诱导
将20年龄的野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在130rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
本实施例中，步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图1所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，成熟野山参切片上直接诱导产生了不定根。
实施例2
(1)不定根的诱导
将10年龄的野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.4mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1.5cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在120rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。
实施例3
(1)不定根的诱导
将6年龄的园参的芦头清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括6mg/L萘乙酸，0.2mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，1.2g/L柠檬酸，0.1g/L抗坏血酸，20g/L蔗糖、5g/L植物凝胶，4g/L B5培养基和1.8g/L WPM培养基，pH值为5.6。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在110rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.6。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。
实施例4
(1)不定根的诱导
将15年龄的林下参的艼部清洗、消毒除菌后，切成宽0.7cm、长0.7cm和厚0.5mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括5mg/L萘乙酸，1mg/L赤霉素，0.1mg/L激动素，0.75g/L柠檬酸，0.03g/L抗坏血酸，40g/L蔗糖，4g/L植物凝胶，2g/L B5培养基和1g/L WPM培养基，pH值为6.0。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为2cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在130rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，WPM培养基和30g/L蔗糖，pH值为6.0。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。
实施例5
(1)不定根的诱导
将20年龄的移山参的主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.4mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括1mg/L萘乙酸，0.5mg/L赤霉素，0.6mg/L激动素，1.5g/L柠檬酸，1g/L抗坏血酸，50g/L蔗糖、6g/L植物凝胶，1g/L B5培养基和2.4g/L WPM培养基，pH值为5.7。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，B5培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.7。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。
实施例6
(1)不定根的诱导
将百年野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。
(2)不定根的继代培养
将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；
(3)不定根的培养
将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在130rpm摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。
与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。
实施例7利用人参干细胞发酵生产人参皂苷
(一)制备人参干细胞初级种子：
(1)采用实施例2制备得到的人参不定根；
(2)不定根根尖干细胞的分离：取(1)中的野山参不定根根尖，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；
(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中，22℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞诱导培养基包括：3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基，pH为5.8；
(4)继代培养：挑取部分(3)得到的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，22℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞继代培养基包括：3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基，pH为5.8；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，22℃、120rpm下黑暗培养，4周传代一次，获得人参干细胞初级种子；
干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；pH为5.8。
(二)一级培养：将(一)中的初级种子接种到一级培养发酵罐(5L)中，接种的初级种子的质量占一级发酵罐中液体培养基体积的4％，液体培养基包括3mg/L2,4-D，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；在22℃、通气量0.08vvm下发酵培养20-25天后，作为一级种子；
(三)二级培养：将(二)中的一级种子接种到二级培养发酵罐(50L)中，接种的一级种子的质量占二级发酵罐中液体培养基体积的5％，液体培养基包括3mg/L2,4-D，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；在22℃、通气量0.1vvm下发酵培养20-30天后，作为二级种子；
(四)三级培养：将(三)中的二级种子接种到三级培养发酵罐(500L)中，接种的二级种子的质量占三级发酵罐中液体培养基体积的8％，液体培养基包括3mg/L2,4-D，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；在24℃、通气量0.3vvm下发酵培养30-40天，结束发酵，过滤收集干细胞，检测人参皂苷含量。
实施例8利用人参干细胞发酵生产人参皂苷
(一)制备人参干细胞初级种子：
(1)采用实施例3制备得到的人参不定根；
(2)不定根根尖干细胞的分离：取(1)中的人参不定根根尖，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中，25℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞诱导培养基包括：4mg/L赤霉素，0.6mg/L激动素，2mg/L吲哚乙酸，75mg/L抗坏血酸，50mg/L柠檬酸，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，2.4g/L 1/2MS培养基，1g/L B5培养基，pH为5.8；
(4)继代培养：挑取部分(3)得到的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，25℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞继代培养基包括：2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L植物凝胶，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基，pH为5.8；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，25℃、150rpm下黑暗培养，3周传代一次，获得人参干细胞初级种子；
干细胞液体培养基包括2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基，pH为5.8；
(二)一级培养：将(一)中的初级种子接种到一级培养发酵罐(5L)中，接种的初级种子的质量占一级发酵罐中液体培养基体积的5％，液体培养基包括2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基；在25℃、通气量0.2vvm下发酵培养20-25天后，作为一级种子；
(三)二级培养：将(二)中的一级种子接种到二级培养发酵罐(50L)中，接种的一级种子的质量占二级发酵罐中液体培养基体积的8％，液体培养基包括2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基；在25℃、通气量0.2vvm下发酵培养20-30天后，作为二级种子；
(四)三级培养：将(三)中的二级种子接种到三级培养发酵罐(500L)中，接种的二级种子的质量占三级发酵罐中液体培养基体积的10％，液体培养基包括2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基；在25℃、通气量0.5vvm下发酵培养30-40天，结束发酵，过滤收集干细胞，检测人参皂苷含量。
实施例9利用人参干细胞发酵生产人参皂苷
(一)制备人参干细胞初级种子：
(1)采用实施例4制备得到的人参不定根；
(2)不定根根尖干细胞的分离：取(1)中的野山参不定根根尖，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；(3)分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中，20℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞诱导培养基包括：2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，4mg/L吲哚乙酸，15mg/L抗坏血酸，150mg/L柠檬酸，60g/L蔗糖，1g/L植物凝胶，1g/L 1/2MS培养基，2.5g/L B5培养基，pH为5.8；
(4)继代培养：挑取部分(3)得到的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，22℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；
干细胞继代培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基，pH为5.8；
(5)液体培养：将(4)获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，22℃、120rpm下黑暗培养，4周传代一次；人参干细胞初级种子；干细胞液体培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基，pH为5.8。
(二)一级培养：将(一)中的初级种子接种到一级培养发酵罐(5L)中，接种的初级种子的质量占一级发酵罐中液体培养基体积的2％，液体培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基；在20℃、通气量0.02vvm下发酵培养20-25天后，作为一级种子；
(三)二级培养：将(二)中的一级种子接种到二级培养发酵罐(50L)中，接种的一级种子的质量占二级发酵罐中液体培养基体积的2％，液体培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基；在20℃、通气量0.05vvm下发酵培养20-30天后，作为二级种子；
(四)三级培养：将(三)中的二级种子接种到三级培养发酵罐(500L)中，接种的二级种子的质量占三级发酵罐中液体培养基体积的5％，液体培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基；在22℃、通气量0.1vvm下发酵培养30-40天，结束发酵，过滤收集干细胞，检测人参皂苷含量。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
本对比例步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图3所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，采用对比例1的培养基无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
结果，与对比例1图片展示类似，无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚乙酸，WPM，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。
结果：第一周，通体颜色变黄，第三周，颜色加深，中部开始变成褐色，第五周，全部变成褐色，并呈干枯状。
试验例1
本试验例将实施例7-9制备得到的野山参干细胞和实施例2中所用的野山参切片进行人参皂苷含量检测。
1、皂苷检测方法
(1)原理
试样经提取等前处理后，经C18色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，外标法定量测定人参皂苷各组分的含量。
(2)试剂
甲醇(CH4O)：色谱纯乙腈(C6H11N)：色谱纯
标准试剂：人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rf、Rb2、Rb3、Rg2、Rd、F1
(3)分析步骤
人参干细胞样品制备：
将实施例7-9最终得到的人参干细胞样品用水清洗三次、在研钵中磨碎成糊状、超声破壁、冻干后，样品在研钵上研细，准确称取50mg于10ml离心管中，加入70％甲醇溶液，涡旋。于超声振荡器上超声10分钟，重复两次，过滤备用。
野山参样品制备：
将野山参切片样品用水清洗三次、在研钵中磨碎成糊状、超声破壁、冻干后，样品在研钵上研细，准确称取50mg于10ml离心管中，加入70％甲醇溶液，涡旋。于超声振荡器上超声10分钟，重复两次，过滤备用。
标准品制备：
储备液的配制(0.8mg/ml)：分别称取8.00mg人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rf、Rb2、Rb3、Rg2、Rd、F1等标品于10ml容量瓶中，用优级纯甲醇定容。
使用液的配制(32ug/ml)：准确吸取1ml储备液的配制(0.8mg/ml)于25ml的容量瓶中，用优级纯甲醇定容，经过0.22um的有机滤膜过滤，备用。
(4)仪器参考条件
A)色谱柱：C18柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱填料粒径5μm，或相当者；
B)流动相：a：乙腈，b：水过0.45μm微孔滤膜过滤；
C)流速：0.7mL/min；梯度洗脱程序：0～13min，23％～46％乙腈，体积流量0.7mL/min；13～33min，46～68％乙腈，体积流量0.7mL/min；33～46.5min，68～85％乙腈，体积流量0.7mL/min；
D)柱温：30℃；
E)检测波长：203nm；
F)进样体积：10μL。
(5)分析结果的表述
试样中人参皂苷各组分的含量按式(1)计算:
Figure BDA0003028763650000171
式中：
X——试样中人参皂苷各组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L)；
A1——试样中人参皂苷各组分的峰面积
A2——标准品中人参皂苷各组分的峰面积
ρ——标准品中人参皂苷各组分的浓度(ug/ml)
V——试样溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；
M——试样质量，单位为克(g)；
试样中人参皂苷的含量是将检测的各组分相加得到的总和。
2、结果
人参皂苷检测结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003028763650000172
由以上结果可以看出，与成熟野山参切片相比，本发明培养的野山参干细胞中人参皂苷总含量大大提高。因此，本发明采用多级发酵生产人参皂苷的方法，干细胞生长速率快且稳定，产生的人参皂苷含量高，有较高的经济价值。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种利用人参干细胞发酵生产人参皂苷的方法，其特征在于，包括：
(1)制备人参干细胞初级种子，方法包括：
a.采用一步法培养人参不定根：将成熟人参清洗消毒，切片，接种到不定根诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到不定根诱导培养基中继代培养扩繁；然后将获得的人参不定根剪切成段，接种到液体培养基中培养获得不定根；
所述不定根诱导培养基的组成为：1-6mg/L萘乙酸，0.1-0.6mg/L激动素，0.2-1mg/L赤霉素，0.1-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基；
b.取人参不定根的根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；
c.分离培养：将干细胞区域接种到干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团；所述干细胞诱导培养基的组成为：2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基；
d.继代培养：挑取部分c获得的干细胞团接种到干细胞继代培养基中，暗培养；所述干细胞继代培养基的组成为：2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；
e.液体培养：将d获得的干细胞接种到干细胞液体培养基中，暗培养，获得人参干细胞初级种子；干细胞液体培养基的组成为2-4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；
(2)一级培养：将(1)中的初级种子接种到一级培养发酵罐中，在通气量0.02-0.2vvm下发酵培养20-25天后，作为一级种子；
(3)二级培养：将(2)中的一级种子接种到二级培养发酵罐中，在通气量0.02-0.2vvm下发酵培养20-30天后，作为二级种子；
(4)三级培养：将(3)中的二级种子接种到三级培养发酵罐中，在通气量0.05-0.5vvm下发酵培养30-40天，结束发酵，过滤收集干细胞，检测人参皂苷含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，接种的初级种子的质量占一级发酵罐中液体培养基体积的1-5％，在20-25℃下进行发酵培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，接种的一级种子的质量占二级发酵罐中液体培养基体积的1-8％，在20-25℃下进行发酵培养。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，接种的二级种子的质量占三级发酵罐中液体培养基体积的5-10％，在22-26℃下进行发酵培养。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述一级发酵罐、二级发酵罐、三级发酵罐的容积逐级增大。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，一级发酵罐的容积为5L，二级发酵罐的容积为50L，三级发酵罐的容积为500L。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)-步骤(4)中，采用的液体培养基包括：2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，液体培养基包括：3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，干细胞诱导培养基的组成为3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，干细胞继代培养基的组成为3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。
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