CN113046297B - 一种人参干细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参干细胞的分离培养方法，包括：(1)采用一步法制备人参不定根；(2)将步骤(1)制得的人参不定根取根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；(3)将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团，再将所述干细胞团转入继代培养基中暗培养；(4)将步骤(3)经继代培养的干细胞接种至干细胞液体培养基中，暗培养，获得人参干细胞。采用本发明的液体培养基和培养方法，能够直接通过成熟人参的各个部分诱导产生不定根，在简化诱导步骤、缩短诱导时间的同时提高不定根中人参皂苷的含量，最终获取指标良好的人参干细胞。

Description

一种人参干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一种人参干细胞的分离培养方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)是五加科人参属植物，分布于中国、日本、韩国，其根茎是名贵的中药材，号称“百草之王”。人参味甘、微苦，微温，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效，多用于体恤欲脱，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，惊悸失眠等。人参皂苷是人参主要的活性成分，有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生产等功效。近年来，人参被广泛地用在各类化妆品、保健品、饮品中，人参的市场前景非常广阔。

目前由于过度采挖、环境破坏等，野生人参资源几乎灭绝，大田栽培是人参的主要来源。然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，栽培技术复杂以及农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。大田栽培人参供应难以满足市场的需求。人参组织培养技术周期短，不受季节限制，容易进行大规模的工业化生产，具有很大的发展前景。

目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，培养的人参中还存在人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求的问题。

申请号为201410698528.0的中国专利公开了一种人参不定根诱导增殖方法，包括以下步骤：将人参组培苗切割成组织小块后接种于固体诱导培养基中诱导形成不定根，将所述不定根切割成不定根小块后接种于液体增殖培养基中进行不定根的增殖培养；其中，所述固体诱导培养基和液体增殖培养基为以1/2MS(-N)培养基为基本培养基含有浓度为1-10mg/L的吲哚丁酸。上述方案中，将日龄为28-32天的组培苗切成小块直接诱导不定根，组培苗幼嫩，分化能力强，且实际上需要先经过种子萌发或者外植体培养获得组培苗，仍然需要至少28-32天的时间，外植体培养仍然需要诱导愈伤组织。因此，实际上并没有缩短周期。

人参干细胞是未分化的细胞，具有无限分裂能力，目前可以通过分离与培养人参的干细胞来生产人参相关的药物活性成分。目前现有技术在分离人参干细胞时，均采用已经分化的组织器官为外植体，通过立体培养阶段的培养(脱分化过程)将其诱导为具有分化能力的愈伤组织细胞。但这种细胞本质来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化生产中，容易出现细胞系退化，分裂能力弱。另外，培养周期长，得到的干细胞中有效成分含量也有待提高。

人参不定根根尖部分存在分生组织，分裂能力强。因此，倘若能够探索所需时间更短、步骤更简单的从成熟人参培养获得人参干细胞的方法，同时可以提高人参干细胞中有效成分的含量，则有利于临床应用，具有广泛的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种人参干细胞的分离培养方法。本发明获得了所需时间更短、步骤更简单的从成熟人参培养获得人参干细胞的方法，具体在一步法制备不定根的过程中对扩繁后的不定根选择特定的液体培养基进行培养，再将获得的不定根根尖部分的干细胞区域通过解剖分离，后续配合适宜成分比例的干细胞诱导培养基和干细胞继代培养基，使分离的干细胞继续生长，步骤更加简易，获得的干细胞中各类人参皂苷的含量高。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明提供了一种人参干细胞的分离培养方法，包括：

(1)将成熟人参清洗消毒，切片，接种到不定根诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到不定根诱导培养基中继代培养扩繁；然后将扩繁获得的人参不定根接种到液体培养基中培养获得人参不定根；

(2)将步骤(1)制得的人参不定根取根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；

(3)将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团，再将所述干细胞团转入继代培养基中暗培养；

(4)将步骤(3)经继代培养的干细胞接种至干细胞液体培养基中，暗培养，获得人参干细胞；

所述步骤(1)中所使用的液体培养基包括：10-55g/L蔗糖，0.8-1.5g/L WPM培养基，0.6-1.6g/L N6培养基，1-6mg/L萘乙酸，0.2-1.2mg/L激动素。

上述方案中，本发明采用一步法从成熟人参培养人参不定根，可以节省步骤，缩短诱导时间；人参不定根的根尖部分具备更多的分生组织，且活性强。目前不定根一般是由人参愈伤组织诱导产生的，需要先诱导产生愈伤组织，再诱导产生不定根，所需的实验周期长，操作步骤复杂，污染风险较高的问题。另外，在诱导愈伤组织产生不定根的过程中，人参组织的代谢程度较高，使得其中所产生皂苷含量降低，使得由愈伤组织诱导培养获取的人参难以满足临床应用等需求。

上述方案中，鉴于成熟人参参龄较长，成熟度高，不易再进行分化，目前还没有可以直接从成熟人参诱导不定根的报道。而本发明的发明人在试验中意外发现可在特定诱导培养基上将成熟人参切片可以直接诱导产生不定根。因此省略了诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从成熟参一步诱导得到不定根，在简化诱导步骤、缩短诱导时间的同时，也避免了愈伤组织从生成至分化的代谢过程所导致皂苷含量下降的问题。

本发明的进一步方案为：步骤(1)所述液体培养基还包括0-1.8mg/L吲哚丁酸。

本发明的进一步方案为：步骤(1)所述液体培养基包括：35g/L蔗糖，1.35g/L WPM培养基，1g/L N6培养基，1-5mg/L萘乙酸，0.2-1mg/L激动素，0.2-1.8mg/L吲哚丁酸；优选的，步骤(1)所述液体培养基包括：35g/L蔗糖，1.35g/L WPM培养基，1g/L N6培养基，5mg/L萘乙酸，1mg/L激动素，0.2mg/L吲哚丁酸。

上述方案中，本发明在对人参切片进行不定根诱导过程中，调整了扩繁步骤后的液体培养基成分，其中采用适当含量的WPM培养基和N6培养基，使体系中硝态氮和铵态氮达到较为平衡比例，其中的铵对人参细胞的脱分化过程起到了抑制作用，使得扩繁后的组织在液体培养基的作用下保留根部原有细胞的功能，并继续成长。进一步的，本发明提供的液体培养基中还增加了萘乙酸、激动素和吲哚丁酸成分，其中含量较多的萘乙酸成分在上述铵成分抑制脱分化的情形下，调控根部原有细胞mRNA的选择性表达，促进细胞快速分裂成长，而非形成愈伤组织。而较少的激动素可一定程度解除顶端优势，与吲哚丁酸协同进一步促进了不定根的生成。综上所述，本发明提供的不定根液体培养基通过WPM和N6培养基提供了成分平衡的硝态氮和铵态氮，同时在较多含量的萘乙酸对基因表达调控和较少的激动素解除顶端优势以及吲哚丁酸的共同作用下，使制备过程不形成愈伤组织而直接生成不定根，在得到皂苷含量较高的不定根同时可提高不定根的增长倍数并缩减生长时间。

本发明的进一步方案为：步骤(3)中，所述干细胞诱导培养基包括2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基；优选的，干细胞诱导培养基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基。

上述方案中，本发明提供的干细胞诱导培养基含有吲哚乙酸、赤霉素和激动素，可以诱导干细胞生长，而抗坏血酸和柠檬酸能够产生协同抗氧化的作用。该诱导培养基中各个成分协同作用，能够促使干细胞在初期快速生长。

本发明的进一步方案为：步骤(3)中，所述干细胞继代培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；优选的，干细胞继代培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。

本发明的进一步方案为：步骤(4)中，所述干细胞液体培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L蔗糖，1-2.4g/L1/2MS培养基和0.6-1.4g/L WPM培养基；优选的，干细胞液体培养基包括3mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基。

本发明的进一步方案为：干细胞诱导培养基、干细胞继代培养基和干细胞液体培养基的pH为5.6-6.0。所述诱导培养基、继代培养基和干细胞液体培养基使用NaOH或KOH调节pH。

本发明的进一步方案为：步骤(4)中，所述暗培养在20-25℃和100-150rpm条件下进行，3-5周传代一次。

本发明的进一步方案为：步骤(2)中，取步骤(1)中培养的人参不定根的根尖部分，在显微镜下观察根尖部分，根据干细胞的特征确定干细胞区域，显微操作以解剖刀切割获得根尖干细胞区域。

上述方案中，在显微镜下观察根尖部分，细胞形状、排列不规则部分为生长点，即分生组织细胞聚集区域，此区域细胞中含有多个液泡。显微操作解剖刀切割获得根尖干细胞区域。

本发明的进一步方案为：步骤(3)中，经解剖分离的人参干细胞在20-25℃条件下，分别先后在干细胞诱导培养基和干细胞继代培养基中避光培养，直至接种干细胞长出大量细胞团。

本发明的进一步方案为：步骤(1)中，所述不定根诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.1-0.6mg/L激动素，0.2-1mg/L赤霉素，0.075-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基。优选的，所述不定根诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基。

上述方案中，萘乙酸是植物生长调节剂，赤霉素是植物激素，共同作用时可以促进不定根形成。激动素为一种细胞分裂素，可以促进细胞的分裂。柠檬酸和抗坏血酸能够产生协同抗氧化的作用，防止成熟人参离体组织褐变，有利于从成熟参离体组织直接诱导不定根。诱导培养基中各个成分协同作用，最终实现了从成熟参的各个部分直接诱导产生不定根，而不需要诱导愈伤组织的中间步骤。上述优选成分配比下的诱导培养基，对成熟参的产生不定根的诱导效果最好，产生的不定根数量多，质量好，有利于下一步扩繁，提高不定根中的活性成分含量。

上述方案中，对诱导产生的不定根进行进一步的液体培养时，可以采用常规培养的培养基，如1/2MS培养基，与常用的不定根的培养基保持一致，说明通过本发明一步法诱导产生的不定根，在采用常规培养基培养的条件下，也可实现缩短诱导时间的技术目的，同时相比现有技术的两步法还降低了污染风险。

需要说明的是本发明中，WPM培养基、N6培养基、B5培养基、1/2MS培养基等为现有技术中已知的培养基。

1/2MS培养基

成分(mg/L)：硝酸钾950，硝酸铵825，二水氯化钙220，硫酸镁185，磷酸二氢钾85，硫酸锰11.15，硫酸锌4.3，硼酸3.1，碘化钾0.415，钼酸钠0.125，硫酸铜0.0125，氯化钴0.0125，乙二胺四乙酸二钠37.3，硫酸亚铁27.8，肌醇100，甘氨酸2，盐酸0.5，盐酸吡哆醇0.5，盐酸硫铵0.1。

B5培养基

成分(mg/L)：硝酸钾KNO₃ 2500，MgSO₄·7H₂O 250，CaCl₂·2H₂O 150，(NH₄)₂SO₄134，NaH₂PO₄.H₂O 150，KI 0.75，H₃BO₃ 3.0，MnSO₄·4H₂O 10，ZnSO₄·7H₂O 2.0，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25，CoCl₂·6H₂O 0.025，CuSO₄·5H₂O 0.025，Na₂-EDTA 37.3，FeSO₄·7H₂O 27.8，肌醇100，烟酸1.0，盐酸吡哆醇1.0，盐酸硫铵10。

木本植物用培养基(WPM，Woody Plant medium)

成分(mg/L)：硝酸铵400，四水硝酸钙556，硫酸钾990，无水氯化钙72，磷酸二氢钾170，二水钼酸钠0.25，无水硫酸镁180，一水合硫酸锰22.4，七水合硫酸锌8.6，五水合硫酸铜0.25，七水合硫酸亚铁27.8，乙二胺四乙酸二钠37.3，肌醇100，维生素B1 1，烟酸0.5，维生素B6 0.5，甘氨酸2，pH 5.2。

N6培养基

成分(mg/L)：硝酸钾2800，硫酸铵463，硫酸二氢钾400，七水合硫酸镁185，二水合氯化钙165，乙二胺四乙酸二钠37.3，七水合硫酸亚铁27.8，水合硫酸锰4.4，七水合硫酸锌1.5，硼酸1.6，碘化钾0.8，维生素B1 1.0，维生素B6 0.5，盐酸0.5，甘氨酸2.0，蔗糖2000，pH为5.8(25℃)。

本发明的进一步方案为：步骤(1)中，所述将扩繁获得的人参不定根接种到液体培养基包括：将扩繁获得的人参不定根剪切成小段，接种至液体培养基中，并在22±1℃和110-130rpm条件下于摇床上培养3～4周获得不定根。

本发明的进一步方案为：步骤(1)中，所述将扩繁获得的人参不定根接种到液体培养基还包括：将所述摇床上培养3～4周的不定根接种至含有液体培养基的生物反应装置中继续避光培养3～4周，所述生物反应装置的通气量为0.01-0.4vvm，培养温度为22±1℃；优选的，通气量为0.15-0.25vvm。

上述方案中，灭菌的液体培养基的体积占生物反应装置容积的20％-80％；接种的不定根的质量占液体培养基体积的0.5％-2.5％。所述生物反应装置用于培养人参不定根，包括：罐体，所述罐体的顶部设置有可开闭的盖体，盖体上或罐体的顶部设有排气装置；所述罐体的底部设置有至少两个进气装置，空气经进气装置进入罐体内部。

上述方案中，生物反应装置的罐体内部中空，用于盛放液体培养基。生物反应装置可以由任意适于制备发酵罐的、可用于高温灭菌的材质制成，例如玻璃、不锈钢、耐高温塑料等；优选不锈钢材质，经久耐用，使用寿命长。罐体顶部的盖体可以打开或者关闭，用于向内添加液体培养基，液体培养基加入后盖体与罐体密封连接。罐体的底部具有至少两个进气装置，从不同位置向罐体内通入无菌空气，从而保证罐内的培养物与空气能够充分接触，并且生长均匀，有利于促进不定根快速生长。

本发明的进一步方案为：步骤(1)中，所述切片为宽0.5-0.7cm、长0.5-0.7cm和厚0.2-0.5mm的薄片；所述成熟人参的参龄为3年以上，优选的，成熟人参的参龄为6年以上。

作为一种优选的实施方案，所述成熟人参为百年人参。

百年人参在自然界非常罕见，具有很高的食用、药用价值，可补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智；其价值远大于种植的参龄短的人参。本发明不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以直接从百年人参切块直接一步诱导获得不定根，不但可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，还可以获得母本百年老参中特有的功能成分，从而获得营养价值更好的不定根。

进一步的方案，将所述成熟人参的主根部、或芦头、或艼部、或支根、或须根清洗消毒，切片，接种到诱导培养基中诱导出人参不定根。

上述方案中，人参的不同部位所含皂苷的含量多有不同，其中以其根系部位含量最高，因此优选此部位制成切片，以期提高诱导生成不定根中的皂苷含量。

进一步的方案，所述人参选自野山参、移山参，林下参，园参；优选的，所述人参为野山参。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1.本发明提供的人参干细胞的分离培养方法，将采用一步法制备的人参不定根通过显微观察解剖获取干细胞区域，得以配合组分比例适宜的干细胞诱导培养基和干细胞继代培养基对分离的干细胞进行培养，使干细胞生长速度极快，获得的人参干细胞中活性成分含量有所提高；

2.本发明提供的人参不定根的分离培养方法，实现了采用一步法，将成熟人参的各部分处理后接种到诱导培养基中直接诱导出人参不定根，不需要诱导愈伤组织的中间步骤，可以简化诱导步骤、缩短诱导时间，降低污染风险；

3.本发明提供的人参干细胞的分离培养方法，在一步法培养人参不定根的过程中，采用特定成分的液体培养基，所述不定根液体培养基通过WPM和N6培养基提供了成分平衡的硝态氮和铵态氮，同时在较多含量的萘乙酸对基因表达调控、较少的激动素解除顶端优势和吲哚丁酸的共同作用下，使制备过程不形成愈伤组织而直接生成不定根，在得到皂苷含量较高的不定根同时可提高不定根的增长倍数并缩减生长时间。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是采用本发明实施例1诱导培养基诱导不定根的示意图；

图2是采用对比例1的诱导培养基诱导不定根的示意图。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例中，采用一步法和特定的液体培养基培养制取人参不定根，具体包括如下步骤：

(1)不定根的诱导

将20年龄的野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。

(2)不定根的继代培养

将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；

(3)不定根的培养

将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。

本实施例中，步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图1所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，成熟野山参切片上直接诱导产生了不定根。

实施例2

本实施例中，采用一步法和特定的液体培养基培养制取人参不定根，具体包括如下步骤：

(1)不定根的诱导

将6年龄的园参的芦头清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括6mg/L萘乙酸，0.2mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，1.2g/L柠檬酸，0.1g/L抗坏血酸，20g/L蔗糖、5g/L植物凝胶，4g/L B5培养基和1.8g/L WPM培养基，pH值为5.6。

(2)不定根的继代培养

将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；

(3)不定根的培养

将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.6。

与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。

实施例3

本实施例中，采用一步法和特定的液体培养基培养制取人参不定根，具体包括如下步骤：

(1)不定根的诱导

将10年龄的林下参的艼部清洗、消毒除菌后，切成宽0.7cm、长0.7cm和厚0.5mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出不定根；其中，诱导培养基包括5mg/L萘乙酸，1mg/L赤霉素，0.1mg/L激动素，0.75g/L柠檬酸，0.03g/L抗坏血酸，40g/L蔗糖、4g/L植物凝胶，2g/L B5培养基和1g/L WPM培养基，pH值为6.0。

(2)不定根的继代培养

将步骤(1)获得的不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；

(3)不定根的培养

将步骤(2)获得的不定根，剪切成长度为2cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，WPM培养基和30g/L蔗糖，pH值为6.0。

与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步诱导产生不定根。

实施例4

本实施例中，采用一步法和特定的液体培养基培养制取人参不定根，具体包括如下步骤：

(1)不定根的诱导

将15年龄的移山参的主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.5cm、长0.6cm和厚0.4mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括1mg/L萘乙酸，0.5mg/L赤霉素，0.6mg/L激动素，1.5g/L柠檬酸，1g/L抗坏血酸，50g/L蔗糖、6g/L植物凝胶，1g/L B5培养基和2.4g/L WPM培养基，pH值为5.7。

(2)不定根的继代培养

将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；

(3)不定根的培养

将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，B5培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.7。

与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。

实施例5

本实施例中，采用一步法和特定的液体培养基培养制取人参不定根，具体包括如下步骤：

(1)不定根的诱导

将百年野山参，去掉芦头，艼部，主根部清洗、消毒除菌后，切成宽0.6cm、长0.7cm和厚0.3mm的薄片，接种到诱导培养基中，22±1℃条件下暗培养4～5周诱导出山参不定根；其中，诱导培养基包括4mg/L萘乙酸，0.6mg/L赤霉素，0.4mg/L激动素，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，30g/L蔗糖、3g/L植物凝胶，1.55g/L B5培养基和1.21g/L WPM培养基，pH值为5.8。

(2)不定根的继代培养

将步骤(1)获得的山参不定根接种到与步骤(1)中相同的诱导培养基中，相同条件下暗培养4～5周；

(3)不定根的培养

将步骤(2)获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织，接种到液体培养基中，22±1℃条件下在摇床上培养3～4周获得不定根；其中，液体培养基为含有4mg/L吲哚丁酸，0.1g/L柠檬酸，0.05g/L抗坏血酸，1/2MS培养基和30g/L蔗糖，pH值为5.8。

与实施例1结果类似，本实施例步骤(1)中可以一步直接诱导产生不定根。

实施例6

本实施例是在实施例1的基础上进一步结合生物反应装置制取人参不定根，将实施例1步骤(3)制得的不定根继续进行如下处理：

将液体培养基加入生物反应装置的罐体内(容积为5L)，生物反应装置中液体培养基的体积占其容积的80％；121℃灭菌20min后，备用；

将实施例1获得的山参不定根，剪切成长度为1cm左右的组织；接种到生物反应装置的液体培养基中，接种的不定根的质量占液体培养基体积的2.5％；生物反应装置通气，通气量为0.4vvm，22±1℃条件下暗培养3～4周，获得不定根。

本实施例中所用的液体培养基同实施例1。

实施例7-24

实施例7-24是在实施例1的基础上，将步骤(3)中的液体培养基替换为含有35g/L蔗糖，1.35g/L WPM培养基，1g/L N6培养基，0-1.8mg/L吲哚丁酸(IBA)，1-6mg/L萘乙酸(NAA)，0.2-1.2mg/L激动素(KT)的培养基，其pH值为5.8。各实施例中培养基的具体含量比例详见表1。

实施例25

本实施例中，采用由实施例17制取的人参不定根进行人参干细胞的分离培养，具体包括如下步骤：

(1)采用实施例17制备得到的人参不定根；

(2)取步骤(1)中人参不定根的根尖部分0.5mm，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；

(3)将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中，22℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞诱导培养基包括：3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基，pH为5.8；然后收集长出的干细胞，转入干细胞继代培养基中，在22℃下继续避光培养直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞继代培养基包括3mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基，pH为5.8；

(4)将步骤(3)经继代培养的干细胞接种至干细胞液体培养基中，在22℃下，120rpm摇床条件下继续避光培养，4周传代一次，获得野山参不定根干细胞；干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8g/L WPM培养基；pH为5.8。

实施例26

本实施例中，采用由实施例18制取的人参不定根进行人参干细胞的分离培养，具体包括如下步骤：

(1)采用实施例18制备得到的人参不定根；

(2)取步骤(1)中人参不定根的根尖部分0.8mm，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；

(3)将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中，25℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞诱导培养基包括：4mg/L赤霉素，0.6mg/L激动素，2mg/L吲哚乙酸，75mg/L抗坏血酸，50mg/L柠檬酸，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，2.4g/L 1/2MS培养基，1g/L B5培养基，pH为5.8；然后收集长出的干细胞，转入干细胞继代培养基中，在25℃下继续避光培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞继代培养基包括2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L植物凝胶，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基，pH为5.8；

(4)将步骤(3)经继代培养的干细胞接种至干细胞液体培养基中，在22℃下，120rpm摇床条件下继续避光培养，3周传代一次，获得野山参不定根干细胞；干细胞液体培养基包括2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，3mg/L赤霉素，1.2mg/L激动素，60g/L蔗糖，1g/L 1/2MS培养基和1.4g/L WPM培养基，pH为5.8。

实施例27

本实施例中，采用由实施例24制取的人参不定根进行人参干细胞的分离培养，具体包括如下步骤：

(1)采用实施例24制备得到的人参不定根；

(2)取步骤(1)中人参不定根的根尖部分0.3mm，显微操作解剖、切割下根尖干细胞区域；

(3)将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中，20℃下暗培养，直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞诱导培养基包括：2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，4mg/L吲哚乙酸，15mg/L抗坏血酸，150mg/L柠檬酸，60g/L蔗糖，1g/L植物凝胶，1g/L 1/2MS培养基，2.5g/L B5培养基，pH为5.8；然后收集长出的干细胞，转入干细胞继代培养基中，在22℃下避光培养直至接种干细胞长出大量细胞团；干细胞继代培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基，pH为5.8；

(4)将步骤(3)经继代培养的干细胞接种至干细胞液体培养基中，在22℃下，120rpm摇床条件下继续避光培养，5周传代一次，获得野山参不定根干细胞；干细胞液体培养基包括4mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，1mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，20g/L蔗糖，2.4g/L 1/2MS培养基和0.6g/L WPM培养基，pH为5.8。

实施例28

本实施例中，采用由实施例1制取的人参不定根进行人参干细胞的分离培养，本实施例的其他实施方式与实施例25相同。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。

本对比例步骤(1)中诱导培养基上产生的不定根如图2所示，其中，A为培养1周的照片，B为培养3周的照片，C为培养5周的照片。可见，5周后，采用对比例1的培养基无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚丁酸，1/2MS培养基，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。

结果，与对比例1图片展示类似，无法从成熟野山参切片上直接诱导产生不定根。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于采用的诱导培养基不同，其他的步骤均参照实施例1实施。本对比例的诱导培养包括：30g/L蔗糖，0.5mg/L激动素，3mg/L吲哚乙酸，WPM，3g/L植物凝胶，pH值为5.8。

结果：第一周，通体颜色变黄，第三周，颜色加深，中部开始变成褐色，第五周，全部变成褐色，并呈干枯状。

试验例1

本试验例对实施例7-24制得的人参不定根的增长倍数和人参皂苷含量进行测定，检测方法如下：

一、人参不定根中人参皂苷的检测方法包括：

(1)原理

试样经提取等前处理后，经C18色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，外标法定量测定人参皂苷各组分的含量。

(2)试剂

甲醇(CH₄O)：色谱纯 乙腈(C₆H₁₁N)：色谱纯

(3)分析步骤

取混合均匀的试样约6g(精确至0.01g),于150mL研钵中研细，转移到50ml离心管中，加入10ml水混匀，于超声波细胞粉碎机上400W破壁3分钟，在-18℃的冰箱中冷冻3小时。于冻干机冻干48小时，直至杯体外面没有水珠为止。

样品在研钵上研细，准确称取50mg于10ml离心管中，加入70％甲醇溶液，涡旋。于超声振荡器上超声10分钟，重复两次，过滤备用。

(4)仪器参考条件

A)色谱柱：C18柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱填料粒径5μm，或相当者；

B)流动相：a：乙腈，b：水过0.45μm微孔滤膜过滤；

C)流速：0.7mL/min；梯度洗脱程序：0～13min，23％～46％乙腈，体积流量0.7mL/min；13～33min，46～68％乙腈，体积流量0.7mL/min；33～46.5min，68～85％乙腈，体积流量0.7mL/min；

D)柱温:30℃；

E)检测波长:203nm；

F)进样体积:10μL。

(5)分析结果的表述

试样中人参皂苷各组分的含量按式(1)计算:

式中:

X——试样中人参皂苷各组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L)；

A1——试样中人参皂苷各组分的峰面积

A2——标准品中人参皂苷各组分的峰面积

ρ——标准品中人参皂苷各组分的浓度(ug/ml)

V——试样溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；

M——试样质量，单位为克(g)；

试样中人参皂苷的含量将各组分相加既得。

试样中人参皂苷的含量是将检测的各组分相加得到的总和。

二、增长倍数的计算方式如下：

增长倍数＝生长结束后的不定根的重量/接种的不定根种子的重量。

检测结果如表1所示：

表1

由表1可知，实施例11中未添加吲哚丁酸IBA，而实施例9在其他成分与实施例11相似的情况下添加了1mg/L的吲哚丁酸，对比二者制取的人参不定根可以发现，在添加了较高浓度的萘乙酸NAA和相同含量的激动素KT时，缺少吲哚丁酸IBA的实施例11在增长倍数和皂苷含量上相比实施例9均有所下降。进一步对比实施例8、15和18，在三者均添加少量吲哚丁酸的情况下，调整了萘乙酸和激动素的添加配比，发现萘乙酸和激动素适当减量的实施例18具有更优异的增长倍数和皂苷含量；再进一步根据实施例20和23的记载，可知当液体培养基的其他成分相同时，降低激动素的含量可提高增长倍数和皂苷含量，结合实施例18的情况，可见本发明提供的液体培养基中在存在较高含量的萘乙酸时，需要适当降低激动素的占比，以提高二者的协同效果。在此基础上，根据实施例21和24的记载，再进一步提高萘乙酸浓度至5mg/L时，同时调整吲哚丁酸和激动素的含量，发现在降低激动素的同时适当提高吲哚丁酸的含量，生成不定根的增长倍数和皂苷含量之间的差异相比实施例20和23间的差异更小，进一步证明了萘乙酸、激动素解和吲哚丁酸相互间对不定根生长的协同作用。需要说明的是，表1中的生长时间为完成不定根培养的时间，即在表中所述时间基础上继续培养，皂苷含量的变化不再显著。

本实验例中，采用实施例17、18和24配比的液体培养基时，不定根中的增长倍数相对较高，同时具有较高的皂苷总量。而由于需要对不定根进行后续干细胞的培养，因此可部分忽略增长倍数具有优势的组别，优选采用皂苷总量更高的实施例17、18和24。其中，实施例17和18的不定根在兼具较大的增长倍数和皂苷含量的同时具有较短的生长时间，属于更佳选项。

试验例2

本试验例将实施例25-28制备得到的野山参不定根干细胞和实施例1中所用的野山参切片分别进行皂苷检测。

检测方法如下所示：

(1)原理

试样经提取等前处理后，经C18色谱柱分离，高效液相色谱-紫外检测器检测，外标法定量测定人参皂苷各组分的含量。

(2)试剂

甲醇(CH₄O)：色谱纯 乙腈(C₆H₁₁N)：色谱纯

标准试剂：人参皂苷Re、Rg1、Ra3、Rb1、Rf、Rb2、Rb3、F3、Rg2、Rd、F1

(3)分析步骤

人参干细胞样品制备：

将实施例25-28得到的样品用水清洗三次、在研钵中磨碎成糊状、超声破壁、冻干后，样品在研钵上研细，准确称取50mg于10ml离心管中，加入70％甲醇溶液，涡旋。于超声振荡器上超声10分钟，重复两次，过滤备用。后与不定根检测方法相同。

野山参样品制备：

将野山参切片样品用水清洗三次、在研钵中磨碎成糊状、超声破壁、冻干后，样品在研钵上研细，准确称取50mg于10ml离心管中，加入70％甲醇溶液，涡旋。于超声振荡器上超声10分钟，重复两次，过滤备用。

标准品制备：

储备液的配制(0.8mg/ml)：分别称取8.00mg人参皂苷Re、Rg1、Ra3、Rb1、Rf、Rb2、Rb3、F3、Rg2、Rd、F1共11种标品于10ml容量瓶中，用优级纯甲醇定容。

使用液的配制(32ug/ml)：准确吸取1ml储备液的配制(0.8mg/ml)于25ml的容量瓶中，用优级纯甲醇定容，经过0.22um的有机滤膜过滤，备用。

(4)仪器参考条件

A)色谱柱：C18柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱填料粒径5μm，或相当者；

B)流动相：a：乙腈，b：水过0.45μm微孔滤膜过滤；

C)流速：0.7mL/min；梯度洗脱程序：0～13min，23％～46％乙腈，体积流量0.7mL/min；13～33min，46～68％乙腈，体积流量0.7mL/min；33～46.5min，68～85％乙腈，体积流量0.7mL/min；

D)柱温：30℃；

E)检测波长：203nm；

F)进样体积：10μL。

(5)分析结果的表述

试样中人参皂苷各组分的含量按式(1)计算:

式中：

X——试样中人参皂苷各组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L)；

A1——试样中人参皂苷各组分的峰面积

A2——标准品中人参皂苷各组分的峰面积

ρ——标准品中人参皂苷各组分的浓度(ug/ml)

V——试样溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；

M——试样质量，单位为克(g)；

试样中人参皂苷的含量是将检测的各组分相加得到的总和。

检测结果如表2所示：

表2

由以上结果可以看出，与成熟野山参切片相比，本发明培养的野山参不定根干细胞中各种人参皂苷的含量均有所提高，相比使用渗透剂分离细胞的方案，本发明通过观察细胞形态解剖切离干细胞区域，最大程度地保留了细胞活性，也使得后续制取干细胞的人参皂苷总含量有所提高。因此，本发明的人参干细胞的培养方法步骤简便，适于扩大生产，且活性成分含量高。

需要说明的是，由于在液相检测时，有的人参皂苷峰比较接近，无法分离，因此在表中有的人参皂苷混合计算。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (9)

1.一种人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括：

(1) 将成熟人参清洗消毒，切片，接种到不定根诱导培养基中诱导出人参不定根；将获得的人参不定根再次接种到不定根诱导培养基中继代培养扩繁；然后将扩繁获得的人参不定根接种到液体培养基中培养获得人参不定根；所述不定根诱导培养基包括1-6mg/L萘乙酸，0.1-0.6mg/L激动素，0.2-1mg/L赤霉素，0.075-1.5g/L柠檬酸，0.03-1g/L抗坏血酸，20-60g/L蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-4g/L B5培养基和1-2.4g/L WPM培养基；

(2) 将步骤(1)制得的人参不定根取根尖部分，解剖分离获取干细胞区域；

(3) 将步骤(2)经分离获取的干细胞接种至干细胞诱导培养基中暗培养，获得干细胞团，再将所述干细胞团转入继代培养基中暗培养；所述干细胞诱导培养基包括2-4mg/L赤霉素，0.6-1mg/L激动素，2-4 mg/L吲哚乙酸，15-75mg/L抗坏血酸，50-150mg/L柠檬酸，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基，1-2.5g/L B5培养基；

所述继代培养基包括2-4mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L 蔗糖，1-6g/L植物凝胶，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4 g/L WPM培养基；

(4) 将步骤(3)经继代培养的干细胞接种至干细胞液体培养基中，暗培养，获得人参干细胞；所述干细胞液体培养基包括2-4mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，1-3mg/L赤霉素，0.8-1.2mg/L激动素，20-60g/L 蔗糖，1-2.4g/L 1/2MS培养基和0.6-1.4 g/L WPM培养基；

所述步骤(1)中所使用的液体培养基包括：10-55g/L蔗糖，0.8-1.5g/L WPM培养基，0.6-1.6g/L N6培养基，1-6 mg/L 萘乙酸，0.2-1.2 mg/L 激动素和0.2-1.8 mg/L吲哚丁酸。

2. 根据权利要求1所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基包括：35g/L蔗糖，1.35g/L WPM培养基，1g/L N6培养基，1-5 mg/L 萘乙酸，0.2-1 mg/L激动素，0.2-1.8 mg/L吲哚丁酸。

3. 根据权利要求2所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基包括：35g/L蔗糖，1.35g/L WPM培养基，1g/L N6培养基，5 mg/L 萘乙酸，1 mg/L 激动素，0.2 mg/L吲哚丁酸。

4. 根据权利要求1所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，干细胞诱导培养基包括3mg/L赤霉素，0.8mg/L激动素，2.5 mg/L吲哚乙酸，50mg/L抗坏血酸，100mg/L柠檬酸，40g/L 蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基，1.5g/L B5培养基。

5. 根据权利要求1所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，干细胞继代培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L 蔗糖，3g/L植物凝胶，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8 g/L WPM培养基。

6. 根据权利要求1所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，干细胞液体培养基包括3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，2mg/L赤霉素，1mg/L激动素，35g/L 蔗糖，1.8g/L 1/2MS培养基和0.8 g/L WPM培养基。

7.根据权利要求1所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述暗培养在20-25℃和100-150rpm条件下进行，3-5周传代一次。

8.根据权利要求1所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中，取步骤(1)中培养的人参不定根的根尖部分，在显微镜下观察根尖部分，根据干细胞的特征确定干细胞区域，显微操作以解剖刀切割获得根尖干细胞区域。

9.根据权利要求1所述人参干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，经解剖分离的人参干细胞在20-25℃条件下，分别先后在干细胞诱导培养基和干细胞继代培养基中避光培养，直至接种干细胞长出大量细胞团。

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