CN111876368A - 长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法 - Google Patents

长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法，其诱导方法包括以下步骤：长春花根尖切除根冠，接种到诱导培养基上，黑暗培养，外植体中干细胞层增殖生长形成细胞团；将分层后的的干细胞层转移至继代培养基培养10‑15天，完全黑暗培养；然后再转移至新的继代培养基中，相同条件下培养10‑15天，获得细胞形态稳定的长春花干细胞系。本发明利用长春花根顶端分生组织来诱导建立长春花干细胞培养体系，在一定的条件下，可以稳定的传代培养，无表观遗传变异。本发明建立的长春花干细胞培养体系具有生长速度快、遗传稳定等特点，并且初步实现10L生物反应器培养。

Description

长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养 方法
技术领域
本发明涉及长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导和离体培养方法。
背景技术
长春花为夹竹桃科长春花属植物，已从中发现了超过130种以上的生物碱，具有多种药理活性，其中一些生物碱药物已获批准上市，如降压药物阿玛碱、抗肿瘤药物长春碱和长春新碱。
目前，人们获得这些药物的来源主要从原植物提取，但长春花的生长周期较长，且受到环境和气候的影响，而且长春碱、长春新碱等生物碱在植物中的含量极低，只有百万分之几到万分之几。此外，长春花中的生物碱有超过130种以上，生物碱成分极为复杂，这些因素使得获取单一成分的药用活性成分成本极高。同时，这些生物碱的化学结构比较复杂，人工合成生物碱的成本极高，且人工合成带来的环境污染问题也比较严重。
随着中药生物技术的进步，利用植物细胞和组织培养技术结合生物反应器技术大规模工业化规模生产重要的药用活性成分已经实现，如利用离体悬浮培养的红豆杉细胞可以工业化生产抗癌药物紫杉醇，利用悬浮培养的鬼臼细胞可以工业化生产鬼臼毒素。
目前，研究人员已建立了离体培养的长春花愈伤组织和毛状根，并利用生物反应器对愈伤组织和毛状根进行培养，用于生产长春碱和长春新碱，但均未获得成功。
由于长春花愈伤组织和毛状根在诱导建立过程中都经历过脱分化过程，在长期培养后，二者容易发生遗传变异，表现出生长越来越缓慢，阿玛碱、长春质碱等次生代谢产物含量越来越低或者检测不到。因此，建立遗传稳定，生长迅速和次生代谢产物产量高的细胞系是植物细胞培养亟待突破的难点。
植物细胞的全能性使得普通的植物细胞可以在一定条件下发育形成植物组织以及完整的植株。因此，植物干细胞是否存在一直是有争议的。近年来的研究表明，植物干细胞存在于植物的茎顶端分生组织、根顶端分生组织和维管形成层分生组织中，是一类原始的细胞群，具有持续分裂和分化形成不同组织细胞和功能细胞的能力。根据植物干细胞的分裂和分化特性，可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
根据植物根尖的发育特征，将其分为4个区域：根冠、分生区、伸长区和成熟区，这4个区域只存在于根尖的前几毫米。在植物的根尖，静止中心是根所有组织的最原始来源，为全能干细胞。在静止中心周围，存在一些多能和单能干细胞，主要包括：根冠起始细胞、表皮-侧生根冠起始细胞、皮层-内皮层起始细胞、维管组织起始细胞。静止中心是一些有丝分裂不活跃的细胞，但可以维持周围其他起始细胞处于无限分裂且不分化的状态。植物的主根由根顶端分生组织的干细胞不断分裂分化而形成的。
研究表明，植物干细胞具有遗传信息稳定、细胞生长稳定，且次生代谢产物产量较高，是一种理想的用于生产次生代谢产物的细胞来源。因此，建立植物干细胞培养体系，提高植物干细胞诱导成功率，可以实现植物干细胞的商业化应用。
中国专利申请CN106148267A公开了长春花茎形成层来源的干细胞的诱导及分离方法，该方法先从长春花的茎中获得形成层组织，并在含有萘乙酸(NAA)的培养基中培养、分离获得茎形成层干细胞。然而，茎形成层来源的长春花干细胞能否产长春碱、产长春碱的能力如何，这些问题上述专利都未涉及。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导方法。
本发明的另一目的是在诱导得到植物干细胞的基础上，提供一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的离体培养方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导方法，包括以下步骤：
(1)切取长春花的根尖，清洗干净，灭菌，然后置于抗褐化保存液中保存1-3h；
所述的长春花优选1-2年生，7-9月采集；
所述长春花，其根部中长春碱含量高于100μg/g干重；
所述根尖的长度优选0.5-3cm，含有根顶端分生组织；
所述的清洗，优选先用自来水冲洗2-4h，然后在无菌环境中用无菌双蒸水冲洗至少1-3h；
所述的灭菌，优选先用70-75％(V/V)乙醇溶液浸泡20-100s，然后用0.02-0.06％质量体积比的HgCl2溶液浸泡2-10min，最后用无菌双蒸水将消毒剂冲洗干净；
所述的抗褐化保存液是含有150-250mg/L柠檬酸、100-500U/mL青霉素、200-500mg/L链霉素的MS培养基，pH值为5.6-5.8；
褐化的现象是指在植物组织培养中，外植体由于自身分泌的酚类化合物的影响导致外植体褐变，进而褐化，是植物组织培养中一种常见的现象，严重时会引起外植体死亡。褐化、污染是植物组织培养的2大难题。抗氧化剂柠檬酸可以竞争性地与酚类物质结合，防止褐化；青霉素和链霉素抗生素则可以防止组织污染。
(2)将经过抗褐化处理的长春花根尖切除根冠，然后接种到诱导培养基上，培养7-16天，培养温度26-30℃，湿度60-70％，完全黑暗培养，经过诱导培养，外植体(即切除根冠后的根尖)中干细胞层迅速增殖生长，继而在根尖外植体周围的培养基上形成小的细胞团；
所述的诱导培养基是含有3.0-4.0g/L结冷胶、2.0-4.0mg/L萘乙酸(NAA)、2.0-3.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS培养基，pH值为5.6-5.8；
本发明的诱导培养基使用2种激素相结合，诱导效率比较高。
本发明试验发现，若在该步骤中采用光暗交替培养，诱导成功率很低，推测可能光照不利于干细胞的诱导，因此优选采用完全黑暗培养。
(3)将分层后的的干细胞层转移至继代培养基培养10-15天，继代培养的条件为：温度26-30℃，湿度60～70％，完全黑暗培养；然后再转移至新的继代培养基中，相同条件下培养10-15天，获得细胞形态稳定的长春花干细胞系；
所述的继代培养基是含有3.0-4.0g/L结冷胶、0.5-1.0g/L活性炭、2.0-4.0mg/LNAA、2.0-3.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.6-5.8。
上述方法制得的长春花根顶端分生组织的干细胞系，具有如下特征：
(1)在光学显微镜及透射电镜观察下，长春花干细胞系为单个细胞或若干单个细胞聚集形成的小细胞团；
(2)经类放射性药物(博来霉素)处理后，长春花干细胞系死亡率显著高于愈伤组织；
(3)长春花干细胞系中防御响应因子(NO、Ca2+、H2O2)的表达水平显著高于愈伤组织；
(4)长春花干细胞系在生物反应器中有较高的生长率；
(5)长春花干细胞系经长期培养后生长率稳定，阿玛碱、长春碱等次生代谢产物产量高且保持稳定。
一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的离体培养方法，包括以下步骤：
取200-2000mL MS液体培养基，按接种量50-80g/L接种长春花干细胞系，然后进行悬浮振荡培养12-20天，得到长春花干细胞系；
悬浮培养条件为：温度20-30℃，转速100-120rpm，完全暗培养，通气比0.25～0.50vvm；所述的MS液体培养基添加有25-35g/L蔗糖、2.0-4.0mg/L NAA和2.0-3.0mg/L 2,4-D，pH值5.6-5.8；
在进行了上述小规模放大悬浮培养后，可以进行如下更大规模的放大悬浮培养：
取8-10L MS液体培养基，按接种量40-60g/L接种上述小规模放大悬浮培养得到的长春花干细胞系，悬浮培养12-20天；悬浮培养条件和培养基与上述小规模放大悬浮培养的一致。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明利用长春花根顶端分生组织来诱导建立长春花干细胞培养体系，在一定的条件下，可以稳定的传代培养，无表观遗传变异。
2、本发明建立的长春花干细胞培养体系具有生长速度快、遗传稳定等特点，并且初步实现10L生物反应器培养。
3、本发明首次建立了从长春花根顶端分生组织中诱导的干细胞系，并利用生物反应器技术进行大规模培养。本发明对研究植物干细胞的生理生化功能具有重要的理论意义，同时对利用植物干细胞结合生物反应器技术生产药用活性成分具有重要的应用价值和市场前景。
附图说明
图1是根顶端分生组织来源的长春花干细胞系的显微观察图。
图2是经300μg/mL博来霉素处理长春花干细胞和愈伤组织的死亡率柱状图(n＝3)。
图3是愈伤组织和干细胞中防御响应因子(NO、Ca2+、H2O2)的含量(n＝3)。
图4是10L生物反应器培养时长春花干细胞和愈伤组织细胞生长率(n＝3)。
图5是长期培养时长春花干细胞中生长率、阿玛碱和长春碱含量变化(n＝3)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种从长春花根顶端分生组织诱导干细胞系的方法，包括如下步骤：
S1：外植体的采集和灭菌
清晨时采集1-2年生夹竹桃科长春花属长春花的根尖部位，自来水冲洗4h后，滤纸轻轻擦去水分，作为外植体。在生物安全柜中用无菌双蒸水冲洗外植体2h，用75％(V/V)乙醇溶液灭菌30s，用0.06％的HgCl2溶液处理5min，用无菌双蒸水冲洗10min，然后将灭菌后的外植体放入抗褐化保存液中1-3h保存，待用；
上述抗褐化保存液是包含有250mg/L柠檬酸、300U/mL青霉素、300mg/L链霉素的MS培养基，pH值为5.75。
所述MS培养基配方为：KNO3 19.0g/L、NH4NO3 16.5g/L、KH2PO4 1.7g/L、MgSO4·7H2O 3.7g/L、肌醇1.0g/L、CaCl2 3.32g/L、FeSO4﹒7H2O 2.78g/L、Na2EDTA 3.73g/L、KI0.083g/L、MnSO4·H2O 1.69g/L、CoCl2·H2O 0.0025g/L、Na2MoO4 0.025g/L、H3BO4 0.62g/L、ZnSO4·7H2O 0.86g/L、CuSO4·5H2O 0.0025g/L、甘氨酸0.20g/L、维生素B6 0.05g/L、维生素B3 0.05g/L、烟酸硫胺素0.01g/L，蔗糖30g/L。
配制MS液体培养基时，按上述配方使用蒸馏水分别溶解，加入蔗糖，定容后搅拌均匀，调pH值5.70，无菌过滤后即得MS液体培养基；配制MS固体培养基时，加入蔗糖和3.5g/L结冷胶，121℃高温高压蒸汽灭菌20min后冷却即得MS固体培养基。
S2：诱导干细胞系
将经过S1得到的长春花根尖部位切除根冠，然后接种到诱导培养基上，培养12天，诱导培养的条件为温度26℃，湿度60～70％，完全黑暗培养，外植体中干细胞层培养后迅速增殖生长，继而在根尖外植体周围的培养基上形成小的细胞团。
所用诱导培养基的配方为：MS培养基，添加3.5g/L结冷胶，单独或联合使用3.0mg/L萘乙酸、3.0mg/L 2,4-D，pH值为5.70。
结果如表1所示，诱导培养基单独使用萘乙酸的诱导成功率为11-13％，单独使用2,4-D的诱导成功率为4％左右，联合使用萘乙酸和2,4-D的诱导成功率为56-64％。因此，联合使用上述2种植物激素的诱导成功率最高。
表1不同激素诱导根顶端分生组织诱导长春花干细胞的成功率
Figure BDA0002576592840000061
S3：继代培养
将S2中增殖在外植体周围的干细胞团转移至继代的固体培养基培养12天，继代培养的培养条件为：温度26℃，湿度60～70％，完全黑暗培养；然后再转移至新的继代MS固体培养基中12天，连续重复继代培养后可获得生长稳定、细胞形态稳定的长春花干细胞系，如图1所示，在光学显微镜下，长春花干细胞系为单个细胞或若干单个细胞聚集形成的小细胞团。
所用继代培养基的配方为：添加3.5g/L结冷胶、0.5g/L活性炭、2.0mg/L萘乙酸、2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.70。
实施例2
实施例1所述长春花干细胞系的三角瓶悬浮培养方法
向500mL三角瓶中加入200mL MS液体培养基，按接种量60g/L接种实施例1所述长春花干细胞系，然后进行悬浮振荡培养。
悬浮培养条件为：温度26℃，转速120rpm，完全暗培养，溶氧量0.30mg/L，培养时间15天；MS液体培养基为添加有2.0mg/L萘乙酸，2.0mg/L 2,4-D的MS培养基。
实施例3
实施例1所述长春花干细胞系的生物反应器培养方法
将8L MS液体培养基置于10L生物反应器中，然后将实施例2中悬浮培养的长春花干细胞系继代于10L生物反应器中进行悬浮培养，接种量为60g/L；悬浮培养条件为：温度26℃，转速120rpm，通气比0.50vvm，调节悬浮培养基pH值至5.70，完全暗培养，溶氧量0.50mg/L，连续培养15天。
生物反应器培养所用液体培养基为：添加有35g/L蔗糖、2.5mg/L萘乙酸、2.0mg/L2,4-D的MS培养基。
实施例4
对实施例1得到的长春花干细胞系的特性进行鉴定，具体如下：
1、博来霉素敏感性实验
取实施例1步骤S3中经两次继代培养获得的长春花干细胞系，悬浮培养(悬浮培养条件同实施例2)6天，置于24孔板中；
取长春花叶片为外植体，置于洁净工作台中无菌蒸馏水冲洗2-4h，依次使用70-75％酒精浸泡10-20s，使用0.05-0.20(m/v)氯化汞溶液浸泡10-20min，使用无菌蒸馏水冲洗3-5次。将消毒后的外植体切成0.3-0.7cm2的小块，接种到诱导MS培养基中，培养基的配方为：添加3.5g/L结冷胶、0.5g/L活性炭、3.0mg/L萘乙酸、3.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.7。
诱导成功后获得的长春花愈伤组织置于继代培养中进行培养，培养基的配方为：添加3.5g/L结冷胶、0.5g/L活性炭、2.0mg/L萘乙酸、2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.7。得到长春花愈伤组织。取悬浮培养(悬浮培养条件同实施例2)6天的愈伤组织置于24孔板中；
往24孔板中分别加入150、300μg/mL博来霉素溶液，然后120rpm振荡，完全暗培养0h、24h、48h。然后加入200ng/mL荧光素二乙酯，混匀后观察细胞的荧光，发出绿色荧光的为活细胞，红色的为死细胞。
结果如图2所示，300μg/mL博来霉素处理后，长春花干细胞的死亡率显著高于愈伤组织，表明长春花干细胞系对博来霉素更为敏感，具备植物干细胞的典型特征。
2、生物反应器培养时长春花干细胞系生长率
按实施例3的方法培养长春花干细胞系，分别在培养第3、6、9、12、15天进行采收，抽滤，细胞冷冻干燥至恒重，计算细胞生长率。
结果如图4所示，在观察期(0-15天)内，长春花干细胞系的干重一直在增加，并在第15天达到峰值；而愈伤组织干重在第12天达到峰值，之后干重有所下降。
在观察期(0-15天)内，长春花干细胞系的干重一直高于愈伤组织。在观察期结束时(第15天)，长春花干细胞系的干重是愈伤组织的2倍以上。
在观察期结束时(第15天)，与实验开始时相比，长春花干细胞系的生长率为1100％，而愈伤组织的生长率为500％。
以上结果表明本发明实施例1制备的长春花干细胞系在生物反应器培养时生长能力显著高于愈伤组织。
实施例5
对实施例1得到的长春花干细胞和实施例4中的愈伤组织悬浮培养(悬浮培养条件同实施例2)12d，采收所得新鲜细胞1.5g，加液氮研磨15min，加20mL PBS缓冲液，4℃下4000×g离心15min，得上清液。
分别采用NO试剂盒、Ca2+试剂盒、H2O2试剂盒测定细胞中NO、Ca2+、H2O2的含量。
结果如图3所示，长春花干细胞中NO、Ca2+、H2O2含量分别是愈伤组织的15.7倍、6.4倍和5.2倍，均显著高于愈伤组织。
实施例6
对实施例1得到的长春花干细胞于250mL锥形瓶中进行悬浮培养(培养基同实施例2)，培养条件为，接种量10g/L，转速120r/min，25℃下24h持续光照振荡培养，每14d为一个继代周。
在第0、6、12、18、24、30和36月时间点分别采收长春花干细胞和愈伤组织，抽滤，滤液4℃保存，细胞冷冻干燥至恒重，对细胞的生长和生物碱含量进行测定，结果如图5所示，在6-36月内，长春花干细胞的生长及阿玛碱、长春花含量均保持稳定，说明长春花干细胞体系具有生长稳定，生物碱产量稳定等优点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)切取长春花的根尖，清洗干净，灭菌，然后置于抗褐化保存液中保存1-3h；
(2)将经过抗褐化处理的长春花根尖切除根冠，然后接种到诱导培养基上，培养7-16天，培养温度26-30℃，湿度60-70％，完全黑暗培养，经过诱导培养，外植体中干细胞层增殖生长，继而在根尖外植体周围的培养基上形成小的细胞团；
所述的诱导培养基是含有3.0-4.0g/L结冷胶、2.0-4.0mg/L NAA、2.0-3.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.6-5.8；
(3)将分层后的的干细胞层转移至继代培养基培养10-15天，继代培养的条件为：温度26-30℃，湿度60～70％，完全黑暗培养；然后再转移至新的继代培养基中，相同条件下培养10-15天，获得细胞形态稳定的长春花干细胞系；
所述的继代培养基是含有3.0-4.0g/L结冷胶、0.5-1.0g/L活性炭、2.0-4.0mg/L NAA、2.0-3.0mg/L 2,4-D的MS培养基，pH值为5.6-5.8。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述的抗褐化保存液是含有150-250mg/L柠檬酸、100-500U/mL青霉素、200-500mg/L链霉素的MS培养基，pH值为5.6-5.8。
3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述的长春花为1-2年生，7-9月采集。
4.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述长春花，其根部中长春碱含量高于100μg/g干重。
5.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述根尖的长度为0.5-3cm，含有根顶端分生组织。
6.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于：步骤(1)所述的灭菌，先用70-75％(V/V)乙醇溶液浸泡20-100s，然后用0.02-0.06％质量体积比的HgCl2溶液浸泡2-10min，最后用无菌双蒸水将消毒剂冲洗干净。
7.一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞，其特征在于是由权利要求1-6任一项所述的方法制得。
8.一种长春花根顶端分生组织来源的植物干细胞的离体培养方法，其特征在于包括以下步骤：
取200-2000mL MS液体培养基，按接种量50-80g/L接种权利要求7所述的植物干细胞，然后悬浮振荡培养12-20天，得到长春花干细胞系。
9.根据权利要求8所述的离体培养方法，其特征在于：得到长春花干细胞系之后，按接种量40-60g/L接种到8-10L MS液体培养基中，悬浮培养12-20天。
10.根据权利要求8或9所述的离体培养方法，其特征在于：悬浮培养条件为：温度20-30℃，转速100-120rpm，完全暗培养，通气比0.25～0.50vvm；所述的MS液体培养基添加有25-35g/L蔗糖、2.0-4.0mg/L NAA和2.0-3.0mg/L 2,4-D，pH值5.6-5.8。
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