SU852275A1 - Способ регенерации растенийлюцЕРНы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ

IN viTRO

1

Изобретение относитс  к сельскоему хоз йству и может быть использовано в селекции и семеноводстве, в . частности дл  соматической гибридизации , клеточной селекции, ускоренного размножени  растений в исследовани х по фитопатологии, физиологии игенетике растений.

Известен способ ферментативного выделени  изолированных протопластов растений из клеток суспензионных культур, в частности сои, арахиса , фасоли 1.

Однако получить растени -регенеранты из таких протопластов до сих пор не удавалось.

Наиболее близким к изобретению  вл етс  способ регенерации растений люцерны из протопластов, выделенных с помощью ферментов из каллусов листового происхождени  12.

Однако этот способ применим только дл  растений, у которых -листовые эксплантаты образуют крупные, рыхлые Ксшлусы, пригодные дЛ  мацерации в растворе ферментов. Частота таких растений среди различных сортов и гибридов люцерны колеблетс  в пределах 10-30%. Таким образом, этот способ имеет лишь ограниченное применение . Минимальный срок, необходимый, дл  получени  регенерантов этим спо-ч собом, довольно продолжителен и составл ет 5 мес.,а выход регенерантов в расчете на 1 каллус незначителен (в среднем получают 3 растени  на 1 каллус).

Целью изобретени   вл етс  ускорение процесса регенерации растений и повышение его эффективности.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что листочки, то есть пластинки тройчатого листа, культивируемых сортов и гибридов люцерны стерилизуют в

15 0,1%-ном водном растворе диоцида и после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде делают на каждом из них р д надрезов по всей площади пластинки и помещают на основную питательную среду Гамборга в5 13,которую дополнительно ввод т бООр-8000 мг/л бактоагара и 200.300 мг/л нитрата аммони , содержание железа сернокислого (FeSO4- 7Н2Р) увеличивают до 70-100 мг/л, трилона Б (Na2.3DTA) до 25000-35000 мг/л и внос т следу рщие фитогормоны: 2,4-дихлор феноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 816 мг/л кинетин - 6-10 мг/л и -30 -нафтилуксусную кислоту (НУК) - ,5 мг/л, а рН среды довод т до 5,86 ,0.

Материал инкубируют 10-16 дней при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность Qi54 ,0 тыс.лк)/температуре 26-lc и относительной влажности воздуха 95Примечание: Сахарозы 20000 мг/л,рН 5,5.

Через 10-16 дней развившиес  каллусы перенос т в жидкую среду В, содержание сахарозы в которой увеличивают до 25000-35000 мг/л и дополнительно ввод т фитогормон - бензиламинопурии (ВАП) 0,2-0,8 мг/л. Материал инкубируют 6-8 дней в закрытых, прозрачных сосудах на встр хивающих аппаратах с числом оборотов 100125 при тех же параметрах освещенности , температуры и влажности, которые используют при инкубации листочков.

Образовавшиес  через 6-8 дней суспензии клеток используют дл  выделени  изолированных протопластов или субкультивируют путем добавлени  к 1 объему свежей среды того же состава I объема суспензии и через 68 дней инкубации повторно используют дл  получени  протопластов.

Предназначенную дл  выделени  протопластов суспензию клеток центрифугируют (4-5 мин, 135-160 д). и после удалени  супернатанта (надосадочна  жидкость) добавл ют к остав- шимс  в осадке клеткам раствор ферментов с осмотиком, содержащий,вес.%

4,.0-5, О

Целлюлаза . 3,0-3,5 Пектиназа : Хлористый кальций ( )

5,0-5,5 Остальное Вода

Материал инкубируют в темноте При температуре в течение 12-,

100% в закрытых, прозрачных сосудах .

В случае по влени  на листочках бактериальной или грибной инфекции их удал ют с частью прилегающей к ним питательной среды. Состав среды приведен в табл.1.

Таблица

14 ч. Выделившиес  протопласты отдел ют от грубых примесей путем фильтc ровани  через сетку с диаметром пор 100-125 мкм, а затем отмывают от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием (4-5 мин, 135160 д), использу  дл  промывки 5,05 ,5%-ный раствор хлористого кальци 

0 {СаСЧ/. 6Н2О) . После центрифугировани  и удалени  супернатанта к изолированнЕ:1М протопластам добавл ют жидкую среду Гамборга В, содержание сахарозы в которой увеличивают до

5 25000-35000 мг/л, дополнительно ввод т осмотик - D-маннит - 8500095000 мг/л и фитогормоны: ауксин (2,4-D) из расчета 0,5-2,0 мг/л и цитокинин - БАП - 0,5-1,0 мг/л или кинетин - 1,0-2,0 мг/л, а рН среды довод т до 6,0.

Образовавшуюс  суспензию протопластов дл  окончательной очистки от примесей фильтруют через фильтр с диаметром пор 80-90 мкм ч инкубируют в закрытых прозрачных сосудах 18-24 ч в темноте, а затем при непрерывном люминесцентном освещении (400600 лк), температуре и отно- сительной влажности воздуха 95-100%.

в течение инкубационного периода (24-30 дней) добавл ют свежую питательную среду того же состава, но без осмотика и фитогормонов, в кото5 РУЮ дополнительно ввод т аминокислоту-Ь-аспарагин из расчета 1200 , 150р„ мг/л. Среду добавл ют 5-7 раз .впервые через 6-7 дней после высева протопластов,а затем с интервалом 3 4 дн  из расчета 1 объем свежей сре ды на 8-10 объемов суспензии. . После образовани  из протопласто многоклеточных колоний (более 32 кле ток в каждой) их перенос т в свежую среду By/ в которой содержание сахар зы увеличивают до 60000-80000 мг/л, добавл ют Ь-аспарагин-500-750 мг/л и фитогормоны- (2,4-Д)-1, 5-2,0 мг/л и кинетин - 1,5-2,0 мг/л. Пересадку осуществл ют путем добавлени  к 4-6 объемам свежей среды 1 объема суспен зии с колони ми. Материал инкубирую 18-24 ч при тех же параметрах, что и протопласты, а затем перенос т на встр хивающие аппараты с числом оборотов 25-35 МИН ,Освещенность повышают до 2000-250,0 лк, другие парамет ры оставл ют без изменений. Через 10-15 дней многоклеточные колонии образуют каллусы, которые пе ресаживают в свежую среду того же состава, при этом содержание сахарозы снижают до 40000-60000 мг/л, а в качестве фитогормона используют один бензиламинопурин в концентрации 0,20 ,8 мг/л. Пересадку осуществл ют путем добавлени  к 4-6 объемам свежей . среды 1. объема суспензии с каллусами Материал инкубируют в закрытых.прозрачных сосудах на встр хивающих аппаратах с числом оборотов 100125 , освещенность повышают до 3000-4000 лк, Температуру и относите льную влажность воздуха оставл ют без изменений. Через 10-12 дней на каллусах обра -зуютс  мелкие (200-500 мкм) зеленые эмбриоиды, которые пересаживают на свежую среду того же состава, но без 1,-аспарагина, содержание сахарозы снижают до 30000-40000 мг/л. Пересадку осуществл ют путем добавлени  к 4-6 объемам свежей среды 1 объема суспензии с эмбриридами. Ма,те рт ал инкубируют при тех же параметра что и каллусы. Через 10-12 дней развиваютс  круп ные (1,0-2,5 мм) зеленые эмбриоиды, которые пересаживают на агаризованную среду В5 (6000-8000 мг/л бактоагара ) без гормонов и добавок. Услови  инкубации остаютс  прежними, но длину фотопериода сокращают до 16 ч в сутки. I.. . Через 15-20 дней развиваютс  проростки , котбрые пересаживают на агаризованную среду By с разбавленной (1;2 - 1:3) концентрацией всех вход щих в нее компонентов и инкубируют при тех же услови х. По мере развити  растений на этой среде и по влени  у них 2-3 тройчатых листьев и корней (через 20-30 дней) их пересаживают в почву и выращивают в обычных, услови х. Работу, св занную со,стерилизацией листьев получением протопластов и пересадками, провод т в асептических услови х. П р и м е р. Проводилась регенераци  растений из протопластов, выделенных из клеток суспензионных культур люцерны гибридной сортов Рамблер, Зайкевича и желт„ой сорта Дединовска . При этом получены следукнцие результаты: 95% листочков,помещенных на питательную среду с трем  фитогормонами , через 14 дней образовали каллусы , которые помещали в жидкую питательную среду с О,,2 мг/л бензиламинопурина из расчета 20 мг каллусной ткани на 1 мл среды и инкубировали на аппарате АВУ-1 (аппарат универсальный дл  встр хивани  жидкости . в колбах и пробирках) при 125 мин и амплитуде колебаний 20-30 мм. Через 7 дней из каллусов образовалась суспензи  клеток, содержаща  в среднем 120 тыс. клеток в 1 мл. Полученную суспензию после центрифугировани  и удалени  супернатанта использовали дл  выделени  протопластов, добавл   к оставшимс  в осащке клеткам раствор ферментов с осмотиком, содержащий,вес.%: целлюлазу Onozuka Р 1500-4,0, пектиназу Serva 3 ,5, хлористый кальций (СаСбд- )5 ,5 и дистиллированную воду - 87;О. Раствор стерилизовали фильтрованием через стекл нный фильтр 365 (Schott and Gen,Jena, DDR). Ha I CMзклеток оставшихс  в осадке после центрифугировани , добавл ли 1 мл ферментного раствора и инкубировали в чашках Петри -в темноте при температуре в течение 13 ч. Выделившиес  протопласты отдел ли от рубых примесей путем фильтровани  через трехслойную капроновую сетку с диаметром пор 125 мкм, а затем отмывгши от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием .(5 мин, 135-160 д) , использу  5,5 %-ный раствор хлористого кальци  (СаСВа. ) . к оставшимс  в осадке протопластам добавл ли жидкую среду с О-маннитом и фитогормонами: 1) 2,4-D-0,5 мг/л + БАП 1 ,0 мг/л 2) 2,4-D-2,0 мг/л + кинетин- 2, О мг/л и после фильтровани  Суспензии через стекл нный фильтр ПС-1 высевали в чашки Петри (по 23 мл в чашку размером 60x12 или 60x15 мм). Конечна  концентраци  ротопластов составл ла 40-60 ротопластов составл ла 40-60 тыс. 1 мл.. Вли ние возраста суспензионных культур клеток, состава и концентрации фитогормонов в питательной среде на выход жизнеспособных изолированных протопластов приведены в табл.2. Таким образом, оптимальный период Инкубации суспензионных культур, предназначенных дл  выделени  прото пластов, составл л 6-8 дней. Наивол ший выход жизнеспособных протопластов наблюдалс  при использовании в качестве фитогормона бензиламинопур на в концентрации 0,2 мг/л. Изолиро ванные протопласты, полученные из суспензионных культур, растущих в среде без фитогормонов, имели низку жизнеспособность и были непригодны дл  культивировани . Значительное вли ние на жизнеспо собность протопластов и темп клеточ ных делений оказывала концентраци  фитогормонов в питательной среде, используемой дл  культивировани  пр топластов. Снижение концентрации фи тогормонов до 0,1-0,2 мг/л приводило к замедленному на 2-3 недели) развитию многоклеточных колоний и кгшлусов. Увеличение концентрации фитогормонов до 3-4 мг/л вызывало нарушени  в процессе клеточных деле ний, ингибировало развитие многокле точных колоний и кешлусов. Оптималь ные результаты были получены при ис пользовании фитогормонов в концентр ции 0,5-2,0 мг/л. В период образовани  из протопластов многоклеточных колоний (25 дней) к инкубируемому материалу доб л ли свежую среду, содержащую 1350 мг/л L-аспарагина. Первый раз среду добавл ли через 7 дней после высева протопластов, а затем с 34-диевным интервалом еще 4 раза. Финальна  концентраци  аспарагина в инкубационной среде составл ла 600 мг/л. Добавление свежей среды с 3-4дневными .интервалами повышало темп клеточных делени  г то приводило к ускорению процесса развити  многоклеточных колоний на 7-10 дней по сравнению с еженедельным добавлением среды. Уменьшение интервала межд добавками до 1-2 дней приводило к повреждению части клеток, вследст

Т а б л и ц а 2, вие резкого снижени  осмотического давлени  питательной среды. Образовавшиес  колонии пересажи-. вали в свежую среду, содержащую 80000 мг/л сахарозы, 530 мг/л L-аспарагина , 2 мг/л 2,4-D и 2 мг/л кинетина путем добавлени  к 1 объему суспензии 4 объемов свежей среды и инкубировали 18 ч при тех же услови х , что и протопласты (с целью стабилизации осмотического давлени ), а затем переносили инкубируемый материал на аппарат дл  встр хивани  с .круговым вращением Shake ТЛ/ BDR и культивировали при 30 мин-, освещенности 2100± iOO лк и температуре . Увеличение числа оборотов до 40-50 приводило к повреждению колоний и их выбрасыванию на стенки чашек, снижение до 10-20 мин уменьшало аэрацию питательной среды, в результате чего срок, необходимый дл  развити  каллусов из многоклеточных колоний , удлин лс  на 7-10 дней. Таким образом, оптимальнее число оборотов составл ло 25-35 мин. Через 14 дней из многоклеточных колоний образовались каллусы,которые пересаживали в свежую среду,содержащую бОООО мг/л сахарозы, 530 мг/л Ii-аспарагина и 0,2 мг/л БАП (к б объемам свежей среды добавл ли 1 объем суспензии с каллусами). Материал инкубировали на аппарате АВУ-1 при 125 мин и освещенности 3500 200 лк до образовани  в суспензии мелких, зеленых змбриоидов (10 дней). Суспензию с змбриоидами субкультивировали путем добавлени  свежей среды того же состава, нр без аспарагина С концентрацию сахарозы снижали до 40000 мг/л) и инкубировали в тех же услови х 10 дней. Значительное вли ние на процессы развити  из протопластов многоклеточных колоний, каллусов и эмбриоидов оказывало введение в питательную среду аминокислоты - аспарагина. Добавление этого) соединени  увеличивсшо число образовавшихс  колоНИИ в 1,75 раза по сравнению с конт-. ролем (среда без добавок). В контрольном варианте развитие продолжалось лишь до образовани  8-16 клеточных колоний, которые впоследствии бурели.,Нар ду с L-аспарагином, друга  аминокислота - L-аргинин стимулировала образование многоклеточДобавление L-аспарагина стимулировало образование тканевых структур , из которых в дальнейшем развивались каллусы.-При инкубации каллу сов в питательной среде с аспарагин число образовавшихс  эмбриоидов воз растсшо в 3 раза по сравнению с контрольным вариантом (среда без до бавок). Полученные эмбриоиды нормал но развивались в среде без аспараги Оптимальна  концентраци  L-аспарагина в инкубационной среде состав л ла 500-750 мг/л. Увеличение концентрации до 1000-1500 мг/л не повы шало зффективность действи  аспарагина , а уменьшение до 100-250 мг/л приводило к замедленному (на 5-10 дней) образованию многоклеточных ко лоний, каллусов и эмбриоидов. Крупные, зеленые эмбриоиды перес живали на агаризованную среду бе гормонов, содержащую 30000 мг/л сахарозы и инкубировали при 16-часовом фотопериоде до образовани  проростков (17 дней). Проростки пересаживали на агаризованную среду гормонов с уменьшенной в 2 раза концентрацией всех компонентов. По мере развити  из проростков растений с 2-3 листь ми и корн ми (2025 дней) их пересаживали в почву и выращивали в обычных услови х. Растени -регенеранты были свободны от фитопатогенной инфекции, нормально росли и развивались, цвели и зав зывали семена от перекрестного опылени  и самоопылени . Период регенер ции (от протопласта до растени ) . составл л 95-100 дней. В расчете на 1 каллус было получено 300 растений. При высеве изолированных протопластов в питательную среду с двум 

ных колоний, однако дл  нормальнох-о прохождени  процесса каллус®генеза &шо необходимо присутствие в питательной среде L-аспарагина.

Вли ние аминокислот на развитие колоний, тканевых структур и эмбриоидов приведено в табл.3.

Claims (4)

1. ТаблицаЗ сочетани ми фитогормонов (2,4-0 0 ,5 мг/л + БАП - 1,0 мг/л и 2,4-D 2 ,0 мг/л + кинетин - 2,0 мг/л) и последующего культивировани  в одинаковых услови х были получены аналогичные результаты. Использование изобретени  позволит значительно ускорить процесс регенерации растений из протопластов и повысить его эффективность. Высокий выход регенерантов позволит использовать данный способ в клеточной селекции, дл  генетической модификации растений, соматической гибридизации , ускоренного размножени  и оздоровлени  растений и т.д. Формула изобретени  1. Способ регенерации растений люцерны in vitro, включающий получение каллусов и суспензий клеток с последующим выделением из них протопластов , и культивирование их в услови х, способствующих развитию многоклеточных колоний, каллусов, почек, змбриоидов и растений, о т - лич ающийс  тем, что, с целью ускорени  процесса регенерации растений и повышени  его эффективности , протопласты выдел ют из клеток суспензионных культур через 68 дней инкубации в среде с бензиламинопурином , изолированные протопласты инкубируют в жидкой питательной среде Гамборга Bj- с фитогормонами с добавлением каждые 3-4 дн  свежей среды с L-аспарагином, а образовавшиес  многоклеточные колонии, пересаживают в свежую среду с фитогормонами и L-аспарагином и инкубируют на встр хивающих аттаратах с

   числом оборотов 25-35 до образовани  каллусов, которые пересаживают в среду с бенэнламинопурином и L-аспарагином и инкубируют до образовани  эмбриоидов с последующей пересадкой их на среды, способствующие регенерации растений.
2. 2.Способ по П.1, отличающийс  тем, что суспензионные культуры( клеток, предназначенные дл  выделени  протопластов инкубируют в среде, содержащей 0,2-0,8 мг/л бензиламинопурина. .
3. 3.Способ по П.1, отличающийс  тем, что изолированные протопласты инкубируют в среде, содержащей в качестве фитогормонов: ауксин - 2,4-D - 0,5-2,0 мг/л, цитокинин-бейэиламинопурин 0,5-1,0 мг/л или кинетин 1,0-2,0 мг/л.
4. 4. Способ по П.1, отличаю щ и и с   тем, что среда, используема  дл  добавок в период образовани  из протопластов клеточных колоний , содержит 1200-1500 мг/л L-acnaрагина ,а среда дл  пересадок колоний и каллусов 500-750 мг/л.

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

   1. R.U. Schenk Q.C. Hitdebrandt Crop Science-, 1969, 9, 5, p. 629631 .

   2., Авторское свидетельство СССР № 743647, кл. А 01 Н 3/00,. 1978 (прототип ).

   3. O.Gamborg etaE ExperimentaE Cete Research 50, 1, p. 151-158, 1968.